Oncogeni ed Oncosoppressori
Cellula Tumorale
Cellula Normale
E’ una malattia genetica?
E’ una malattia ereditaria?
Cosa causa il cancro?
Radiazioni
Virus
Cancerogenichimici
Cellula Normale
Cellula Tumorale
UV
Cancro
• Accumulo abnorme di cellule causato da alterazioni nella:
• Proliferazione• Apoptosi• Riparazione del DNA• Differenziazione
Alterata proliferazione cellulare e cancro
• Ogni cellula contiene ~ 30-40,000 geni
• Alcuni geni sono responsabili del controllo della proliferazione cellulare
• Se in questi geni avviene una mutazione, la proliferazione diventa anomala
• L’anomala proliferazione è una caratteristica del cancro
Cancerogenichimici
UV
Cellula Normale
Cellula Tumorale
Radiazioni
Virus
Errori di replicazione
Danno al DNA
Mutazionipuntiformi
Riarrangiamenti(traslocazioni, delezioni,
Amplificazione)
Alterazioni al DNA di geniche controllano la proliferazione
1. Cellula somatica normale
2.Espansione clonale con mutazione iniziale
4.Ulteriore espansione di un subclone con mutazione addizionle
3. Espansione di un subclone A con una nuova mutazione e la mutazione iniziale
Nelle cellule normali il controllo della proliferazione avviene in specifiche fasi del ciclo
cellulare
Segnali proliferativinegativi
Segnali proliferativipositivi
attività metabolica e crescita cellulare
attività metabolica e crescita cellulare
Come è controllata la proliferazione cellulare?
• Il ciclo cellulare e la divisione cellulare sono controllati dalla regolata espressione di geni
• L’integrità genomica di tutte le cellule dipende dall’attenta attività dei geni riparativi soprattutto in cellule più esposte all’azione di genotossici
• Coinvolge l’equilibrio tra l’espressione di geni responsabili per la regolazione positiva della proliferazione e l’espressione di geni responsabili per la regolazione negativa della proliferazione
Cellula Normale
Cellula Tumorale
Perdita di funzione di uno o più geni oncosoppressori
Abnorme espressione di uno o più oncogeni
Proto-oncogeni conosciuti. Mutazioni nei proto-oncogeni causano il cancro.
Proteine codificate dagli oncogeni
Cancerogenichimici
UV
Cellula Normale
Cellula Tumorale
Radiazioni
Virus
Errori di replicazione
Danno al DNA
Mutazionipuntiformi
Riarrangiamenti(traslocazioni, delezioni,
Amplificazione)
Alterazioni al DNA di geni che controllano la proliferazione (oncogeni e geni oncosoppressori)- Proliferazione sregolata
La scoperta dei “geni del cancro” nasce da due osservazioni (fine anni ‘70)
• Sequenze geniche di retrovirus oncògeni (v-onc) sono omologhe a sequenze di normali geni cellulari (c-onc) da questi “catturati”
• Segmenti genici estratti da tumori trasformano cellule normali in cellule neoplastiche
Trasformazione cellulare da parte di un virus del sarcoma Rous (RSV) e di un avian leukosis virus (ALV). Entrambi i virus infettano e si replicano nei fibroblasti di pollo, ma solo i RSV inducono trasformazione cellulare
Il genoma del retrovirus contiene un gene addizionale, l’src, che non è presente nell’AVL e codifica una protein-tyrosine kinase p60src
Isolamento del virus della leucemia di Abelson. Il virus altamente oncogeno Ab-MuLV fu isolato da un raro tumore che si sviluppava in un topo in cui era stato inoculato un virus non trasformante (Moloney murine leukemia virus, or MuLV), contente solo i geni gag, pol, and env necessari per la replicazione virale. Invece, Ab-MuLV aveva acquisito un nuovo oncogene (abl), responsabile della sua capacità trasformante. L’oncogene abl rimpiazza alcuni geni replicativi ed è fuso con un gene gag parzialmente deleto (Δgag) nel genoma Ab-MuLV.
