UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL
PROTEIN DAN ASAM AMINO EKSTRAK AMPAS
BIJI JINTEN HITAM (Nigella sativa Linn.) DENGAN
METODE SDS-PAGE DAN KCKT
SKRIPSI
NIA YULIANI DEWI
NIM.108102000030
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
SEPTEMBER 2013
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL
PROTEIN DAN ASAM AMINO EKSTRAK AMPAS
BIJI JINTEN HITAM (Nigella sativa Linn.) DENGAN
METODE SDS-PAGE DAN KCKT
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
(S.Far)
NIA YULIANI DEWI
NIM.108102000030
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
SEPTEMBER 2013
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRAK
Nama : Nia Yuliani Dewi
Program Studi : Farmasi
Judul : Penetapan Kadar dan Analisis Profil Protein dan
Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam
(Nigella sativa Linn.) dengan Metode SDS-PAGE
dan KCKT.
Biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) merupakan salah satu tumbuhan obat yang
antara lain berkhasiat sebagai pelancar ASI, peluruh buang angin, pencegah
muntah, pencahar, pengelat, pengobatan pasca persalinan dan immunomodulator.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar dan profil protein serta asam
amino pada ekstrak ampas biji jinten hitam. Ekstraksi protein dari ampas biji
jinten hitam (Nigella sativa Linn.) menggunakan PBS (phosphate buffer saline)
pH 7,2 dan di sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C selama 30
menit. Pengukuran kadar protein digunakan dengan metode Lowry menggunakan
pereaksi folin-ciocalteu yang di ukur pada panjang gelombang 737,5 nm. Hasil
pengukuran kadar protein dengan metode Lowry didapatkan kandungan protein
pada ekstrak ampas biji jinten hitam yaitu 8,5848 mg/ml. Analisis profil protein
dilakukan dengan menggunakan sodium dedosil sulfat poliakrilamid gel
elektroforesis (SDS-PAGE). Elektroforesis gel poliakrilamid digunakan untuk
mengetahui profil protein serta bobot molekul dari ampas biji jinten hitam
(Nigella sativa Linn.). Pewarnaan pita protein menggunakan comassie brilliant
blue. Data dianalisis secara deskriftif berdasarkan nilai migrasi pita protein
sampel dibandingkan dengan pita protein marker (Rf). Hasil analisis profil protein
dengan menggunakan SDS-PAGE menunjukkan pada ampas biji jinten hitam
(Nigella sativa Linn.) terdapat pita protein dengan berat molekul 67,4839 kDa –
8,0872 kDa. Penentuan kandungan asam amino dilakukan dengan menggunakan
KCKT. Hasil analisis kandungan asam amino pada ampas biji jinten hitam
(Nigella sativa Linn.) menunjukkan terdapat 16 asam amino dengan kandungan
total 1,055%. Diantaranya 9 asam amino esensial, yaitu histidin 0,015%, arginin
0,035%, treonin 0,021%, valin 0,032%, metionin 0,001%, lisin 0,182%, isoleusin
0,020%, leusin 0,030%, fenilalanin 0,013%; serta 7 asam amino non esensial,
yaitu aspartat 0,058%, serin 0,064%, glutamat 0,071%, glisin 0,053%, alanin
0,219%, prolin 0,148%, dan tirosin 0,005%.
Kata kunci : Ampas Biji Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.), Profil Protein,
Asam Amino.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRACT
Name : Nia Yuliani Dewi
Program Study : Pharmacy
Title : Determination and Analysis Of Protein Profile and
Amino Acid of Black Cumin Seeds Waste Extrac
Using SDS-PAGE and HPLC Method.
Black cumin seeds (Nigella sativaLinn.) is one of herb that had potency like
facilitator milk, laxative flatulence, preventing vomiting, laxatives, postpartum
treatment and immunomodulator. The aims of this research is to determine protein
concentration and profile protein and amino acids on black cumin seeds waste
extract. The extraction of proteins from the black cumin seeds waste (Nigella
sativa Linn.) using PBS (phosphate buffer saline) pH 7.2 and centrifuged at
10,000 rpm at a 40C for 30 minutes. Measurement of protein concentration using
the Lowry method using Folin-Ciocalteu reagent is measured at a wavelength of
737.5 nm. Protein measurement results obtained by the method of Lowry protein
content from black cumin seed waste extrac is 8.5848 mg/ml. Poliacrylamide gel
electrophoresis is used to know determine the molecular weight of the protein
profile of black cumin seeds waste (Nigella sativa Linn.). Staining the protein
comassie brilliant blue was used. Data were analyzed descriptively, based on
score of the migration of the sample protein band compared marker protein band
(Rf). Results of analysis of protein profiles using SDS-PAGE showed the of black
cumin seeds waste (Nigella sativa Linn.) There is a protein band with BM
67.4839 – 8.0872 kDa. Determination of the amino acid content is done using
HPLC. Results of analysis of amino acid content in the black cumin seeds waste
(Nigella sativa Linn.) Shows are 16 amino acids with total amino acid 1,055%.
Nine of them are assential amino acids, they are histidine 0,015%, arginine
0,035%, threonine 0,021%, valine 0,032%, metheonine 0,001%, lysin 0,182%,
isoleucine 0,020%, leucine 0,030%, phenylalanine 0,013%. And the other seven
are non-essential, they are aspartic acid 0,058%, serine 0,064%, glutamic acid
0,071%, glycine 0,053%, alanine 0,219%, proline 0,148%, dan tyrosine 0,005%.
Keywords : Black Cumin Seeds Waste (Nigella sativa Linn.), Protein
Profile, Amino Acid.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Allah SWT. Atas segala rahmat-Nya, penulis dapat
menyelesaikan skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar dan Analisis Profil Protein
dan Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.) dengan
Metode SDS-PAGE dan KCKT”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu
syarat menempuh ujian akhir guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada
Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas
Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Penulis menyadari bahwa, keberhasilan penulisan dan penyusunan
skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan bimbingan serta do’a dari berbagai pihak,
dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu,
penulis mengucapkan terima kasih kepada:
(1) Ibu Farida Sulistiawati, M.Si, Apt selaku pembimbing pertama dan Ibu Lina
Elfita, M.Si, Apt selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar
dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir penulis ini, semoga
segala pengarahan, nasehat, dukungan serta bantuan kedua pembimbing
mendapat imbalan yang jauh lebih baik di sisi-NYA.
(2) Bapak Prof. Dr. (hc). Dr. M. K. Tadjudin, Sp. And. selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta.
(3) Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc, Apt, selaku ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)
Syarif Hidayatullah Jakarta.
(4) Ibu Eka Putri, M.Si, Apt selaku pembimbing akademik.
(5) Bapak dan Ibu staf pengajar Program Studi Farmasi yang telah memberikan
ilmu dan pengetahuan hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan
Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
(6) Para staf dan karyawan program studi Farmasi. Staf Administrasi Farmasi,
Kak Pia yang telah banyak membantu dalam kelancaran studi kuliah.
(7) Pihak laboratorium Program Studi Farmasi Kak Eris, Mba Rani, Kak Yopi
dan Kak Liken; Pihak Laboratorium Terpadu UIN Kak Prita, Kak Pipit;
pihak Laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech Bogor. Terima kasih
karena telah banyak membantu selama proses penelitian.
(8) Kedua Orang Tua, Ayahanda H. Anan Ardiansyah dan Ibunda Hj. Eni
Suherti yang telah membesarkan, memberikan kasih sayang, mendoakan
dan memberikan dukungan luar biasa baik moril maupun materil kepada
penulis untuk segera menyelesaikan Skripsi ini. Terima kasih bapak dan
mamah. Tiada apapun di dunia ini yang dapat membalas semua kebaikan
yang telah bapak dan mamah berikan, hanya Allah yang bisa membalas
dengan Jannah-Nya.
(9) Kakak penulis Teh Dian yang telah banyak memotivasi, menghibur dan
memberikan do’a serta semangat hingga penulis dapat menyelesaikan
skripsi ini dan adik-adik penulis Epul dan Thalita.
(10) Sahabat penulis Wiwin, Sinthi, Ade, Sivia dan Nurma yang telah menjadi
sahabat-sahabat paling baik dan menjadikan hari-hari berwarna. Serta Imam
Maulana yang telah memberikan dukungan dan doa serta semangat hingga
penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
(11) Teman seperjuangan penelitian Sinthi Ayesha dan Zikriah atas perhatian,
kerjasama dan kebersamaan selama penelitian ini.
(12) Teman-teman seperjuangan Farmasi angkatan 2008 yang sama-sama
berjuang bersama untuk menyelesaikan pendidikan ini.
(13) Teman-teman Komda FKIK dan teman-teman akhwat Al-Kahfi 2008,
terimakasih untuk motivasi dan semangat yang selalu kalian tularkan. Tiada
kata yang dapat penulis ucapkan selain I love u all coz Allah.
(14) Sahabat terbaik penulis, Kariena Febriantin. Terimakasih untuk dukungan,
do’a dan untuk setiap cerita yang selalu kita habiskan bersama. Semoga kita
dapat meraih mimpi-mimpi kita dan sukses dengan profesi kita masing-
masing.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
(15) Pihak-pihak lain yang terlibat langsung maupun tidak dalam penulisan ini
yang namanya tidak dapat disebutkan.
Semoga apa yang telah diberikan kepada penulis, baik dalam bentuk doa,
dukungan, motivasi, dan tenaga atau apapun bentuknya. Semoga Allah membalas
kebaikan ini. Aamiin Ya Rabb..
Ciputat, September 2013
Penulis
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS
AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah
Jakarta, saya yang bertanda tangan dibawah ini :
Nama : Nia Yuliani Dewi
NIM : 108102000030
Program Studi : Farmasi
Fakultas : Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Jenis karya : Skripsi
Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya
dengan judul:
PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL PROTEIN DAN ASAM
AMINO EKSTRAK AMPAS BIJI JINTEN HITAM (Nigella sativa Linn.)
DENGAN METODE SDS-PAGE DAN KCKT.
Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital
Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.
Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan
sebenarnya.
Dibuat di : Jakarta
Pada Tanggal : 26 September 2013
Yang menyatakan,
( Nia Yuliani Dewi )
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………….............…...…... ii
HALAMAN PERNYATAAN ORISISNALITAS………………................ iii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………................... iv
HALAMAN PENGESAHAN……………………………………................ v
ABSTRAK………………………………………………………................... vi
ABSTRACT ………………………………………………...….................... vii
KATA PENGANTAR…………………………………...………................. viii
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH................ xi
DAFTAR ISI……………………………………………………................... xii
DAFTAR TABEL………………………………………………................... xiv
DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN………………………………………....................... xvi
DAFTAR ISTILAH........................................................................................ xvii
BAB 1. PENDAHULUAN............................................................................. 1
1.1 Latar Belakang………………………………….……................... 1
1.2 Rumusan Masalah…………………………….…………….......... 4
1.3 Tujuan Penelitian…………………………………………............ 4
1.4 Manfaat Penelitian………………………….…………..…........... 4
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA................................................................... 5
2.1 Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.)……………………..…..…..... 5
2.1.1 Klasifikasi Tanaman………………………………......……. 5
2.1.2 Nama Botani………………………………………...........… 5
2.1.3 Morfologi……………………………………….…..…….… 5
2.1.4 Kandungan Kimia……………………………..…..……....... 6
2.1.5 Khasiat dan Kandungan………………………....………….. 7
2.2 Ekstrak……………………………………..........................…....... 8
2.2.1 Pengertian Ekstrak…………………………...……….…….. 8
2.3 Protein........…………………..……………................................... 8
2.3.1 Struktur Protein ……………...………………..….……….... 9
2.3.2 Fungsi Prottein………………………………..….………..... 9
2.3.3 Pengukuran Kadar Protein...................................................... 10
2.3.4 Analisis Profil Protein............................................................. 11
2.3.5 SDS-PAGE............................................................................. 12
2.4 Asam Amino….....…………………………..……………..…….. 13
2.4.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)………...……… 13
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN ..................................................... 17
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian......................................................... 17
3.2 Alat dan Bahan................................................................................ 17
3.2.1 Alat......................................................................................... 17
3.2.2 Bahan...................................................................................... 17
3.3 Prosedur Penelitian.......................................................................... 18
3.3.1 Perolehan Simplisia................................................................. 18
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Protein...................................................... 18
3.3.3 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Lowry................. 19
3.3.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam....... 20
3.3.5 Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam...... 21
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................... 23
4.1 Determinasi Biji Jinten Hitam ........................................................ 23
4.2 Ekstraksi Protein Ampas Biji Jinten Hitam..................................... 23
4.3 Hasil Pengukuran Kandungan Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten
Hitam dengan Metode Lowry......................................................... 24
4.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan
SDS-PAGE..................................................................................... 28
4.5 Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan
KCKT............................................................................................. 30
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN......................................................... 34
5.1 Kesimpulan.………………………………………………………. 34
5.2 Saran.......…………………………………………………………. 34
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………….. 35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1. Kandungan Nilai Gizi Ampas Biji Jinten Hitam ............................... 7
Tabel 4.1 Hasil Pengujian Identitas dan Organoleptik Ekstrak........................ . 24
Tabel 4.2. Nilai Serapan Spektrofotometri Seri Konsentrasi Larutan BSA ........ 25
Table 4.3. Hasil Pengujian Kandungan Protein dengan Metode Lowry ............. 27
Tabel 4.4. Hasil Analisis Kandungan Asam Amino ........................................... 32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1. Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.).. ......................................... 6
Gambar 2.2 Prinsip Kerja SDS-PAGE.......................................................... 12
Gambar 2.3 Struktur Asam Amino ............................................................... 13
Gambar 2.4 Alur Proses Penggunaan HPLC ................................................ 14
Gambar 4.1 Kurva dan Persamaan Kalibrasi Konsentrasi terhadap Serapan
Larutan BSA .................................. ......................................... 26
Gambar 4.2 Hasil Analisis SDS-PAGE pada Ekstrak Ampas Biji Jinten
Hitam..................................... ................................................... 30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR ISTILAH
SDS-PAGE : Sodium Dedosil Sulfat Poliakrilamid Gel Elektroforesis
KCKT : Kromatgrafi Cair Kinerja Tinggi
BSA : Bouvine Serum Albumin
UV-VIS : Ultra Violet – Visibel
LAF : Laminar Air Flow
TEMED : Tetramethylethylene Diamine
PBS : Phospate Buffer Saline
AABA : Alpha Amino Butiric Acid
AQC : 6-Aminoquinolyl-N-Hidroxysuccsinimidil Carbamate
AMQ : 6-Aminoquinolin
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Skema Prosedur Penelitian Secara Umum ................................ 41
Lampiran 2. Skema Kerja Penetapan Kadar Protein .......................... ........... 42
Lampiran 3. Analisis Profil Protein dengan SDS-PAGE ............................... 43
Lampiran 4. Analisis Asam Amino dengan KCKT ....................................... 44
Lampiran 5. Hasil Determinasi Biji Jinten Hitam .......................................... 45
Lampiran 6. Spektrum Panjang Gelombang Maksimum ............................... 46
Lampiran 7. Bahan Pereaksi untuk SDS-PAGE ............................................ 47
Lampiran 8. Bahan dan Alat Penelitian ................... ............................... 49
Lampiran 9. Beberapa Hal Terkait SDS-PAGE ............................................. 52
Lampiran 10. Kromatogram Standar Asam Amino ......................................... 55
Lampiran 11. Kromatogram Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam ....................... 56
Lampiran 12. Hasil Analisis Asam Amino menggunakan KCKT ................... 58
Lampiran 13. Pembuatan Larutan Baku untuk KCKT..................................... 60
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh,
karena zat ini disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga
berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur (Winarno, 1992).
Jinten hitam merupakan tanaman semusim, famili Ranunculaceae.
Tanaman asli dari daerah Asia Barat, dan banyak tumbuh disekitar Laut
Tengah. Secara tradisional, jinten hitam telah lama dikenal sebagai obat
berbagai macam penyakit di banyak negara, termasuk Indonesia (Indriati
dan Khaerati, 2009).
Selama berabad-abad biji dari tanaman jinten hitam (Nigella sativa
Linn.) telah digunakan sebagai obat herbal untuk meningkatkan kesehatan
dan melawan penyakit terutama di Timur Tengah dan Asia Tenggara (Gilani
et al., 2004).
Jinten hitam diketahui memiliki banyak manfaat sesuai dengan sabda
Rasulullah SAW didalam sebuah hadist Bukhari mengenai khasiat jinten
hitam. Didalam kitab Shahih Bukhari Muslim, Abu Hurairah r.a. berkata
bahwa dia mendengar Rasulullah S.A.W. bersabda sebagai berikut:
عي أبي هريرة رضي اهلل عٌه أًه سوع رسول اهلل صلى اهلل عليه و سلن يقول:
.الالسام"إى في الحبت السوداءشفاءهي كل داء،" إ
“Dari Abu Hurairah RA bahwa dia mendengar Rasulullah
bersabda,”Sesungguhnya biji hitam itu mengandung obat untuk segala
penyakit, kecuali sam (kematian).” (HR. Bukhari).
Biji jinten hitam diketahui memiliki banyak manfaat antara lain
sebagai pelancar ASI, peluruh buang angin, pencegah muntah, pencahar dan
pengobatan pasca persalinan (Depkes RI, 1985). Selain itu, biji jinten hitam
menunjukkan aktivitas imunopotentiating, immunomodulasi dan memiliki
aktivitas seperti interferon (Hailat et al., 1995). Protein dari biji jinten hitam
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang dimurnikan dengan kromatografi ion exchange juga ditemukan
memiliki efek immunomodulator (Haq et al., 1999).
Dalam penelitian Al- Gaby, A.M, (1998) (tidak dilaporkan jenis biji
jinten hitamnya), dikatakan bahwa biji jinten hitam mengandung konsentrasi
protein sebesar 22,7%. Asam amino yang terkandung meliputi lisin, leusin,
isoleusin, valine, glycine, alanin, fenilalanin, arginin, asparagin, cystine,
asam glutamat, asam aspartat, prolin, serin, treonin, triptopan dan tirosin.
Berdasarkan hasil analisis ampas biji jinten hitam yang dilakukan oleh
Laboratorium Sucofindo, Bekasi (2011) menyatakan bahwa ampas biji
jinten hitam masih mengandung nutrisi penting bagi tubuh, diantaranya
mengandung karbohidrat 14,18%, lemak 37,58%, protein 21,58%,
phosphor, Fe, Ca dan Zn.
Berbagai studi telah dilakukan untuk menganalisa kadar protein dan
asam amino dari ampas biji jinten hitam. Michel et al (2010) melakukan
analisa profil protein ampas biji jinten hitam yang diekstraksi dengan
menambahkan Tris-HCl kemudian di analisa menggunakan SDS-PAGE
dengan konsentrasi akrilamid 12%. Dari penelitian tersebut, diperoleh hasil
bahwa berat molekul protein ampas biji jinten hitam berkisar antara 91,97
kDa-29,00 kDa. Sedangkan untuk analisis asam amino dilakukan dengan
menggunakan kromatografi penukar ion. Diperoleh hasil bahwa, ampas biji
jinten hitam mengandung 16 asam amino. Diantaranya, asam aspartat
3,07%, Treonin 1,21%, serin 1,31%, asam glutamat 7,78%, prolin 1,58%,
glisin 1,89%, alanin 1,47%, sistein 0,75%, valin 1,34%, metionin 0,53%,
isoleusin 1,06%, leusin 2,04%, fenilalanin 1,16%, histidin 1,05%, lisin
1,10% dan arginin 2,86% (Michel et al., 2010).
Silvia et al (2012) melakukan analisa asam amino dari ampas biji
jinten hitam berdasarkan perbedaan temperatur ekstraksi menggunakan
HPLC dengan derivatisasi AQC (6-Aminoquinolyl-N-Hidroxysuccsinimidil
Carbamate). Diperoleh hasil bahwa, ampas biji jinten hitam mengandung
metionin, treonin, fenilalanin, valin, isoleusin, arginin, lisin, leusin, histidin,
triptofan, glisin, prolin, alanin, serin, asam glutamat, tirosin, sistein dan
asam aspartat.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar dan profil protein serta
asam amino dari ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.)
dengan metode SDS-PAGE dan KCKT. Pelarut yang digunakan untuk
mengekstraksi ampas biji jinten hitam adalah PBS (Phosphate Buffer
Saline). Adapun penetapan kadar protein dari ekstrak ampas biji jinten
hitam (Nigella sativa Linn.) dilakukan dengan metode Lowry. Berdasarkan
studi literatur, penetapan kadar protein ekstrak ampas biji jinten hitam
(Nigella sativa Linn.) menggunakan metode Lowry belum pernah
dilakukan. Metode Lowry merupakan metode yang paling banyak
digunakan untuk menentukan kandungan protein suatu sediaan tumbuhan
(Harbone, 1987). Selain itu, uji Lowry seratus kali lebih sensitif
dibandingkan dengan reaksi Biuret (Coligan et al., 2007).
Selanjutnya dilakukan analisis profil protein dengan menggunakan
SDS-PAGE. Identifikasi SDS-PAGE merupakan teknik elektroforesis yang
menggunakan gel poliakrilamida yang bertujuan untuk memisahkan protein
dalam sampel berdasarkan berat molekul (Janson et al., 1998). SDS-PAGE
dinilai lebih menguntungkan dibandingkan elektroforesis kertas dan
elektroforesis pati. Hal ini disebabkan karena besarnya medium penyangga,
serta perbandingan konsentrasi akrilamida dan bis-metilen akrilamida.
Selain itu, gel ini tidak menimbulkan konveksi dan transparan (Bintang,
2010). Selanjutnya dilakukan analisis asam amino secara kromatografi. Cara
kromatografi telah memiliki banyak pengembangan, salah satu yang umum
yaitu kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). KCKT mampu memisahkan
senyawa yang serupa dengan resolusi yang baik serta dapat bekerja lebih
cepat sehingga waktu yang dibutuhkan singkat (Adnan, 1997).
Hasil analisa ekstrak ampas biji jinten hitam diharapkan dapat menjadi
informasi awal bagi pengembangan ekstrak sebagai immunomodulator.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang tersebut di atas, maka dapat dirumuskan
beberapa permasalahan sebagai berikut:
1. Berapakah kadar protein ekstrak ampas biji jinten hitam?
2. Bagaimanakah profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam yang
dianalisa dengan SDS-PAGE?
3. Bagaimanakah profil asam amino ekstrak ampas biji jinten hitam yang
dianalisa dengan KCKT ( Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)?
1.3 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Mengetahui kadar protein ekstrak ampas biji jinten hitam.
2. Mengetahui profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam.
3. Mengetahui jenis dan kadar asam amino ekstrak ampas biji jinten hitam.
1.4 Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumber informasi
ilmiah tentang kandungan protein dan asam amino dari ekstrak ampas biji
jinten hitam (Nigella sativa Linn.) serta dapat memberikan informasi dalam
formulasi sediaan farmasi mengenai kadar protein dan asam amino yang
terkandung didalam ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.)
2.1.1 Klasifikasi Tanaman
Berdasarkan ilmu taksonomi, klasifikasi tanaman jinten hitam adalah
sebagai berikut (Depkes RI, 1979):
Kingdom : Plantae
Subkingdom :Traceabionta
Divisi : Spermatophyta
Kelas : Magnoliopsoda dicotyledon
Subkelas : Magnoliidae
Ordo : Ranunculaceae
Genus : Nigella L
Spesies : Nigella sativa L
2.1.2 Nama Botani
Nigella sativa Linn
Nama Lain
Jawa : Jinten ireng (Jawa)
Sumatera : Jinten item (Melayu) (Anonim, 1983)
2.1.3 Morfologi
Jinten hitam merupakan tanaman perdu dengan ketinggian mencapai
50 cm dan mempunyai batang sedikit berkayu yang berbentuk bulat dan
berusuk, serta berbulu kasar, bercabang dan berwarna hijau. Daun berbentuk
bulat telur, ujung lancip, terdapat 3 tulang daun yang berbulu. Buah
berbentuk bulat panjang, bersegi dan beralur, berbiji kecil warna hitam
(Mursito, 2000). Kelopak bunga 5, bundar telur, ujungnya agak melancip
sampai agak tumpul, pangkal mengecil membentuk sudut yang pendek dan
besar. Mahkota bunga pada umumnya 8, agak memanjang, lebih kecil dari
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kelopak bunga, berbulu jarang dan pendek. Bibir bunga dua, bibir bagian
atas agak pendek, lanset, ujung memanjang berbentuk benang, ujung bibir
bunga bagian bawah tumpul. Benang sari banyak, gundul. Kepala sari
jorong dan sedikit tajam, berwarna kuning. Buah bulat telur atau agak bulat.
Biji hitam, jorong bersudut tiga tak beraturan dan sedikit berbentuk kerucut,
panjang 3 mm, berkelenjar (Depkes RI, 1989).
Gambar 2.1. Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.)
Sumber : Bamusa dan Al-Hujaj, 2011.
2.1.4 Kandungan Kimia
Biji jinten hitam mengandung asam lemak (35,6-41,6%), meliputi
asam arakidonat, asam linoleat, asam linolenat, asam oleat, asam palmitat,
asam stearat, dan asam miristat. Minyak atsiri (0,5-1,6%) meliputi
nigellone, thymoquinone, thymohidroquinone, dithymoquinone, thymol,
carvacrol, α dan β–pinene, d-limonene, d-citronellote, dan p-cymene. Data
penelitian yang dilakukan oleh Al-Gaby, A.M, 1998 (tidak dilaporkan jenis
jinten hitam nya), terkandung kadar protein 22,7%, asam amino meliputi
albumin, globulin, lisin, leusin, isoleusin, valin, glisin, alanin, fenilalanin,
arginin, asparagin, sistin, asam glutamat, asam aspartat, prolin, serin,
treonin, triptopan dan tirosin. Alkaloid meliputi nigellicine, nigellidine-N-
oxide. Mineral (1,79-3,74%), meliputi Fe, Na, Cu, Zn, P dan Ca. Vitamin
seperti asam askorbat, tiamin, niasin, piridoksin, dan asam folat, serta
karbohidrat (33,9%), serat (5,5%), air (6%), juga memiliki nilai gizi. Selain
itu, terkandung senyawa flavonoid, saponin dan tannin, asam organik.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Bijinya juga mengandung lipase, fitosterol, dan β-sitosterol (Hasan Gilani et
al., 2004).
Tabel 2.1. Kandungan nilai gizi ampas biji jintan hitam (Nigella sativa
Linn.)
Uraian Satuan Hasil
Kadar abu % 4,67
Warna - Hitam
Kadar air % 8,34
Karbohidrat % 14,18
Lemak % 37,58
Kalori Kcal / 100 g 481,26
Protein % 21,58
Serat kasar % 13,65
Phosphor ( P ) % 1,37
Zat besi (Fe ) mg/kg 889,17
Calcium ( Ca ) % 0,84
Zinc ( Zn ) mg/kg 70,28
Sumber : Laboratorium PT. Sucofindo, Cibitung - Bekasi (2011).
2.1.5 Khasiat dan kegunaan
Biji jinten hitam digunakan sebagai pelancar ASI, peluruh buang
angin, pencegah muntah, pencahar, pengelat, dan pengobatan pasca
persalinan (Depkes RI, 1985). Selain itu, biji jinten hitam menunjukkan
aktivitas imunopotentiating, immunomodulasi dan memiliki aktivitas seperti
interferon (Hailat et al., 1995). Protein dari biji jinten hitam yang
dimurnikan dengan kromatografi ion exchange juga ditemukan memiliki
efek immunomodulator (Haq et al., 1999).
Analisis dan publikasi studi-studi yang telah dilakukan dibeberapa
negara, menyatakan bahwa ekstrak Nigella Sativa dapat digunakan sebagai
antimikroba dan antioksidan (Singh, 2005), anti diabetes, antiinflamasi,
antiplasmolitik (Paarakh, 2009), toksisitas terhadap sel kanker usus dan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
leukimia karsinoma (Norsharina et al., 2011), peningkat sistem imun
(Swamy et al., 2000) dan anti bakteri (Halawani, 2009).
2.2 Ekstrak
2.2.1 Pengertian Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan menarik
senyawa aktif dari simplisia nabati ataupun hewani menggunakan pelarut
yang sesuai. Ragam ekstraksi yang tepat sudah tentu bergantung pada
tekstur dan kandungan air bahan tumbuhan yang diekstraksi dan pada jenis
senyawa yang diisolasi (Harbone, 1987).
Ekstraksi tanaman obat adalah pemisahan secara kimia atau fisika
suatu bahan padat atau bahan cair dari suatu padatan, yaitu tanaman obat
(Depkes RI, 2000).
Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang
terdapat pada simplisia. Karena didalam simplisia mengandung senyawa
aktif yang berbeda-beda dan mempunyai struktur kimia yang berbeda-beda,
sehingga metode didalam penarikan senyawa aktif didalam simplisia harus
memperhatikan faktor seperti: udara, suhu, cahaya, logam, berat. Proses
ekstraksi dapat melalui tahap menjadi: pembuatan serbuk, pembasahan,
penyarian, dan pemekatan (Depkes RI, 1978).
2.3 Protein
Istilah protein yang dikemukakan pertama kali oleh pakar kimia
Belanda, G.J.Mulder pada tahun 1939, yang berasal dari bahasa Yunani
“proteios”. Proteios sendiri mempunyai arti yang pertama atau yang paling
utama. Protein memegang peranan yang sangat penting pada organisme,
yaitu dalam struktur, fungsi, dan reproduksi (Sumardjo, 2009).
Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang
sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Disamping berat
molekul yang berbeda-beda, protein mempunyai sifat yang berbeda-beda
pula. Ada protein yang mudah larut dalam air, tetapi ada juga yang sukar
larut dalam air (Poedjiadi, 1994).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.3.1 Struktur Protein
Berdasarkan strukturnya, protein dibentuk oleh:
1. Struktur primer, dibentuk oleh ikatan peptida antar asam amino. Struktur
ini mengacu pada jumlah, jenis, serta urutan asam amino yang
membentuk rantai polipeptida.
2. Struktur sekunder, dibentuk oleh ikatan hidrogen intramolekular yang
terjadi di antara oksigen karbonil dan nitrogen amida pada perangkat
peptida.
3. Struktur tersier, merupakan rangkaian molekular yang menggambarkan
bentuk keseluruhan dari protein.
4. Struktur kuartener dibentuk oleh beberapa polipeptida yang berikatan
satu sama lain tidak secara kovalen (Bintang, 2010).
2.3.2 Fungsi Protein
Protein memegang peranan penting dalam hampir semua proses
biologi. Peran dan aktivitas protein terlihat dalam contoh berikut ini:
1. Katalis enzimatik.
Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh
makromolekul spesifik yang disebut enzim. Enzim mempunyai daya
katalitik yang besar, umumnya meningkatkan kecepatan reaksi sampai
jutaan kali. Fakta menunjukkan bahwa hampir semua enzim yang
dikenal adalah protein. Jadi protein merupakan pusat dalam
menetapkan pola transformasi kimia dalam sistem biologis.
2. Transport dan penyimpanan.
Berbagai molekul kecil dan ion ditransport oleh protein spesifik.
3. Koordinasi gerak.
Protein merupakan komponen utama dalam otot. Kontraksi otot
berlangsung akibat pergeseran dua jenis filamen protein.
4. Penunjang mekanis.
Ketegangan kulit dan tulang disebabkan oleh kolagen yang merupakan
protein fibrosa.
5. Protein imun.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal
serta berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel
yang berasal dari organisme lain.
6. Membangkitkan dan menghantar impuls saraf.
Respons sel saraf terhadap rangsang spesifik diperantai oleh protein
reseptor.
7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi.
Pengaturan urutan ekspresi informasi genetik sangat penting bagi
pertumbuhan yang beraturan serta diferensiasisel.
2.3.3 Pengukuran Kadar Protein
Adapun metode yang dilakukan untuk penetapan kadar protein pada
penelitian ini yaitu dengan metode Lowry.
Metode Lowry dikembangkan pada tahun 1951 dengan menggunakan
reagen pendeteksi Folin-ciocalteu. Reagen ini biasa digunakan untuk
mendeteksi gugus-gugus fenolik. Dalam keadaan basa, ion tembaga divalen
(Cu2+
) dengan ikatan peptida yang mereduksi Cu2+
menjadi tembaga
monovalen (Cu+) (Bintang, 2010). Dalam analisa protein reagen Folin-
Ciocalteu dapat mendeteksi residu oksidasi dimana gugus fenolik tirosin
akan mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat yang terdapat pada reagen
tersebut menjadi tungsten dan molibden yang berwarna biru. Hasil reduksi
ini dapat dianalisa lebih lanjut dengan melihat puncak absorpsi yang lebar
pada daerah panjang gelombang sinar tampak (600-800nm).
Kadar protein dapat ditentukan dengan membaca kurva standar, dibuat
dengan larutan protein murni yang telah diketahui kadar proteinnya
misalnya BSA (Bouvine Serum Albumin) yang memiliki rentang konsentrasi
tertentu dimana konsentrasi sampel protein berada didalam rentang tersebut
dengan konsentrasi yang semakin menaik (Slamet Sudarmadji et al., 1981).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.3.4 Analisis Profil Protein dengan Elektroforesis Gel Poliakrilamid SDS
(Sodium Dodesil Sulfat)
Pemisahan protein merupakan tahap yang harus dilakukan untuk
mempelajari sifat dan fungsi protein. Protein dapat dipisahkan dari protein
jenis lain atau dari molekul lain berdasarkan ukuran, kelarutan, muatan, dan
afinitas ikatan (Nelson, 2004). Salah satu teknis yang digunakan untuk
melihat profil protein dan menentukan bobot molekulnya menggunakan
SDS-PAGE (Stryer, 1995).
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular
berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan
pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui satu medium, misalnya
gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada
nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk
molekulnya (Yuwono, 2005).
Elektroforesis pada umumnya digunakan untuk menentukan berat
molekul (BM), mendeteksi kemurnian dan kerusakan protein atau asam
nukleat, menetapkan titik isoelektrik, serta memisahkan spesies-spesies
yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif (Bintang, 2010).
Kegunaan elektroforesis antara lain, (1) menentukan berat molekul (2)
dapat mendeteksi terjadinya pemalsuan bahan, (3) dapat mendeteksi
terjadinya kerusakan bahan seperti protein dalam pengolahan dan
penyimpanan, (4) untuk memisahkan spesies molekul yang berbeda secara
kualitatif maupun kuantitatif, yang selanjutnya masing-masing spesies dapat
dianalisis, (5) menetapkan titik isoelektrik protein (Yuwono, 2005).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.3.5. SDS PAGE (Sodium Dedosil Sulfat Poliakrilamid Gel Elektroforesis).
Salah satu jenis elektroforesis yang digunakan secara luas pada saat
ini adalah elektroforesis SDS gel poliakrilamida (SDS PAGE).
Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk
memisahkan protein dalam sampel berdasarkan berat molekul. Prinsip dasar
SDS-PAGE ini adalah denaturasi protein oleh sodium dedosil sulfat yang
dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat molekulnya
dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel, dalam hal ini yang
digunakan adalah poliakrilamid (Janson et al., 1998).
SDS-PAGE dilakukan pada pH netral. Pada metode ini digunakan
SDS dan beta-merkaptoetanol. SDS merupakan anionic detergent yang
bersama dengan beta-merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan
rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi konfigurasi random coil. Hal
ini disebabkan oleh terpecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi
menjadi gugus-gugus sulfihidril. (Janson et al., 1998).
Gambar 2.2 Prinsip Kerja SDS PAGE (Sobti, et al 2008 dan Stryer, 2002)
((1) Denaturasi sampel dengan sodium dedocyl sulfate (SDS) menyelubungi
protein. (2) Penempatan protein sampel pada gel kemudian dialiri listrik.
(3) Pewarnaan untuk visualisasi pemisahan pita).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4 Asam Amino
Asam amino merupakan unit dasar struktur protein. Suatu asam amino
α terdiri dari gugus amino, gugus karboksil, atom H dan gugus R tertentu,
yang semuanya terikat pada atom karbon α. Atom karbon ini disebut α
karena bersebelahan dengan gugus karboksil (asam). Gugus R menyatakan
rantai samping (Stryer, 2000).
Rumus umum asam amino:
Gambar 2.3 Struktur Asam Amino (Sumardjo, 2009)
Berdasarkan polaritas gugus R, asam amino dibedakan menjadi 4
golongan yaitu (1) asam amino dengan gugus-R yang bersifat non polar,
seperti alanin, leusin, isoleusin, valin, prolin, fenilalanin, triftopan, dan
metionin, (2) asam amino dengan gugus –R polar tidak bermuatan, seperti
serin, treonin, tirosin, aspargin, glutamin, sistein dan glisin, (3) asam amino
dengan gugus –R bermuatan positif, seperti lisin, arginin, histidin, dan (4)
asam amino dengan gugus –R bermuatan negatif, seperti asam aspartat dan
asam glutamat (Bodanszky, 1993 ; Sumarno et al., 2002).
2.4.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
KCKT secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah
kromatografi yang dikembangkan menggunakan cairan sebagai fase gerak
baik cairan polar maupun cairan non polar, dan bekerja pada tekanan tinggi
(Adnan 1997). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu
cara pemisahan komponen dari suatu campuran berdasarkan perbedaan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
distribusi/absorbsi/adsorbsi komponen di antara dua fase yang berbeda,
yaitu fase diam (stasioner) dan fase gerak (mobil) (Salamah, 1997).
