Potenzialità dei P Sistemi per la Modellazione
dell’Attività dei Canali Meccanosensibili nei
ProcariotiAnna Anselmo
P SistemaModello di calcolo ispirato alla strutturaed al funzionamento delle cellule.Utilizzato come modello discreto per processi cellulari
Componenti necessari per la descrizione di un processo cellulare tramite P Sistema:
• Struttura cellulare• Sostanze Biochimiche• Reazioni cellulari• Comunicazione di sostanze
CANALI MECCANOSENSIBILI (Msc)
Scoperti nel 1984 in cellule animaliCanali proteici regolati da forze meccaniche
In particolare da cambiamenti di pressione esercitati contro la membrana in cui sono localizzati.
• Condizioni ambientali• Esperimenti di patch clamping
Esperimenti di patch clamping (cattura di membrana)
Viene praticata una suzione che fa si che il vetro aderisca strettamente al doppio strato lipidico.
La resistenza tra l'interno della pipetta e il liquido extracellulare è così elevata da permettere la registrazione delle piccolissime variazioni di resistenza causate dall'apertura o chiusura di un singolo canale.
• Localizzazione nella membrana cellulare
Protezione contro downshifts osmotici
• Funzione principale: permette la rapida uscita di sostanze chimiche e la diminuzione della pressione osmotica all’interno della cellula
La pressione osmotica all’interno dalla cellula avvicina i valori osmotici del mezzo extracellulare
In particolare ci occuperemo degli shock iposmotici =>diminuzione della concentrazione dell’ambiente extracellulare
CELLULA INTEGRA
MODELLIper la descrizione del funzionamento di Msc
in vitroesperimenti di patch clamping
in vivoshock ipotonici
SISTEMA comprende:• ambiente• regione• tensione di membrana• probabilità associate a regole di evoluzione
In questo P sistema gli oggetti non vengono modificati dalle regole di evoluzione, ma solo scambiati tra la regione interna e l’ambiente extra-cellulare
CANALI MECCANOSENSIBILI IN E.COLILa parete di peptoglicano nei batteri bilancia il turgore cellulare che in E.Coli è circa 4 atm.
Shock iposmotici Acqua entra rapidamente nella cellula aumentando la pressione di turgore.
ASSENZA di meccanismi che riducono turgore
Pressione di turgore di E.Coliraggiunge 11atm (0,3 M)
ATTIVAZIONE dei canalimeccanosensibili
Nessun danno alla cellula
Condizioni stazionarie
Il rilascio di soluti aumenta il potenziale osmotico del citoplasma diminuendo quindi la driving force per l’entrata dell’acqua
Risponde a stimoli meccanici (tensione di membrana: non richiede componenti extramembrana x il gating).
Struttura di MscL in E.Coli
Codificata da un gene singolo di 412 bp
136 aa
15 kDa
Struttura Secondaria:
2 domini di α-eliche transmembrana (M1 e M2)Loop divisibile in S1 e S2N-terminale e C-terminale localizzati nel citoplasmaMultimero con 5 subunità
Stretch meccanico
Aumento della tensione di membrana
Conformazioni:C, conformazione chiusaCE, conformazione chiusa espansaSO1, conformazione semi-aperta in cui solo una subunità è apertaSO2, conformazione semi-aperta in cui solo due subunità sono aperteSO3, conformazione semi-aperta in cui solo tre subunità sono aperteSO4, conformazione semi-aperta in cui solo quattro subunità sono
aperteO, conformazione completamente aperta
PROGRESSIONE ATTRAVERSO LE DIVERSE CONFORMAZIONI
Modello di membrana per l’attività di MscL In VitroQualche definizione….
Struttura di membranaStruttura di membrana: insieme di membrane gerarchicamente racchiuse in un’unica membrana. Ogni coppia di parentesi quadrate = 1 membrana. Ciascuna membrana identifica una RegioneRegione.
Regole di evoluzione: Regole di evoluzione: regole di riscrittura con associato un target (determina la regione dove l’oggetto sarà comunicato dopo l’applicazione della regola).
Configurazione: Configurazione: struttura di membrana con tutti i multinsiemi di oggetti associati ad una regione
Computazione: Computazione: sequenza di transizioni attraverso le configurazioni, ottenuta lasciando evolvere gli oggetti in tutte le regioni in maniera non deterministica e parallela.
Simulazione di un Ciclo: Simulazione di un Ciclo: sequenza finita di transizioni che partendo dallaconfigurazione iniziale Co finisce con una configurazione finale Cf.