Questo scenario suggeriva l’ipotesi che gli oncogeni retrovirali derivano da geni della cellula ospite, e che occasionalmente tale gene cellulare viene incorporato in un genoma virale, producendo un nuovo virus altamente oncogenico come prodotto di un evento di ricombinazione virus-ospite
Le cellule normali contengono geni che sono strettamente correlati agli oncogeni retrovirali
• I geni delle cellule normali da cui originano gli oncogeni retrovirali sono i proto-oncogeni. Sono importanti geni regolatori, codificanti proteine coinvolte nei pathways di trasduzione del segnale che controllano la normale proliferazione cellulare (es.: src, ras, and raf).
• Gli oncogeni sono espressi in maniera
abnorme o sono forme mutate dei corrispondenti proto-oncogeni.
• Come conseguenza di tali alterazioni gli oncogeni inducono l’ abnorme proliferazione cellulare e lo sviluppo tumorale.
Proteine che partecipano al controllo della crescita cellulare. Il cancro può essere causato dall’espressione di forme mutate di queste proteine: fattori di crescita (I), recettori per fattori di crescita (II), proteine del segnale (III), fattori di trascrizione (IV), proteine pro- o anti-apoptotiche (V), proteine che controllano il ciclo cellulare (VI), e proteine che riparano il DNA (VII). Mutazioni delle proteine di classe I – IV danno origine ad oncogeni dominanti attivi. Le proteine di VI classe sono tumor suppressors, mutazioni in questi geni causano la perdita del controllo della proliferazione della cellula. Mutazioni della Classe VII aumenta la probabilità di mutazioni nelle altre classi.
Proto-oncogeni conosciuti. Mutazioni nei proto-oncogeni che causano il cancro.
Studio di un oncogene tumorale umano mediante transfezione di DNA estratto da un carcinoma della vescica umano in cellule murine; esso induce la trasformazione delle cellule murine. La transformazione è causata dall’integrazione ed espressione di un oncogene derivato dal tumore umano
Principali meccanismi per cui un proto-oncogene può diventare un
oncogene
Traslocazione:Un gene si trova in un nuovo
locus, sotto un nuovo controllo
Amplificazione genica:Copie multiple di un gene
Mutazionepuntiforme
Proteina in eccesso Proteina in eccesso Proteina iperattiva
NuovoPromoter
Attivazione di un oncogene per mutazione puntiforme
Mutazione puntiforme nell’ oncogene ras. Un singolo nucleotide cambiato, che altera il codone 12 da GGC (Gly) a GTC (Val), è responsabile dell’attività transformante del oncogene ras
Il ciclo della proteina Ras tra la forma inattiva legata al GDP e la forma attiva legata al GTP avviene in 4 fasi. Il legame dei fattori di crescita ai loro recettori induce la formazione del complesso attivo Ras/GTP. Fase 1: Guanine nucleotide – exchange factor (GEF) facilita la dissociazione del GDP dal Ras. Fase 2: GTP si lega spontaneamente, e il GEF si dissocia lasciando Ras /GTP in forma attiva. Fase 3 e 4: Idrolosi di GTP per generare la forma Ras/GDP inattiva, accelerata da GTPase-activating protein (GAP) o SOS.
Mutazione puntiformeL’effetto di questa mutazione missenso crea un oncoproteina Ras che non idrolizza GTP a GDP. L’oncoproteina Ras rimane nel complesso Ras–GTP attivo ed attiva continuamente la serine/threonine kinase downstream
Regolazione dell’attività di Src e sua attivazione per mutazione.
(a) Struttura del dominio di c-Src e v-Src. La fosforilazione nella tirosina 527 da parte di Csk, un’altra tyrosine kinase, inattiva l’attività Src kinase. L’oncoproteina transformante v-Src codificata dal Rous sarcoma virus manca di 18 amino acidi C-terminal compresa la tirosina 527 e così è constitutivamente attiva.
(b) Effetto della fosforilazione sulla conformazione di c-Src. Il legame della fosfotirosina 527 al dominio SH2 induce cambiamenti conformazionali sui domini SH3 e kinase, con distorsione il sito attivo della kinase sicchè è cataliticamente inattivo. L’attività della kinase di c-Src è normalmente attivato con la rimozione del fosfato sulla tirosina 527.