Pelarut yang biasanya digunakan pada KCKT adalah air, metanol,
asetonitril, kloroform, dan pelarut lainnya yang berada dalam keadaan murni
(HPLC grade). Pelarut-pelarut tersebut sebelum digunakan harus disaring
terlebih dahulu dengan kertas saring milipore (0,45 mm) dan harus
dihilangkan gasnya (degassing) (Salamah, 1997). Komponen utama alat
yang dipakai dalam KCKT antara lain (1) reservoir zat pelarut untuk fase
mobil; (2) pompa; (3) injektor; (4) kolom; (5) detektor dan (6) rekorder
(Adnan, 1997). Jantung dari peralatan KCKT adalah kolom dimana terdapat
fase diam dan terjadi pemisahan komponen antara fase diam dan fase
bergerak yang dialirkan dengan bantuan pompa (Salamah, 1997). Alur
proses penggunaan KCKT dapat dilihat pada Gambar :
Gambar 2.4 Alur proses penggunaan HPLC (Husgen dan Schuster, 2001)
Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi asam
amino atau kandungan protein dan peptida. Sebelum dilakukan analisis
asam amino dengan kromatografi terlebih dahulu dilakukan hidrolisis yang
bertujuan untuk memutuskan ikatan peptidanya dengan hidrolisis asam dan
basa yang kuat atau dengan menggunakan enzim spesifik untuk
mendapatkan asam amino. Pada hidrolisis asam unsur yang dasar yang
diperlukan adalah HCl 6 M, suhu 1100C dan waktu 24 jam. Reaksinya
biasanya dilakukan di tabung kaca yang ditutup rapat, yang sebelumnya
telah dikeluarkan gasnya. Sementara itu, pada hidrolisis basa, ikatan amida
dapat diputus dengan perlakuan terhadap peptida menggunakan NaOH 2M
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pada suhu 1000C. Hidrolisis basa menghasilkan destruksi arginin, sistein,
serin, dan treonin (Bailey, 1990). Dengan hidrolisis asam, triptofan tidak
stabil dalam lingkungan asam, sehingga rusak dalam hidrolisis asam dan
sedikit kerusakan juga terjadi pada serin dan treonin, sedangkan asparagin
dan glutamin akan terhidrolisa sempurna menjadi asam aspartat dan asam
glutamat dengan membebaskan ion amonium (Linder, 1992 ; Sumarno et
al., 2002). Selain itu, ada pula hidrolisis enzim. Peristiwa ini terjadi didalam
tubuh. Untuk menghancurkan makanan, perut memiliki enzim dengan kadar
tertentu yang dapat dikatalisi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal
sebagai peptidase. Amino peptidase bekerja cepat dan efisien dalam
hidrolisis ikatan peptida sekaligus memotong suatu residu asam amino
mulai dari ujung N (Bailey, 1990). Pemisahan yang umum dilakukan adalah
dengan cara kromatografi. Di antara teknik kromatografi yang dapat
dilakukan dengan pemisahan, yaitu kromatografi penukar ion, kromatografi
kertas, dan kromatografi cair kinerja tinggi. Selain itu, pemisahan asam
amino dapat pula dilakukan dengan elektroforesis kertas (Bailey, 1990).
Kromatografi penukar ion sangat efisien dalam memisahkan
campuran asam amino dengan menggunakan kolom penukar ion secara
paralel dengan metode deteksi ninhidrin yang hasilnya reprodusibel
sehingga teknik ini sangat banyak digunakan dalam pemisahan dan analisis
campuran asam amino. Kromatografi kertas digunakan dalam pemisahan
asam amino berdasarkan fakta bahwa gugus selulosa kertas memiliki
afinitas kuat terhadap molekul air, yang terbentuk oleh ikatan hidrogen
dengan gugus OH pada rantai polisakarida. Jika asam amino tidak dapat
dipisahkan dengan sempurna dengan kromatografi kertas sederhana, maka
kromatogram dua dimensi dapat dicoba (Bailey, 1990). KCKT tidak umum
digunakan pada pemisahan asam amino (Bailey, 1990). Banyak senyawa
yang sukar dideteksi oleh detektor KCKT. Salah satu upaya yang dilakukan
untuk mengatasi hal tersebut adalah dengan melakukan proses derivatisasi.
Derivatisasi dalam KCKT bertujuan untuk mengubah analit menjadi bentuk
yang dapat terdeteksi oleh sistem detektor yang digunakan. Proses
derivatisasi dapat dilakukan sebelum sampel diinjeksikan (pre colomn
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
derivatization), atau sesudah pemisahan dari kolom (post colomn
derivatization) (Adnan, 1997).
Metode analisis asam amino dengan KCKT memiliki beberapa
keuntungan diantaranya dapat bekerja lebih cepat sehingga waktu yang
dibutuhkan singkat serta KCKT mampu memisahkan senyawa yang sangat
serupa dengan resolusi yang baik (Adnan, 1997). Kelemahan dari metode
ini adalah sulitya mendeteksi yang kita inginkan jika sampel yang
digunakan memiliki banyak pengotor. Selain itu, kebersihan kolom KCKT
harus dijaga, karena kolom yang kotor tidak akan mampu mendeteksi
senyawa yang akan dianalisa (Husgen dan Schueter, 2001).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3. 1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan dilaboratorium Jurusan Farmasi UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta, Laboratorium Mikrobiologi Pusat Laboratorium
Terpadu Kampus UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium PT.
Saraswanti Indo Genetech, waktu penelitian ini berlangsung dari bulan
Januari sampai Agustus 2013.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer
UV-VIS (ParkinElmer Lambda 25), pH meter, 1 set alat elektroforesis (Bio-
Rad), mikropipet beserta tipnya, erlenmeyer, labu ukur, sentrifuge beserta
tabungnya, peralatan gelas, pinset, spatula, syringe, tabung reaksi, tabung
ulir, batang pengaduk, vial, oven, timbangan analitik (Wiggen Hauser),
pipet volumetrik, vortex, pipet tetes, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi,
Laminar Air Flow (LAF), 1 set perangkat KCKT (Waters tipe Breeze).
3.2.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ampas biji
jinten hitam (diperoleh dari PT. Lantabura Internasional, Depok, berasal dari
negara Ethiopia), aquabidest, dinatrium hidrogen fosfat, natrium klorida,
natriumm dihidrogen posfat, Bovin Serum Albumin (BSA), natrium
karbonat, natrium hidroksida, CuSO4.H2O, Na.K-tartrat, pereaksi folin
ciocalteu, standar berat molekul protein (Bio-Rad Prestained SDS-PAGE
Standars, Broad Range (10 kDa-250 kDa), commasie brilliant blue, larutan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
30% akrilamid, 0,8% bisakrilamid, buffer Tris-HCL 1,5 M pH 8,8, buffer
Tris-HCL 0,5 M pH 6,8, larutan 10% ammonium persulfat, larutan 10%
(w/v) SDS, TEMED (tetramethylethylenediamine), sample buffer, buffer
elektroforesis, metanol, AccQ•Tag Reagen Kit dari Waters (Milford,
Massachusetts, USA). Reagen kit terdiri dari Waters AccQ-Tag. Fluor
Borate Buffer, Waters AccQ•Tag Fluor Reagen serbuk (6-aminoquinolil-N-
hidroksi-succinimidil karbamat–AQC), Waters AccQ•Tag Fluor Reagen
Diluent, dan Hidrolisat Asam Amino Standar dari Waters (tiap ampul
mengandung 2.5 mM campuran hidrolisat asam amino yaitu asam aspartat
(Asp), serin (Ser), asam glutamat (Glu), glisin (Gly), histidin (His), arginin
(Arg), treonin (Thr), alanin (Ala), prolin (Pro), tirosin (Tyr), valin (Val),
metionin (Met), lisin (Lys), isoleusin (Ile), leusin (Leu), fenilalanin (Phe),
triptofan, kecuali sistein (Cys) 1.25 mM, asetonitril grade HPLC,
aquabidest.
3.3 Prosedur Penelitian.
3.3.1 Perolehan Simplisia
Bahan yang digunakan adalah ampas biji jinten hitam (Nigella sativa
Linn.) yang diperoleh dari lempeng biji yang dihaluskan. Pembuatan ampas
dilakukan dengan menghaluskan lempeng menggunakan blender hingga
diperoleh serbuk berukuran 40 mesh
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Protein (Afrozul Haq et al., 1995)
10 gram serbuk ampas biji jinten hitam di tambahkan 100 ml PBS
(Phosphate Buffer Saline) pH 7,2 dan disentrifugasi pada 10.000 rpm
selama 30 menit pada suhu 40C. Kemudian supernatan dikumpulkan sebagai
ekstrak larut dengan membuang lapisan berminyak dan pelet yang tidak
larut.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.3 Pengukuran Kadar Protein dilakukan dengan Metode Lowry
Pengukuran kandungan protein ekstrak ampas biji jinten hitam
(Nigella sativa Linn.) dilakukan di Laboratorium Terpadu UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
a. Pembuatan Spektrum
Kuvet diisi dengan salah satu larutan protein standar dengan
konsentrasi 200 ppm. Larutan blanko disiapkan dengan menggunakan
aquades. Absorban larutan dibaca pada kisaran panjang gelombang 400-800
nm dengan interval 5 mm. Pada setiap interval panjang gelombang diukur
dengan larutan standar dan blanko. Dibuat kurva hubungan panjang
gelombang dengan absorbans standar terkoreksi. Panjang gelombang yang
tepat untuk larutan tersebut kemudian ditentukan dan digunakan untuk
pengukuran selanjutnya.
b. Pembuatan kurva kalibrasi
Dibuat larutan stok BSA konsentrasi 1000 ppm dengan menimbang
serbuk BSA sebanyak 50 mg kemudian dilarutkan dengan aquades sebanyak
50 ml. Kemudian dilakukan pengenceran dengan seri konsentrai 0, 40, 80,
120, 160, 200 ppm.
Sebanyak 1000 µl larutan protein standar BSA dengan seri
pengenceran konsentrasi (0, 40, 80, 120, 160, 200 ppm). Larutan standar
dimasukkan kedalam tabung. Campuran 50:1 (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1
N dan larutan CuSO4 0,5% dalam larutan Na.K tartrat 1%) disiapkan.
Kemudian campuran tersebut ditambahkan sebanyak 5 ml ke dalam larutan
standar dan dibiarkan selama 10 menit, lalu ditambahkan 0,5 ml pereaksi
folin-ciocalteau, kocok dan dibiarkan selama 30 menit. Absorbannya di ukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 737,5 nm.
c. Pengukuran kadar protein ekstrak ampas biji jinten hitam
Sebanyak 20 µl ekstrak ampas biji jinten hitam diencerkan sampai
1000 µl (pengenceran 50 kali). Sampel dimasukkan kedalam tabung.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Campuran 50:1 larutan (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N dan larutan CuSO4
0,5% dalam larutan Na.K tartrat 1%) disiapkan. Kemudian campuran
tersebut ditambahkan sebanyak 5 ml ke dalam larutan sampel dan dibiarkan
selama 10 menit, lalu ditambahkan 0,5 ml pereaksi folin-ciocalteau, kocok
dan dibiarkan selama 30 menit. Absorbannya di ukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 737,5 nm.
3.3.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam
Analisis profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa
Linn.) dilakukan di Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Pada penelitian ini, profil protein dianalisis dengan menggunakan
Sodium dodecyl sulphate polyacrilamyde gel electrophoresis (SDS-PAGE)
berdasarkan metode Laemmli dalam Coligan et al (1995) dengan sistem
buffer Laemmli dan konsentrasi gel poliakrilamid yang digunakan adalah
12%. Gel poliakrilamid dicetak diantara dua buah lempengan kaca. larutan
separating gel yang telah dibuat, disiapkan dimasukkan ke dalam cetakan
gel dengan menggunakan mikro pipet sampai batas tertentu, kemudian
ditambahkan dengan aquades sampai penuh agar permukaan gel rata.
Setelah gel mengering, aquades dibuang dan sisa air pada cetakan gel
diserap dengan kertas saring. Kemudian larutan stacking gel yang telah
dibuat dimasukkan ke dalam cetakan dan permukaan gel dipasang sisir
berlubang lalu didiamkan sampai mengeras. Setelah gel mengeras, cetakan
gel dipindahkan ke perangkat elektroforesis.
Preparasi sampel dilakukan dengan memasukkan ekstrak ampas biji
jinten hitam yang telah disiapkan sebelumnya ke dalam tabung eppendorf
dan ditambahkan masing-masing sampel buffer dengan perbandingan 1:1
dan 2:1. Kedua tabung dipanaskan pada suhu 1000C selama 5 menit.
Elektroforesis dilakukan dengan cara campuran ekstrak ampas biji
jinten hitam dengan sampel buffer dimasukkan ke dalam sumur yang telah
dicetak pada gel poliakrilamid sebanyak 10 μl, kemudian alat elektroforesis
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dihubungkan ke power supply dengan tegangan 200 V selama 55 menit
sampai pewarna mencapai ujung gel.
Visualisasi gel menggunakan coomassie briliant blue selama semalam
dan digoyangkan dengan alat penggoyang shaker. Selanjutnya, gel dicuci
sebanyak dua kali dengan menggunakan larutan destaining masing-masing
selama 15 menit. Setelah pita terlihat, gel dicuci dengan aquades.
Identifikasi dan analisis SDS PAGE membandingkan antara pita
protein yang telah dipisahkan sebelumnya dengan protein standar. Bobot
molekul dari masing-masing protein ditentukan dengan cara menghitung
nilai Rf dari masing-masing pita protein yang tampak. Kemudian dibuat
kurva standar hubungan antara log BM dengan Rf dari protein standar
sehingga nilai BM protein sampel dapat dihitung.
3.3.5 Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam
Analisis asam amino dilakukan di Laboratorium PT. Saraswanti Indo
Genetech Bogor.
Sebelum dianalisis, preparasi sampel dilakukan dengan cara:
sebanyak 0,1 - 0,5 gram ekstrak ampas biji jinten hitam ditimbang lalu
ditambahkan 5 mL HCl 6 N, vortex kemudian ditambahkan gas nitrogen
dan dihidrolisis pada suhu 1100
selama 22 jam. Hidrolisat yang diperoleh
didinginkan pada suhu kamar, lalu dipindahkan ke labu ukur 100 ml,
kemudian ditambahkan aquabidest sampai tanda batas. Lalu disaring dengan
filter 0,45µm. Pipet 500 µl filtrat lalu tambahkan 40 µL AABA ± 460 µl
aquabidest. Pipet 10 µl larutan kemudian tambahkan 70 µl AccQ-Fluor
Borate, vortex. Tambahkan 20 µl reagen fluor A, vortex, diamkan 1 menit.
Inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C, lalu suntikan pada HPLC.
Dengan kondisi kromatografi menggunakan kolom C18, temperatur 370C,
fase gerak asetonitril 60%, detektor fluorescence, laju alir 1 ml/menit dan
volume penyuntikan 5µl.
Konsentrasi asam amino dapat dihitung sebagai berikut:
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
AA (mg/100 gram) =
(
)
Keterangan:
Area komponen sampel = area asam amino sampel
Cstd = Konsentrasi standar (
BM = Berat Molekul
FP = Faktor pengenceran sampel
Area komponen satndar = Area asam amino standar
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Determinasi Biji Jinten Hitam
Sampel biji jinten hitam yang diperoleh dari PT. Lantabura
International, Depok, Jawa Barat, dideterminasi di Herbarium Bogoriense,
Puslit Biologi Bidang Botani LIPI Cibinong, Bogor, Jawa Barat,
menunjukkan bahwa jenis sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah
benar biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) dengan family (suku)
Ranunculaceae. Tujuan dilakukan determinasi adalah untuk
mengidentifikasi simplia. Hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 5.
4.2 Ekstraksi Protein Ampas Biji Jinten Hitam
Ampas biji jinten hitam memiliki ukuran partikel 40 mesh, bau
aromatik, rasa pedas dan pahit. Proses ekstraksi yang dilakukan terhadap
ampas biji jinten hitam menggunakan pelarut PBS (Phosphate Buffer
Saline) pH 7,2 kemudian disentrifuge pada kecepatan 10.000 rpm, pada
suhu 40C selama 30 menit. Menurut Janson dan Ryden (1998) masalah
utama dalam hal ekstraksi protein adalah dapat mengeluarkan protein dari
dalam sel tanpa terdegradasi atau terdenaturasi dan tidak kontaminasi
sehingga hal tersebut dapat diatasi dengan pemilihan medium ekstraksi yang
tepat, waktu persiapan cepat dan pada kondisi temperatur yang rendah.
Adapun sentrifuge digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan berat
molekul. Ekstraksi dilakukan menggunakan PBS (Phosphate Buffer Saline)
pH 7,2 karena buffer ekstraksi yang ideal untuk target protein biasanya
antara pH 7,0 dan pH 8,5 hal ini bertujuan untuk membantu kestabilan
target protein atau menghalangi dari aktivitas protein yang tidak
dikehendaki (Bonner, 2007).
Dari hasil ekstraksi sebanyak 10 gram serbuk ampas biji jinten hitam
diperoleh ekstrak cair 14,01 gram sehingga diperoleh rendemen ekstrak
sebesar 140,1 %.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pengujian parameter spesifik meliputi identitas ekstrak dan
organoleptik ekstrak.
Tabel 4.1 Hasil Pengujian Identitas Ekstrak dan Organoleptik.
Parameter Hasil
Identitas :
Nama ekstrak
Nama lain tumbuhan
Bagian tanaman
Nama Indonesia tumbuhan
Ekstrak ampas biji jinten hitam
Jinten ireng, jinten item
Biji
Jinten hitam
Organoleptis:
Warna
Bau
Rasa
Bentuk
Kuning kecoklatan
Tidak berbau
Pedas dan sedikit pahit
Ekstrak cair
Pengujian parameter spesifik meliputi identitas ekstrak dan
organoleptik. Tujuan dilakukan identitas ekstrak adalah memberikan
identitas obyektif dari nama dan spesifik dari senyawa, sedangkan
organoleptik ekstrak bertujuan sebagai pengenalan awal menggunakan
pancaindera dengan mendeskripsikan bentuk, warna, bau dan rasa (Depkes
RI, 2000).
4.3 Hasil Pengukuran Kandungan Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten
Hitam dengan Metode Lowry
Pengukuran kandungan protein yang terdapat dalam ekstrak ampas
biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) ditentukan dengan menggunakan
metode Lowry. Penentuan kadar protein dengan metode ini didasarkan atas
dua reaksi yang berbeda. Reaksi pertama adalah pembentukan tembaga
monovalen (Cu+). Dalam keadaan basa yang dibentuk oleh larutan Na2CO3
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dalam NaOH, ion tembaga divalen (Cu2+
) membentuk suatu kompleks
dengan ikatan peptida yang mereduksi Cu2+
menjadi tembaga monovalen
(Cu+) (Gornall et al., 1949 dan Coligan et al., 2007). Reaksi yang kedua
adalah reaksi reduksi oleh reagen folin-Ciocalteu (fosfomolibdat dan
fosfotungstat). Ion Cu+
dan gugus radikal dari tirosin dan triftopan bereaksi
dengan pereaksi folin untuk menghasilkan suatu produk yang tidak stabil
yang mereduksi molibdenum atau tungsten blue. Protein akan bereaksi
dengan pereaksi folin-ciocalteu membentuk senyawa kompleks yang
memberikan warna biru (Coligan et al., 2007). Warna yang diperoleh
diukur absorbannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang maksimum antara 400-800 nm. Adapun saat penelitian, panjang
gelombang serapan maksimum hasil optimasi yang digunakan adalah 737,5
nm (Lampiran 6). Pembanding yang digunakan adalah BSA (bovine serum
albumin) dengan seri konsentrasi 0, 40, 80, 120, 160 dan 200 ppm.
Tabel 4.2. Nilai Serapan Spektrofotometri UV-Vis Seri Konsentrasi
Larutan BSA (sebagai standar).
Konsentrasi BSA
(µg/ml)
Serapan (λ= 737,5
nm)
0 0,0003
40 0,0234
80 0,0821
120 0,1373
160 0,2006
200 0,2391
Tujuan dari pembuatan larutan standar dengan berbagai seri
konsentrasi adalah untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel
dengan menggunakan persamaan regresi linear garis lurus yang diperoleh
dari grafik larutan standar.
Dari 6 tabung BSA dengan satu tabung sebagai blanko, diperoleh
angka-angka absorbansi yang menjadi sumbu y dan konsentrasi BSA
sebagai sumbu x.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.1. Kurva dan Persamaan Kalibrasi Konsentrasi terhadap Serapan
Larutan BSA
Dari gambar diatas, kurva menunjukkan slop positif dengan gradien
garis mendekati 1 (0,994). Dengan regresi linear, diperoleh pula nilai a = -
1,343 x 10-2
dan b = 1,272 x 10-3
. Sehingga, untuk persamaan garis y = bx +
a diperoleh persamaan y = 1,272 x 10-3
- 1,343 x 10-2
.
Berdasarkan persamaan dan kurva kalibrasi, kandungan protein dari
ekstrak cair protein ampas biji jinten hitam yang di uji secara duplo dan
diambil nilai rata-ratanya, yaitu 8,5848 mg/ml atau 0,0923% terhadap
ekstrak cair atau 0,8 % terhadap serbuk ampas.
y = 0,001x - 0,013 r = 0,994
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 50 100 150 200 250
Sera
pan
µg/ml
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.3. Hasil Pengujian Kandungan Protein Ekstrak Ampas Biji
Jinten Hitam Nigella sativa Linn dengan Metode Lowry.
Jumlah
Sampel
Serapan (y)
Persamaan
Kalibrasi
Kandungan
Protein(µg/ml)
(x)
Kandungan
Protein
(µg/ml) (x
Faktor
Pengenceran)
20 µl 0,204 0,001272 x -
0,0134
170,91 µg/ml 8.545,6 µg/ml
0,206 0,001272 x -
0,0134
172,48 µg/ml 8.624 µg/ml
Nilai rata-rata
8.584,8µg/ml
atau
8,5848 mg/ml
Merujuk pada hasil kandungan protein ampas biji jinten hitam
sebelumnya yang dilakukan oleh PT. Sucofindo, Bekasi (2011) dengan
metode analisis yang digunakan adalah metode Kjehdal diperoleh
kandungan protein ampas biji jinten hitam sebesar 21,58% sedangkan dalam
penelitian ini dihasilkan kandungan protein terhadap ekstrak ampas biji
jinten hitam dengan menggunakan metode Lowry sebesar 8,5848 mg/ml
atau 0,0923%. Hal ini dikarenakan dalam metode Lowry didasarkan pada
reaksi pembentukan warna yang disebabkan adanya reaksi aatara basa
tembaga dengan kandungan residu triftopan, tirosin dan sistein dalam
ekstrak ampas biji jinten hitam. Kekuatan warna biru yang terbentuk
tergantung pada kandungan residu triftopan, tirosin dan sistein dalam
sampel protein yang diuji (Bintang, 2010). Adapun dalam penelitian ini,
warna biru yang dihasilkan oleh ekstrak ampas biji jinten hitam adalah
warna biru muda (lampiran 8, Gambar 7). Sedangkan dalam metode
Kjehdal, mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat
menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn kemudian
amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Adapun kelemahan dalam metode Kjehdal bahwa purin, pirimidin, vitamin-
vitamin, asam amino besar, kreatin serta kreatinin ikut teranalis dan terukur
sebagai nitrogen protein (Bintang, 2010).
4.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan SDS-
PAGE
Analisis profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam ini dilakukan
dengan teknik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sebagai
medium pemisahan. Pada sistem ini, gel yang digunakan terdiri dari dua
jenis gel berbeda, yaitu separating gel (gel pemisah) dan stacking gel (gel
penumpuk). Pemisahan protein dengan elektroforesis gel poliakrilamid
berdasarkan pada perbedaan muatan dan ukuran molekul dapat dilakukan
dengan menambahkan detergen ionik dan menambahkan tahap denaturasi
(Kurniati dan Wanadi, 2001). Pada proses persiapan sampel, sampel
ditambahkan dengan suatu detergen anionik seperti sodium dodesil sulfat
(SDS). Sebelum elektroforesis, sampel yang akan dipisahkan dilarutkan
terlebih dahulu dalam suatu dapar yang mengandung Tris-HCl, SDS,
gliserol, bromfenol biru dan merkaptoetanol.
Tujuan penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan
pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi dari ptotein, terutama ikatan
disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS juga
membungkus rantai protein yang terikat dengan muatan negatif yang sama
membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS-protein memiliki
densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan
ukuran protein (Wijaya dan Rohman 2005; Fatmawati et al., 2009). Oleh
karena itu, kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyai mobilitas
yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks SDS-protein yang lebih
kecil (Fatmawati et al., 2009).
Adapun dalam penelitian, elektroforesis diatur dengan tegangan 200 v
konstan dengan arus sebesar 30 mA. Pengaturan ini dapat dimodifikasi oleh
siapa pun yang melakukan sesuai dengan keperluan dan pengalaman
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
percobaan. Pengaturan tercatat tersebut dipilih karena telah memberikan
hasil yang paling baik di antara percobaan-percobaan yang telah dilakukan.
Elektroforesis dilakukan sampai pewarna mencapai bagian dasar gel. Waktu
yang diperlukan adalah 55 menit.
Elektroforesis dilakukan terhadap sampel berupa ekstrak ampas biji
jinten hitam hasil ekstraksi dengan menggunakan PBS (phosphate buffer
saline) pH 7,2 dan menggunakan standar berat molekul pembanding
(marker protein) Prestained SDS-PAGE Standars Broad Range dari Bio-
Rad. Hasil SDS - PAGE berdasarkan perhitungan berat molekul sesuai
dengan kurva standar protein (Lampiran 10.2), menunjukkan bahwa terdapat
beberapa protein yang tampak. Marker protein yang digunakan adalah
miosin 250 kDa, Β-galaktosidase 150 kDa, BSA 75 kDa, Ovalbumin 50
kDa dan soybin tripsin inhibitor 25 kDa. Kurva standar yang dihasilkan dari
marker protein ini memiliki persamaan linier Y = -1,469 X + 2,352; R =
0,971; r = 0,985. Dengan Y adalah log bobot molekul (BM) dan X adalah Rf
(nisbah antara migrasi pita protein sampel dengan migrasi pita protein
marker).
Hasil SDS-PAGE, berdasarkan perhitungan berat molekul sesuai
dengan kurva standar protein, menunjukkan terdapat beberapa pita protein
yang tampak. Adapun pita protein yang tampak pada sampel supernatan
hasil ekstraksi dengan menggunakan PBS (phosphate buffer saline) pH 7,2
dengan perbandingan sampel yang digunakan 1:1 dan 2:1. Pada
perbandingan 2:1 tampak pita protein yang dihasilkan memberikan warna
yang lebih jelas dibandingkan dengan pita protein dari perbandingan 1:1
karena volume pemipetan yang diberikan besar yaitu 20 µl maka jumlah
proteinnya pun menjadi lebih besar. Pita protein yang tampak pada
perbandingan 2:1 yaitu 67,4839 kDa - 8,0872 kDa.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1 2 3 4 5
Gambar 4.2. Hasil Analisis SDS-PAGE pada Ekstrak Ampas Biji
Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.).
Keterangan gambar :
No. 1 = Marker Prestained SDS-PAGE standars Broad Range
No. 2 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 1:1
No. 3 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 1:1
No. 4 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 2:1
No. 5 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 2:1
4.5 Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan KCKT
Asam amino esensial sangat dibutuhkan oleh manusia karena tidak
dapat disintetis sendiri oleh tubuh. Semakin lengkap dan tinggi kandungan
gizi asam amino dalam biji maka nilai gizi semakin baik dan diharapkan
dapat menyamai protein hewani (Richana, 2000) .
Analisis asam amino dilakukan untuk menduga jenis dan kadar asam
amino yang terdapat pada ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa
250 kDa
150 kDa
75 kDa
50 kDa
25
kDa
67,4839
47,8410
38,0365
33,9156
30,2413
28,5496
25,4566
20,2396
19,1161
16,0916
15,1985
12,0837
10,7746
10,1718
8,0872
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Linn.). Analisis asam amino diawali dengan hidrolisis. Pada tahap ini,
hidrolisis rantai polipeptida yang sempurna dilakukan dengan HCl 6 N pada
suhu 1100C selama 22 jam. Hidrolisis dilakukan dengan HCl karena HCl
dapat memecah ikatan peptida secara sempurna dan dapat dengan mudah
hilang dari hidrolisat dengan adanya pengupan (Masuda dan Dohmae,
2011). Setelah larutan di hirdolisis, hidrolisat yang diperoleh kemudian
didinginkan pada suhu kamar dan ditera volume nya dengan aquabidest.
Setelah itu larutan disaring. Sampel asam amino ditambahkan dengan
AABA (Alpha amino butyric acid) sebagai internal standar dan digenapkan
volumenya dengan aquabidest. Penambahan larutan standar internal
digunakan untuk mengoreksi hilangnya residu asam amino selama proses
hidrolisis karena aliran atau penghancuran.
Sampel mulai di derivatisasi dengan reagen AQC (6-aminoquinolyl-N-
hidroxysucsinimidil carbamate) yang sering dilakukan secara prakolom di
ikuti oleh pemisahan fase terbalik KCKT dengan menggunakan detektor
fluoresensi. Penderivat AQC ini merupakan penderivat yang paling stabil
jika dibandingkan dengan agen penderivat yang lainnya. Agen penderivat
AQC dapat bereaksi dengan asam amino primer dan asam amino sekunder
dan menghasilkan derivat fluoresen dengan eksitasi 250 nm dan emisi 395
nm (Bosch et al., 2006 ; Eriksson et al., 2009). Kelebihan reagen AQC
dapat bereaksi dengan air dan membentuk 6-aminoquinolin (AMQ), N
hidroksi succsinimidi (NHS) dan karbondioksida (CO2) (Salazar et al,
2012). AMQ bereaksi sangat lambat dengan reagen AQC berlebih
membentuk bis aminoquinolin urea. Produk-produk samping tidak
mengganggu identifikasi dan kuantifikasi dari salah satu asam amino.
Pengujian asam amino pada ekstrak ampas biji jinten hitam
menghasilkan hampir semua jenis asam amino esensial dan non esensial,
kecuali triptofan. Triptofan tidak stabil dalam lingkungan asam, sehingga
rusak dalam hidrolisis asam. Dengan hidrolisis asam ini serin dan treonin
akan mengalami kerusakan sebagian, sedangkan asparagin dan glutamin
akan terhidrolisa sempurna menjadi asam aspartat dan asam glutamat
dengan membebaskan ion amonium (Linder, 1992 ; Sumarno et al., 2002).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Analisis asam amino dengan metode KCKT menunjukkan data
kandungan asam amino ekstrak ampas biji jinten hitam Nigella sativa Linn
sebagaimana pada tabel 4.2.
Tabel 4.4. Hasil Analisis Kandungan (% b/b) Asam Amino dalam
Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam Nigella sativa Linn.
Dari tabel diatas, hasil analisis asam amino dari ampas biji jinten
hitam dengan menggunakan KCKT, menunjukkan bahwa ekstrak ampas biji
jinten hitam mengandung 16 asam amino dengan kandungan total 1,055%.
Diantaranya 9 asam amino esensial, yaitu histidin 0,015%, arginin 0,035%,
treonin 0,021%, valin 0,032%, metionin 0,001%, lisin 0,182%, isoleusin
0,020%, leusin 0,030%, fenilalanin 0,013%; serta 7 asam amino non
esensial, yaitu aspartat 0,058%, serin 0,064%, glutamat 0,071%, glisin
0,053%, alanin 0,219%, prolin 0,148%, dan tirosin 0,005%.
Kandungan asam amino esensial yang tertinggi pada ampas biji jinten
hitam adalah lisin dengan nilai 0,182%. Lisin merupakan asam amino degan
No
Asam Amino
Kandungan Asam Amino (perlakuan duplo)
(%)
1 2 Rata-rata
1 Aspartat 0,060 0,055 0,058
2 Serin 0,061 0,067 0,064
3 Glutamat 0,084 0,057 0,071
4 Glisin 0,063 0,043 0,053
5 Histidin 0,016 0,013 0,015
6 Arginin 0,043 0,027 0,035
7 Treonin 0,018 0,025 0,021
8 Alanin 0,330 0,108 0,219
9 Prolin 0,084 0,213 0,148
10 Sistin 0,058 0,118 0,088
11 Tirosin 0,006 0,004 0,005
12 Valin 0,036 0,029 0,032
13 Metionin 0,001 0,001 0,001
14 Lisin 0,154 0,209 0,182
15 Isoleusin 0,021 0,019 0,020
16 Leusin 0,028 0,031 0,030
17 Fenilalnin 0,009 0,017 0,013
Total 1,070 1,037 1,055
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gugus R polar yang digunakan sebagai bahan dasar antibodi darah,
memperkuat sistem sirkulasi, mempertahankan pertumbuhan sel-sel normal
bersama prolin dan vitamin C akan membentuk jaringan kolagen,
menurunkan kadar trigliserida darah yang berlebih (Harli, 2008). Sedangkan
kandungan asam amino non esensial yang tertinggi adalah alanin dengan
kandungan 0,219%. Alanin merupakan asam amino dengan gugus R
nonpolar yang digunakan sebagai prekursor glukogenik dan pembawa
nitrogen dari jaringan permukaan untuk ekskresi nitrogen (Linder, 1992).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Dari hasil penentuan kadar menggunakan metode Lowry diketahui kadar
protein pada ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) adalah
8,5848 mg/ml.
2. Hasil analisis profi protein dengan metode SDS-PAGE terhadap ekstrak
ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) menunjukkan adanya pita
protein dengan bobot molekul 67,4839 kDa – 8,0872 kDa.
3. Hasil analisis asam amino dengan menggunakan KCKT terhadap ekstrak
ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) terdapat 16 asam amino
dengan kandungan total 1,055%. Diantaranya 9 asam amino esensial,
yaitu histidin 0,015%, arginin 0,035%, treonin 0,021%, valin 0,032%,
metionin 0,001%, lisin 0,182%, isoleusin 0,020%, leusin 0,030%,
fenilalanin 0,013%; serta 7 asam amino non esensial, yaitu aspartat
0,058%, serin 0,064%, glutamat 0,071%, glisin 0,053%, alanin 0,219%,
prolin 0,148%, dan tirosin 0,005%.
5.2 Saran
1. Perlu dilakukan ekstraksi dengan menggunakan komposisi buffer
ekstraksi yang lain sehingga hasil kandungan protein dan asam amino
yang didapatkan lebih besar.
2. Perlu dilakukan tahapan purifikasi lebih lanjut setelah ekstraksi agar
pemisahan pita protein pada elektroforesis lebih spesifik.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Adnan M. (1997). Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan.
Yogyakarta : Andi Yogyakarta.
Al-gaby, A. M. (1998). Amino Acid Composition and Biological Effects of
Supplementing Broad Been and Com Protein with Nigella sativa (Black Cumin)
Cake Protein,Nahrung. 42: 290-294.
Bachrudin Z. (1999). Petunjuk Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan
Pewarnaan Protein. PAU BioteknologiUGM. Yogyakarta.
Bailey, P.D. (1990). An Introduction to Peptide Chemistry. Wiley interscience.
New York.
Bamusa U.A dan Al-Hujaj A.Y. (2011). Sembuh dan Sehat dengan
Habbatussauda’ Obat Segala Penyakit. Aqwamedika. Solo. Hal : 34
Bintang, Maria. (2010). Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga, Jakarta. Hal : 99,
103-106.
Bodanszky, M. (1993). Chemistry of Peptide, Spinger-Verlag, Berlin. Hal : 47-52.
Bonner, Philip, L.R. (2007). Protein Purification The Basics. Nottingham Trent
University. Taylor & Francis Group. Hal : 31.
Bosch L, Alegria A, Farre R. (2006). Application of the 6-Aminoquinolyl-N-
Hydroxysccinimidil Carbamate (AQC) Reagent to the RP-HPLC Determination of
Amino Acid in Infant Foods. J.Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
831 (1-2):176-183.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Coligan, J, Dunn, B, Ploengh, H, Speicher, D, and Wingfield, P. (2007). “Current
Protocols in Protein Sciences,” Vol. 1.John Wiley & Sons, New York. Hal : 332-
340.
Departemen Kesehatan RI. (1979). Materia Medika Indonesia Jilid III. Direktorat
Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta. Hal : 114-117.
Departemen Kesehatan RI. (1985). Tanaman Obat Indonesia Jilid I. Direktorat
Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta. Hal. 33.
Departemen Kesehatan Republika Indonesia. (1989). Vademekum Bahan Obat
Alam.Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta. Hal : 99-100.
Fatmawati, U, Suranto dan Sajidan. (2009). Ekspresi Protein pada
Mikroorganisme Resisten Cr dengan Metode Elektroforesis. Bioteknologi. 6 (1):
40-48.
Eriksson J, Janasson S, Papaefthimiou D, Rasmussen U and bergman B. (2009).
Improving Derivatization Efficiency of BMAA Utilizing AccQ-Tag in a Complex
Cyanobacterial Matrix.Departement of Botany, Stockholm University. 36:43-48.
Gilani Hassan A. (2004). A Review of Medicinal Uses and Pharmacological
Activities of Nigella sativa L,. Departement of Biological and Biomedical Science.
7(4): 441-451.
Gornall, A.G., Bardawill, C.S., and David, M.M.(1949). Determination of Serum
Proteins by Means of the Biuret Method.J. Biol. Chem. 177:751-766.
Hailat, N., Bataineh, Z., Lafi, S. et al. (1995). Effect of Nigella sativa volatile oil
on Jurkal T cell leukemia polypeptides. International Journal of Pharmacognosy,
33, 16–20.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Halawani, Eman. (2009). Antibacterial Activity of Thymoquinone and
Thymohydroquinone of Nigella sativa L. and Their Interaction with Some
Antibiotics.Department of Biology Faculty of Science Taif University. 3 (5-6):
148-152.
Harborne, J.B. (1987). Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Penerbit ITB : Bandung. Hal 6-9.
Harli M. (2008). Asam Amino Esensial. http://www.suparmas.com. [4 september
2013 pukul: 07:00].
Haq, A., Remo, N. R., and Al-Sedairy, S. T. (1996). Fractionation of Black seed
(Nigella sativa Linn) proteins byusing Rotofor. J. Liq. Chrom. Rel. Technol., 19,
593-599.
Haq, A, Abdullatif Mohammad, Lobob Peter I., Khabar, S.A. Khalid, Shet V.
Kirtikant and Al-sedairy T.sultan. (1995). Nigella sativa: Effect on Human
Lymphocytes and Polymorphonuclear Leukocyte Phagocytic Activity.International
Journal of Immunopharmacology 30. 147-155.
Haq, A, Lobob Peter I., Al-Tufailc Mohammad, Nona R. Ramaa, and Al-Sedairya,
S.T. (1999). Immunomodulatory effect of Nigella Sativa Proteins Fractionated by
Ion Exchange Chromatography.International Journal of Immunopharmacology
21. 283-295.
Haq, A, Abdullatif M, Lobo IP, Khabar, S.A.K, Sheth. V.K and Al-sedairy T.S.
(1995). Nigella sativa; Effect on Human Lymphocytes and Polymorphonuclear
Leukocyte Phagocytic Activity.Immunopharmacology 30 (1995) 147-155.
Husgen AG, Scuhster R. 2001. HPLC for Food Analysis. Germany: Agilent
Technoligies Company.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Indriati G dan Khaerati. (2009). Peluang Budidaya dan Manfaat Jintan Hitam
(Nigella sativa). Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri, Volume
15 Nomor 1. Hal 23-24.
Janson, J.C and Ryden, L. (1998). Protein Purification: Principles, High
Resolution Methodes, and Applications, 2nd edition. A john willey & Sons Inc.
Pub., Hal: 464-484.
Khanza, Abu. (2010). Fit and Fresh Through Habbatussauda. Cicero Publishing :
Jakarta. Hal. 45-56.
Kurniati, Vita dan Wanadi, I,S. (2001). Pemisahan Protein Berdasarkan Berat
Molekul dalam Buku Biokimia: Eksperimen Laboratorium.Biokimia FKUI. Hal.
35-37.
Linder M. C. (1992). Biokimia, Nutrisi dan Metabolisme (diterjemahkan oleh
Aminuddin dan Amwila A,Y). Universitas Indonesia Press. Jakarta 89-115.
Masuda, A dan Dohmae, N. (2011). Amino Acid Analysis Of Sub-Picomolar
Amounts of Proteins by Precolom Fluoresence Derivatization with 6-
Aminoquinolyl-N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate. Jepang. Bioscience Trends;
5(6):231-238. DOI: 10.5582/bst.v5.6.231.
Michel, G. C. et al. (2010). Phytochemical and Biological Investigation of the
Extracts of Nigella sativa L. Seed Waste.Drug Testing and Analysis. John Wiley
& Sons, Ltd. DOI 10.1002/dta.225.
Nelson, D.L. dan Michael M.Cox. (2004). Lehninger Principles of
Biochemistry.4th
Edition. New York: W.H. Freeman & Company.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Norsharina, ismail et al (2011). Thymoquinone Rich Fraction from Nigella sativa
and Thymoquinone are Cytotoxic Towards Colon and Leukemic Carcinoma Cell
Lines. Academic Journals. pp. 3359-3366.
Paarakh, Padmaa M. (2010). A Comprehensive Review Nigella sativa Linn.
Department of Pharmacognosy, The Oxford College of Pharmacy. pp.409- 429.
Poedjiadi Anna, Supriyanti Titin F.M. (1994). Dasar-Dasar Biokimia Edisi Revisi.
Penerbit Universitas Indonesia (UI Press): Jakarta. Hal. 81, 109.
Salamah E. (1997). Analisis Kimia Menggunakan HPLC Bagian-I.Buletin
Teknologi Hasil Perikanan. Vol 3:1.
Salazar. C, Armenta JM, Cortes FD, and Shulaev V. (2012). Chapter :2
Combination of an AccQ-Tag Ultra Performance Liquid Chromatoghraphic
Method with Tandem Mass Spectrometry for the Analysis of Amino acids dalam
Amino Acid Analysis: Methods and Protocols, Method in Molecular
Biology.http://www.spinger.com/978-1-61779-444-5 diakses pada tanggal 4
September 2013 pukul 4:00.
Sastrohamidjojo, Hardjono. (1996). Sintesis Bahan Alam.Gadjah Mada University
Press. Yogyakarta. Hal : 169.
Silvia. D. et al. (2012). The Effect of Different Extraction Temperature of the
Screw Press on Proximate Compositions, Amino Acid Contens and Mineral
Contents of nigella sativa Meal. American Journal of Food Technology. 7(4).180-
191.
Singh, gurdip. et al(2005). Chemical Constituents and Antimicrobial and
Antioxidant Potentials of Essential Oil and Acetone Extract of Nigella sativa
Seeds.Chemistry Department, DDU Gorakhpur University. 85:2297–2306.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Stryer L. (1995). Biokimia. Sadikin et al, penerjemah; Soebianto S, editor.Jakarta:
EGC. Terjemahan dari:Biochemistry.
Sudarmadji S, Haryono B, dan Suhardi. (1981). Analisa Bahan Makanan dan
Pertanian. Cetakan ke-3. Yogyakarta: Pusat Antar Universitas, Universitas Gajah
Mada.
Sumardjo Damin. (2009). Pengantar Kimia. Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Penerbit Buku
Kedokteran EGC: Jakarta. Hal. 161-172.
Sumarno, Noegrohati S, Narsito dan Falah II (2002). Estimasi Kadar Protein
dalam Bahan Pangan Melalui Analisis Nitrogen Total dan Analisis Asam Amino.
Majalah Farmasi Indonesia. 13 (1), 34 – 43.
Swamy S.M.K. (1998). Cytotoxic and Immunopotentiating Effects of Ethanolic
Extract of Nigella sativa L. Seeds.Department of Pharmacology, Faculty
ofMedicine, National University of Singapore. 70 (2000) 1–7.
Wijaya SKS, Rahman L. (2005). Fraksinasi dan Karakterisasi Protein Utama Biji
Kedelai. Fakultas MIPA Universitas Jember. Jember.
Winarno FG. (2008). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia.
Yeheya M. (2009). A Review Therapeutic Role of Phrophetic Medicine Habbat El
Baraka (Nigella sativa L.). Departement of Pharmacy. 7 (9): 1203-1208.
Yuwono, T. (2005). Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 1. Skema Prosedur Penelitian Secara Umum
Ampas biji jinten hitam
Ampas biji jinten hitam dilarutkan dalam phospahate buffer
saline (pH 7,2)
Sentrifuge pada 10.000 rpm selama 30 menit pada suhu 40C
Pelet Supernatan
Freeze dry
Penetapan Kadar Protein Analisis Profil Protein Analisis Asam Amino
SDS-PAGE KCKT
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 2. Skema Kerja Penetapan Kadar Protein dengan Metode Lowry
a. Pembuatan Kurva Kalibrasi
Absorbannya di ukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 737,5 nm.
Pembuatan Larutan Induk BSA 1000 ppm
Ditambahkan 5 ml Campuran 50:1 (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N
dan larutan CuSO4 0,5% dalam larutan Na.K tartrat 1%). Kocok dan
dibiarkan selama 10 menit.
Pembuatan seri konsentrasi BSA ( 0, 40, 80, 120, 160, 200 ppm)
Ditambahkan 0,5 ml pereaksi folin-ciocalteau, kocok dan dibiarkan
selama 30 menit
Larutan standar dimasukkan ke dalam tabug
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 3. Analisis Profil Protein dengan SDS-PAGE
larutan separating gel yang
telah dibuat, disiapkan
dimasukkan ke dalam cetakan
gel dengan menggunakan mikro
pipet sampai batastertentu.
kemudian ditambahkan
dengan aquades sampai penuh
agar permukaan gel rata.
Setelah gel mengering,
aquades dibuang dan sisa air
pada cetakan gel diserap
dengan kertas saring.
Kemudian larutan stacking gel
yang telah dibuat dimasukkan
ke dalam cetakan
permukaan geldipasang sisir
berlubang lalu didiamkan
sampai mengeras.
Setelah gel mengeras, cetakan
gel dipindahkan ke perangkat
elektroforesis.
Preparasi sampel dilakukan dengan
memasukkan sampel yang telah
disiapkan sebelumnya ke dalam tabung
effendorf tabung eppendorf
Masing-masing di tambahkan
sampel bufferdengan perbandingan
1:1 dan 2:1. Kedua tabung
dipanaskan pada suhu 1000C selama
5 menit.
Elektroforesis dilakukan dengan
cara sampel dimasukkan ke dalam
sumur yang telah dicetak pada gel
poliakrilamid sebanyak 10 μl
Gel poliakrilamid dicetak
diantara dua buah lempengan
kaca
Elektroforesis dihubungkan ke power
supply dengan tegangan 200 V
dengan amper 30mA selama 55
menit.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 4. Analisis Asam Amino dengan KCKT
Sampel ditimbang
Ditambahkan 5 ml HCl 6
N kemudian vortex
Disaring dengan filter
0,45 µm
Sampel dialiri gas
nitrogen dan di
hidrolisis pada suhu
1100C selama 22 jam.
Hidrolisat didinginkan
pada suhu kamar, lalu
dipindakhan ke labu
ukur dan ditambahkan
dengan aqubidest sampai
tandabatas.
Pipet 10 µl larutan,
tambahkan 70 µl AccQ-
Fluor Borate, kemudian
vortex.
Pipet 500 µl filtrat lalu
ditambahkan 40 µm
AABA ± 460 µl aqubidest.
Dengan kondisi
kromatografi menggunakan
kolom C18, temperatur
370C, fase gerak asetonitril
60%, detektor fluoresen, laju
alir 1 ml/menit dan volume
penyuntikan 5 µl.
Inkubasi selama 10 menit
pada suhu 550C, lalu
suntikan pada HPLC.
Tambahkan 20 µl reagen
flour A, vortex, diamkan 1
menit.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 5. Hasil Determinasi Biji Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.)
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 6. Spektrum Panjang Gelombang Maksimum Serapan
metode Lowry
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 7. Bahan Pereaksi untuk SDS PAGE (berdasarkan metode
Laemmli 1970 dalam Coligan et al 1995)
Pembuatan Larutan Stok 30% akrilamid/0,8% bisakrilamid
Sebanyak 30 gram akrilamid ditambahkan dengan 0.8 gram N’, N’-metilen
bisakrilamid ditimbang, kemudian dilarutkan dengan aquabidest sampai volume
100 ml. Setelah itu, larutan tersebut disaring dengan kertas saring dan disimpan
pada suhu 40C dalam kondisi gelap. dan larutan siap digunakan.
Pembuatan Buffer 4x Tris-HCl/SDS, pH 6,8 (Stacking Buffer)
Sebanyak 6.05 gram Tris dilarutkan dalam 60 ml aquabidest. pH diatur
menjadi 6,8 dengan HCl 6 N. total volume digenapkan sampai 100 ml dengan
penambahan aquabidest. Larutan disimpan pada suhu 40C dan larutan siap
digunakan.
Pembuatan Buffer 4x Tris-HCl/SDS, pH 8,8 (Resolving / Separating)
Sebanyak 18,15 gram Tris dilarutkan dalam 75 ml aquabidest. Atur pH 8,8
dengan HCl 6 N, kemudian ditambahkan aquabidest hingga volume totalnya 100
ml. Larutan disimpan pada suhu 40Cdan larutan siap digunakan.
Pembuatan Buffer Sampel
Larutan dibuat dengan mencampurkan 2 ml larutan SDS 10%, 2,5 ml
gliserol, 1,25 ml buffer Tris HCl pH 6,8, 3,55 aqubidest dan 0,2 ml larutan
bromofenol biru 0,5% atau secukupnya sampai terbentuk warna biru gelap pada
larutan. Terakhir ditambahkan 0,5 ml 2-merkaptoetanol.
Pembuatan 10x Buffer Elektroforesis (Running Buffer)
Sebanyak 30,3 gram Tris, 144 gram glisin, 10 gram SDS dilarutkan dalam
1000 ml aquabidest. Larutan disimpan pada suhu 40C dan larutan siap digunakan.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pembuatann Separating Gel 12%
Larutan separating gel dibuat dengan cara 30% acrylamide solution 4 ml
ditambahkan separating gel buffer (1,5 M Tris HCl pH 8,8) sebanyak 2,5 ml
kemudian aquabidest 3,4 ml, 10 % SDS 0,1 ml dan Ammonium PerSulfate (APS)
0,2 ml serta TEMED 0,01 ml.
Pembuatan stacking gel (5%)
Larutan stacking gel dibuat dengan cara 30% acrylamide solution 0,85 ml
ditambahkan stacking gel buffer (1,5 M Tris HCl pH 6,8) sebanyak 1,25 ml
kemudian aquabidest 2,85 ml, SDS 10 % 0,05 ml dan 10 % Ammonium PerSulfate
(APS) 0,2 ml serta TEMED 0,01 ml.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 8. Bahan dan Alat Penelitian
5.1 Bahan Penelitian
Gambar 1.
Ampas biji jinten hitam
Gambar 2. Serbuk ampas
biji jinten hitam
Gambar 3. Larutan
induk BSA 10.000 ppm
Gambar 4. Ekstrak
terlarut ampas biji jinten
hitam
Gambar 5. Ekstrak Cair
Ampas Biji Jinten Hitam
Gambar 6. Standar BSA
untuk Lowry
Gambar 7. Sampel
untuk Lowry
Gambar 8. Pereaksi folin
ciocalteu
Gambar 9. Standar
marker
Gambar 10. TEMED
Gambar 11. SDS 10%
Gambar 12. Tris-HCl
pH 6,8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 13.
Tris-HCl pH 8,8
Gambar 14. Bromophenol
Blue
Gambar 15. Larutan
stok acrilamid
Gambar 16. Sampel
buffer + β
merkaptoetanol
Gambar 17. Sampel buffer
Gambar 18 Amonium
Persulfat 10 %
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
5.2 Alat Penelitian
Gambar 1. J2-H5
Sentrifuse BECKMAN
Gambar 2. Bagian
dalam J2-H5 Sentrifuse
BECKMAN
Gambar 3. Vortex
Gambar 4.
Spektrofotometer
Gambar 5. Tip
mikropipet
Gambar 6. Elektroforesis
gel poliakrilamid
Gambar 7.
Power Supply
Gambar 8.
Wadah Elektroforesis
Gambar 9.
Cetakan Gel Separating gel
dan Stacking Gel
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 9. Beberapa Hal Terkait Analisis Protein dengan SDS-PAGE
1) Gambar Sticker Katalog Prestained SDS-PAGE Standards, Broad
Range.
Pita Marker yang Muncul pada saat Elektroforesis
Protein MW ( kDa)
Miosin 250
Β-galaktosidase 150
BSA 75
Ovalbumin 50
Soybin tripsin inhibitor 25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2) Tabel dan Kurva Rf terhadap Log BM Pita Marker Protein
Prestained SDS-PAGE Standars – Broad Range
Protein d ( cm ) MW (kDa) Rf Log MW
Miosin 0,1 250 0,016949152 2,397940009
Β-galaktosidase 0,7 150 0,118644067 2,176091259
BSA 1,5 75 0,254237288 1,875061263
Ovalbumin 2,6 50 0,440677966 1,698970004
Soybean trypsin
inhibitor
4,0 25 0,677966101 1,397940009
Loading dye 5,9 cm
y = -1,469x + 2,352 r = 0,985
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Lo
g B
M
RF
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Bobot molekul protein ampas biji jinten hitam
Sampel Migrasi Band Rf b a Log BM BM Kda
AF 2:1 5,9 2,1 0,3559 -1,469 2,352 1,8292 67.483,9 67,4839
5,9 2,7 0,4576 -1,469 2,352 1,6798 47.841,0 47,8410
5,9 3,1 0,5254 -1,469 2,352 1,5802 38.036,5 38,0365
5,9 3,3 0,5593 -1,469 2,352 1,5304 33.915,6 33,9156
5,9 3,5 0,5932 -1,469 2,352 1,4806 30.241,3 30,2413
5,9 3,6 0,6102 -1,469 2,352 1,4556 28.549,6 28,5496
5,9 3,8 0,6441 -1,469 2,352 1,4058 25.456,6 25,4566
5,9 4,2 0,7119 -1,469 2,352 1,3062 20.239,5 20,2395
5,9 4,3 0,7288 -1,469 2,352 1,2814 19.116,1 19,1161
5,9 4,6 0,7797 -1,469 2,352 1,2066 16.091,6 16,0916
5,9 4,7 0,7966 -1,469 2,352 1,1818 15.198,5 15,1985
5,9 5,1 0,8644 -1,469 2,352 1,0822 12.083,7 12,0837
5,9 5,3 0,8983 -1,469 2,352 1,0324 10.774,6 10,7746
5,9 5,4 0,9153 -1,469 2,352 1,0074 10.171,8 10,1718
5,9 5,8 0,9831 -1,469 2,352 0,9078 8.087,2 8,0872
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 10. Kromatogram Standar Asam Amino
No Peak Name RT Area % Area Height
1 AMQ 9.316 555206 0.51 28687
2 L-Aspartic Acid 12.059 2460839 2.26 191182
3 L-Serine 13.431 3497092 3.21 250256
4 L-Glutamic Acid 14.494 2729011 2.51 195836
5 Glycine 15.553 3161919 2.90 212593
6 L-Histidine 16.340 4738157 4.35 319281
7 NH3 17.140 3932609 3.61 184541
8 L-Arginine 20.264 4707955 4.32 412951
9 L-Threonine 20.788 4571976 4.20 376790
10 L-Alanine 22.142 4926720 4.52 404245
11 L-Proline 24.572 2439341 2.24 240722
12 AABA 26.041 6700235 6.15 700886
13 L-Cystine 27.946 116477 0.11 11910
14 L-Tyrosine 28.282 5800875 5.33 624906
15 L-Valine 29.328 8257559 7.58 862538
16 L-Metheonine 29.817 7377303 6.77 779465
17 L-Lysine HCl 32.158 4894833 4.49 534069
18 L-Isoleucine 32.972 11142373 10.23 1066106
19 L-Leucine 33.462 11701866 10.74 1045770
19 L-Phenylalanine 34.393 14501553 13.31 1403669
20 Tryptophan 35.180 714931 0.66 78946
Total 108928831.20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 11. Kromatogram Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam
No Peak Name RT Area % Area Height Amount
1 AMQ 9,699 568038 1.76 29578 1.023
2 L-Aspartic Acid 12.378 168233 0.52 13909 6.836
3 L-Serine 13.713 309021 0.96 23033 8.837
4 L-Glutamic Acid 14.730 236984 0.73 17707 8.684
5 Glycine 15.780 405825 1.26 28333 12.835
6 L-Histidine 16.518 76559 0.24 5446 1.616
7 NH3 17.355 19446079 60.20 881186 4.945
8 L-Arginine 20.344 176779 0.55 13532 3.755
9 L-Threonine 20.865 104470 0.32 9212 2.285
10 L-Alanine 22.260 2782429 8.61 201808 56.476
11 L-Proline 24.577 271346 0.84 22390 11.124
12 AABA 26.045 5914730 18.31 606200 0.873
13 L-Cystine 27.956 16995 0.05 1602 7.295
14 L-Tyrosine 28.280 28241 0.09 3283 0.487
15 L-Valine 29.330 385740 1.19 33162 4.671
16 L-Metheonine 30.112 4893 0.02 750 0.006
17 L-Lysine HCl 32.131 629734 1.95 52478 12.881
18 L-Isoleucine 32.961 271703 0.84 25408 2.438
19 L-Leucine 33.446 385997 1.19 35786 3.299
19 L-Phenylalanine 34.379 119406 0.37 12962 0.840
20 Tryptophan 35.177
Total Asam Amino tanpa
Triftopan
32303202.22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
No Peak Name RT Area % Area Height Amount
1 AMQ 9,705 559487 1.94 29275 1.008
2 L-Aspartic Acid 12.404 105018 0.36 8782 4.268
3 L-Serine 13.725 227108 0.79 16845 6.494
4 L-Glutamic Acid 14.749 108995 0.38 8385 3.994
5 Glycine 15.805 186041 0.64 13411 5.884
6 L-Histidine 16.533 40440 0.14 3031 0.853
7 NH3 17.370 19737964 68.28 893396 5.019
8 L-Arginine 20.330 75363 0.26 6727 1.601
9 L-Threonine 20.871 97411 0.34 8731 2.131
10 L-Alanine 22.243 613429 2.12 42647 12.451
11 L-Proline 24.268 462702 1.60 28399 18.968
12 AABA 26.049 5256610 18.19 545279 0.775
13 L-Cystine 27.955 23182 0.08 2105 9.951
14 L-Tyrosine 28.282 12734 0.04 1468 0.220
15 L-Valine 29.320 209829 0.73 22516 2.541
16 L-Metheonine 30.113 6413 0.02 891 0.087
17 L-Lysine HCl 32.121 575399 1.99 44873 11.770
18 L-Isoleucine 32.958 166620 0.58 16330 1.495
19 L-Leucine 33.446 282797 0.98 27446 2.417
19 L-Phenylalanine 34.375 157181 0.54 16032 1.106
20 Tryptophan 35.177
Total Asam Amino 28904723.73
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 12. Hasil Analisis Asam Amino menggunakan KCKT
a ) Perhitungan Kandungan Asam Amino
No Asam Amino Bobot
Molekul
Area
Standar 1 2
1 Aspartat 133,1 2460839 168233 105018
2 Serin 105,09 3497092 309021 227108
3 Glutamat 147,13 2729011 236984 108995
4 Glisin 75,07 3161919 405825 186041
5 Histidin 155,16 4738157 76559 40440
6 Arginin 174,29 4707955 176769 75363
7 Treonin 119,12 4571976 104470 97411
8 Alanin 89,1 4926720 2782429 613429
9 Prolin 115,13 2439341 271346 462702
10 Sistin 121,16 116477 16995 23182
11 Tirosin 181,19 5800875 28241 12734
12 Valin 117,15 8257559 385740 209829
13 Metionin 149,21 7377303 4893 6413
14 Lisin 182,65 4894833 629734 575399
15 Isoleusin 131,18 11142373 271703 1666620
16 Leusin 131,18 11701866 385997 282797
17 Fenilalnin 165,19 14501553 119406 157181
Bobot sampel (µg) 345800 261400
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
No
Asam Amino
Bobot
Molekul
Area
Setelah
Perhitungan
Kandungan
Asam Amino (%)
Standar 1 2 1 2
1 Aspartat 133,1 2460839 168233 105018
(Area p nen area AABA a pe C BM p
(Area p nen area AABA an ar r
0,060 0,055
2 Serin 105,09 3497092 309021 227108 0,061 0,067
3 Glutamat 147,13 2729011 236984 108995 0,084 0,057
4 Glisin 75,07 3161919 405825 186041 0,063 0,043
5 Histidin 155,16 4738157 76559 40440 0,016 0,013
6 Arginin 174,29 4707955 176769 75363 0,043 0,027
7 Treonin 119,12 4571976 104470 97411 0,018 0,025
8 Alanin 89,1 4926720 2782429 613429 0,330 0,108
9 Prolin 115,13 2439341 271346 462702 0,084 0,213
10 Sistin 121,16 116477 16995 23182 0,058 0,118
11 Tirosin 181,19 5800875 28241 12734 0,006 0,004
12 Valin 117,15 8257559 385740 209829 0,036 0,029
13 Metionin 149,21 7377303 4893 6413 0,001 0,001
14 Lisin 182,65 4894833 629734 575399 0,154 0,209
15 Isoleusin 131,18 11142373 271703 1666620 0,021 0,019
16 Leusin 131,18 11701866 385997 282797 0,028 0,031
17 Fenilalnin 165,19 14501553 119406 157181 0,009 0,017
Bobot sampel (µg) 345800 261400 1,070 1,037
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 13. Pembuatan Larutan Baku
Pipet 40 µl mix standar asam amino, lalu tambahkan 40 µl standar
internal AABA, 920 µl aquabides kemudian di homogenkan. Ambil 10 µl
standar, lalu tambahkan 70 µl AccQ Fluor borat, vortex dan diamkan selama
1 menit. Kemudian inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C lalu suntikan
pada KCKT.
Perhitungan Kadar Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam
AA (mg/100 gram)
(
)