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Nuovemutazioninellaleucemiamielomonoci/cacronica
Firenze31marzo2011
DANIEL A CILLONIUNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI TORINODIPARTIMENTO DI SCIENZE CLINICHE EBIOLOGICHE
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c‐Ros1c‐Ros1••HumanHumanorthologorthologofDrosophilaofDrosophilasevenlesssevenlesslocatedonlocatedonchromosome6,locusspanningover130Kbpchromosome6,locusspanningover130Kbp
••ExpressedinExpressedinfetal/ssuesfetal/ssues
••ExpressedinaExpressedinavarietyoftumorsvarietyoftumors(especiallyNSCLCand(especiallyNSCLCandglioblastoma)glioblastoma)
••ItencodesforanItencodesforanorphanReceptorTyrosinekinaseorphanReceptorTyrosinekinasestructurallystructurallyunrelatedtoanyotherRTKs.unrelatedtoanyotherRTKs.
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FIG-ROS fusion geneIden/fiedinhumanglioblastomacelllineU118MG
Fusiongenedueto240kbdele/ononchr6
Fusion between exon 7 ofFIGandex36ofROS
CharestA.etal;Genes,Chromosomes&Cancer2003
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Analysisoftheexpressionlevelsof96TKsindifferenttypesofMPNusingmicrofluidiccards
ROS1 is highly expressed in the 4 CMML cases included inthe study
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p<0.001
p<0.001
ROS1 expression in CMML cells by RQ-PCR
CD34+
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ROS1 protein in CMML cells by RQ-PCR
SW1088CMMLCTRLNEGCTRLBM PB BM PB
c‐ros260kDa→
45kDa→ Actin
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ROS1 protein in CD34+ and monocytes
CD34+ Monocytes
CTRL CTRL
CMML CMML
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Why is ROS1 overexpressed?
Which are the consequences of ROS1overexpression?
Which pathways are activated by ROS1?
May ROS1 represent a druggable target?
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Whatleadsderegulatedc‐Ros1expression?
mutaPon/swithinthepromoterregion?
Sequencing800bpSequencing800bpupstreamATGupstreamATG
Nomuta/onsinCMMLptsNomuta/onsinCMMLpts
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46,XY,3q-,6q-,-11,der(22),+mRP1-92C8RP1-179P9
InterphasecellswerelabelledwithInterphasecellswerelabelledwithprobesfromPAC(cloneRP1‐92C8)andprobesfromPAC(cloneRP1‐92C8)andBAC(cloneRP1‐179P9)BAC(cloneRP1‐179P9)
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SNPs analysis
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Why is ROS1 overexpressed?
Which are the consequences of ROS1overexpression?
Which pathways are activated by ROS?
May ROS1 represent a druggable target?
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EGFR-ROS chimera
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Transmembrane (TM) TK Domain
COOH
1 625 1852 1863 1882 1940 2218
EC Domain
NH2
EGFR ROS
Egfr/c-Ros CHIMERAEgfr/c-Ros CHIMERA
pBSK.Egfr/c-Ros
pcDNA3.1HisC.Egfr/c-Ros
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SW1088 pcDNA ER
ROS
42 kDa
∼150 kDa
Actin
pcDNA ER
FBS+ FBS- EGF FBS+ FBS- EGF
ROS1
p-ROS1
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Proliferation of ER transfected cells
H3 tymidine incorporation
MTT assay
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HEK 293T
ROS1 activation reduces cell adhesion
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ER ER + EGF
ANNEXIN VI ANNEXIN V
Perc
enta
ge o
f apo
ptos
is
ROS1 activation reduces apoptosis
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ROS1 activation induces
Incresed proliferation
Reduction of cell adhesion
Mild reduction of apoptosis
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Which pathways are activated by ROS?
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SW1088 pcDNA ER
IP (GRB2 and ROS/SOS)
SOS
ROS
ROS
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p-Erk 1/2
ER+FBS ER-FBS ER+EGF
Erk1/2
p-Akt
Akt
actin
pROS pErk/Erk pAkt/Akt
ERK and AKT pathways are activated by ROS1
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pAkt
pErk 1/2
Erk 1/2
Akt
Actin
CTRL CMML
pROS
pErk/Erk pAkt/Akt
The same pathways are activated in CMML patientsoverexpressing ROS1
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Why is ROS1 overexpressed?
Which are the consequences of ROS1overexpression?
Which pathways are activated by ROS?
May ROS1 represent a druggable target?
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ROS1 inhibitors ( Nippon-Shinyaku-Japan)
ROS JAK2 JAK3 Src TRKA ALK INSR Syk FLT-3 EGFRcompond E 0.88 47 300 33 16 440 3500 3700 2100 > 10000compound F 6.0 690 > 10000 1300 18 1900 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000
kinase inhibition (IC50, nM)
ROS JAK2 JAK3 Src TRKA ALK INSR Syk FLT-3 EGFRcompound A 6.8 1.8 65 20 52 110 > 10000 1300 560 > 10000compound B 8.4 15 390 100 10 730 6700 9600 740 > 10000compound C 2.6 130 790 110 51 1700 > 10000 > 10000 6900 > 10000compound D > 10000 0.8 32 > 10000 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
kinase inhibition (IC50, nM)
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APOPTOSYS in HCC 78 cell line
HCC-78-CTRL
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
2.5%
3.9%93.6%
HCC-78-COMPOUND A 1 µM
PR
OP
IDIU
M P
E-
AANNEXIN FITC-A
90.9%5.4%
3.7%
HCC-78-COMPOUND D 1 µM
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
94.1%3.9%
2%
HCC-78-COMPOUND E 1 µM
ANNEXIN FITC-A
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
70.6%15.8%
13.5%
HCC-78-COMPOUND F 1 µM
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
72.6%8.5%
18.8%
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CMMLpatientROS+
RQ‐PCRexpression=15393
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APOPTOSYS (CD34+ pz CMML ROS+)
pz CMML-CTRL
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
48.6% 44.6%
6.1%
pz CMML-COMPOUND A 300nM
ANNEXIN FITC-A
37.1%
2.7%
60.1%P
RO
PID
IUM
PE
-A
pz CMML-COMPOUND D 300 nM
ANNEXIN FITC-A
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
48.4% 46.5%
5.1%
pz CMML-COMPOUND E 200 nM
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
34.6% 59.2%
5.8%pz CMML-COMPOUND F 300 nM
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
43.2%
8.4%
48.3%
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APOPTOSYS in PMF patient ROS1 negative
pz PMF-CTRL
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
83.8% 14.1%
2%
pz PMF-COMPOUND A 300 nM
ANNEXIN FITC-A
78.7%
1.7%
19.4%P
RO
PID
IUM
PE
-A
pz PMF-COMPOUND D 300 nM
ANNEXIN FITC-A
PR
OP
IDIU
M P
E-
A 74.3% 23.1%
2.4%
pz PMF-COMPOUND E 200 nM
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
77.5% 19.1%
3.4%
pz PMF-COMPOUND F 300 nM
PR
OP
IDIU
M P
E-
A
ANNEXIN FITC-A
77.4%
1.5%
20.9%
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UniversityofTurin
Departmentofclinicalandbiologicalsciences
Enrico BraccoSonia CarturanValentina Campia
ROS inhibitors
Nippon-Shinyaku-Japan)Masaki Nogawa
SNPs array
University of BolognaIlaria IacobucciGiovanni Martinelli