Modello di membrana per l’attività di MscL In Vitrocorrispondente ad esperimenti di Patch Clamping
•TENSIONE che può assumere valori reali dell’insieme finito
Tension = {tC, tCE, tSO1, tSO2, tSO3, tSO4, tO, tL}
Componente fondamentale:
dove:
• tC = valore iniziale della tensione di membrana
• tCE = valore raggiunto durante l’espansione del canale MscL
• tSO1, tSO2, tSO3, tSO4 = valori di tensioni di membrana quando il canale è parzialmente aperto
• tO = valore corrispondente all’apertura completa di MscL
• tL = valore corrispondente alla soglia litica di membrana
Da esperimenti in vitro si sono potuti osservarei seguenti valori di tensione di membrana (dyne/cm):
1. tC Є [0,10) no aspirazione2. tCE = 10 applicata suzione3. tSO1, tSO2, tSO3, tSO4 Є (10,13) canale parzialmente aperto4. tO = 13 completamente aperto5. tL ≥ 14 lisi membrana
Transizioni attraverso i valori di tensione sono dovuti a cambiamenti nella pressione applicata alla membrana (dipendenza lineare tra la tensione di membrana e la pressione applicata)
Si considera un Ambiente Esterno (Env) ed una Regione Interna (Reg)
1. l’ambiente è fatto di soluti (simboli dell’alfabeto Vchem) e molecole d’acqua (w Vchem );
2. la regione interna consiste di oggetti sullo stesso alfabeto dell’ambiente e si assume che al suo interno non avvenga nessun altro processo
∉
La notazione Env [t Reg indica la membrana (associata al parametro di tensione t) che separa l’ambiente esterno da quello interno.
NB: in esperimenti in vitro l’attivazione di MscL è determinata dalla pressione negativa applicata artificialmente alla membrana
Le soluzioni interne ed esterne nonnon hanno nessun ruolo nel meccanismo di apertura del canale
Regola dell’ambiente in vitro: cambiamento nel parametro di pressione p dovuto ad azione esterna
‹p,apply› [t prob [t'
Transizioni delle tensioni di membrana per il modello in vitro
Azione del parametro p ha conseguenze sulla tensione di membrana ed è applicata con una probabilità associata
Per p Є R, t,t‘ Є Tension, prob Є [0,1] R
Insieme R di regole di evoluzione per il modello in vitro
14 sottoinsiemi di regole
Transizione da un valore fissato di tensione di membrana per un determinato valore di aspirazione
Regole appartenenti allo stesso sottoinsieme hanno associati valori di probabilità la cui somma è 1.
1. [tC prob=1 [tC (no suction applied)
2. ‹p,apply›[tC prob=0.01 [tCE for some p « 403. ‹p,apply›[tC prob=0.99 [tC for some p « 40
Tensione di membrana = tC e la pressione applicata è <<40mmHg
la conformazione di MscL diventa CE con una probabilità molto bassa perché la suzione applicata è insufficiente per l’attivazione del canale
Valori scelti arbitrariamente, ma con stretta attinenza al fenomeno biologico
4. ‹p,apply›[tC prob=0.8 [tCE for some 0< p ≤405. ‹p,apply›[tC prob=0.2 [tC for some 0< p ≤40
6. ‹p,apply›[tCE prob=0.05 [tC for some p ≈ 40 7. ‹p,apply›[tCE prob=0.5 [tSO1 for some p ≈ 40 8. ‹p,apply›[tCE prob=0.20 [tSO2 for some p ≈ 40 9. ‹p,apply›[tCE prob=0.15 [tSO3 for some p ≈ 40 10. ‹p,apply›[tCE prob=0.07 [tSO4 for some p ≈ 40 11. ‹p,apply›[tCE prob=0.03 [tO for some p ≈ 40
12. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.05 [tCE for some p ≈ 40 13. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.5 [tSO1 for some p ≈ 40 14. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.2 [tSO2 for some p ≈ 40 15. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.15 [tSO3 for some p ≈ 40 16. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.07 [tSO4 for some p ≈ 40 17. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.03 [tO for some p ≈ 40
(x,out) Flusso di sostanze chimiche ed acqua quando il canale è aperto
Transizione dalla CEalle altre conformazioni in risposta ad un’aspirazione di 40 mmHg
18. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.1 [tSO1 for some p ≈ 40 19. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.02 [tSO2 for some p ≈ 40 20. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.5 [tSO3 for some p ≈ 40 21. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.3 [tSO4 for some p ≈ 40 22. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.08 [tO for some p ≈ 40
23. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.02 [tSO1 for some p ≈ 40 24. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.3 [tSO2 for some p ≈ 40 25. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.08 [tSO3 for some p ≈ 40 26. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.5 [tSO4 for some p ≈ 40 27. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.1 [tO for some p ≈ 40
28. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.02 [tSO1 for some p ≈ 40 29. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.08 [tSO2 for some p ≈ 40 30. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.3 [tSO3 for some p ≈ 40 31. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.1 [tSO4 for some p ≈ 40 32. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.5 [tO for some p ≈ 40
36. [tO (x,out) prob=1 [tC (no suction applied)
39. ‹p,apply›[tC (x,out) prob=0.99 [tL for some p >> 40 40. ‹p,apply›[tC (x,out) prob=0.01 [tCE for some p >> 40
41. ‹p,apply›[tCE (x,out) prob=0.9 [tL for some p >> 40 42. ‹p,apply›[tCE (x,out) prob=0.1 [tSO1 for some p >> 40
43. ‹p,apply›[tL prob=1 for all p ≥0
Comunicazione di oggetti dalla regione interna all’ambiente
Distruzione membranaMultiset interni ed esterni mischiati nell’ambiente
37. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=P (o l) [tL for some p > 40, x Mreg 38. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=1-P (o l) [to for some p > 40, x Mreg
⊆
⊆
33. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=0.9 [tC for some p ≈ 40, x Mreg34. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=0.01 [to for some p ≈ 40, x Mreg 35. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=0.09 [tSO4 for some p ≈ 40, x Mreg ⊆
⊆⊆
Definizione formale del modello in vitro per l’attività MscL
πinvitro = (V, µ, Tension, Menv, Mreg, R)
Dove:
• V = Vchem U {w} Alfabeto del sistema doveVchem= {a1,…,an} è l’insieme finito di simboli corrispondenti ai soluti
• µ Є {[t ]t, } Struttura di membrana: membrana etichettata con il parametro variabile t. Se la membrana non è più presente nel sistema (lisi) si usa la notazione
• Tension = {tC, tCE, tSO1, tSO2, tSO3, tSO4, tO, tL} Insieme di valori per la tensione t di membrana
• Menv, Mreg Multinsiemi presenti nell’ambiente e nella regione (all’inizio Menv = Mreg)
• R Insieme di regole
Valori tipici per buffers simmetrici usati in esperimenti in vitro:
• 200 mM KCl• 40 mM MgCl2
Quindi si può definire:
Menv = Mreg = a1200 a2
40 wN
dove a1 = KCl, a2 = MgCl2, N = valore intero » soluti
Il P sistema definito per la modellazione dei MscL durante esperimenti di patch clamping con buffers simmetrici puòessere utilizzato anche per modellare esperimenti con buffers non simmetrici (Mreg ≠ Menv).
CONFIGURAZIONI:
C è una 4-tupla ( [ ], t, Menv, Mreg) oppure2-tupla ( , Menv)
Configurazione iniziale: Co = ([ ], tc, Menv, Mreg) con Menv = Mreg
Configurazione finale: Cf = { ( [ ], tc, M’env, M’reg), ( , M’’env)}, con M’env, M’reg, M’’env tale che M’env U M’reg = Menv U Mreg eM’’env = Menv U Mreg
C ( [ ], t, Menv, Mreg)
Transizione da una configurazione all’altra può essere descritta come:
P : ({ [ ] } x Tension x Env x Reg) U ({ } x Env)ז({ [ ] } x Tension x Env x Reg) U ({ } x Env)
Con ( [ ], t, Menv, Mreg) → {([ ], t’, M’env, M’reg), ( , M’’env)}( , Menv) → {( , Menv )}
Modello per esperimenti In Vivo
• Viene considerato un numero minore di conformazioni
• Non vengono associati valori di probabilitàalle regole di evoluzione
• Aggiunto un nuovo valore di tensione di membrana raggiungibile dopo un ciclo
• Ulteriori possibili transizioni attraverso valori di tensione di membrana in risposta a differenti condizioni ambientali
Alcune considerazioniAlcune considerazioni
Nei modelli in vivoConfigurazione iniziale del sistema corrisponde all’equilibrio biologico (situazione in cui non c’è attivazione di MscL)
Possibili combinazioni di multinsiemi e concentrazioni:
1. Composizione e concentrazione dei multinsiemi diverseMenv ≠ Mreg, Conc(env) ≠ Conc(reg)
⇨ Corrisponde all’habitat naturale di E.Coli
2. Composizione dei multinsiemi diversa, ma concentrazioni ugualiMenv ≠ Mreg, Conc(env) = Conc(reg)
⇨ Corrisponde all’habitat naturale di Halobacter salinarum
3. Composizione e concentrazione dei multinsiemi ugualiMenv = Mreg, Conc(env) = Conc(reg)
⇨ Corrisponde agli esperimenti di patch clamping considerati nel modello in vitro
Batteri Archea Alofili (Halobacter salinarum, Haloferax volcanii)
No pressione di turgore
La concentrazione di soluti all’interno della cellula è praticamente uguale alla concentrazione all’esterno
La quantità di ciascun soluto però è molto differente all’interno rispetto all’esterno.