Attivazione di un oncogene per delezione
Effetti di mutazione in proto-oncogeni che codificano recettori di superficie. Una mutazione che altera un singolo aminoacido, nella regione transmembrana del recettore Her2R causa la dimerizzazione di due recettori in assenza del ligando correlata all’EGF e rende la proteina costitutivemente attiva.Una delezione che causa la perdita del ligand binding domain extracellulare nel recettore EGF porta all’ attivazione costitutiva della proteina kinasi
La proteina del proto-oncogene Raf è formata da amino-terminal regulatory domain ed un carboxy-terminal protein kinase domain. Nella proteina dell’ oncogene virale Raf, il regulatory domain è deleto e rimpiazzato dalle sequenze virali Gag. Come risultato, il Raf kinase domain è constitutivamente attivo, causando transformazione cellulare.
Attivazione di un oncogene per traslocazione
Translocazione del c-myc. Nel linfoma di Burkitt il protoncogene c-myc è traslocato dal cromosome 8 al locus delle catene pesanti delle immunoglobuline (IgH) sul cromosome 14, che causa un’abnorme espressione del c-myc
Traslocazione di abl. Nella LMC l’ oncogene abl è traslocato dal cromosoma 9 al cromosoma 22, formando il cromosome Ph. Il protoncogene abl, che contiene due primi esoni alternativi (1A e 1B), si congiunge a metà del gene bcr sul cromosome 22. L’esone 1B è deleto come risultato della translocazione. La trascrizione del gene fuso inizia sul promoter bcr e continua verso abl. Lo splicing genera un mRNA Bcr/Abl, in cui le sequenze dell’esone 1A abl sono delete e le sequenze bcr sono congiunte all’esone 2 di abl.
Riarriangemento cromosomico nel lifoma follicolare. La traslocazione fonde gli elementi trascrizionali enhancer di un gene, sul cromosoma 14, all’unità trascizionale di un’altro gene, sul cromosoma 18, che codifica Bcl2, La proteina Bcl2 così viene prodotta dalle plamsma -cellule
Attivazione di un oncogene per inserzione
Attivazione di c-myc proto-oncogene per inserzione di promoter retrovirale o di un enhancer.
(a) Il promoter può essere attivato quando il retrovirus si inserisce upstream (5′) degli esoni di c-myc. Il LTR di destra può agire da promoter.
(b) Il gene c-myc può anche essere attivato quando un retrovirus inserisce upstream del gene c-myc nella direzione trascrizionale opposta; un LTR virale agisce da enhancer, activando la trascrizione dalla sequenza del promoter di c-myc.
Oncogene Type of cancer Activation mechanism
abl Chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia Translocation
akt Ovarian and pancreatic carcinomas Amplification
bcl-2 Follicular B-cell lymphoma Translocation
D1 Parathyroid adenoma, B-cell lymphoma Translocation
D1 Squamous cell, bladder, breast, esophageal, liver, and lung carcinomas
Amplification
E2A/pbx1 Acute lymphocytic leukemia Translocation
erbB-2 Breast and ovarian carcinomas Amplification
gip Adrenal cortical and ovarian carcinomas Point mutation
gli Glioblastoma Amplification
gsp Pituitary and thyroid tumors Point mutation
hox-11 Acute T-cell leukemia Translocation
lyl Acute T-cell leukemia Translocation
c-myc Burkitt's lymphoma Translocation
c-myc Breast and lung carcinomas Amplification
L-myc Lung carcinoma Amplification
N-myc Neuroblastoma, lung carcinoma Amplification
PDGFR Chronic myelomonocytic leukemia Translocation
PML/RARα Acute promyelocytic leukemia Translocation
rasH Thyroid carcinoma Point mutation
rasK Colon, lung, pancreatic, and thyroid carcinomas Point mutation
rasN Acute myelogenous and lymphocytic leukemias, thyroid carcinoma
Point mutation
ret Multiple endocrine neoplasia types 2A and 2B Point mutation
ret Thyroid carcinoma DNA rearrangement
SMO Basal cell carcinoma Point mutation
Oncogeni che codificano per fattori di crescita
Stimolazione di crescita autocrina. Una cellula produce un fattore di crescita al quale risponde, con il risultato di una continua stimolazione della proliferazione cellulare
Meccanismo dell’attivazione dell’oncogene Tel/PDGFR.Il PDGFR normale è attivato dalla dimerizzazione indotta dal legame con PDGF. L’ oncogene Tel/PDGFR codifica una proteina nella quale il dominio extracellulare normale del PDGFR e rimpiazzato da una sequenza N-terminale del fattore di trascrizione Tel. Queste sequenze dimerizzano in assenza di PDGF, con attivazione costitutiva della protein-kinase.
Oncogeni che codificano per recettori di membrana
Molecole del segnale extracellulare si possono legare sia a recettori extracellulari che intracellulari. Molte molecole del segnale sono idrofile e non possono attraversare la membrana cellulare e si legano ai recettori di superficie cellulare, che generano segnali all’interno della cellula target. Alcune molecole del segnale, diffondono attraverso la membrana plasmatica e si legano a recettori all’interno della cellula target nel cytosol o nel nucleo. Molte di queste molecole sono idrofobiche; sono trasportate dal flusso sanguigno e altri fluidi legate a proteine carrier, dai quali si dissociano prima di entrare nella cellula target.
Sei famiglie di recettori tyrosin- kinasi. In alcune sottofamiglie il dominio tyrosin-kinasi e interrotto da una "kinase insert region".
Recettori tirosin-kinasi
Auto-fosforilazione dei recettori tirosin-chinasi
Tre classi di recettori di superficie cellulare
Recettori Enzyme-linked• (1) recettori guanilil cyclasi, che catalizzano la
produzione del cGMP nel cytosol;
• (2) recettori tirosin- kinasi, che fosforilano specifici residui tirosina su un piccolo gruppo di proteine del segnale intracellulari;
• (3) recettori tirosin-kinasi-associati, che sono associati a proteine con attività tyrosin-kinasi;
• (4) recettori tirosin- fosfatasi, che rimuovono i gruppi fosfato dai residui di tirosina di specifiche proteine del segnale intracellulari;
• (5) recettori serine/treonine kinasi, che fosforilano specifici residui di serina o treonina da alcune proteine intracellulari.
I due principali meccanismi intracellulari del segnale hanno caratteristiche comuni. In entrambi I casi una proteina del segnale è attivata all’ addizione di un gruppo fosfato e inattivato dalla rimozione del fosfato.
(A)Il P è aggiunto covalentemente alla proteina del segnale da una protein kinase;
(B)La proteina del segnale è indotta a cambiare il suo legame GDP a GTP.
Recettori con 7 domini transmembranacei accoppiati alle proteine G eterodimeriche.- Accoppiati all’adenil ciclasi- Accoppiati a canali ionici- Accoppiati a PLC
Schema dei recettori legandi a G-protein. The parts of the intracellular domains that are mainly responsible for binding to trimeric G proteins are shown in orange, while those that become phosphorylated during receptor desensitization (discussed later) are shown in red.
Pathways principali mediante I quali i recettori di superficie legati alle G-protein generano mediatori intracellulari. In entrambi I casi il legame ad un ligando extracellulare altera la conformazione del dominio citoplasmatico del recettore, che si lega alla G-protein e attiva (o inattiva) un enzima della plasma membrana. Nel pathway del cAMP l’enzima produce direttamente cAMP. Nel pathway Ca2+ l’enzima produce un mediatore solubile (IP3) che rilascia Ca2+ dal reticolo endoplasmico. Entrambi cAMP e Ca2+ inducono il segnale legandosi a proteine specifiche, e alterando la loro conformazione e quindi la loro attività
Oncogeni e segnale di trasduzione. Gli oncogeni agiscono da fattori di crescita (es. EGF), recettori di fattori di crescita (es. ErbB), e molecole del segnale intracellulari (Ras and Raf). Ras e Raf attivano il pathway ERK MAP kinase, inducendo geni addizionali (e.g., fos) che codificano potenzialmente proteine oncogeniche che sono regolatori trascrizionali. Le proteine con potenziale oncogenico sono evidenziate in giallo
Azione dell’ oncogene PML/RAR α PML/RARα blocca la differenziazione da promielociti a granulociti.
Oncogeni e sopravvivenza cellulare. Gli oncogeni che segnalano la sopravvivenza cellulare sono fattori di crescita, recettori per fattori di crescita , PI 3-kinase, and Akt. Il segnale del pathway PI 3-kinase/Akt regola membri della famiglia di Bcl-2, che promuove la sopravvivenza cellulare inibendo il rilascio del citocrome c dai mitocondri. Proteine con potenziale oncogenico sono in giallo
Il Cancro è una malattia ereditaria?
-15% dei casi di tumore hanno una componente ereditaria
Geni adibiti al riparo del DNA (caretakers)
1. La loro mutazione è spesso alla base di sindromi neoplastiche familiari
2. Prototipo sono i geni hMLH1, hPMS1e hPMS2, mutati nell’Hereditary Non Polyposis Colon Cancer (HNPCC); i geni BRCA-1 e BRCA-2, mutati nel carcinoma della mammella; il gene ATM (atassia-teleangectasia)
3. La mutazione di questi geni non influenza direttamente la crescita cellulare né l’apoptosi ma favorisce la trasformazione e accelera la progressione neoplastica.
4. Gli individui affetti presentano instabilità di particolari regioni del DNA (coppie ripetute di 1-6 nucleotidi) denominate microsatelliti
Cancro Familiare
• L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un oncogene:
- RET sindromi tumorali – Carcinoma Familiare della Midollare della tiroide (FMTC) e Neoplasia Endocrina Multipla Tipo 2A (MEN 2A)
- MET nel cancro ereditario papillare renale - CDK4 nel melanoma familiare
• L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un gene oncosoppressore
• L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un gene che ripara il DNA
Cancro Familiare
• Una singola mutazione è insufficiente a causare il cancro
• Ulteriori alterazioni in altri geni sono necessarie all’insorgenza del cancro
Cancerogenichimici
UV
Cellula Normale
Cellula Tumorale
Radiazioni
Virus
Errori di replicazione
Danno al DNA
Mutazionipuntiformi
Riarrangiamenti(traslocazioni, delezioni,
Amplificazione)
Alterazioni al DNA di(0ncogeni e geni oncosoppressori)- Quando avviene un’alterazione in un gene della linea germinale
Insorge un cancro familiare- Proliferazione sregolata
Geni Tipi di cancro
APC Carcinoma colon/retto
BRCA1 Carcinomas ovarico e della mammella
BRCA2 Carcinomas della mammella
DPC4 Carcinoma pancreatico
INK4 Melanoma; ca del polmone, tumori del cervello, leucemie, linfomi
MADR2 Carcinoma colon/retto
NF1 Neurofibrosarcoma
NF2 Meningioma
p53 Tumori del cervello; Ca della mammella, colon/retto, esofageo, fegato, e polmone; sarcomi; leucemie e lymfomi
PTC Carcinoma cellule basali
PTEN Tumori del cervello; melanoma; Ca della prostata, endometrio, rene, e polmone
Rb Retinoblastoma; sarcomi; ca della vescica, mammella, e polmone
VHL Carcinoma cellule renali
WT1 Tumore del Wilms
Ereditarietà del retinoblastoma
La suscettibilità al retinoblastoma è trasmessa al 50% dei discendenti.
Forma ereditaria Mutazioni somatiche
Retinoblastoma e ciclo cellulare
La cellula decide se Proseguire nel ciclo cellulare
o arrestarsi
Punto di restrizione
Rb è il principale gene che controlla il punto RQuindi è un target (diretto o indiretto) del processo di cancerogenesi
Ruolo di p53 nel Controllo del ciclo
cellulare
Il Retinoblastoma inibisce la trascrizione di geni contenenti siti di legame per i fattori di trascrizione E2F
G1 S
G2
M
p16ARFpRbp53p21ATM
Rb
p21ATM
In loro assenza, le cellule con DNA danneggiato continuano a generare nuove cellule senza riparare il danno
La maggior parte dei geni oncosoppressorisono regolatori del ciclo cellulareAlcuni oncosoppressoribloccano il ciclo cellularein presenza di danno al DNAo incompleta Rip. del DNA
Alcuni oncosoppressori sono responsabili dellariparazione del DNA danneggiato
Geni che riparano il DNA
• Il cancro insorge anche per difettiva riparazione del DNA
• Mutazioni nei geni (BRCA1, BRCA2) induce suscettibilità per il Ca della mammella
• Geni (MSH2, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6) nella suscettibilità del Hereditary Non-polyposis Colon Cancer (HPNCC)
P16 (Hereditary Melanoma)
• p16 è mutato o deleto nelle leucemie e nel cancro della testa e del collo. E’ mutato nel melanoma comprese le forme familiari della malattia.
• p16 è un membro della famiglia INK4 degli inibitori cyclin dependent kinase inhibitor
• p16 protegge l’ Rb dall’iperfosforilazione ed inattivazione da parte di cyclin D1/CDK4
• Quando p16 è mutato o deleto non è capace di eseguire questa funzione
Conclusioni
• Il Cancro è una malattia multifattoriale, fattori ambientali e genetici contribuiscono allo sviluppo dei tumori
• Alterazioni nei proto-oncogeni e nei geni oncosoppressori causano la predisposizione all’insorgenza di tumori. Ma non causano il cancro
• Lo sviluppo del cancro è un processo multifasico: Addizionali mutazioni sono necessarie affinché si possa sviluppare un tumore
• Possono essere necessari fino a 6-12 mutazioni per lo sviluppo del cancro
• I cambiamenti genici possono avvenire negli oncogeni, nei geni oncosoppressori, nei geni che regolano l’apoptosi che riparano il DNA e che controllano la differenziazione
• La predisposizione ereditaria avviene circa nel 15% dei tumori per mutazioni ereditarie in:
• Geni oncosoppressori• Geni che riparano il DNA• Raramente oncogeni
Oncogeni: Attivati da Mutazioni Dominanti (GOF) Oncosoppressori: Inattivati da Mutazioni Recessive (LOF)
Cellule proliferanti in modo abnorme
Mutazione attivante permette l’oncogene a stimolare la proliferazione cellulare
Cellula normale
Una singola mutazione
crea l’oncogene
Due mutazioni inattivanti eliminano la funzionalmente il gene oncosoppressore, stimolando la proliferazione cellulare
Cellula normale
Una mutazione
Inattiva un gene oncosoppressore
La mutazione di una singola copia del gene non ha effetto
La 2°mutazione
Inattiva un gene oncosoppressoreInattiva il gene oncosoppressore
Loss of Heterozygosity (LOH)
Perdita di EterozigosiLa seconda mutazioneinattivante di una normale copia del gene
può avvenire mediante alcuni meccanismi
SecondMutation
La natura multifasica del cancro
• •Lo sviluppo del cancro è un processo multifasico che coinvolge 6-12 cambiamenti in geni regolatori.
• Lo sviluppo del cancro dipende da alterazioni in vari pathways della trasduzione del segnale nella cellula. Esempio: il cancro Colon-rettale.
• Lo sviluppo del cancro dipende dall’alterazione di molti geni in un pathway di transduzione. In molti casi queste alterazioni possono essere ridondanti.
p53 p53
MDM2
p21
GADD45
BAX
FAS
IGF-BP3
Cdk4/6
cyclin D
+
Espressione di Geni in S-fase
pRB inattiva
E2F ATTIVO
PCNADNA pol a
Apoptosi
Arresto in G1
Targets Trascrizionali di p53
Attivazione di p53- incremento dei livelli di proteina- modificazione (Fosforilazione)
Danno al DNA
ATM/R
http://www.cineca.it/networking/streaming/sestri/courses/cancgen/Bernards.htm
http://www.cineca.it/networking/streaming/sestri/courses/cancgen/Bernards.htm