Possono vivere in ambienti ipersalini (Mar Morto)
• Strategia nondispendiosa
• Richiede adattamenti del macchinario enzimatico per l’alta concentrazione intracellulare.
• Limitata adattabilità delle cellule
Un’altra strategia…
Escherichia Coli
Presenza all’interno della cellula di alti livelli di molecole organiche (glutammato, zuccheri, ecc.)
Aumentano la pressione osmotica
Diminuisce l’entrata di ioni sodio all’interno della cellula
• Strategia dispendiosa(dipende dal soluto organico sintetizzato)
• Nessuna modificazione del macchinario intracellulare
• Velocità di adattamento delle cellule a cambiamenti della salinità esterna
Occorrenza multipla dei MscL
Esempio:Membrana con due canali
‹p, apply› [tc prob=0.8 [tCE per il canale 1‹p, apply› [tc prob=0.3 [tC per il canale 2 p Є (0,40]
‹p’, apply› [tCE prob=0.7 [tSO1 per il canale 1‹p’, apply› [tCE prob=0.5 [tCE per il canale 2
p’ ≈ 40
e così via…
Per descrivere tutte le reazioni possibili è sufficiente considerare differenti probabilità per ciascun canale.
Considerazioni Finali ed Estensioni FutureConsiderazioni Finali ed Estensioni Future
Studio del parallelismo in Biologia e nei P sistemi
Relazioni tra modelli In Vitro e In Vivo
Occorrenza multipla di MscL
Effetti di Inibitori ed Attivatori
Risposte a breve e lungo termine alla Pressione Osmotica
• Descrizione del funzionamento di altri canali meccanosensibili con diverse conduttività (MscS, MscM in E.Coli)
• Descrizione di altre strutture coinvolte nell’ osmoregolazionein cellule procariotiche
Relazioni tra modelli In Vitro e In Vivo
Il potere intrinseco dei P sistemi per l’elaborazione di modelli sia in vivo che in vitro di processi biologici ha due ragioni:
1. P sistemi sono stati costituiti sull’assunzione che un progetto formale di computazione può essere astratto dal funzionamento delle cellule
2. La matematica discreta potrebbe essere più appropriata che la matematica continua per descrivere eventi molecolari discontinui come l’apertura e la chiusura dei MscL.
per l’integrazione di informazioni note sui MscL nei procarioti
Occorrenza multipla dei MscL
Modelli (in vitro ed in vivo) simulano l’attività di un singolo canale ma in una singola cellula batterica se ne possono trovare 50-100.
Modelli in vitro possono facilmente essere estesi per considerare l’occorrenza multipla di MscL.
Applicazione aspirazione:
CANALI completamente aperti, stati di semi-conduttività completamente chiusi
Condizioni ambientali fissate
non tutti i MscL sono nella stessa conformazione.
Effetti di Inibitori ed Attivatori
Inibitori: ione gadolinium, amiloride antibiotici aminoglicosidiciAttivatori: molecole anfipatiche, molecole con gruppi idrofilici ed idrofobici
per descrivere cambiamenti nell’attivazione dei MscLed il funzionamento della cellula
Esempi:
Gadolinium
Gramicidina
Vantaggio:P sistema adatto alla predizione dell’azione di attivatori ed inibitori (non molto utilizzati in esperimenti biologici)
inibisce il flusso osmotico di soluti da E.Coli e altri microrganismi durante shock iposmotico
forma canali nel bilayer: quando aumenta la tensione nel doppio strato, due molecole di gramicidina si legano e il dimero formato è responsabile della formazione del canale
Bibliografia
• D. Besozzi, I.I. Ardelean, G.Mauri, The Potential of P Systems for Modelling the Activity of Mechanosensitive Channels in Prokaryotes
• S. Sukharev, Mechanosensitive channels in bacteria as membrane tension reporters
• S. Sukharev, M. Betanzos, C. Chiang, R. Guy, The gating mechanism of the large mechanosensitive channel MscL
• M. Betanzos, C. Chiang, R. Guy, S. Sukharev, A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension