Modifikation der Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode (EMD) zur Identifikation von Punktmutationen im PMP22-Gen
nach DNA-Isolierung aus Nerv, Muskel oder Blut
Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der
Medizin genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Cordula Margarete Nellessen geb. Fuchs
aus
Düren
Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr. med. J. Michael Schröder Herr Universitätsprofessor Dr.med. Johannes Noth
Tag der mündlichen Prüfung: 25. November 2003 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung
2. Mutationen im PMP22-Gen bei hereditären motorisch-sensorischen Neuropathien 2.1. Historische Entwicklung
2.2. Klinisches Erscheinungsbild
2.3. Elektrophysiologische Diagnostik
2.4. Morphologie
2.5. Differentialdiagnosen
2.6. Therapie und Prognose
3. Patientenkollektiv
4. Untersuchungsgut
5. Methoden
5.1. DNA-Extraktion aus paraffineingebetteten formalin- oder glutaraldehydfixierten Suralnerven- bzw. Muskelbiopsien
5.2. DNA-Extraktion aus Frischmaterial (Nerv, Muskel, Blut)
5.3. Polymerase-Kettenreaktion
5.4. Kapillarelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte auf dem ABI
PRISM 310
5.5. Aufreinigung der PCR-Produkte
5.6. Identifikation heterozygoter Punktmutationen mit der Enzymatischen
Mutationsdetektionsmethode (Enzymatic Mutation Detection, EMD)
5.7. Automatisierte DNA-Sequenzanalyse
6. Ergebnisse
6.1. Allgemeine Anmerkungen
6.2. Ergebnisse der Methodenoptimierung
6.3. Patient Nr. 18
6.4. Untersuchung auf Mutationen im Cx32-Gen
6.5. Untersuchung auf MPZ Mutationen
6.5.1. Probe Nr. 5
6.6. Patienten Nr. V1, V18, und 44
7. Diskussion
7.1. Diskussion der Methode
7.2. Diskussion der Analyseergebnisse
7.3. Bedeutung des Polymorphismus in Probe Nr. 18
7.4. Potentielle Mutationen außerhalb des codierenden Bereichs des PMP22-Gens
7.5. Punktmutationen im P0-Gen – gemeinsamer Pathomechanismus für CMT1A und CMT1B?
7.6. Andere im Zusammenhang mit HMSN stehende Gene und Proteine
7.7. Differentialdiagnostische Überlegungen
8. Zusammenfassung
9. Literatur
10. Anhang
10.1. Sequenzen der untersuchten Exone des PMP22-Gens
10.2. Patientenkollektiv: Histologie und Klinik
10.3. Übersicht der Analyseergebnisse
11. Danksagung
1. Einleitung
Bei der hereditären motorisch-sensorischen Neuropathie (HMSN), auch Charcot-
Marie-Tooth (CMT) Krankheit genannt, handelt es sich um die häufigste erbliche
Erkrankung des peripheren Nervensystems. Dabei umfasst der Begriff HMSN eine
Gruppe genotypisch heterogener Krankheitsbilder, die in der phänotypischen
Ausprägung hervorstechende Gemeinsamkeiten zeigen. Diese sind insbesondere
eine chronisch progrediente, symmetrische Schwäche und Atrophie vornehmlich der
distalen Extremitätenmuskulatur, Sensibilitätsstörungen, eventuell auch
Fußdeformitäten und ein herabgesetztes Reflexniveau (Pareyson 1999).
Nach klinischen, morphologischen und molekulargenetischen Parametern
lassen sich die Krankheitsbilder wie folgt einteilen (nach Dyck et al. 1993; Poeck und
Hacke 1998 und http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html):
• CMT1: demyelinisierende Form
• CMT2: axonale Form
• DSS: Dejerine Sottas Syndrom, schwere demyelinisierende Form
• CMT4: demyelinisierende Form (rezessiv)
• CMT5-7: mit spastischer Paraparese / Optikusatrophie / Retinitis Pigmentosa /
Taubheit
• CMTX: axonale und demyelinisierende Form (X-chromosomal)
• HNPP: hereditäre Neuropathie mit Neigung zur Drucklähmung
• CH: kongenitale Hypomyelinisationsneuropathie
In der vorliegenden Arbeit bezieht sich die Abkürzung HMSN auf die Gesamtheit der
zum Formenkreis hereditärer motorisch-sensorischer Neuropathien gehörenden
Erkrankungen. Die einzelnen Untergruppen werden mit den in der obigen
Klassifikation vorgestellten Abkürzungen bezeichnet. Angesichts der aufgeführten
Unterteilung der HMSN muss jedoch angemerkt werden, dass die klinische
Symptomatik sowie die histologischen, neurologischen und elektrophysiologischen
Untersuchungsbefunde einer großen Variationsbreite unterliegen, was sowohl die
exakte Klassifikation als auch die Diagnosestellung erschwert. Große Bedeutung ist
in dieser Hinsicht der molekulargenetischen Analyse beizumessen: Mit ihr ist es
möglich, einem Teil der Krankheitsbilder konkrete Mutationen zuzuordnen und somit
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Klassifikation und Diagnostik zu erleichtern. Bis heute ist für siebzehn Gene eine
Assoziation mit HMSN bekannt. Auf fünf dieser Gene, deren Veränderungen im
kausalpathogenetischen Zusammenhang mit den häufigsten Formen der HMSN
stehen, soll kurz eingegangen werden (http://molgen-www.uia.ac.be/CMTMutations/):
Das PMP22-Gen auf Chromosom 17p11.2 kodiert für ein
Transmembranprotein der Myelinscheiden peripherer Nerven. Eine Duplikation
dieses Gens liegt in bis zu 80% der Fälle dem Phänotyp der CMT1 Krankheit
zugrunde, wohingegen eine Deletion zur HNPP-Erkrankung führt. Für beide
Erkrankungen sowie CH und DSS wurden darüber hinaus Punktmutationen des
PMP22-Gens beschrieben. Das MPZ-Gen auf Chromosom 1q22 kodiert für das
Myelinprotein Zero (MPZ), welches mit 50% den größten Teil der Myelinproteine
peripherer Markscheiden ausmacht und dort als transmembranöses
Adhäsionsmolekül fungiert. Mutationen dieses Gens sind assoziiert mit den
Erkrankungen CMT1, DSS, CH und CMT2. Darüber hinaus konnten das EGR2-Gen
auf Chromosom 10q21 als ursächlich für CMT1, CH und DSS sowie das LITAF-Gen
auf Chromosom 16p13 als ursächlich für CMT1 identifiziert werden. In den aktuellen
Klassifikationen bezeichnet man den PMP22-assoziierten Typ der CMT1 als CMT1A,
den MPZ-assoziierten Typ als CMT1B, den LITAF-assoziierten Typ als CMT1C und
den EGR2-assoziierten Typ als CMT1D. Schließlich existiert neben den autosomalen
Erbgängen auch ein X-chromosomaler Vererbungsmodus, nämlich durch das Cx32-
Gen auf Chromosom Xq13. Mutationen in diesem für ein Gap Junction Protein
kodierenden Gen finden sich bei an CMTX erkrankten Patienten.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Etablierung und Optimierung eines
effizienten und zuverlässigen Screeningverfahrens für heterozygote Punktmutationen
im PMP22-Gen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen konnte ein ausgewähltes
Patientenkollektiv, welches die Krankheitsbilder CMT1, HNPP, DSS und CH umfasst,
auf bisher unbekannte Punktmutationen im PMP22-Gen untersucht werden.
Bezüglich der erstgenannten Erkrankungen wurde im Vorfeld eine Duplikation oder
Deletion ausgeschlossen. So gelangte Patientengut zur Analyse, dessen
molekulargenetische Untersuchung und damit die eindeutige diagnostische
Zuordnung noch nicht abgeschlossen waren. Während die Identifikation der
Duplikation oder Deletion des PMP22-Gens mittlerweile zur molekulardiagnostischen
Routine gehört, wird die Suche nach Punktmutationen bisher nur an einigen Zentren,
vornehmlich unter Forschungsaspekten, durchgeführt. Auf dem Hintergrund eines
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täglich wachsenden Wissens um molekulargenetische Erkrankungsmechanismen ist
es jedoch notwendig, auch in der Routinediagnostik schnell, effizient und präzise ein
umfassendes Mutationsscreening durchzuführen. Die in dieser Arbeit vorgestellte
Vorgehensweise soll hierfür ein Beispiel sein. Sie ermöglicht nicht nur eine weitere
Einengung der diagnostischen Lücke in Fällen unklarer HMSN-Erkrankungen,
sondern auch eine differenzierte humangenetische Beratung der betroffenen
Familien. Darüber hinaus kann das zunehmende Wissen um die Art der Schädigung
des PMP22-Gens in Korrelation zum klinischen Erscheinungsbild zu einem tieferen
Verständnis von der Funktion des Proteins und dem eigentlichen Pathomechanismus
der Erkrankung verhelfen. Nicht zuletzt ist die Kenntnis dieser Aspekte Fundament
für eine eventuell in Zukunft mögliche Gentherapie, die bis heute für diese Patienten
die einzige Chance auf eine kausale Behandlung ihres Leidens darstellt.
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2. Mutationen im PMP22-Gen bei hereditären motorisch-sensorischen Neuropathien
2.1. Historische Entwicklung
Erstbeschreiber der Erkrankung: Erste Veröffentlichungen zu einem Krankheitsbild,
welches die typischen Charakteristika der HMSN zeigt, finden sich bereits Mitte des
19. Jahrhunderts. Berühmte Ärzte wie Virchow (1855), Aran (1855), Eulenberg
(1856) und Friedreich (1873) beschrieben zu dieser Zeit Krankheitsfälle, die durch
eine fortschreitende distale Muskelatrophie gekennzeichnet waren (Pearce 2000,
http://www.ultranet.com/~smith/history.html).
Im Februar 1886 veröffentlichten Jean–Martin Charcot (1825-1893) und sein
Schüler Pierre Marie (1853-1940) unter dem Titel: « Sur une forme particulière
d'atrophie musculaire progressive, souvent familiale, débutant par les pieds et les
jambes et atteignant plus tard les mains » die Beschreibung eines Krankheitsbildes,
welches sie an fünf Kindern im Hôpital de la Salpétrière zu Paris studiert hatten
(Charcot et al. 1886). Nahezu zeitgleich vollendete Howard Tooth (1856-1926) eine
Arbeit an der Cambridge University in England zum Thema «The Peroneal Type of
Progressive Muscular Atrophy» (Tooth 1886). Als typische Charakteristika führten
alle drei Autoren den frühen Erkrankungsbeginn, die fortschreitende Schwächung
und Atrophie der distalen Beinmuskulatur mit späterer Ausdehnung auf die obere
Extremität und das mögliche Auftreten von Hohlfußdeformitäten sowie
Sensibilitätsstörungen an.
Während Charcot und Marie von einer muskulären Ursache ausgingen,
lokalisierte Tooth den Krankheitsursprung korrekter Weise im Bereich der peronealen
Nerven (Pearce 2000). In Reminiszenz an die drei berühmten Ärzte des 19.
Jahrhunderts ging die von ihnen beschriebene Erkrankung als Charcot-Marie-Tooth
Krankheit in die Nosologie ein. In früheren Artikeln wird man jedoch noch auf die
damalige Bezeichnung PMA für Progressive / Peroneal Muscular Atrophy stoßen,
wohingegen heute oft auch das Synonym HMSN (Hereditäre motorisch-sensorische
Neuropathie) verwendet wird.
1893 beschrieben Dejerine und Sottas in Frankreich die Krankengeschichte
zweier Geschwister, die unter einer von ihnen als interstitielle hypertrophische
Neuritis bezeichneten schwerwiegenden Muskelatrophie litten (Dejerine und Sottas
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1893). Diese Erkrankungsform wurde als hypertrophische Neuropathie oder Dejerine
Sottas Erkrankung als eigenständige Entität von der CMT Krankheit abgegrenzt.
Eine weitere Form peronealer Muskelatrophie, welche mit Tremor, Ataxie,
Pyramidenbahnzeichen und Optikusatrophie einhergeht, wurde 1926 nach den
Erstbeschreibern Roussy-Lévy-Syndrom genannt (Roussy und Lévy 1926).
Im 20. Jahrhundert bemühte man sich, die bis dahin unabhängig voneinander
veröffentlichten Syndrome und Erkrankungen des Formenkreises der „PMA“ in einer
Klassifikation zusammenzufassen; ein erster Versuche erfolgte 1927 durch
Dawidenkow. Diese Bemühungen konnten in der Mitte des 20. Jahrhunderts
entschieden verbessert und präzisiert werden durch das Aufkommen
elektrophysiologischer Messmethoden an Nerv und Muskel sowie der
Elektronenmikroskopie. So unterschieden Dyck und Lambert 1968 erstmalig anhand
von physiologischen und morphologischen Merkmalen zwei Hauptgruppen unter den
hereditären motorisch-sensorischen Neuropathien (Dyck und Lambert 1968a; Dyck
und Lambert 1968b). Zur ersten Gruppe, CMT1, gehörten Patienten, deren
Nervenbiopsien histologisch auffällige Zeichen segmentaler De- und
Remyelinisierungsprozesse aufwiesen. Die offensichtlich gestörte Myelinisierung
führte bei diesen Patienten zur Ausbildung charakteristischer
Zwiebelschalenformationen; hierbei handelt es sich um konzentrisch um das Axon
angeordnete Schwannzellfortsätze. Die unzureichende Myelinisierung der Nerven
drückte sich bei diesem Patientenkollektiv darüber hinaus in elektrophysiologischen
Untersuchungsbefunden aus, die pathologisch verlangsamte
Nervenleitgeschwindigkeiten (NLG) zeigten. Folglich wurde diese Entität auch als
demyelinisierende Form bezeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigt die axonale Form,
CMT2, in der Biopsie hauptsächlich Veränderungen der Axone wie z.B. Ausfall und
Atrophie von Nervenfasern oder auch Regenerationsgruppen, jedoch gibt es kaum
Zeichen einer Demyelinisation. Zwiebelschalenformationen kommen folglich bei
dieser Patientengruppe nicht vor. Die Nervenleitgeschwindigkeit ist nicht oder nur
geringfügig verlangsamt.
Neue Horizonte für die HMSN-Forschung öffneten sich in den 70er Jahren des
20. Jahrhunderts, als man begann, verstärkt die genetischen Grundlagen der
Erkrankung zu betrachten. Schon die Erstbeschreiber hatten Erblichkeit vermutet.
Fallbeschreibungen ließen sowohl dominante als auch rezessive, autosomale wie
gonosomale Vererbungsmodi möglich erscheinen – was erneut die außerordentliche
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Heterogenität der HMSN, nicht nur in der klinischen Ausprägung, sondern auch im
molekulargenetischen Korrelat, unterstreicht. So erweiterte Dyck seine Klassifikation
1975 unter Berücksichtigung von Klinik und Vererbungsmodus auf 7 Untergruppen
(siehe Einleitung).
Entdeckung des PMP22-Gens im Zusammenhang mit CMT1: Im Jahre 1989
konnten Vance und Kollegen erstmalig aufzeigen, dass bei CMT1-Familien eine
Kopplung der Erkrankung zum Chromosom 17p11.2-12 besteht (Vance et al. 1989).
Ein weiterer entscheidender Durchbruch gelang, als man eine Tandemduplikation auf
dem Chromosom 17p11.2-12 durch positionelle Clonierung identifizieren konnte
(Raeymaekers et al. 1991; Lupski et al. 1991). Der duplizierte Abschnitt in der Größe
von etwa 1,5 Megabasen umfasst eine Distanz von 6 CentiMorgan (Raeymaekers et
al. 1991). Neben der autosomal dominanten Vererbung kommt es nicht selten zu
einem de novo Ereignis der Tandemduplikation. Dieses findet zu 90 % während der
väterlichen Spermatogenese statt. So konnte für Familien, bei denen zunächst ein
rezessiver Erbgang vermutet worden war, die Erkrankung auf eine de novo Mutation
zurückgeführt werden (Keller und Chance 1999).
Die Identifikation der Duplikation warf weitere Fragen auf: Welches Gen bzw.
welche Gene sind in dieses Ereignis involviert und welche molekularen
Mechanismen führen schließlich zur Ausprägung des CMT1 Phänotyps? Werden
Gene im Bereich der Bruchstellen frakturiert und damit unwirksam oder liegt der
Erkrankung eher ein Gendosiseffekt zugrunde? Hinweise für letztere Vermutung
lieferte die Betrachtung von Patienten, die eine totale oder partielle Trisomie für das
Chromosom 17p trugen und unter anderem ähnliche Symptome wie CMT1A
Patienten zeigten (Chance et al. 1992). Entscheidende weiterführende Erkenntnisse
brachte schließlich die Betrachtung der Tiermodelle für CMT1: die Trembler Maus
(Tr) und die Trembler j Maus (Tr j). Beide zeigen CMT-ähnliche Symptome, beide
tragen Punktmutationen in den transmembranösen Domänen des PMP22-Gens auf
dem murinen Chromosom 11 (Tr: G150→D, Tr j L16→P) (Suter et al. 1992a; Suter et
al. 1992b). Da diese Region synthän zum humanen Chromosom 17p ist, gelang es
Patel et al. (1992) den homologen Genort auf Chromosom 17p12-p11.2 zu
identifizieren. Die Arbeitsgruppe konnte des Weiteren zeigen, dass bei Trägern der
Tandemduplikation eben jenes Gen stark exprimiert und daher in verdoppelter und
nicht in frakturierter Form vorliegen muss; somit war ein weiterer Hinweis für einen
Gendosiseffekt gefunden.
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Die Sequenz des PMP22-Gens wird im
Abstand von ca. 1,5 Mb von zwei sehr
ähnlichen repetitiven Sequenzen flankiert, den
sogenannten proximalen und distalen CMT1A-
REP. Diese Tatsache prädestiniert für die
Tandemduplikation durch ein ungleiches
nichthomologes Crossing-over, aus dem zwei
reziproke Mutationen resultieren: Eine das
PMP22-Gen umfassende 1,5 Mb große
Deletion sowie die bei CMT1A beschriebene
Duplikation von 3 Mb, welche je die zwei
repetitiven Sequenzen, zwei PMP22-Gene
sowie zentral eine hybride Repeatsequenz
umfasst (siehe Abbildung 1).
Der beschriebene Mutations-
mechanismus ist für 76% der familiären und
53% der sporadischen Fälle verantwortlich
(Rieß und Schöls 1998a). Die Duplikation
erklärte also nicht alle Fälle von CMT1; darüber
hinaus gibt es Familien, in denen
Kopplungsanalysen zwar auf den selben
Genort 17p12-p11.2 hinweisen, bei denen
jedoch keine Duplikation vorliegt. Bereits 1992
gelang es Valentijn et al. eine Missensemutation im PMP22-Gen nachzuweisen –
faszinierender Weise dieselbe Mutation, die man bei der Trembler-J Maus identifiziert
hatte. Weitere Veröffentlichungen von Punktmutationen im PMP22-Gen bei CMT 1
Patienten folgten, so dass die Zahl bislang auf etwa zwölf gewachsen ist (Roa et al.
1993b; Fabrizi et al. 1999).
Abbildung 1: Durch ein nichthomologes Crossing-over kommt eszur Duplikation (CMT1A Phänotyp)bzw. Deletion (HNPP Phänotyp) (Rießund Schöls 1998a)
x
Deletion HNPP
Duplikation: CMT IA
Rep
PMP22
Rep
PMP22
Rep
Rep Rep
PMP22
Rep
PMP22
Rep
Rep
Das PMP22-Gen und HNPP: Durch De Jong (1947) wurde erstmals diese
durch Druckschädigung ausgelöste Neuropathie im Zusammenhang mit Migräne
beschrieben. Dyan et al. (1968) und Behse et al. (1972) betonten besonders die
globulären Verdickungen der Myelinscheiden, „Sausages“, welche dann 1975
erstmalig mit dem entsprechenden Fachterminus „Tomakula“ von Madrid und
Bradley (1975) bezeichnet wurden. Den molekularpathologischen Ursachen kam
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man 1993 auf die Spur, als Chance et al. (1993) mit Hilfe von DNA Markern eine 1.5
Mb große Deletion auf Chromosom 17p11.2 nachweisen konnten. Die deletierte
Region umfasste nicht nur das PMP22-Gen, sondern auch sämtliche in der CMT1A-
Duplikation enthaltenen Marker. Dies legte die Vermutung nahe, dass mit der HNPP
der reziproke Phänotyp des zum CMT1A führenden Pathomechanismus gefunden
worden war. Dies wird darüber hinaus durch die Tatsache erhärtet, dass die
Bruchstellen für beide Erkrankungen im selben Intervall auf 17p11.2 liegen. Die
Häufigkeit der Deletion als Ursache für die HNPP liegt bei 86% in familiären und bei
77% in sporadischen Fällen (Rieß uns Schöls 1998a). Wie für die CMT1A sind auch
de novo Deletionen beschrieben worden (Stögbauer et al. 1998), die ebenfalls
häufiger paternalen Ursprungs sind. Auch sind im Zusammenhang mit der HNPP
zurzeit zehn Sequenzveränderungen des PMP22-Gens bekannt. Es handelt sich
meist um schwerwiegende Ereignisse, die zu komplettem Funktionsverlust bzw.
Ausfall eines Allels führen wie Frameshiftmutationen (Nicholson et al. 1994; Young et
al. 1997) oder Veränderungen der splice site (Bort et al. 1997); aber auch „einfache“
Punktmutationen sind beschrieben worden (Sahenk et al. 1998). Es ist zu vermuten,
dass die HNPP häufiger ist als allgemein angenommen wird; dies kann z.B. an der
sehr variablen, teilweise nur milden Ausprägung des Phänotyps liegen. Einige
Autoren empfehlen daher das Deletions-Screening bei jeder Art von
demyelinisierender Neuropathie ungeklärter Genese (Kumar et al. 1999).
Das PMP22-Gen und DSS: Nach der Erstbeschreibung 1893 wurde diesem
Krankheitsbild in den Mitte des 20. Jahrhunderts verstärkte Aufmerksamkeit gezollt,
mehrere Autoren beobachteten die Hypertrophische Neuropathie über bis zu 5
Generationen hinweg (Bedford und James 1956; Croft et al. 1957). Die
Beschreibungen ließen einen rezessiven autosomalen Vererbungsmodus vermuten.
Die Symptomatik ist bei DSS zwar schwerer ausgeprägt als bei CMT1, jedoch haben
beide Syndrome sehr viele Gemeinsamkeiten. Daher war es naheliegend, auch in
diesen Fällen das PMP22-Gen auf Mutationen zu untersuchen. Tatsächlich gelang
es Roa et al. (1993a) erstmals, dort - wohlgemerkt dominante - Punktmutationen
nachzuweisen. In der Folge bestätigten weitere Veröffentlichungen (bislang
mindestens 16) von sowohl dominanten als auch rezessiven Mutationen den
kausalpathogenetischen Zusammenhang zwischen Gen und Erkrankung (Marques et
al. 1998; Parman et al. 1999; Ohnishi et al. 2000). Gerade angesichts dieser
Ergebnisse wird mehr denn je diskutiert, ob es sich bei der Erkrankung tatsächlich
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um ein eigenständiges Krankheitsbild handelt, oder ob nicht viel mehr das DSS als
extreme Form des klinisch-symptomatischen Kontinuums der CMT1-Erkrankung
anzusehen ist (Vance 2000; Keller und Chance 1999).
Das PMP22-Gen und CH: Ähnliches wird bei der Betrachtung der
kongenitalen Hypomyelinisationsneuropathie (CH) deutlich. Hier wiederum fällt
klinisch besonders die Abgrenzung zum DSS schwer. Im PMP22-Gen wurden bei CH
Patienten bisher mindestens 2 Punktmutationen gefunden (Simonati et al. 1999;
Fabrizi et al. 2001).
Funktion des Proteins und Pathomechanismus: Das PMP22-Gen codiert für
ein Transmembranprotein, welches sich in den kompakten Anteilen der
Myelinscheiden peripherer Nerven befindet (Snipes et al. 1992). Das 160
Aminosäuren umfassende Protein hat ein Molekulargewicht von 18 Kilodalton (kDA),
welches durch Glykosylierung auf 22 kDa erhöht wird (Manfioletti et al. 1990); es
durchzieht die Plasmamembran mit 4 Domänen (siehe Abbildung 2). Es macht etwa
5% des gesamten Myelins aus. Darüber hinaus
wird das Gen auch in anderen Geweben
exprimiert, zwei verschiedene Promotoren
ermöglichen die Transkription der jeweiligen
gewebsspezifischen Form (Suter et al. 1994).
Transkriptionsprodukte, die das Exon 1A
enthalten, finden sich in hohem Maße während
der Myelinbildung peripherer Nerven, während
Exon 1B enthaltende Proteine bevorzugt in nicht
neuralen Geweben wie z.B. Fibroblasten
aufzufinden sind. Die Funktionen des Proteins
und seine Interaktion mit anderen zellulären Strukturen werden zurzeit noch intensiv
beforscht, doch sind in den letzten Jahren schon einige Aspekte diesbezüglich
bekannt geworden, die für das Verständnis der HMSN von besonderem Interesse
sind. In Zellkulturen regelt PMP22 sowohl Zelltod als auch, in Abhängigkeit von der
Rho-GTPase, die Zellentfaltung (cell spreading) von Fibroblasten und Schwannzellen
(Brancolini et al. 1999; Fabbretti et al. 1995). Im Zusammenhang mit der Duplikation
bei CMT1A und der Deletion bei HNPP wurde, wie bereits erwähnt, ein Gen-Dosis-
Effekt als Pathomechanismus vermutet (Patel und Lupski 1994). Mehrere Studien
konnten die Vermutung untermauern, dass die gestörte Stöchiometrie des PMP22-
Abbildung 2: Aufbau des PMP22-Proteins (http://molgen-www.uia. ac.be/CMTMutations/)
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Gens für die Myelinisationsstörungen der HMSN verantwortlich sein könnte (Vallat et
al. 1996; Gabriel et al. 1997; Robaglia-Schlupp et al. 2002).
Da Träger von Punktmutationen häufig schwerer betroffen sind als Träger der
Duplikation und da die meisten Mutationen in den Transmembrandomänen gefunden
wurden, wird in diesen Fällen schon länger ein „gain-of–function“ Mechanismus
vermutet (Hanemann et al. 1998). Auch das Tiermodell unterstützt diese These, da
Trembler Mäuse (PMP22-Punktmutation Tr: G150→D) wesentlich stärker betroffen
sind als Mäuse, die nur ein Allel tragen (PMP22+/-) (Adlkofer et al. 1997).
Punktmutierte Proteine, wie sie bei CMT1 und DSS vorkommen, können weder
Apoptose noch Zellwanderung und Zellformung regelrecht induzieren (Brancolini et
al. 1999). Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass Wildtyp PMP22 an der
Zelloberfläche präsentiert wird, während die punktmutierten Varianten im Bereich des
endoplasmatischen Reticulums zurückgehalten wurden (D'Urso et al. 1998; Naef und
Suter 1999; Brancolini et al. 2000). Die Versuche von Brancolini et al. deuten darauf
hin, dass die Mutationen den intrazellulären Transport stören und die PMP22-
Proteine durch mangelnde Präsenz an der Zelloberfläche ihre oben beschriebenen
Funktionen nicht ausführen können. Die Arbeitsgruppe vermutet, dass gerade
fehlende Interaktion mit dem MPZ-Gen für den Pathomechanismus verantwortlich
sein könnte (Brancolini et al. 2000). Darüber hinaus ist es möglich, dass es zu
intrazellulären Wechselwirkungen von mutiertem PMP22 mit Wildtyp PMP22 oder
anderen Proteinen des endoplasmatischen Reticulums (ER), vielleicht sogar dem
MPZ-Protein, kommt und dadurch zusätzlich die Verfügbarkeit der Myelinproteine an
der Zellmembran reduziert wird (Naef et al. 1997; D'Urso et al. 1999; Tobler et al.
1999). Die enorm reduzierte myelinspezifische Genexpression könnte außerdem
erklärt werden durch eine Signaltransduktionskaskade zwischen ER und Zellkern,
welche durch die missgefalteten PMP22-Proteine induziert wird (Kamholz et al.
2000). Diverse Studien deuten darauf hin, dass die veränderte Physiologie der
Schwannzellen schließlich zu axonaler Degeneration und damit zu progredienter
Schwächung und Behinderung der betroffenen Patienten führt (Watson et al. 1994;
Sahenk 1999).
Andere involvierte Gene: Erste Kopplungsstudien zeigten in den 80er Jahren,
dass bei einem Teil der CMT1-Familien das krankheitsverursachende Gen zum Duffy
(Fy) Blutgruppenlocus auf Chromosom 1 gekoppelt war (Bird et al. 1982; Stebbins
und Conneally 1982). Anfang der 90er Jahre konnten dann Hyasaka et al. das
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sogenannte MPZ-Gen auf Chromosom 1q22 als weiteres in die Pathogenese der
HMSN involviertes Gen identifizieren, welches für das transmembranöse
Adhäsionsmolekül Myelinprotein Zero (auch P0-Protein genannt) kodiert.
Punktmutationen in diesem Gen können zu CMT1B, welche phänotypisch kaum von
CMT1A unterscheidbar ist, zum Dejerine Sottas Syndrom oder CH führen (Hayasaka
et al. 1993a; Hayasaka et al. 1993b; Warner et al. 1996). Auch Mutationen des
EGR2-Gens, kodierend für einen Transkriptionsfaktor der Myelinogenese, bewirken
demyelinisierende Neuropathieformen wie CMT1, DSS und CH (Warner et al. 1998;
Timmerman et al. 1999).
Die Arbeitsgruppe um Street et al. identifizierte jüngst einen weiteren mit
CMT1 assoziierten Lokus auf Chromosom 16p13.1-p12.3: das „lipopolysaccharide-
induced tumor necrosis factor-alpha factor“-Gen (kurz LITAF oder SIMPLE) (Street et
al. 2002; Street et al. 2003). Die Autoren beschreiben Mutationen in drei Familien.
Das zugehörige Protein scheint eine Rolle im Proteinabbau zu spielen. Welche
Pathomechanismen zum Tragen kommen und wie häufig solche als CMT1C
klassifizierten Fälle sind, bleibt allerdings zum jetzigen Zeitpunkt noch offen.
Neben den autosomalen Erbgängen war schon lange ein X-chromosomaler
Vererbungsmodus vermutet worden. Nach Kopplungsanalysen in den achtziger
Jahren (Gal et al. 1985) konnten schließlich 1992 Bergoffen et al. Mutationen im
Cx32 Gen auf Chromosom Xq13 identifizieren (Bergoffen et al. 1993), und bis heute
ist die Zahl der beschriebenen Mutationen (über 250) beständig gewachsen
(Senderek et al. 1999; Felice und Seltzer 2000).
Abbildung 3 auf Seite 15 verdeutlicht in einer Zusammenschau einerseits den
Aufbau einer myelinisierten Nervenfaser, andererseits die Lokalisation einiger der
erwähnten Proteine in der Myelinscheide.
Für die Diagnostik ist die Kenntnis dieser involvierten Gene insofern von
Bedeutung, als bei unbekannter Familienanamnese ein CMT1 Patient ohne
Duplikation des PMP22-Gens durchaus Träger eines Defektes in einem der anderen
Gene sein kann.
11
ein
bes
we
bei
CM
z.
(Ne
(MT
al.
Abbildung 3: Aufbau eines myelinisierten Axons. In Abbildung A ist eine „entrollte“myelinisierende Schwannzelle dargestellt. Abbildung B zeigt die Proteine, die im kompaktenbzw. nicht-kompakten Myelin enthalten sind: Links die Proteine des kompakten Myelins P0,PMP22 und MBP (myelinbasisches Protein), rechts das nicht-kompakte Myelin mit denProteinen Cx32, E-Cadherin, DM20 (Isoform des Proteolipid-Proteins), MAG (Myelin-assoziiertes Glycoprotein) und Claudin (Scherer und Arroyo 2002)
Aktuelle Situation, Ausblick: Trotz weitreichender Erkenntnisse konnte für
en nicht unbeträchtlichen Teil der HMSN-Patienten bisher keiner der
chriebenen genetischen Defekte identifiziert werden, so dass die Suche nach
iteren beteiligten Genen noch lange nicht abgeschlossen ist. Neben dem kürzlich
CMT1C beschriebenen LITAF-Gen sind besonders für die rezessiv vererbte Form
T4 in den letzten Jahren neue Gene als ursächlich involviert beschrieben worden
B. das „ganglioside-induced differentiation-associated protein 1“-Gen (GADP1)
lis et al. 2002; Senderek et al. 2003), das „myotubularin-related protein-2“-Gen
MR2) (Bolino et al. 2000), das „SET binding factor 2“-Gen (SBF2) (Senderek et
2003) und das „N-mycdownstream-regulated gene 1“-Gen (NDRG1) (Kalaydjieva
12
et al. 2000), so dass das Wissen um die Ursachen dieser Erkrankungen mit enormer
Dynamik an Umfang gewinnt.
Mittlerweile kann für einige der HMSN auch eine pränatale Diagnostik und
Beratung durchgeführt werden, die zurzeit das PMP22-, MPZ- und Cx32-Gen
umfasst (Bird 2000). Allerdings muss man sagen, dass die pränatale Diagnostik bei
Erkrankungen, die sich erst im frühen Erwachsenenalter manifestieren, eher selten
ist und einer sorgfältigen genetischen Beratung bedarf. Ähnliches gilt für die
Präimplantationsdiagnostik (PID), die in einigen Ländern bereits erfolgreich für Paare
mit HMSN angeboten wird (De Vos et al. 1998).
Nicht zuletzt schafft das wachsende Wissen über die
molekularpathogenetischen Zusammenhänge der HMSN die Basis für zunehmende
Fortschritte in Richtung kausaler Therapiemöglichkeiten (Bell und Haites 1998). So
wurde bereits im Tierversuch gezeigt, dass transplantierte Gliazellen
Myelinisatinsprozesse im ZNS ermöglichen können (Archer et al. 1997). Kamholz et
al. (2000) zeigen in einer Übersicht, dass durch Gentransfer mit rekombinanten
Adenoviren als Vektoren die Genexpression in den wichtigsten Zellgruppen des
peripheren Nervensystems modifiziert werden kann. Solche Ansätze lassen auf
weitere Fortschritte auch zur Behandlung der hereditären demyelinisierenden
Erkrankungen des peripheren Nervensystems hoffen.
13
Abbildung 4 zeigt eine fürHMSN typische Fußdeformitätmit Hammerzehen, Hohlfußund Atrophie der kleinenFußmuskulatur (http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html)
www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html)
2.2. Klinisches Erscheinungsbild 2.2. Klinisches Erscheinungsbild
Von der CMT1Von der CMT1 sind etwa einer von 2500 Personen
betroffen (Lupski und Garcia 1992). Damit ist sie die
häufigste neurogenetische Erkrankung und somit
auch der vorherrschende Krankheitstyp unter den
HMSN. Dem Kliniker präsentiert sich eine
weitgefächerte Symptompalette, deren Ausprägung
selbst innerhalb einer Familie einer hohen Variabilität
unterworfen sein kann. Erste Symptome zeigen sich
meist im ersten bzw. zweiten Lebensjahrzehnt
(durchschnittliches Ersterkrankungsalter 12,2 ± 7,3
Jahre), selten auch im Erwachsenenalter. Die
Patienten leiden unter distal betonten, chronisch
progredienten atrophischen Paresen, die besonders
die kleinen Fußmuskeln und die
Unterschenkelmuskulatur (Fußheber: Mm. peronei und
tibiales anteriores) betreffen. Durch die fortschreitende
Schwächung der Muskelgruppen kommt es zu
Skelettdeformierungen wie Pes cavus oder equinovarus
und Hammerzehen (siehe Abbildung 4) sowie
Gangauffälligkeiten (Stepper- oder Bügeleisengang).
Eventuell können verdickte Nervenstränge unter der Haut
tastbar sein, z.B. am Sulcus ulnaris oder am
Fibulaköpfchen.
Die neurologische Untersuchung zeigt oft Minderung
oder Verlust der Sehnenreflexe der unteren Extremität
sowie teilweise leichte Sensibilitätsstörungen, die im frühen
Stadium besonders die Vibration, später auch
Propriozeption und Berührung betreffen. Daraus
resultierende Stand- und Gangunsicherheit kann mit dem
Underberger Tretversuch und dem Rombergversuch
objektiviert werden. Es kann zu sensiblen
Reizerscheinungen wie schmerzhaften nächtlichen
AM E C A Hk nu
14
bbildung 5: it Fortschreiten derrkrankung kann es beiMT1-Patienten zurtrophie der kleinenandmuskulatur ommen (http://www.euro.wustl.edu/neuromscular/time/hmsn.html)
Muskelkrämpfen sowie strumpf- oder handschuhförmigen distalen Parästhesien
kommen.
Das Krankheitsbild verschlechtert sich über Jahrzehnte hinweg und dehnt sich
schließlich auch auf die Oberschenkelmuskulatur und die obere Extremität aus.
Durch Schwächung der intrinsischen Handmuskulatur können im weiteren Verlauf
auch eine Einschränkung der Feinmotorik sowie eine Krallenhanddeformität
auftreten. (siehe Abbildung 5 auf Seite 17). Meist ist der Verlauf jedoch relativ
gutartig und die Patienten werden eher selten rollstuhlpflichtig oder berufsunfähig.
Selten kann die CMT1 mit Ataxie, Armtremor, sekundärer Skoliose bei
Beteiligung der Rückenmuskulatur oder Wadenhypertrophie korreliert sein.
Hirnnerven oder autonome Nerven können gelegentlich betroffen sein, und in
schweren Fällen kann es zu einer Einschränkung der Atemfunktion durch Affektion
des N. phrenicus kommen.
Die Hereditäre Neuropathie mit Neigung zur Drucklähmung äußert sich als
Parese eines oder seltener mehrerer peripherer Nerven nach leichter mechanischer
Beanspruchung. Infolge der Druckschädigung kommt es plötzlich zu schmerzlosen
motorischen und sensorischen Ausfällen, die sich nach Tagen bis Wochen
vollständig zurückbilden. Mit abnehmender Häufigkeit sind N. peronealis, N. ulnaris,
N. radialis, Plexus brachialis und N. medianus betroffen. Obwohl zunächst den
Anschein einer Mononeuropathie erweckend, weist die klinische Diagnostik auf ein
polyneuropathisches Geschehen hin. Erste Erkrankungsepisoden treten später auf
als bei der CMT1, meist in der 2. oder 3. Lebensdekade. Der Krankheitsverlauf ist in
der Regel milder und führt selten zu Behinderungen. Nur bei häufiger Schädigung
desselben Nervs kann es zu bleibenden Defekten kommen. Selten beobachtet man
die klassischen Fußdeformitäten, doch gibt es auch Verläufe, die klinisch kaum von
einer CMT1 unterscheidbar sind. Andererseits ist eine beachtliche Zahl von
Mutationsträgern subjektiv beschwerdefrei. Auch hier ist also die phänotypische
Variabilität beachtlich (Pareyson et al. 1996).
Die Klinik des Dejerine Sottas Syndroms ist der CMT1-Symptomatik sehr
ähnlich, jedoch ist die Erkrankung wesentlich stärker ausgeprägt und früher
beginnend. Besonders charakteristisch ist eine verzögerte motorische Entwicklung in
den ersten Lebensjahren, manchmal werden die Säuglinge schon nach der Geburt
durch Muskelhypotonie auffällig (Parman et al. 1999). Im Gegensatz zu CMT1 kann
es zu früher Invalidität kommen. Schmerzen und Skelettdeformitäten wie sekundäre
15
Skoliosen treten häufiger auf, die verdickten Nervenstränge können besonders im
Sulcus ulnaris und am Fibulaköpfchen tastbar sein. Teilweise fallen
Pupillenstörungen (Hirnnervenbeteiligung) sowie bemerkenswerter Weise eine
Erhöhung des Liquorproteins auf, was differentialdiagnostische Schwierigkeiten
bereiten kann.
Die Kongenitale Hypomyelinisationsneuropathie (CH) zeigt die Symptome des
DSS besonders ausgeprägt. Neben Hypotonie („floppy infant“), Areflexie,
Muskelschwäche und sensorischen Defiziten kann es zu Schluckstörungen und
Ateminsuffizienz bereits im Neugeborenenalter kommen. In seltenen schweren
Erkrankungsfällen kann die CH mit Gelenkkontrakturen, Lissenzephalie oder
Arthrogyrosis multiplex congenita vergesellschaftet sein. Die Prognose ist wesentlich
schlechter als bei den oben beschriebenen Neuropathien, schlimmstenfalls
versterben die Patienten bereits vor dem 3. Lebensmonat.
2.3. Elektrophysiologische Diagnostik
Elektrophysiologische Untersuchungen bei Patienten mit CMT1 ergeben eine
verminderte Nervenleitgeschwindigkeit (NLG) motorischer und sensorischer Nerven
von durchschnittlich 17 bis 20 m/s. Harding und Thomas definierten 1980 eine NLG
des N. medianus von 37 m/s als kritische Grenze, oberhalb derer eher eine axonale
als eine demyelinisierende Störung in Betracht kommt. Verzögert sind auch die
distalen Überleitungszeiten und die F-Wellen Antwort. Die Veränderungen im
Elektroneurogramm (ENG) sind bereits vor Manifestation klinischer Zeichen
messbar; je früher die Erkrankung beginnt, desto langsamer sind die NLG. Im
Elektromyogramm (EMG) kann in Folge der Nervenschädigung eine Verringerung
der zusammengesetzten motorischen Aktionspotentiale beobachtet werden. Weitere
Zeichen der neurogenen Muskelatrophie sind ein gelichtetes Aktivitätsmuster,
pathologische Spontanaktivität und verlängerte, polyphasische Potentiale
motorischer Einheiten. Sensorische Potentiale fehlen oft oder sind verlangsamt und
amplitudengemindert. Die elektrophysiologisch messbaren Veränderungen sind bei
Punktmutationen noch drastischer ausgeprägt. Da klinisch unauffällige Träger der
PMP22-Duplikation ebenfalls stark verlangsamte NLG aufweisen können, wird diese
16
Diagnosemöglichkeit von einigen Autoren besonders hervorgehoben (Berciano et al.
1994).
Die elektrophysiologischen Befunde bei HNPP Patienten zeigen eine
vergleichsweise leichte Reduktion der NLG motorischer und auch sensibler Nerven.
An anatomischen Engpässen lassen sich zusätzliche fokale Veränderungen
feststellen. Ähnlich der CMT1 kann man im EMG Zeichen der neurogenen
Muskelatrophie messen (Neundörfer et al. 1987).
Bei der elektrophysiologischen Diagnostik von DSS und CH lassen sich
ebenfalls die charakteristischen Befunde einer disseminierten Markscheidenläsion
mit konsekutiver neurogener Muskelatrophie erheben. Die Resultate sind hier
entsprechend der Schwere der Krankheitsbilder noch pathologischer, meist liegt die
NLG sogar unterhalb von 10 m/s (Kennedy et al. 1977; Parman et al. 1999). (Zu
Elektrophysiologischen Veränderungen siehe auch unter:
http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html)
2.4. Morphologie
Den PMP22-assoziierten Neuropathien ist wegen der Erkrankung der Markscheiden
als hervorstechendes morphologisches Kriterium die Demyelinisierung gemeinsam.
Je nach Krankheitsbild lassen sich in Folge der gestörten Formation der
Myelinscheiden unterschiedliche pathologische Umbauprozesse beobachten:
Die charakteristischen histopathologischen Merkmale der CMT1 sind die
segmentalen De- und Remyelinisationsprozesse, die durch Vermehrung von
Schwannzellen und endoneuralem Kollagen zur Ausbildung von sogenannten
„Zwiebelschalenformationen“ führen (siehe Pfeilspitzen in Abbildung 6, Seite 21).
Regelmäßig finden sich auch hypermyelinisierte Nervenfasern, oft assoziiert mit
atrophischen Axonen (Schröder 1999). Häufig fallen in Relation zum Axonkaliber zu
dünn myelinisierte Nervenfasern auf; mit Fortschreiten der Erkrankung kommt es
zunehmend zum Ausfall besonders der großen markhaltigen Nervenfasern.
Gabreëls-Festen et al. korrelierten 1995 die morphologischen
Untersuchungsergebnisse von CMT1 Patienten mit den molekulargenetischen
Befunden. Es zeigte sich, dass im Falle einer PMP22-Punktmutation das Verhältnis
von Axondurchmesser zu Nervenfaserdurchmesser wesentlich größer war als in
17
Fällen mit einer PMP22-Duplikation. Bei letzteren lag das Verhältnis deutlich
unterhalb der Norm. Bei Patienten mit Punktmutationen zeigten sich
Zwiebelschalenformationen schon früher und zahlreicher, auch der totale
Faserdurchmesser war erhöht (Gabreëls-Festen et al. 1995).
Andere Autoren beschrieben im Zusammenhang mit PMP22-Punktmutationen
(Asp37Val) Myelinscheidenveränderungen wie Tomakula und eine inkomplette
Kompaktierung der Myelins (Fabrizi et al. 1999).
Als Beispielhistologie ist in Abbildung 6 die Nervenbiopsie von Patient Nr.
NPA3B dargestellt (Semidünnschnitte: Toluidinblau). Der zum Zeitpunkt der
Untersuchung 72-jährige Patient litt an einer links stärker als rechts ausgeprägten
Fußheberparese sowie Parästhesien der Unterschenkelaußenseite links.
Histometrisch erschien die Zahl der großen markhaltigen Nervenfasern um bis zu 60
% reduziert. Des Weiteren fallen zu dünn myelinisierte Nervenfasern sowie
Zwiebelschalenformationen auf (siehe Pfeilspitzen in Abbildung 6).
Abbildung 6: Ausschnitt aus dem N. suralis des Patienten Nr. NPA3B (CMT1, die Pfeilspitzen weisen auf Zwiebelschalenformationen hin)
18
Bei der HNPP zeigen bis zu etwa 25% der Internodien so genannte Tomakula,
d.h. wurstartige Verdickungen der Myelinscheiden (Behse et al. 1972). Zwar sind
diese Tomakula Hauptcharakteristikum der HNPP, aber sie sind kein hartes
diagnostisches Kriterium, da sie im fortgeschrittenen Erkrankungsstadium fehlen
können (Schröder 1999). Auch werden sie nicht selten bei anderen Erkrankungen
wie der CMT1 (Thiex und Schröder 1998), der Anti-MAG-Neuropathie, der CIDP,
DSS und CMT4B beobachtet (http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular
/nother/bx.html#tomacula). Wie bei der CMT1 findet man auch bei der HNPP Zeichen
der segmentalen Demyelinisierung. Morphometrische Vergleichsanalysen beider
Erkrankungen zeigen allerdings analog den klinischen Befunden, dass bei den
HNPP-Patienten die Neuropathie wesentlich milder ausgeprägt ist (Thiex und
Schröder 1998). Abbildung 7 zeigt das histologische Präparat eines zum
Diagnosezeitpunkt 61-jährigen Mannes (Patient Nr. 4), bei dem klinisch zunächst der
Verdacht auf eine sensible Neuropathie vom axonalen Typ geäußert worden war.
Abbildung 7: Histologisches Präparat von Patient Nr.4. Der Pfeil markiert eine tomakulöse Nervenfaser.
19
Die histopathologische Untersuchung zeigte eine Reduktion großer und
kleiner markhaltiger Nervenfasern um bis zu 20%, Zeichen der Hypomyelinisation
sowie eine typische tomakulöse Nervenfaser (siehe Pfeil in Abbildung 7, Seite 22).
Somit ließ sich die Erkrankung als sehr frühes Stadium einer tomakulösen
Neuropathie (HNPP) einstufen.
Die DSS-Erkrankung erinnert im morphologischen Bild an eine besonders
stark ausgeprägte Form der CMT1. So finden sich auch hier die charakteristischen
Zwiebelschalenformationen, Hypomyelinisation und eine starke sekundäre Reduktion
großer myelinisierter Nervenfasern. Auch die marklosen Axone sind betroffen: Zwar
ist ihre Anzahl nicht vermindert, jedoch ihre durchschnittliche Größe geringer als die
Norm. Häufig fallen abnorm verdickte Nerven auf; daher auch das Synonym
„hypertrophische Neuropathie“. Abbildung 8 zeigt exemplarisch das Nervenpräparat
einer zum Zeitpunkt der Diagnostik 21 Jahre alten Patientin (Fall Nr. 12) mit einer
demyelinisierenden Neuropathie vom Typ des DSS. Auffällig sind der subtotale
Ausfall großer markhaltiger Nervenfasern sowie die zahlreichen
Zwiebelschalenformationen.
Abbildung10: Histologisches Präparat des Pat. 12 (DSS)
Abbildung 8: Zwiebelschalenformationen im Nerven der Patientin Nr. 12 (DSS)
20
In Fällen mit Verdacht auf kongenitale Hypomyelinisationsneuropathie fehlen
die Markscheiden gänzlich oder sind in der Mehrzahl der Axone sehr dünn
ausgebildet. Einige Autoren berichten über ein vermehrtes Vorkommen von
Zwiebelschalenformationen, die mehrschichtige Umhüllungen aus Basalmembranen
enthalten (Bornemann et al. 1996). In anderen Fällen ließen sich hingegen gar keine
Zwiebelschalenformationen feststellen (Seitz et al. 1986). Der axonale Untergang
kann vergleichsweise moderat ausgeprägt sein. Abbildung 9 zeigt die Histologie
eines bei Einsendung der Nervenbiopsie fünfzehn Monate alten Jungen (Patient
Nummer V5), der durch eine hypotone statomotorische Entwicklungsverzögerung
aufgefallen war. Das Schnittpräparat zeigt Charakteristika einer
Hypomyelinisationsneuropathie, da zahlreiche großkalibrige Nervenfasern im
Vergleich zur Altersnorm zu dünne Markscheiden aufweisen.
Abbildung 9: Hypomyelinisationsneuropathie bei Patient Nr. V5.
21
2.5. Differentialdiagnosen
Bei Patienten, die sich mit den oben beschriebenen Symptomen der HMSN
vorstellen, kommen zunächst eine Reihe metabolischer, exogen-toxischer und
entzündlicher Polyneuropathien differentialdiagnostisch in Betracht, die größtenteils
durch sorgfältige Anamneseerhebung und Laboruntersuchungen ausgeschlossen
werden können. Die Suralnervenbiopsie ermöglicht schließlich eine diagnostische
Einengung auf die Gruppe der Polyneuropathien mit primärem Markscheidenbefall,
wobei die Zwiebelschalenformationen recht eindeutig auf den demyelinisierenden
Typ der HMSN hinweisen. Besonders wichtig ist hier gerade bei sehr jungen
Patienten die Unterscheidung des altersadäquaten, normalen Entwicklungsstandes
der Axone und Myelinscheiden von verzögerten, gestörten oder gar fehlenden
Reifungsprozessen der kindlichen peripheren Nerven (Schröder et al. 1988).
Schwer ist allerdings die Abgrenzung der CMT1 zur Chronischen
Inflammatorischen Demyelinisierenden Polyneuropathie (CIDP), da bei dieser
Erkrankung histologisch ebenfalls segmentale Demyelinisierung und
Zwiebelschalenformationen nachweisbar sein können. Bei der CIDP handelt es sich
um eine Autoimmunreaktion gegen das periphere Nervensystem, welche im Rahmen
von andern Autoimmunerkrankungen oder postinfektiös auftreten kann. Jedoch
können diese ätiologischen Unterscheidungskriterien anamnestisch fehlen.
Mononukleäre Zellinfiltrate im perivaskulären Raum sollen hinweisend auf CIDP sein
(Dyck und Arnason 1984), jedoch sind diese selten nachweisbar (Schröder 1999).
Liquorbefunde können weiterhelfen (bei der CIDP ist die Eiweißfraktion erhöht)
jedoch kann dies auch bei DSS-Patienten der Fall sein. Die Abgrenzung ist also
keinesfalls trivial und in sofern von herausragender Bedeutung, als CIDP Patienten
im Gegensatz zu HMSN Patienten von einer immunsuppressiven Therapie
profitieren.
Auch für die HNPP kommen diverse andere Polyneuropathien
differentialdiagnostisch in Betracht, bei denen Drucklähmungen auftreten können.
Ein aufschlussreicher Fund bei der Nervenbiopsie sind die Tomakula, die jedoch,
wenn nur wenige Tomakula vorliegen, nicht spezifisch für diese Erkrankung sind.
Nicht zuletzt besteht immer noch eine nicht unerhebliche Schwierigkeit in der
Abgrenzung der in dieser Arbeit betrachteten hypomyelinisierenden Neuropathien
untereinander und von anderen Formen der HMSN, da Klinik, Elektrophysiologie und
22
Morphologie überlappend und uneindeutig sein können. Molekulargenetische
Untersuchungen können in solchen Fällen oft den ausschlaggebenden Hinweis
liefern.
2.6. Therapie und Prognose
Von wenigen Ausnahmen wie dem Morbus Fabry oder dem Morbus REFSUM
abgesehen gibt es bis heute leider noch keine kausaltherapeutischen Möglichkeiten
für Patienten, die an HMSN vom CMT-Typ erkrankt sind. Daher stehen supportive
Maßnahmen nach wie vor im Vordergrund der Behandlung, wie zum Beispiel
sorgfältige Fußpflege, Verordnung von orthopädische Einlagen bzw. Schuhen oder
Peronaeusschienen (Wicklein et al. 1997, http://users.rcn.com/smith.ma.
ultranet/WhatIsCMT.html). Von großer Wichtigkeit ist eine möglichst lebenslange
Physiotherapie, die Übungen zur Muskelkräftigung, Muskeldehnung zur
Kontrakturprophylaxe, Sensibilitätstrainig, Skoliosebehandlung und Atemgymnastik
umfasst. Auch eine ergotherapeutische Beratung kann mit zunehmendem Grad der
Bewegungseinschränkung sehr sinnvoll sein.
Im Bereich der Pharmakotherapie kommen symptomatisch besonders
Analgetika und Muskelrelaxantien zum Einsatz. Der Effekt neurotroper Substanzen
wie Vitamin B12 oder α-Liponsäure ist noch nicht durch Studien belegt. Für die
Verordnung von Anabolika wie Nandrolon besteht angesichts der Pathogenese keine
Indikation. Schließlich gibt es viele Möglichkeiten operativer Korrekturmaßnahmen,
zum Beispiel Archillessehnenverlängerung, Korrektur von Hammerzehen,
Sehnentransplantationen, Sprungelenksarthrodesen, Plantarfaszienspaltung und
Eingriffe an der Wirbelsäule zur Skoliosekorrektur. Die Weichteiloperationen im
Bereich der Füße erzielen oft gute Resultate, gerade wenn sie frühzeitig erfolgen und
so knöchernen Fehlbildungen vorgebeugt werden kann (Holmes und Hansen 1993).
Dahingegen sind die Resultate der knochenkorrigierenden Verfahren kritischer zu
betrachten, lediglich durch die Tripelarthrodese lässt sich für eine begrenzte Zeit eine
Verbesserung der Fußstellung erzielen.
Krankheitsverstärkende Faktoren sind soweit irgend möglich zu meiden. Auf
der Internetseite CMTnet (http://users.rcn.com/smith.ma.ultranet/MedicalAlert.html)
findet man Listen mit Medikamenten, die die Progredienz der Erkrankung fördern
23
können und deren Kenntnis daher für den Patienten und den behandelnden Arzt von
großer Wichtigkeit ist: So wurde zum Beispiel mehrmals in der Literatur eine akute
Exazerbation der Erkrankung nach Gabe des Cytostaticums Vincristin beobachtet
(Olek et al. 1999; Hildebrandt et al. 2000). Auch Umweltgifte können einen Rolle
spielen (Senderek et al. 2000). Des Weiteren können physikalische Traumata,
Schock, emotionaler Stress oder auch eine Schwangerschaft eine Verschlechterung
des Krankheitsbildes mit sich bringen (Gastaut et al. 2000).
Durch molekulargenetische Analysen kann heute die Diagnose einer HMSN
schon in einem sehr frühen Erkrankungsstadium oder sogar präklinisch gestellt
werden. Gerade in diesen Fällen sind eine ausführliche Beratung der Patienten
hinsichtlich möglicher Krankheitsverläufe und die Ermutigung zu präventivern
Maßnahmen wichtig. Der behandelnde Arzt muss sich stets bewusst sein, dass die
Diagnose für die Patienten oft einen entscheidenden Einfluss auf Familienplanung,
Berufswahl oder die Erwägung von Umschulungsmaßnahmen bedeutet. Somit ist
eine gute, tragfähige Arzt-Patient-Beziehung essentiell, um den Betroffenen das
Leben mit ihrer Krankheit zu erleichtern.
24
3. Patientenkollektiv
Das Archiv des Institutes für Neuropathologie der RWTH Aachen verfügt als
Referenzzentrum für neuromuskuläre Erkrankungen über mehr als 7000 fixierte,
paraffineingebettete Präparate von Nerven- und Muskelbiopsien, von denen ein Teil
auch als Frischpräparat bei –70 °C konserviert wurde. Für die vorliegende Studie
wurden 59 Präparate von Patienten ausgewählt, die an den oben beschriebenen
Erkrankungen CMT1, HNPP, DSS oder CH erkrankt waren. Für die an CMT1 oder
HNPP erkrankten Patienten war im Vorfeld eine PMP22-Tandemduplikation bzw. -
Deletion ausgeschlossen worden. Dies erfolgte durch einen semiquantitativen PCR-
Ansatz (Thiex und Schröder 1998) bzw., in der Mehrzahl der Fälle, durch
Mikrosatellitenanalyse und die Direkt-doppelt-differentielle PCR (Beckmann und
Schröder 2000). Dieser Untersuchung wurden auch 5 der 11 DSS-Fälle unterzogen,
da hier die Abgrenzung von schwerer CMT1 zu DSS nicht eindeutig war. Die CH
Patienten wurden vorab auf eine MPZ-Mutation untersucht, so dass dieses Gen als
Ursache für eine erbliche Neuropathie ausgeschlossen werden konnte (genauere
klinische und histopathologische Angaben zu den untersuchten Fällen finden sich
tabellarisch gelistet im Anhang unter 11.2).
25
4. Untersuchungsgut
Das zur Diagnostik eingereichte Material umfasst bei Verdacht auf HMSN neben der
Biopsie des Nervus suralis auch oft eine Muskelbiopsie. Ein Teil des jeweiligen
Präparates wurde in 4%iger Formalinlösung, ein Teil in 3,9%igem Glutaraldehyd mit
0,1 M Phosphatpuffer nach SØRENSEN fixiert. Nach Entwässerung der
Gewebeproben in einer aufsteigenden Alkoholreihe und einem Xylolbad erfolgte die
Einbettung der fixierten Präparate in Paraffin.
Für die lichtmikroskopische Beurteilung wurden Semidünnschnitte der
Suralnervenbiopsien angefertigt. Die glutaraldehydfixierten Nerven mussten zu
diesem Zweck in einer 2%igen phosphatgepufferten Osmiumtetroxidlösung mit 0,1 M
Phosphatpuffer (nach SØRENSEN) nachfixiert werden. Nach Entwässerung in
aufsteigender Ethanolreihe und Einbettung in Epoxydharz wurden 1 µm dicke
Semidünnschnitte angefertigt und mit Paraphenylendiamin und Toluidinblau gefärbt.
35 der 59 in dieser Studie untersuchten Proben wurden wie oben beschrieben
fixiert. Die DNA der übrigen 24 Proben wurde aus frischem Muskel, frischem Nerv
oder Blut gewonnen.
26
5. Methoden 5.1. DNA-Extraktion aus paraffineingebetteten formalin- oder
glutaraldehydfixierten Suralnerven- bzw. Muskelbiopsien
Von den ausgewählten Paraffinblöcken wurden je nach Größe des Präparats 10-20
etwa 10 µm dicke Schnitte gewonnen.
Um das Gewebe von Paraffin zu befreien, wurden die Proben zunächst mit
1000 µl Xylol versetzt und anschließend zweimal mit 100%igem Ethanol gewaschen.
Das restliche Ethanol wurde bei 37°C verdampft.
Die DNA-Isolierung erfolgte in leicht abgewandelter Form gemäß dem Tissue
Protocol des QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen, Hilden): Das gewonnene Gewebepellet
wurde nach Lösung in 180 µl AL Puffer mit 20 µl Proteinase K, einer Endopeptidase,
im Wasserbad bei 56°C über Nacht inkubiert, um störende Proteinbestandteile zu
zersetzen. Nach Zugabe von 200 µl Puffer AL, einem weiteren zehnminütigen
Inkubationsschritt bei 70°C und Versetzen mit 200 µl 100%igem Ethanol erfolgte die
Trennung von DNA und Proteinresten mit Hilfe der QIAamp spin columns. In diese
Röhrchen ist eine Filtermembran aus Silica-Gel eingebaut, die, abhängig von
Salzgehalt und pH, DNA bindet, während das abzentrifugierte Eluat mit allen
störenden Bestandteilen verworfen werden kann. Nach Waschung mit je 500 µl AW1
bzw. AW2 Puffer konnte die DNA mit 50 µl steril filtriertem Wasser (LiChrosolv®,
Merck, Darmstadt) von der Säule gelöst werden. Dies wurde wiederholt, so dass von
jedem Gewebepräparat zwei DNA-Elutionen zur Verfügung standen. Photometrische
Messungen (Perkin Elmer Lambda Bio Spektrometer) ermöglichten es, den DNA-
Gehalt der Proben zu bestimmen und die Probenverunreinigung z.B. durch
Proteinreste zu beurteilen.
5.2. DNA-Extraktion aus Frischmaterial (Nerv, Muskel, Blut)
Auch hier wurden die Protokolle des QIAamp DNA Mini Kit verwendet. Vom frischen
Muskel- oder Nervenpräparaten wurde im Kryostat 10-30 mg entnommen und mit
180 µl Buffer ATL sowie 20 µl Proteinase K versetzt. Die Lyse durch Inkubation bei
27
56°C erfolgte in wenigen Stunden oder auch über Nacht. Von da ab wurden diese
Proben genauso behandelt wie oben für die fixierten Präparate beschrieben.
Von Blutproben wurde auf 25 µl Proteinase K 200 µl Probe sowie 200 µl AL
Puffer gegeben. Eine Lysezeit von 10 Minuten bei 56°C war in diesen Fällen
ausreichend. Nach Zugabe von 200 µl Ethanol wurden die Proben in „spin columns“
übertragen und die Aufreinigung wie oben beschrieben ausgeführt. Abschließend
wurde zweimal mit 50 µl TrisHCl Puffer, pH 8,3, eluiert.
5.3. Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) stellt eine
essentielle Methode der molekulargenetischen Forschung dar. Sie ermöglicht es, in
vitro gezielt und in kurzer Zeit DNA Abschnitte zu vervielfältigen. Seit der
Erstveröffentlichung durch Mullis et al. (1986) hat die Methode viele Modifikationen
und Adaptationen erfahren; unter anderem gelangen Saiki et al. (1988) eine
entscheidende Verbesserung durch den Einsatz einer hitzestabilen DNA-
Polymerase. Selbst geschädigte, stark fraktionierte DNA aus formalinfixiertem
Gewebe lässt sich noch Jahre nach der Fixierung amplifizieren (Kösel und Graeber
1994). In der vorliegenden Arbeit wurde die PCR zur Vermehrung der codierenden
vier Exone des PMP22-Gens verwendet; die gewonnenen Templates konnten dann
in weiteren Arbeitsschritten mit der Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode
(Enzymatic Mutation Detection, EMD) und durch eine automatische Sequenzanalyse
weiterbearbeitet werden.
Das Prinzip der Reaktion lässt sich wie folgt erklären: Zunächst benötigt man
Kenntnisse über die Basensequenz des zu untersuchenden DNA Abschnittes, um
Primer zu entwerfen. Dies sind um die 18 bis 25 Basen lange Oligonukleotide, die
sich an komplementären Sequenzen der denaturierten DNA Stränge anlagern. Sie
sollten so gewählt werden, dass sie die zu untersuchende Sequenz jeweils am 5’
Ende flankieren und möglichst ausschließlich in der Zielregion binden, um
unspezifische PCR-Produkte zu vermeiden. Der amplifizierte Abschnitt sollte eine
Länge von 5 kb nicht überschreiten, da die Vervielfältigung mit zunehmender Länge
des DNA-Abschnitts immer problematischer wird (Strachan 1994). In der PCR folgt
auf einen Denaturierungsschritt bei etwa 95°C die Anlagerung der Primer (Annealing)
28
bei Temperaturen zwischen 50 und 65°C. Ausgehend von diesen Startermolekülen
kann nun eine hitzestabile Polymerase im Extensionsschritt (72°C) die Einzelstränge
mit den Desoxyribonukleotiden dATP, dCTP, dGTP, dTTP zu Doppelsträngen
komplementieren. Jeder der neusynthetisierten Stränge fungiert nun als Matrize für
den nächsten Reaktionszyklus, so dass nach 30 Zyklen aus Denaturierung,
Primeranlagerung und Kettenverlängerung das 108 bis 109 -fache der Zielsequenz im
Reaktionsansatz vorliegt (siehe Abbildung 10).
5’3’
3’5’
zu vervielfältigende DNA
2. Zyklus: Hitzedenaturierung, Anlagerung der Primer, DNA Synthese:
3. Zyklus: Hitzedenaturierung, Anlagerung der Primer, DNA Synthese:
1. Zyklus: Hitzedenaturierung:
DNA Synthese:
Anlagerung der Primer:
nach 30 Zyklen erhält man 108 bis 109 Kopien der gewünschten Zielsequenz
Abbildung 10: Schematische Darstellung der Polymerasekettenreaktion (nach Strachan 1994; Koolmann et al. 1998)
Das PMP22 Gen umfasst 5 Exone, von denen das erste nicht codierend ist
und daher in der vorliegenden Arbeit nicht mit untersucht wurde. Im Folgenden
29
beziehen sich die Nummern 1 bis 4 nur auf die codierenden Exone. Sie wurden mit
Hilfe der folgenden Primerpaare amplifiziert:
Exon 1 (166bp):
Primer 1F 5’- AGAAACTCCGCTGAGCAGAA -3’
Primer 1R 5’- GGAACCCAGATGGGGAAG-3’
Exon 2 (156bp):
Primer 2F 5’- TCAGGATATCTATCTGATTCTC -3’
Primer 2R 5’- AAGCTCATGGAGCACAAAACC -3’
Exon 3 (239bp) :
Primer 3F 5’- CCATGGCCAGCTCTCCTAAC -3’
Primer 3R 5’- CATTCCGCAGACTTTGATGC -3’
Exon 4 (249bp):
Primer 4F 5’- GCCATGGACTCTCCGTC -3’
Primer 4R 5’- CCTATGTACGCTCAGAG -3’
Primerpaar 1 und 3 wurden nach den Angaben von G. A. Nicholson et al.
(1994) hergestellt. Ursprünglich sollten auch Exon 2 und 4 nach dem in dieser
Arbeitsgruppe angewandten Primern amplifiziert werden. Für DNA aus frischem
Gewebe oder Blut war dies problemlos möglich; bei DNA aus fixiertem
paraffineingebetteten Material waren die Resultate für PCR und Sequenzierung
jedoch trotz zahlreicher Optimierungsversuche nicht zufriedenstellend. Der Versuch,
selbst Primer zu kreieren brachte auch keine Verbesserung, darum wurde für Exon 2
und 4 auf die Angaben von Roa und Kollegen (1993b) zurückgegriffen. Die Längen
der PCR-Produkte liegen unter 300 bp, da sich kurze Fragmente in PCR und
Sequenzanalyse besser bearbeiten lassen, besonders wenn stark fraktionierte DNA
aus paraffineingebettetem formalinfixierten Gewebe vorliegt.
Die PCR-Bedingungen konnten wie folgt optimiert werden: Pro Ansatz wurden
60 ng genomische DNA, 2,5 µl 10x Qiagen PCR Puffer (Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4,
15 mM MgCl2; pH 8,7), 6,25 mmol jedes Desoxynucleotids (TaKaRa, SHUZO CO.,
Otsu, Shiga), 1,5 U HotStarTaqTM DNA-Polymerase (Qiagen), jeweils 25 pmol der
30
beiden Primer (MWG-Biotech AG, Ebersberg) und steril filtriertes Wasser (Merck) ad
25 µl zur Reaktion gebracht. Der Ansatz für Exon 1 und 3 enthielt je noch 5 µl 5x Q-
Solution (Qiagen), ein PCR Zusatz, der durch Verbesserung des Schmelzverhaltens
der DNA in schwierigen Fällen die Vervielfältigung ermöglicht. Zudem wird das
spezifische Primerannealing gefördert, so dass weniger unerwünschte PCR-
Fragmente synthetisiert werden.
Nach einem initialen Denaturierungsschritt von 8 min bei 95°C folgten 35
Reaktionszyklen bestehend aus Denaturierung (1 min, 95°C), Primerannealing (1
min, 55°C für Exon 2, 58°C für Exon 1 und 3, 60°C für Exon 4) und Extension (1 min
72°C). Ein finaler Extensionsschritt für 7 min bei 72°C ermöglichte die
Vervollständigung von noch unkomplett synthetisierten DNA-Strängen. Abschließend
wurde der gesamte Ansatz auf 4°C abgekühlt und konnte bei dieser Temperatur für
einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden.
Die verwendete HotStarTaq DNA-Polymerase ist die gentechnisch modifizierte
Form einer hitzestabilen DNA-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus
mit einer Extensionsrate von 2-4 kb pro Minute bei 72°C. Sie besitzt die besondere
Eigenschaft, erst bei einer Temperatur von 95°C aktiviert zu werden. Dies verringert
die Bildung von Primer-Dimeren und unspezifischen Produkten bei niedriger
Temperatur, was die Spezifität und den Ertrag der Reaktion erhöht. Anders als im
Handbuch des Herstellers angegeben, wurde der erste Denaturierungsschritt kürzer,
nämlich 8 statt 15 min gewählt. Diese Modifikation soll die Spezifität der Reaktion
noch erhöhen: In jedem Zyklus wird während der Aktivierungsphase bei 95°C mehr
Enzym aktiviert, so dass sukzessive mehr aktives Enzym mit einer größeren Menge
Ziel-DNA reagieren kann.
Für die weiteren Analysen auf dem Laser-induzierten-Fluoreszenz-
Kapillarelektrophoresesystem ABI PRISM 310 (Perkin Elmer Applied Biosystems,
Foster City, USA) mussten die PCR-Produkte mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert
sein. Daher wurden in PCR–Ansätzen für die im Folgenden beschriebene
Endonukleasereaktion ein Fam- und ein Hex-markierter Primer eingesetzt. Für
Sequenzierungen wurden die Templates lediglich einfach Fam-markiert.
Des Weiteren ist es sowohl für Sequenzierung als auch Endonukleaseverdau
von großer Bedeutung, spezifische und vor allen Dingen ausreichend stark
amplifizierte Templates zu gewinnen. Gerade bei DNA aus paraffineingebetteten,
fixierten Proben war der Ertrag der PCR oft zu gering. In diesen Fällen wurde nach
31
konzentrierender Aufreinigung des ersten Ansatzes eine zweite PCR mit einer
adäquaten Menge des gewonnenen Templates (je nach Ertrag 10-90%) angesetzt.
Die Bedingungen waren wie oben erläutert, jedoch wurde weniger Primer (5 pmol)
verwendet.
Jeder PCR-Ansatz enthielt eine Negativkontrolle mit Wasser anstelle von
genomischer DNA, um Kontaminationen identifizieren zu können.
5.4. Kapillarelektrophoretische Auftrennung der Amplifikationsprodukte auf dem ABI PRISM 310
Der ABI PRISM 310 ist ein Mikroprozessor gesteuertes
Kapillarelektrophoresesystem, welches in der Lage ist, fluoreszenzmarkierte DNA-
Fragmente zu detektieren. Die zu analysierenden Fragmente werden in eine
gelgefüllte Kapillare injiziert (Injektionszeit 5 Sekunden, Injektionsspannung 15.0 kV).
Unter konstanten Elektrophoresebedingungen (Spannung 15.0 kV, Temperatur 60°C,
Laufzeit 24 Minuten) wandert die negativ geladene DNA durch das Polymer in der
Kapillare in Richtung Anode. Dabei gehen die DNA-Fragmente mit den
Polymermolekülen Verwicklungen ein, die das Laufverhalten verlangsamen und
umso zahlreicher sind, je länger die Fragmente sind. Dadurch kommt es zur
Auftrennung der DNA-Moleküle entsprechend ihrer Größe. Kurz vor Ende der
Kapillare befindet sich die Detektionseinheit des Systems. Dort angelangt, werden
die markierten Fragmente durch einen Argonlaser (Hauptemission bei Wellenlängen
von 488 nm bis 514,5 nm) zu Fluoreszenzemission angeregt. Diese Strahlung wird
nach Linsenfokussierung und prismatischer Aufspaltung von einer CCD Kamera
detektiert (Detektionsfarben: gelb, rot, blau, grün). Die Datenspeicherung und
Analyse erfolgt durch die entsprechende Software des Herstellers (PE Applied
Biosystems, Abi Prism 310 Collection und GeneScan Analysis ® 2.1.1). Da bei
jedem Elektrophoreselauf ein Standard (fluoreszensmarkierte Fragmente bekannter
Größenordnung) mitanalysiert wird, kann jedem Fragment unbekannter Länge seine
Größe bis auf 1-3 Basenpaare genau zugeordnet werden entsprechend dem
Zeitpunkt, an dem es die Detektionseinheit im Verhältnis zum Standard passiert.
Darüber hinaus gibt die Intensität der emittierten Fluoreszenzstrahlung Auskunft über
die Quantität des DNA-Templates. Nach Datenanalyse erhält man ein
32
Elektropherogramm, anhand dessen man die Länge der Fragmente (Position der
entsprechenden Peaks) sowie die Quantität (Höhe, Breite und Fläche der Peaks)
beurteilen kann (Beispiel in Abbildung 11).
Abbildung 11 zeigt das Elektropherogramm des PCR-Produktes von Exon 2 des PMP22-Gens beider erwarteten Länge von 156 bp (schwarzer Peak). Die roten Peaks sind die Signale desLängenstandards GENESCAN-500TM TAMRA (Applied Biosystems).
Für die Analyse auf dem ABI PRISM 310 wurden 0,5 µl der Probe mit 0,3 µl
GENESCAN-500TM TAMRA (Applied Biosystems) in 19,2 µl Wasser (Merck)
aufgenommen. GENESCAN-500TM TAMRA ist in unserem Fall der entsprechende
Referenzstandard zur Bestimmung der Fragmentlängen. Nach erfolgter
elektrophoretischer Auftrennung und Datenanalyse konnte wie oben beschrieben
anhand der Elektropherogramme beurteilt werden, ob in der PCR Fragmente der
gewünschten Länge in ausreichender Menge synthetisiert worden waren.
5.5. Aufreinigung der PCR-Produkte
Für die nachfolgenden Arbeitsschritte war es wichtig, möglichst aufgereinigte
Templates frei von störenden Primern, Proteinen und Salzen zu gewinnen. Daher
erfolgte die Aufreinigung der Templates mit dem PCR Purification Kit (Qiagen). Das
Protokoll des Herstellers (QIAquick spin Handbook) wurde wie folgt adaptiert: Die
PCR-Ansätze wurden je in 100 µl Puffer PB aufgenommen und in die QIAquick spin
columns übertragen. Diese mit einer Silica-Gel Membran ausgestatteten Säulen
binden DNA im salzreichen sauren Milieu, während störende Bestandteile
33
abzentrifugiert und mit dem Eluat verworfen werden können. Nach Waschung mit
700 µl des ethanolhaltigen Puffers PE und einem zusätzlichen Zentrifugationsschritt
wurden die PCR-Produkte mit 30 µl steril filtriertem Wasser (Merck) von der Säule
gelöst. Bei gering amplifizierten PCR-Produkten wurde zweimal mit weniger Volumen
(10-20 µl) eluiert, um die Produktkonzentration zu erhöhen.
5.6. Identifikation heterozygoter Punktmutationen mit der Enzymatischen
Mutationsdetektionsmethode (Enzymatic Mutation Detection, EMD)
Zwar ist die DNA-Sequenzanalyse bis heute aufgrund hoher Sensitivität der
Goldstandard bei der Identifikation von Mutationen, jedoch ist sie mit einem hohen
Arbeits-, Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Daher wurden in letzter Zeit viele
andere Systeme entwickelt, die mit ausreichender Sensitivität ein praktikableres,
schnelleres und kostengünstiges Mutationsscreening ermöglichen, z.B. SSCP (engl.:
single-strand conformation polymorphism), HA (engl.: heteroduplex analysis),
TGGE/DGGE (engl.: temperature/denaturating gradient gel electrophoresis) etc.
(Highsmith et al. 1999). In der vorliegenden Studie kam die sogenannte Enzymatic
Mutation Detection EMD zum Einsatz. Es handelt sich um eine enzymatische
Methode, die auf den Eigenschaften der T4 Endonuklease VII aus dem
Bakteriophagen T4 beruht. Dieses zur Gruppe der Resolvasen gehörende Enzym
erkennt Falschpaarungen in DNA-Doppelsträngen („Heteroduplex-Schleifen“) und
schneidet diese Stränge ca. 6 bp 3’-wärts der Fehlpaarung. Um eine Punktmutation
als Fehlpaarung detektieren zu können, werden zunächst fluoreszensmarkierte PCR-
Produkte von den zu analysierenden Proben hergestellt. Vermutet man homozygote
Mutationen, so werden die Proben jeweils mit ebenfalls markierter, nicht mutierter
Wildtyp-DNA versetzt. Nach Hitzedenaturierung wird das Gemisch abgekühlt und die
Einzelstränge hybridisieren wieder zu Doppelsträngen. Dabei kommt es auch zu
Wildtyp-Mutante-Paarungen, welche nun während eines Inkubationsschrittes mit der
T4 Endonuklease erkannt und geschnitten werden können. Die Schnittprodukte
können dann nach elektrophoretischer Auftrennung der Fluoreszenzmarkierung
entsprechend detektiert werden. Vermutet man eine hetergozygote Mutation, kann
auf die Zugabe von Wildtyp-DNA verzichtet werden, da im Ansatz ja bereits ein
Wildtypallel und ein mutiertes Allel enthalten sind. Abbildung 12 stellt den Ablauf der
34
EMD-Reaktion für heterozygote Proben schematisch dar. Die Zuverlässigkeit der
Methode wurde in einer Blindstudie am Tumor-Supressorgen p53 mit einer
Sensitivität von 100% und einer Spezifität von 94% im Vergleich zu Ergebnissen der
Sequenzanalyse bestimmt (Del Tito et al. 1998). Dies ist eine deutliche
Verbesserung zur weit verbreiteten SSCP Methode (Sensitivität 60-80%). Darüber
hinaus ist ein EMD Protokoll für unterschiedliche Amplicons anwendbar, eine
jeweilige Optimierung wie für die SSCP Analyse ist nicht notwendig.
*
*
DNA mit heterozygoter Punktmutation
Vervielfältigung: PCR mit floureszenz-gelabelten Primern
Denaturierung, Hybridisierung
*
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*
*
*
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*
*
Zugabe der T4 Endonuklease VII; Erkennen der Fehlpaarung, Schneidevorgang Schnittprodukte
(z.T. fluoreszenzgelabelt)
! Missmatch-Paarung !
Detektion der gelabelten Fragmente (Kappillarelektrophorese auf dem ABI Prism 310)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Legende: DNA (Wildtypallel) Fluoreszenz DNA (Allel mit Mutation) T4 Endonuklease VII
* *
Abbildung 12: Ablauf der EMD-Reaktion am Beispiel einer heterozygoten Punktmutation.
Die verwendeten Reagenzien entstammen dem PASSPORTTM Mutation
Scanning Kit (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden). Es umfasst
T4 Endonuklease VII, je einen Puffer für Enzymverdünnung, Probenverdünnung und
Hybridisierung sowie Stop Solution. Es wurde das Protokoll für heterozygote Proben
angewendet, da in allen untersuchten Fällen eine dominante Mutation sehr viel
wahrscheinlicher ist als eine rezessive. Nur ausreichend amplifizierte DNA konnte
eingesetzt werden. Daher mussten die spezifischen Peaks in der Gene Scan
Analyse auf dem ABI PRISM 310 mindestens eine Höhe von 6000 erreichen; zu
schwach amplifizierte Templates wurden in einer 2. PCR erneut vervielfältigt. Da
35
Punktmutationen im PMP22-Gen sehr selten sind, konnte auf eine Negativkontrolle
verzichtet werden. Jedoch wurde jedes Mal einen Positivkontrolle mitgeschnitten, um
sicherzugehen, dass die Reaktion wie beabsichtigt abgelaufen war. Die
Positivkontrolle war in diesem Fall eine stumme, heterozygote Mutation im Exon 3
des PMP22-Gens.
Für den Hybridisierungsschritt wurden je 3 µl Probenverdünnungspuffer, 2 µl
Hybridisierungspuffer und 10 µl des entsprechenden PCR-Produktes sorgfältig
gemischt und bei 95°C für 5 Minuten denaturiert. Während die Proben auf
Raumtemperatur abkühlten, wurde das Enzym verdünnt (pro Ansatz 2 µl Enzym und
3 µl Verdünnungspuffer). Jede Probe wurde mit 5 µl dieser Verdünnung gemischt
und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. An diesem Punkt wurde das vom Hersteller
angegebene Protokoll verlassen, da die Analyse nicht, wie vorgegeben, mit dem ABI
PRISM 377, sondern mit dem ABI Prism 310 erfolgte. Im Herstellerprotokoll ist nach
der Inkubation die Zugabe des sogenannten Stop Mix vorgesehen, welches aus je
4 µl der im Kit enthaltenen Stop Solution sowie den für die Analyse auf dem ABI
PRISM 377 vorgesehenen Reagentien Molecular Weight Marker (1 µl) und Loading
Buffer (1 µl) besteht. Die 6 µl Stop Mix werden dann mit 4 µl Reaktionsgemisch
versetzt, gemischt, 3 min bei 95°C denaturiert und auf dem ABI PRISM 377
analysiert. Nicht verwendeter Reaktionsansatz soll bei –20°C gelagert werden. In
unserem Fall waren verschiedene Optimierungsversuche notwendig, um die EMD
Resultate auf dem ABI PRISM 310 zu analysieren:
1. Ansatz: Es wurden 4 µl des Reaktionsansatzes mit einem Gemisch aus
12 µl Stop Solution sowie 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA als Längenstandard
versetzt, der restliche Reaktionsansatz wurde wie angegeben eingefroren. Das
Gemisch wurde 1 min bei 95°C denaturiert. Für die elektrophoretische Auftrennung
wurden die gleichen Bedingungen wie für PCR-Fragmente gewählt (Injektionszeit 5
Sekunden, Injektionsspannung 15.0 kV, Elektrophoresespannung 15.0 kV,
Temperatur 60°C, Laufzeit 24 Minuten).
2. Ansatz: Die kapillarelektrophoretische Auftrennung wurde nicht wie in 1 mit
5, sondern mit 20 Sekunden Injektionszeit durchgeführt.
3. Ansatz: Es wurde gänzlich auf Stop Solution verzichtet und nur 1 µl des
eingefrorenen Reaktionsansatzes mit 20 µl Wasser (Merck) und 0,5 µl GENESCAN-
36
500TM TAMRA vermischt. Vor der Elektrophorese wurde 1 min bei 95°C denaturiert,
die Elektrophoresebedingungen waren wie im zweiten Ansatz.
4. Ansatz: Nach der Inkubation bei 37°C wurde der gesamte Ansatz bei
–20°C eingefroren, um die Reaktion sofort abzubrechen. Zur weiteren Analyse
wurden 10 µl des gerade aufgetauten Reaktionsansatzes einer Ethanolfällung
unterzogen, um alle störenden Bestandteile für die Kapillarelektrophorese zu
entfernen. Im einzelnen lauten die Schritte der Fällung wie folgt: 10 µl Probe wurden
mit je 80 µl steril filtriertem Wasser (Merk), 10 µl 3 M Natriumacetatlösung pH 4,6 und
250 µl 100%igem Ethanol versetzt. Nach 25 Minuten Zentrifugation bei maximaler
Umdrehungsgeschwindigkeit (13000-15000 rpm) wurde die gesamte Flüssigkeit
entfernt und das Pellet mit 250 µl 70%igem Ethanol gewaschen (5 Minuten
Zentrifugation bei 13000-15000 rpm). Das Ethanol wurde abpipettiert und das Pellet
im Trockenschrank bei 37°C getrocknet, bis sämtliche Flüssigkeit entfernt war (ca. 10
Minuten). Die gefällte DNA wurde mit einer Mischung aus 12 µl Formamid und 0,5 µl
GENESCAN-500TM TAMRA gelöst und im ABI PRISM 310 elektrophoretisch
aufgetrennt (Bedingungen wie im 2. Ansatz).
5. Ansatz: Es wurde statt 30 Minuten eine Stunde lang mit dem Enzym
inkubiert. Es wurde der gesamte Reaktionsansatz (20 µl) gefällt und die
Kapillarelektrophorese wie in Ansatz 2 durchgeführt.
6. Ansatz: Die Inkubationszeit betrug eine halbe Stunde, der gesamte
Reaktionsansatz wurde gefällt und die Injektionszeit betrug 20 Sekunden.
7. Ansatz: Die Aufreinigungsmethoden Ethanolfällung und PCR-Purification
Kit (Qiagen) wurden miteinander verglichen: Um den Vergleich auszuführen, wurden
10 µl desselben EMD-Ansatzes (30 Minuten Inkubationszeit) einmal mit der Fällung
und einmal mit dem Purification Kit aufgereinigt. Für die kapillarelektrophoretische
Analyse wurden die Fällungen in 12 µl Formamid mit 0,5 TAMRA aufgenommen. Die
mit dem Aufreinigungskit bearbeiteten Proben wurden mit 14 µl eluiert, 12 µl des
Eluates wurden mit 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA und 7,5 µl Wasser versetzt.
Die Injektionszeit betrug 20 bzw. in einem zweiten Durchgang 5 Sekunden.
Nach dieser Optimierungsphase zeigte sich, dass mit einer 30-minütigen
Inkubationszeit, Ethanolfällung von 10 µl des Reaktionsansatzes und 5 Sekunden
Injektionszeit die Analyse problemlos durchgeführt werden kann und optimale
Ergebnisse erhalten werden (siehe unter 6.2). Eine vorherige Denaturierung bei 95°C
37
ist nicht notwendig. Anzumerken ist darüber hinaus, dass die Ethanolfällung auch
direkt an den Inkubationsschritt bei 37°C angeschlossen werden kann.
Um für die Interpretation der Ergebnisse optimale Bedingungen zu schaffen,
wurden bei der elektrophoretischen Auftrennung nacheinander jeweils die
ungeschnittene Probe (1 µl aufgereinigtes PCR-Produkt mit 0,5 µl GENESCAN-
500TMTAMRA in 12 µl Formamid) und die geschnittene Probe injiziert. Meistens
reicht eine Injektionszeit von 5 Sekunden aus, bei Bedarf kann die Injektionszeit
erhöht werden. Die entsprechenden Elektropherogramme konnten so schließlich
übereinanderprojiziert werden, so dass man genau erkennen konnte, ob nach der
Schneidereaktion neue Peaks entstanden waren. Alle auffälligen Proben wurden
dann der Sequenzanalyse unterzogen.
5.7. Automatisierte DNA-Sequenzanalyse
Für die automatische Sequenzierung von DNA sind viele Methoden entwickelt
worden, basierend auf chemischen (Maxam und Gilbert 1977) oder enzymatischen
Prinzipien. Die klassische Version nach Sanger verwendet die T7-Polymerase
(Sequenase®), radioaktiv markierte Primer, Desoxyribonukleotide, sowie
Didesoxyribonukleotide (Sanger et al. 1977). Es werden vier parallele Ansätze
benötigt, in denen je eine Sorte Didesoxyribonukleotid (ddATP, ddTTP, ddCTP,
ddGTP) mit den normalen Nukleotiden konkurriert. Während der Reaktion baut die
T7-Polymerase neben den Desoxyribonukleotiden somit auch die konkurrierenden
Didesoxyribonukleotide ein, die zum Syntheseabruch führen. Das Verhältnis von
Desoxyribonukleotiden zu Didesoxyribonukleotiden ist dabei so gewählt, dass neben
kurzen Abbruchfragmenten auch lange Fragmente entstehen. Die unterschiedlich
langen, markierten Fragmente können dann nach vierspuriger elektrophoretischer
Auftrennung detektiert werden. Die in der vorliegenden Arbeit verwendete modernere
Variante dieser Methode wird als „Cycle Sequencing“ bezeichnet und bietet im
Vergleich einige entscheidende Vorteile: Es wird nur ein Reaktionsgefäß benötigt
und es tritt keine radioaktive Strahlung auf, da fluoreszenzmarkierte
Didesoxyribonukleotide eingesetzt werden (Schema siehe Abbildung 13 auf Seite
42). Der verwendete ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit enthält das Enzym AmpliTaq®Polymerase, FS (FS für Fluoreszenz-
38
Sequenzierung). Es handelt sich um die Doppelmutante der hitzestabilen
Wildtyppolymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus: Die erste Mutation
(G46D) bewirkt den Verlust der 5’-3’ Nucleaseaktivität des Enzyms. Durch die zweite
Mutation im aktiven Zentrum der Polymerase (F667Y) wird sie toleranter gegenüber
den Kettenabbruch-Didesoxyribonukleotiden, so dass diese leichter eingebaut
werden können. Des Weiteren ist das Enzym mit einer Pyrophosphatase assoziiert,
die Pyrophosphorylierungprobleme minimieren soll.
Für die Sequenzierungsreaktion wurden stets einfach Fam-markierte PCR-
Produkte hergestellt, die, wie oben beschrieben, mit dem PCR Purification Kit
aufgereinigt wurden. Zwar ist die Reaktion auch mit zweifach markierten Templates
möglich, es kommt jedoch an den Primerpositionen zu störenden
Fluoreszenzüberstrahlungen.
markierte Produkte
A
ACGTCA
ACGTC
ACGT
ACG
AC
Reaktionsansatz: Fluoreszenzmarkierte
ddNTPs (T C A G) Enzym
Primer
Puffer
dNTPs
DNA
Denaturierung des original-Templates Einstieg in den Zyklus
orginal Template
Primeranlagerung
Denaturierung
ACGT
Kettenverlängerung ACGT
Abbildung 13 stellt das Prinzip des Cycle-Sequencing anhand eines exemplarischen Zyklusdar. Nach 25 Zyklen enthält man ausreichend viele Fragmente, um die Sequenz auf dem ABIPrism 310 Genetic Analyzer zu ermitteln (Abbildung gemäß dem ABI PRISMTM Kurshandbuch:Sequenzanalyse (310), S. 2.3, Ausgabe von Dezember 1998).
39
Um abzuschätzen, wie viel Template in die Sequenzierungsreaktion
eingesetzt werden muss, wurden die Gene Scan Analyseergebnisse zu Grunde
gelegt: DNA aus archiviertem Material konnte ab einer Peakhöhe von 5000
sequenziert werden. Waren die Peaks kleiner, so wurde nach Aufreinigung eine
zweite PCR angesetzt. Bei DNA aus Frischmaterial waren die Peaks oft sehr viel
höher, bzw. im Elektropherogramm „abgeschnitten“. Diese Proben wurden dann 1:10
verdünnt bevor sie zur Sequenzierung eingesetzt werden konnten. Die für die
Analysereaktion verwendeten nicht markierten Primer entsprechen den in der PCR
eingesetzten Oligonukleotiden. Die Reaktion wurde in Anlehnung an die
Herstellerempfehlung des ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit durchgeführt. Dieser Kit enthält ein Premix (Terminator Ready
Reaktion Mix), welches folgende Reagenzien umfasst: Enzym AmpliTaq®
Polymerase, FS, mit thermostabiler Pyrophosphatase, die vier mit unterschiedlichen
Fluoreszenzfarbstoffen markierten Didesoxyribonukleotide, die vier nicht markierten
Desoxyribonukleotide, MgCl2 und Tris-HCl Puffer, pH 9. Des Weiteren steht die
Doppelstrang DNA des Plamids pGEM-3Zf(+) mit dem zugehörigen Primer –21
M13 zur Verfügung, welche als Positivkontrolle fungiert. Das von Applied Biosystems
redigierte, aktuelle Arbeitsprotokoll wurde für unsere Bedingungen wie folgt adaptiert:
Pro Ansatz wurden 1 µl der aufgereinigten und gegebenen Falls verdünnten
Template DNA mit 2,5 pmol nicht markiertem Primer (F oder R), 2 µl Premix und
steril filtriertem Wasser (Merck) ad 10 µl zur Reaktion gebracht: Nach einminütiger
Denaturierung bei 96°C folgten 25 Zyklen aus Denaturierung (10 Sekunden bei
96°C), Primerannealing (5 Sekunden bei 58°C) und Extension (4 Minuten bei 60°C).
Nach abschließender Extension von 7 min bei 60°C wurden die Proben auf 4°C
heruntergekühlt. Für Exon 4 betrug die Annealingtemperatur nicht 58 sondern 60°C.
Bis zur Aufreinigung wurden die Ansätze bei 4°C gelagert, jedoch meist nicht länger
als einen Tag. Vor der eigentlichen Analyse musste das Reaktionsgemisch
aufgereinigt werden, um die Nukleotidketten von überschüssigen Reagenzien zu
befreien. Eigens für diesen Zweck ist das Centri Sep Spin Column System von
Princeton Separations (Adelphia, USA) entwickelt worden. Es basiert auf dem von
Sambrook und Kollegen 1989 vorgestellten Prinzip der Gelfiltration (Sambrook et al.
1989). Die Röhrchen sind mit einer Filtermembran sowie einem Pulver ausgestattet,
welches nach Zugabe von 800 µl destilliertem Wasser zu einem Gel polymerisiert.
Nach ausreichender Quellungszeit (am besten über Nacht, mindestens jedoch eine
40
halbe Stunde) lässt man ca. 200 µl des überschüssigen Wassers abtropfen und
zentrifugiert bei 2500 rpm für 2 Minuten. Auf die Gelsäulen wird nun das
Reaktionsgemisch aufgetragen und nochmals mit denselben Bedingungen
zentrifugiert. Das Gel hält die überschüssigen Reagentien zurück, während sich die
aufgereinigten DNA Einzelstränge im Eluat befinden.
Zur Analyse auf dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer wurden 4 µl des Eluates
mit 16 µl Wasser versetzt und nacheinander der kapillarelektrophoretischen
Auftrennung unterzogen (Elektrophoresebedingungen: Injektionszeit 30 Sekunden,
Injektionsspannung 2.0 kV, Elektrophoresespannung 15.0 kV, Temperatur 50°C,
Laufzeit 36 Minuten). Die registrierten Daten werden durch das Abi Prism 310
Collection Programm gesammelt und durch das Sequencing Analysis 3.0 Programm
ausgewertet. Jedem detektierten Datenpeak kann entsprechend der emittierten
Fluoreszenz eine Farbe und somit auch eine Base der DNA-Sequenz zugeordnet
werden (grün = Adenin, blau = Cytosin, rot = Thymin, gelb = Guanin, letzteres wird in
Ausdrucken der Übersichtlichkeit halber schwarz dargestellt). Abbildung 14 zeigt ein
Beispiel für eine solche Sequenzanalyse.
Abbildung 14: Das Elektropherogramm zeigt ein Beispiel für eine Sequenzanalyse auf demABI PRISM 310 (Wildtyp Sequenz, Ausschnitt aus PMP22, Exon 3, Hinstrang)
Die Sequenz, die das Programm somit anhand des Elektropherogramms
entschlüsselt, muss immer visuell mit der Wildtypsequenz abgeglichen werden, um
rezessive Mutationen zu erkennen und vom Programm nicht auswertbare Stellen wie
Sequenzüberlagerungen oder ähnliches zu interpretieren.
Fast immer war es nötig, zum eindeutigen Ausschluss einer Mutation sowohl
den Hin- als auch den Rückstrang zu sequenzieren.
41
6. Ergebnisse
6.1. Allgemeine Anmerkungen
In der vorliegenden Studie konnten 59 Proben von Patienten, die an einer Form der
HMSN erkrankt sind, auf Veränderungen der Sequenz des codierenden Bereichs des
PMP22-Gens untersucht werden. Damit umfasst sie alle Patienten mit CMT1 und
HNPP, bei denen das Screening auf Duplikation oder Deletion am Institut für
Neuropathologie Aachen negativ ausgefallen war, sowie einen großen Teil der am
Institut verfügbaren Patientenproben der Erkrankungen DSS und CH.
Auf der Basis der erarbeiteten methodologischen Protokolle konnten bei 58 Patienten
des beschriebenen Patientenkollektivs gemäß den in dieser Arbeit erhobenen
Ergebnissen eine Sequenzveränderung im codierenden Bereich des PMP22-Gens
ausgeschlossen werden. Bei Patient Nr. 18 konnte ein Polymorphismus identifiziert
werden, auf dessen Bedeutung im Folgenden noch ausführlicher eingegangen wird.
6.2. Ergebnisse der Methodenoptimierung
Um optimale Analyseergebnisse zu erlangen, wurde besonderer Wert auf die
dezidierte Ausarbeitung und Verbesserung der angewandten Methoden gelegt.
Dabei gelang es, durch sorgfältige Auswahl der Primer für die vier kodierenden
Exone des PMP22-Gens und modifizierte PCR-Bedingungen ein zuverlässiges
Protokoll zur Vervielfältigung gerade von problematischen DNA-Abschnitten (z.B.
formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe) zu entwickeln. Darüber hinaus
konnte ein äußerst modernes Screeningverfahren, nämlich die enzymatische
Mutationsdetektionsmethode (EMD), für die vorliegenden Anforderungen optimiert
und erstmalig auf dem ABI PRISM 310 etabliert werden. Die Ergebnisse der
einzelnen Optimierungsschritte sollen im Folgenden im Überblick dargestellt werden:
1. Ansatz: (30 Minuten Inkubationszeit / 4 µl Reaktionsansatz + 12 µl Stop
Solution + 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA / Denaturierung bei 95°C für 1 Minute /
Injektionszeit 5 Sekunden): Das Ergebnis zeigte im Elektropherogramm keinerlei
Signale, nicht einmal die Standardpeaks.
42
2. Ansatz: (wie 1, jedoch 20 Sekunden Injektionszeit): Es konnte ebenfalls
keinerlei Signal detektiert werden.
3. Ansatz: (30 Minuten Inkubationszeit / 1 µl Reaktionsansatz + 20 µl Wasser
(Merck) + 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA / Denaturierung bei 95°C für 1 Minute /
20 Sekunden Injektionszeit): Der verdünnte Ansatz lässt sich
kapillarelektrophoretisch auftrennen. Im Elektropherogramm erkennt man den Peak
des PCR-Produktes bei 239bp und auch an erwarteter Stelle das Schnittprodukt bei
152.04 bp mit einer Höhe von 380 (schwarzer, „Hex“-markierter Peak in Abbildung
15). Es handelt sich um das längere Fragment, das kurze Schnittprodukt ist im
„Anfangsrauschen“ meist nicht mehr zu detektieren (Verunreinigungen durch Primer-
Dimere und unspezifische kurze Fragmente). Diese in der EMD ermittelte
Schnittstelle entspricht der durch Sequenzanalyse nachgewiesenen Mutation (exakt
bei 153 bp, Details zu dem Fall siehe unter 6.3).
Anmerkung zu den Abbildungen 15 bis 17: Da für die Ansätze 1 bis 5 PCR-Produkte
verwendet worden waren, die im Rückstrang größtenteils Hex (schwarz), zu einem
geringen Teil jedoch auch Fam (blau) markiert waren, ist innerhalb des schwarzen
Peaks bei 153 bp auch ein kleiner blauer Peak zu erkennen.
Abbildung 15: Elektropherogramm der Positivkontrolle des 3. Ansatzes
4. Ansatz: (30 Minuten Inkubationszeit / Fällung von 10 µl des Ansatzes /
Fällungsprodukt + 12 µl Formamid + 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA / 20
Sekunden Injektionszeit): Dieser Ansatz ermöglicht eine noch bessere Detektion des
43
spezifischen Schnittproduktes (153,58 bp) mit einer Höhe von 2130 (siehe Abbildung
16).
Abbildung 16: Elektropherogramm der Positivkontrolle des 4. Ansatzes
5. Ansatz: (eine Stunde Inkubation / Fällung des gesamten
Reaktionsansatzes (20 µl) / Elektrophorese wie in 4) In diesem Ansatz ist das
detektierte Fragment 1552 hoch (siehe Abbildung 17).
Abbildung 17: Elektropherogramm der Positivkontrolle des 5. Ansatzes.
6. Ansatz: (30 Minuten Inkubationszeit / Fällung des gesamten
Reaktionsansatzes (20 µl) / Elektrophorese wie in 4.). Der Peak des Schnittproduktes
wird mit einer Höhe von 818 detektiert (siehe Abbildung 18 auf Seite 48).
44
Abbildung 18: Elektropherogramm der Positivkontrolle des 6. Ansatzes.
7. Ansatz: (Vergleich Ethanolfällung / PCR-Purification Kit (Qiagen)): Die
gefällten Proben zeigen zwar etwas mehr Hintergrundrauschen, allerdings sind die
Peaks größer als bei Aufreinigung mit dem Purification Kit (siehe Abbildung 19).
PCR-Purification-Kit
Ethanolfällung
Abbildung 19: Vergleich der Aufreinigung mit Ethanolfällung versus PCR-Purification-Kit.
45
Die Zusammenschau der Ergebnisse der Methodenoptimierung zeigt, dass mit
den Bedingungen von Ansatz 4 das Schnittprodukt am besten zu detektieren ist. Im
weiteren Verlauf zeigte es sich, dass bei ausreichender Menge PCR-Produkt oft eine
Injektionszeit von 5 Sekunden ausreichend ist.
Wenn sich beim ersten Screening mit der EMD Auffälligkeiten zeigten,
konnten diese mit der automatisierten DNA Sequenzanalyse verifiziert werden. Somit
konnten in der vorliegenden Studie zwei moderne Verfahren zur Mutationsanalyse in
effizienter und zuverlässiger Weise kombiniert werden.
Es gelang, 91,5% der Proben vollständig zu analysieren. Die Analysen der
einzelnen Exone (insgesamt 252 ohne Kontroll- und Wiederholungsanalysen) lassen
sich wie folgt aufschlüsseln: 27% der untersuchten DNA-Abschnitte wurden
ausschließlich sequenziert und 38% ausschließlich mit EMD untersucht. 33% wurden
beiden Methoden unterzogen, um die neu etablierte EMD-Methode in ihrer
Sensitivität kritisch zu prüfen. Lediglich 2% aller Einzelanalysen waren nicht
durchführbar (siehe Diskussion). Eine detaillierte Aufschlüsselung der Ergebnisse ist
der Tabelle im Anhang (11.3.) zu entnehmen.
Es ist zu betonen, dass die hohe Analysenvollständigkeit nur durch den
kombinierten Einsatz dieser beiden hochsensitiven Methoden möglich war. Die
Ergebnisse zeigen, dass es gerade bei schwierigen Fällen (wie DNA aus fixiertem,
paraffineingebettetem Gewebe) sehr empfehlenswert ist, nach den in dieser Arbeit
erprobten Verfahren zunächst mit EMD zu screenen und in Einzelfällen eine
Sequenzanalyse anzuschließen. Darüber hinaus ist zu erwähnen, dass die in dieser
Studie entwickelte Methodik Anwendung in weiteren Forschungsprojekten in der
Arbeitsgruppe des Institutes für Neuropathologie, Aachen, fand. So konnten mit Hilfe
der hier beschriebenen Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode und DNA-
Sequenzanalyse im MPZ-Gen zwei bis dato noch nicht beschriebene
Punktmutationen sowie zwei Polymorphismen nachgewiesen werden. Nach
denselben Prinzipien werden zurzeit neben dem PMP22- und MPZ-Gen auch die
Gene für EGR2 und Cx32 untersucht, so dass die in dieser Arbeit entwickelten
Vorgehensweisen als wegweisend für weitere Forschungsarbeit gewertet werden
können.
46
6.3. Patient Nr. 18
Der 1984 geborene Patient Nummer 18 hatte klinisch zunächst Symptome einer
CMT1 gezeigt. Mit zunehmendem Alter entwickelte sich zusätzlich eine bulbäre
Beteiligung in Form von Dysarthrie sowie bemerkenswerter Weise ein Diabetes
mellitus. Im Alter von 12 Jahren wurde eine Muskelbiopsie sowie eine Biopsie des N.
suralis entnommen. Lichtmikroskopisch zeigt sich im Muskelpräparat eine große Zahl
teilatrophischer und atrophischer Muskelfasern mit ausgedehnten
Fettvakatwucherungen. Die lichtmikroskopische Untersuchung des N. suralis ergibt
eine subtotale Reduktion großer markhaltiger Nervenfasern sowie zahlreiche
Regenerationsgruppen (siehe Abbildung 20). Wiederholt treten zu dünn myelinisierte
Nervenfasern umgeben von zwiebelschalenartig angeordneten
Schwannzellfortsätzen auf. Zusammengenommen zeigen sich also die Merkmale
einer weit fortgeschrittenen gemischten Neuropathie mit axonalen und
demyelinisierenden Anteilen.
Patient Nr. 18 Kontrolle
Kontrolle
Abbildung 20: Dargestellt ist das histologische Präparat des Patienten Nr. 18 (rechts) sowie im Vergleich ein normales Nervenpräparat als Kontrollfall (links). Unter den mikroskopischen Abbildungen befinden sich die zugehörigen dreidimensionalen Histogramme (Anzahl der Nervenfasern, Dicke der Axone und Dicke der Markscheiden sind gegeneinander aufgetragen).
47
Somit ist eine eindeutige diagnostische Zuordnung schwierig, gerade in Anbetracht
der bulbären und endokrinologischen Begleitsymptomatik. Im Screening auf
Duplikation oder Deletion konnte keine veränderte Anzahl des PMP22-Gens
festgestellt werden. Die Sequenzanalyse zeigte im dritten codierenden Exon eine
Veränderung der Wildtypsequenz: Im Codon 97 (TAC) wurde in einem Allel die dritte
Base Cytosin gegen Thymin ausgetauscht (siehe Abbildung 21).
Abbildung 21: Heterozygote Punktmutation im Exon 3 des PMP22-Gens: Austausch der BaseCytosin gegen Thymin im Codon 97 (TAC).
Das Ergebnis war bei Wiederholung von PCR und Sequenzanalyse
reproduzierbar. Auch in der EMD-Reaktion ließ sich an erwarteter Stelle (bei 153 bp)
ein eindeutiges Schnittprodukt feststellen (siehe Abbildung 22), ein ebenfalls in
mehreren Wiederholungen verifizierbarer Befund.
Abbildung 22: Nach EMD und Kapillarelektrophoretischer Auftrennung zeigt sich ein neuesSchnittprodukt bei 153 Basenpaaren.
48
Der Basenaustausch verändert die Aminosäurensequenz allerdings nicht, da
sowohl TAC als auch TAT für Tyrosin codieren.
6.4. Untersuchung auf Mutationen im Cx32-Gen
Um der Erkrankungsursache weiter auf den Grund zu gehen wurden von den
Patienten, die weder eine Duplikation noch eine Punktmutation im PMP22-Gen
aufwiesen, diejenigen ausgewählt, die potentiell Träger einer Mutation des Cx32-
Gens sein konnten. Auswahlkriterien waren männliches Geschlecht, mild bis
mittelgradig ausgeprägte Neuropathie und – besonders wichtig – neben der
demyelinisierenden Komponente Zeichen einer axonalen Schädigung. Es gelangten
die Patienten NPA3B, 4, 56, 68 und 69 zur Untersuchung. Mittels Sequenzanalyse
konnte eine Mutation des Cx32-Gens in allen fünf Fällen ausgeschlossen werden.
6.5. Untersuchung auf MPZ Mutationen
In der Arbeitsgruppe für molekulargenetische Forschung des Instituts für
Neuropathologie Aachen wird neben dem PMP22-Gen auch das MPZ-Gen im
Zusammenhang mit HMSN untersucht. So konnten 40 der 59 Proben auch einer
Untersuchung auf Sequenzveränderungen in den codierenden Exonen des MPZ-
Gens durch cand. med. C. Vitt unterzogen werden. Es wurden dieselben
Arbeitsmethoden eingesetzt. Interessanter Weise konnte in diesem Patientenkollektiv
durch das zusätzliche MPZ-Screening eine Missense-Mutation sowie zwei
Polymorphismen in diesem Gen identifiziert werden, was im Falle der Patientin Nr. 5
zur Klärung der Krankheitsursache führte.
6.5.1. Patientin Nr. 5
Die 1931 geborene Patientin war klinisch durch eine ausgeprägte axonale
Polyneuropathie auffällig geworden. Klinisch vermutete man eine Polyneuropathie
vorwiegend axonaler Genese. Die klinischen Beobachtungen konnten durch die 1996
49
entnommene Nervenbiopsie in soweit bestätigt werden, als die Zahl großer
markhaltiger Nervenfasern in der Tat bis zu 60% reduziert war. Neben Zeichen der
Demyelinisierung stachen besonders die große Zahl regenerierender Nervenfasern
sowie Ansammlungen mononukleärer Zellen hervor. Insgesamt wies das
histologische Bild also Zeichen axonaler, demyelinisierender sowie entzündlicher
Schädigung auf (siehe Abbildung 23)
Die molekulargenetischen Analysen ergaben einen normalen Befund für das PMP22-
Gen, im MPZ-Gen zeigte sich jedoch im Exon 6 eine Punktmutation: Im Codon 237
war die erste Base Guanin zu Adenin mutiert, so dass nicht mehr GCC für Alanin,
sondern ACC für Threonin codiert (weitere Einzelheiten: siehe Vitt et al. 2002).
Abbildung 23: Dargestellt ist das histologische Präparat der Patientin Nr. 5 (rechts), dasPräparat eines Kontrollfalles (links) sowie das zugehörige Ergebnis der Morphometrie.
Patientin Nr. 5Kontrolle
6.6. Patienten Nr. V1, V18 und 44
Auf die Bearbeitung der Patientenproben V1, V18 und 44 soll kurz eingegangen
werden, da hier charakteristische Analyseschwierigkeiten auftraten, die in der
50
Diskussion eingehender betrachtet werden sollen. Bei den Patienten V1 und V18
(beide an kongenitaler Hypomyelinisationsneuropathie erkrankt) wurden DNA-Proben
aus fixiertem, paraffineingebetteten Gewebe gewonnen, welche in der PCR nur
mühsam zu amplifizieren waren. Meist musste eine zweite PCR des ersten PCR-
Produktes durchgeführt werden, um überhaupt genügend Material für die EMD und
die Sequenzanalyse zu erhalten. Im ersten Screening zeigte sich bei beiden Proben
scheinbar eine heterozygote Sequenzveränderung, die zu einer stummen Mutation
geführt hätte. Bei Wiederholung beider PCR Ansätze und der Sequenzanalyse waren
diese Befunde jedoch nicht reproduzierbar, was Polymorphismen in diesen Fällen
ausschloss.
Die DNA von Patientin Nr. 44 (Dejerine Sottas Syndrom) stammte ebenfalls
aus formalinfixiertem, paraffineingebetteten Gewebe, was die Sequenzanalyse
entsprechend heikel gestaltete: Zwar zeigte sich im Hin-Strang des Exon 2 ein Indiz
für eine mögliche heterozygote Mutation, im Rückstrang konnte das entsprechende
Codon jedoch aus technischen Gründen auch bei mehrfacher Wiederholung nicht
dargestellt werden. Dies ist jedoch für einen Mutationsnachweis unabdingbar; daher
wurde eine EDTA-Blutprobe von der Patientin erbeten. Die DNA-Anayse der
Frischprobe zeigte im Hin- und Rückstrang die Wildtypsequenz, so dass eine PMP22
Mutation ausgeschlossen werden konnte.
51
7. Diskussion 7.1. Diskussion der Methode
Zum ersten Mal wurden in dieser Studie Punktmutationsanalysen des PMP22-Gens
mit Hilfe der Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode in Kombination mit der
automatisierten DNA-Sequenzanalyse durchgeführt. Unseres Wissens ist die
Arbeitsgruppe des Institutes für Neuropathologie Aachen die einzige, die im großen
Umfang DNA-Analysen an archivierten, paraffineingebetteten Gewebeproben von
HMSN Patienten durchführt. In der Vergangenheit lag der Schwerpunkt jedoch eher
beim Duplikations-/Deletionsscreening des PMP22-Gens (Thiex und Schröder 1998;
Beckmann und Schröder 2000) sowie der Identifikation von Punktmutationen im
CX32 bzw. MPZ-Gen (Senderek et al. 1998; Senderek et al. 2000). In der
vorliegenden Arbeit gelang es erstmalig, für alle codierenden Exone des PMP22-
Gens optimale PCR-Bedingungen zu etablieren, die auch die Amplifikation von DNA
aus formalin- bzw. glutaraldehydfixierten, paraffineingebetteten, Jahrzehnte lang
gelagerten Gewebeproben ermöglicht. Die in anderen Arbeiten vorgeschlagenen
Bedingungen sind zwar für die Analyse von Frischmaterial tauglich, erwiesen sich
aber für die hier gewählte Fragestellung als nicht suffizient. Durch Optimierung der
Methode - besonders durch Verbesserung der PCR-Bedingungen und intensive
Suche nach optimalen Primerpaaren – gelang es, 91,5% der Proben vollständig zu
analysieren. Bezogen auf die Gesamtzahl aller Exonanalysen konnte sogar ein
Vollständigkeitsgrad von 98% erreicht werden. Da Sequenzvarianten des PMP22-
Gens sehr selten sind, wurde auf die Vollständigkeit der Analysen besonders großer
Wert gelegt. Bezogen auf die archivierten Proben machte dies zum Teil einen 2.
PCR-Ansatz notwendig. Insgesamt lassen sich die Beobachtungen anderer Autoren
(Kösel und Graeber 1994) bezüglich der Arbeit mit DNA aus formalinfixierten,
paraffineingebettetem Gewebe durch die in der vorliegenden Arbeit gemachten
Erfahrungen bestätigen: Während Amplifikation von DNA-Sequenzen aus
Frischmaterial keinerlei Probleme bereitet, ist die Menge erzeugten PCR-Produktes
bei Verwendung von DNA aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe
wesentlich geringer. Durch Steigerung der in der PCR eingesetzten Menge
genomischer DNA konnte das Ergebnis in den meisten Fällen nicht sonderlich
gesteigert werden. Diese Beobachtungen stützen die von mehreren Autoren
52
geäußerte These, dass die DNA aus paraffineingebettetem Gewebe einen
intrinsischen PCR-Inhibitor enthält, der bis dato noch unbekannt ist und durch die
Isolierungsschritte nicht entfernt werden kann (An und Fleming 1991; Kösel und
Graeber 1994). Die Schwierigkeit der Bearbeitung solcher Proben zeigt die
Ergebnisfindung für die Proben V1, V18 und 44. Bei Proben V1 und V18 war die
Ausbeute der PCR trotz optimaler Bedingungen und ausreichendem Einsatz von
genomischer DNA so gering, dass erst die erneute Vervielfältigung des 1. PCR-
Produktes genug Template zur Bearbeitung erbrachte. Jedoch kam es durch die
mehrfache Amplifizierung zur „Einschleppung“ einer Mutation, die dann bei
Wiederholung der Ansätze nicht mehr nachzuweisen war. Dies ist vermutlich darauf
zurückzuführen, dass die Taq-Polymerase keine prove-reading Aktivität hat und nicht
wie in vivo durch korrigierende Enzyme wie Endonukleasen kontrolliert wird. Bei
Patientin 44 blieben die Ergebnisse der Paraffinprobenanalyse auch bei mehrmaliger
Wiederholung uneindeutig, erst die Blutprobe verschaffte Klarheit darüber, ob es sich
um eine Mutation handelte oder nicht. Es wird deutlich, dass die Bearbeitung solch
problematischer Fälle zwar möglich ist, jedoch teilweise zur Erhärtung des
Ergebnisses auf eine Blutprobe zurückgegriffen werden muss. Auch muss nochmals
betont werden, wie wichtig gerade bei solchen Ansätzen mit zweifacher Amplifikation
die Kontrollwiederholung ist, um falsch-positive Ergebnisse auszuschließen.
Darüber hinaus gelang es in der vorliegenden Studie erstmalig, eine neue,
aktuelle Methode im molekulargenetischen Arbeitskreis des Institutes für
Neuropathologie Aachen zu etablieren: die Enzymatische Mutationsdetektion (EMD).
Mit einer Sensitivität von nahe 100% und einer Spezifität von 94% ist sie der bisher
verwendeten SSCP Methode (Sensitivität 60-80%) deutlich überlegen (Del Tito et al.
1998). Die Methode wurde bereits an den unterschiedlichsten Genen erprobt (p53,
CFTR, Rh, BRCA1 etc.), und alle Arten von Basenfehlpaarungen können detektiert
werden. Die EMD übertrifft die SSCP nicht nur in puncto Sensitivität; vorteilhaft ist
darüber hinaus, dass ein einheitliches Protokoll für jegliche Art von Amplicon
verwendet werden kann und sogar Fragmente von einer Größe bis zu 1200 bp
(versus 250 bp bei SSCP) analysiert werden können. Pluspunkte der Methode im
Vergleich zur Sequenzanalyse sind die einfache, wenig störanfällige
Durchführbarkeit, der hohe Probendurchsatz pro Zeiteinheit und die niedrigeren
Kosten (Del Tito et al. 1998; Babon et al. 1999). So muss bei der Sequenzanalyse
meist sowohl der Hin- als auch der Rückstrang analysiert werden, um eine Mutation
53
sicher ausschließen zu können, bei der EMD reicht ein Analysedurchgang. Die
Autoren um Babon und Del Tito führen sogar an, dass EMD bei der Detektion
heterozygoter Mutationen der Sequenzanalyse überlegen sei (Del Tito et al. 1998;
Babon et al. 1999).
Als qualitative Analysemethode muss die Sequenzanalyse also nur in den
Fällen eingesetzt werden, in denen ein Schnittprodukt in der EMD Reaktion auf eine
potentielle Mutation hinweist.
In der vorliegenden Arbeit gelang es darüber hinaus erstmalig, die EMD
Methode unabhängig vom Herstellerprotokoll für die Analyse auf dem ABI PRISM
310 zu modifizieren und zu optimieren. Die Herstellerinstruktionen sowie bisherige
Veröffentlichungen beziehen sich auf den ABI PRISM 377 bzw. Microdevice
Electrophoresis (Schmalzing et al. 2000). Im Zuge der Methodenetablierung wurde
deutlich, dass die Proben auf dem ABI PRISM 310 nicht analysiert werden können,
wenn der Reaktionsansatz nach der Inkubationszeit mit der vom Hersteller
empfohlenen Stop Solution versetzt wird (Ansatz 1). Vermutlich sind so viele
störende Bestandteile (Ionen, Proteine etc.) enthalten, dass die Injektion der DNA-
Fragmente inhibiert wird. Auch Verlängerung der Injektionszeit kann dieses Problem
nicht beheben (Ansatz 2). Diese Vermutung wird durch das Ergebnis von Ansatz 3 gestützt: Verzichtet man auf die Stop Solution und verdünnt den Reaktionsansatz
(was die Konzentration störender Bestandteile reduziert), lassen sich schwache
Signale detektieren. Sehr gute Analyseergebnisse erzielt man, wenn man den
Reaktionsansatz direkt nach der Inkubation einer Ethanolfällung unterzieht (Ansatz 4). Dadurch wird der Gehalt an hochmolekularen Substanzen und Ionen im
Reaktionsansatz auf ein Minimum reduziert und die Injektion in die Kapillare nicht
mehr gehemmt. Die Elektropherogramme der so behandelten Ansätze weisen sogar
meist ein wesentlich geringer ausgeprägtes Hintergrundrauschen auf als die vom
Hersteller veröffentlichten Elektropherogramme auf dem ABI PRISM 377. Eine
Verlängerung der Reaktionszeit auf eine Stunde scheint angesichts des Ergebnisses
von Ansatz 5 nicht ratsam; der Peak des geschnittenen Produktes ist geringer. Dies
könnte daran liegen, dass bei längerem Verdau die unspezifische Schneideaktivität
des Enzyms stärker zum Tragen kommt, was die Anzahl spezifischer Produkte
vermindert. Auch erwies es sich als vorteilhaft, nur die Hälfte des Reaktionsansatzes
zu fällen, der Peak des Schnittproduktes ist in Ansatz 6 (Fällung des gesamten
Ansatzes) nicht höher als in Ansatz 4. Fällt man nur die Hälfte, kann man den
54
ungefällten Rest im Tiefkühlfach aufbewahren. Dies ist in sofern von Vorteil, als die
gefällten Ansätze bei Zimmertemperatur nur begrenzt haltbar sind. Sollte es also bei
der kapillarelektrophoretischen Analyse zu technisch bedingten Verzögerungen
kommen, kann man den Reserveansatz fällen und analysieren, ohne die gesamte
Reaktion wiederholen zu müssen. Zwar ist statt der Fällung auch eine Aufreinigung
mit dem PCR-Purification Kit (Quiagen) möglich, doch ist dies wesentlich teurer und
zeigt in der Praxis keine einschneidenden Vorteile (siehe Ergebnis von Ansatz 7).
Generell ist anzumerken, dass ein kurzfristiges Einfrieren nach der Inkubation mit
dem Enzym vor der Fällung durchaus praktikabel ist, da man so beide Arbeitsschritte
zeitlich unabhängig von einander durchführen kann. Auch kann durch das starke
Herunterkühlen das Risiko unerwünschter Reaktionen zwischen den einzelnen
Schritten minimiert werden.
Bei der Endanalyse auf dem ABI PRISM 310 erwies es sich als vorteilhaft,
zunächst das ungeschnittene und direkt im Anschluss das geschnittene PCR-Produkt
kapillarelektrophoretisch zu analysieren, da man nur so eindeutig feststellen kann,
welche Peaks bereits vorher z.B. als PCR-Artefakte bestanden oder erst nach dem
Verdau mit T4 Endonuklease auftraten. Dadurch, dass beide Fragmente im selben
Lauf analysiert werden, können kleinste material- oder apparaturbedingte
Schwankungen der elektrophoretischen Auftrennung auf ein Minimum reduziert
werden. Auch diese Parallelbetrachtung wurde in den bisherigen Studien nicht
durchgeführt, erleichtert aber enorm die Differenzierung unspezifischer Peaks von
möglichen Schnittprodukten. Von großem Nutzen im Zuge der Methodenetablierung
war der zuvor in der automatischen DNA-Sequenzanalyse detektierte
Polymorphismus bei Patient Nr. 18. Wie erwartet zeigte sich im Bereich der
Mutationsstelle bei 153 bp ein Hex-markierter Peak. Der reziproke Fam-markierte
Peak ist meist nicht sichtbar, da er bei einer Größe von 86 bp im Anfangsrauschen
verschwindet. Die Probe diente in der Folge als Bestätigung dafür, das die
erarbeitete Methode funktioniert: In jedem EMD Ansatz wurde sie als Positivkontrolle
mitanalysiert, jedes Mal war der Peak an entsprechender Stelle detektierbar. Somit
waren also auch die Wiederholbarkeit sowie der zuverlässige Ablauf eines jeden
Ansatzes durch diesen Polymorphismus gesichert. Überdies spricht die
Beobachtung, dass der 153 bp Peak in den EMD Analysen des Exon 3 anderer
Proben nicht zu detektieren war - neben dem eindeutigen Korrelat in der
Sequenzanalyse - für die Spezifität dieses Schnittproduktes.
55
33% der Analysen wurden mit beiden Methoden durchgeführt. Durch diese
Kontrollanalysen sollte gerade in der Etablierungsphase die Zuverlässigkeit der
EMD-Methode überprüft werden. Auch musste zunächst Erfahrung in der
Interpretation der EMD-Elektropherogramme gesammelt werden. Um kein
potentielles Schnittprodukt als „Geisterpeak“ fehl einzuschätzen, wurde mit strengem
Maß beurteilt und im Zweifelsfall häufiger eine Kontrollsequenzierung durchgeführt.
Mit zunehmender Erfahrung zeigt sich aber, dass gewisse Peaks in allen Analysen
eines jeweiligen Exons auftreten können, ohne dass eine Mutation in der Sequenz
nachzuweisen ist. Diese unspezifischen Hintergrundpeaks entstehen vermutlich
durch Fraktionierung der PCR-Produkte während des Fällungsvorgangs oder durch
unspezifische Schneideaktivität des Enzyms.
Zukünftig sind noch weitere Optimierungsschritte denkbar, um die Effizienz
der Methode für besonders große Gene weiter zu steigern: Wählt man die Abstände
der Primerpaare größer als für SSCP oder Sequenzierung, kommt man schon mit
wenigen EMD Analysen zum Ergebnis. Die Verwendung von Multiplex-PCR-
Ansätzen kann durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung der Fragmente die
Analysenzahl nochmals verringern.
Wie bereits erwähnt ist das EMD Protokoll für alle Amplicons anwendbar, eine
jeweilige Optimierung für jedes Exon eines Gens wie bei der SSCP Analyse ist nicht
notwendig. Daher konnte das in der vorliegenden Arbeit entwickelte Verfahren in der
molekulargenetischen Forschungsgruppe der Neuropathologie Aachen auch für die
Analyse von Punktmutationen in anderen Genen wie P0, Cx32 und EGR2
übernommen werden. So wurde eine neue methodische Basis für die weitere
Ursachenforschung der HMSN geschaffen, welche von den oben genannten
Vorteilen der Screeningmethode EMD profitieren kann.
7.2. Diskussion des Analyseergebnisses
Es gelang in der vorliegenden Arbeit, für alle 59 Patienten eine Punktmutation im
PMP22-Gen, welche die Aminosäurensequenz verändert, auszuschließen. Dies ist
insofern von Bedeutung, da nun die Grundlage geschaffen wurde, um Analysen an
seltener betroffenen Genen wie zum Beispiel EGR2 anzuschließen. Auch konnte
bereits ein großer Teil der Proben direkt im Anschluss an die PMP22-Analyse dem
56
Screening auf P0-Mutationen unterzogen werden, welches die Identifikation von
einer Mutation sowie zwei Polymorphismen ermöglichte. Darüber hinaus wird anhand
der erhobenen Daten die Seltenheit von Sequenzvariationen im PMP22-Gen
deutlich. Mutationsereignisse im Cx32-Gen (über 200 beschriebene Mutationen bei
CMTX) und im P0-Gen (ca. 50 beschriebene bei CMT1) sind wesentlich häufiger.
Das Ergebnis bestätigt ähnliche Prozentzahlen anderer Veröffentlichungen: In der
European Collaborative Study unter der Leitung von Professor Dr. Christine Van
Broeckhoven wurden 98 Patienten CMT1-Patienten ohne Duplikation des PMP22-
Gens untersucht, jedoch nur 3 Sequenzvariationen (4,1%) gefunden (Nelis et al.
1996). Mersiyanova et al. (2000) konnten unter 115 CMT Patienten ohne Duplikation
lediglich 2 PMP22-Gen Mutationen nachweisen, jedoch 12 Mutationen im Cx32- und
8 im P0-Gen
Auf den in dieser Studie identifizierten Polymorphismus sowie auf die Frage,
welche Erkrankungsursachen nach Ausschluss einer PMP22-Mutation für die
untersuchten Patienten in Frage kommen, soll im Folgenden eingegangen werden.
7.3. Bedeutung des Polymorphismus in Probe Nr. 18
Die in Patientenprobe Nr. 18 entdeckte Mutation führt zu keiner Veränderung der
Aminosäurensequenz des PMP22-Gens. Daher ist es naheliegend, dass es sich um
einen Polymorphismus handelt, der die Erkrankung des Patienten nicht erklären
kann. Allerdings muss gesagt werden, dass trotz des beschleunigten Wachstums
molekulargenetischen Wissens in den letzen Jahren längst noch nicht alle
Zusammenhänge aufgedeckt sind. Es wäre also durchaus denkbar, dass diese
Mutation nicht durch eine Veränderung der Aminosäurensequenz pathogen wirkt,
sondern dass sie Einflüsse auf bis jetzt noch nicht entschlüsselte Funktions- und
Regelkreise hat. Vielleicht wurde eine Bindungsstelle für ein Protein verändert,
welches eine Rolle im Transkriptions- oder Splicingprozess spielt. Es könnte auch
sein, dass eine bis dato noch unbekannte Splice Site Sequenz entstanden ist, die
von einem Schneideenzym der Zelle erkannt und zum falschen Splicing der m-RNA
führt. Im Hinblick auf den aktuellen Kenntnisstand bleibt dies jedoch spekulativ.
In einer anderen Hinsicht haben solche Polymorphismen - auch SNPs (single
nucleotide polymorphisms) genannt – in den vergangenen Jahren an Bedeutung
57
gewonnen: Das „SNP Consortium“ und das „International Human Genome
Sequencing Consortium“ haben intensiv die Suche nach solchen SNPs im humanen
Genom vorangetrieben, um eine „map of human genome sequence variation“ mit
insgesamt 1.42 Milionen SNPs zu erstellen. Dieses Projekt erlaubt zum einen,
Aussagen über die Häufigkeit von Sequenzvariationen im Genom, die
Prädilektionsstellen für SNPs sowie deren Verteilung auf codierende und nicht
codierende Abschnitte zu machen. Zum anderen können bestimmte Muster von
SNPs den Träger besonders empfänglich oder aber resistent gegen Erkrankungen
machen. Gerade bei multifaktoriell vererbten Erkrankungen kann die SNP-Kartierung
also dazu beitragen, identische Muster und Häufigkeiten von SNPs in jeweiligen
Patientenkollektiven zu erkennen und verantwortliche Gene zu identifizieren
(Chakravarti 2001; Sachidanandam et al. 2001). In diesem Kontext ist also der
Nachweis von bisher unbekannten Polymorphismen keineswegs belanglos, sondern
im Rahmen der aktuell betriebenen Forschung von besonderer Bedeutung.
7.4. Potentielle Mutationen außerhalb des codierenden Bereichs des PMP22-Gens
Nach der vorliegenden Untersuchung lässt sich für das untersuchte Kollektiv zwar
eine die Aminosäurensequenz verändernde Mutation im codierenden Bereich des
PMP22-Gens ausschließen, dies heißt jedoch nicht, dass das Gen bei einigen
Betroffenen nicht doch direkt oder indirekt von pathologischen
Sequenzveränderungen betroffen sein kann. So ist zum Beispiel denkbar, dass
Mutationen außerhalb des codierenden Bereichs des PMP22-Gens einen Einfluss
auf seine Transkription oder die Stabilität der m-RNA haben (Keller und Chance
1999). Auch wäre es von Interesse, die Promotorregionen des PMP22-Gens näher
zu untersuchen. Wie auch das Cx32-Gen besitzt das PMP22-Gen einen
nervenspezifischen Promotor sowie Promotoren für die Expression in nichtneuralen
Geweben, welche die gewebsspezifische Transkription steuern.
Sequenzveränderungen im nervenspezifischen Promotor könnten dazu führen, dass
das Gen nicht mehr abgelesen wird, was sich phänotypisch wie eine Deletion, also
eine HNPP Erkrankung, äußern würde. Bei einer Mutation, welche die Ableserate
steigert, könnte sich phänotypisch eine CMT1 ausprägen. Es könnte auch sein, dass
58
mehrere nervenspezifische Promotoren existieren, die zu unterschiedlichen
Entwicklungsstufen der Myelinisation aktiv sind bzw. funktionsspezifisch
unterschiedliche Transkripte initiieren (z.B. für Signaltransduktion oder als
Strukturprotein). Bis jetzt gibt es nur eine Veröffentlichung zu dieser Fragestellung,
bei der unter 31 Patienten keine Mutation im nervenspezifischen Promotor gefunden
wurde (Nelis et al. 1998). Das untersuchte Kollektiv war allerdings nicht sehr groß, es
wurde nur ein Promotor untersucht und die Fragestellung wurde bis jetzt noch nicht
darüber hinausgehend beforscht, so dass bei HMSN Fällen unklarer Genese nach
den üblichen Screeningverfahren durchaus auch eine Analyse der
Promotorenregion(-en) zu erwägen ist – zumal im Promotor des Cx32-Gens bereits
Mutationen identifiziert werden konnten (Ionasescu et al. 1996; Bergmann et al.
2000). Des Weiteren könnte die Transkription des PMP22-Gens beeinflusst werden
durch modifizierende Gene oder epigenetische Interaktion wie Methylierung oder
„genomic imprinting“ (Rieß et al. 1998b)
7.5. Punktmutationen im P0-Gen – gemeinsamer Pathomechanismus für CMT1A und CMT 1B?
Bemerkenswerter Weise konnte bei einer Patientin aus dem für die PMP22-Studie
ausgewählten Kollektiv in weiteren Untersuchungen eine heterozygote
Punktmutation des P0-Gens festgestellt werden (Vitt et al. 2002). Im Anschluss an
die in der vorliegenden Studie geleisteten Analysen konnte in diesem Fall eine
molekulargenetische Ursache für die Neuropathie der Patientin identifiziert werden.
An dieser Stelle wird einmal mehr das unter den HMSN nicht seltene Phänomen
deutlich, dass ein und demselben Krankheitsbild Defekte in unterschiedlichen Genen
zugrunde liegen. Dies wirft die interessante Frage auf, in welcher Weise die
Kandidatengene für HMSN zusammenwirken. Arbeiten über die Assoziation von
PMP22 und P0 in den Myelinscheiden legen die Vermutung nahe, dass es für
CMT1A und CMT1B einen gemeinsamen Pathomechanismus gibt, der somit zum
selben Phänotyp führt (Muller 2000). In diesem Zusammenhang sind die von
Brancolini et al im Jahre 2000 publizierten Ergebnisse interessant: Sie zeigten, dass
Produkte punktmutierter PMP22-Gene nicht an der Zelloberfläche präsentiert
werden, diese Präsenz jedoch unabdingbar für die Fähigkeit des Proteins ist,
59
Zellformung und Zelltod zu regulieren (Brancolini et al. 2000). Die Autoren vermuten,
dass PMP22 Teil an einem Signaltransduktionsprozess der Plasmamembran beteiligt
ist. Es könnte also sein, dass sich PMP22 im Rahmen dieses Prozesses mit anderen
Proteinen der Plasmamembran zu einem Komplex zusammenlagert, oder aber dass
PMP22 im Rahmen einer Signaltransduktionskaskade mit anderen Proteinen in
Interaktion tritt. Das P0 Protein könnte ein Partner des PMP22-Gens im Rahmen
dieser membrangebundenen Vorgänge sein; Griffiths et al. (1992) konnten sogar
zeigen, dass es zwischen den beiden Proteinen zu einer heterophilen Interaktion
über die L2/ HNK-1 Epitope der glykosylierten Links kommt. Solche Interaktionen
könnten der Grund dafür sein, dass ein Phänotyp wie bei Patientin Nr. 5 zunächst
eine Veränderung des PMP22-Gens vermuten lässt, bei Analyse jedoch eine
Veränderung des Partnerproteins P0 zu Tage tritt. Es wäre höchst interessant,
weitere Einblicke in das Zusammenwirken speziell dieser, aber auch anderer
Myelinproteine zu gewinnen.
7.6. Andere im Zusammenhang mit HMSN stehende Gene und Proteine
Die vorliegende Studie wirft die Frage auf, welche Gene abgesehen vom PMP22-
Gen in die Pathogenese der HMSN involviert sein könnten. Für die X-chromosomale
Form der CMT konnten bisher über 200 Mutationen im Cx32 Gen nachgewiesen
werden. Die Häufigkeit dieser Mutationsereignisse veranlasste uns, 5 männliche
Patienten mit einer milderen, gemischten Form der Neuropathie aus dem
vorliegenden Kollektiv auszuwählen und einer Cx32-Analyse zu unterziehen. Die
Sequenzanalyse des codierenden Bereichs sowie der Promotorregion zeigte
allerdings keine Beteiligung dieses Gens. Wie bereits erwähnt konnten auch für
einen großen Anteil der Patienten in einer Parallelstudie P0-Mutationen
ausgeschlossen werden. Welche weiteren Analysen kommen für diese zwei bzw.
dreifach gescreenten Proben nun in Betracht? Bell und Kollegen wiesen 1998 darauf
hin, dass im Zusammenhang mit HMSN neben dem PMP22-, P0- und Cx32-Gen
noch mindestens acht weitere Genloci identifiziert wurden (Bell et al. 1998). Die
weitere Entwicklung zeigte, dass es sich bei einem der unbekannten Loci um das
EGR2-Gen, welches für einen auch Krox2 genannten Transkriptionsfaktor kodiert,
handelt. Bemerkenswerter Weise reguliert EGR-2 unter anderem auch die
60
Expression von PMP22, P0 und Cx32 (Nagarajan et al. 2001) – daher wäre die
Analyse dieses Gens im vorliegenden Patientengut eine weitere interessante
Aufgabe für folgende Studien.
Spätestens seit der Entdeckung von EGR2-Mutationen bei an HMSN
erkrankten Patienten ist die Betrachtung von Proteinen, die regulierend auf die
Transkription des PMP22-Gens Einfluss nehmen, besonders vielversprechend.
Außer EGR2 ist von den Transkriptionsfaktoren und anderen Regulatorproteinen der
Myelinogenese nur Oct 6 bekannt (Kamholz et al. 1999), dessen Bedeutung für die
Pathogenese der HMSN noch nicht geklärt ist.
Darüber hinaus wird seit Kurzem das LITAF-Gen (lipopolysaccharide-induced
tumor necrosis factor-alpha factor) als ursächlich für CMT1C diskutiert (Street et al.
2003). Dieses Gen codiert für ein in den Proteinabbau (Degradation) involviertes
Protein. Abgesehen davon wurden in letzter Zeit einige neue Gene als verantwortlich
für die CMT4 (rezessiv vererbte demyelinisierende Form der CMT) identifiziert (z.B.
GADP1, MTMR2, SBF2, NDRG1, siehe auch unter Abschnitt 2.1). Interessant wäre
es zu untersuchen, ob diese Gene eventuell auch andere Erkrankungsformen aus
dem Kreis der HMSN verursachen. Für das Myotubularin-relatet protein 2-Gen
(MTMR2) wurde ein solcher Zusammenhang schon von Bolino et al. (2001)
betrachtet. So scheint dieses Gen, dessen zugehöriges Protein ebenfalls in die
Transkriptionsregulation eingeschaltet ist, in sehr seltenen Fällen auch für andere
Formen der HMSN (z.B. CH) verantwortlich zu sein. Es ist zu erwarten, dass durch
die Entschlüsselung von Regulationsmechanismen der Myelinogenese weitere
Kandidatengene für die molekulargenetische Forschung ins Blickfeld gelangen.
Auch ist noch nicht geklärt, welche Bedeutung andere Myelinscheidenproteine
peripherer Nerven für die Entstehung erblicher Neuropathien haben können.
Tiermodelle geben Hinweise auf das myelinbasische Protein MBP und das
myelinassoziierte Glykoprotein MAG: die shiverer-Mausmutante besitzt eine Mutation
im MBP-Gen und auch das Knock-out Modell für MAG zeigt eine gestörte
Myelinscheidenbildung sowie Zeichen der Neuropathie (Rieß und Schöls 1998a). Ein
Zusammenhang zu den beim Menschen bekannten Erkrankungen des peripheren
Nervensystems oder im Speziellen den HMSN konnte bisher noch nicht gesichert
werden. Bei der Trembler Mausmutante sind allerdings PMP22, P0 und MBP in
ultrastrukturellen immuncytochemischen Analysen deutlich vermindert nachweisbar;
61
MAG zeigt eine abnorme Lokalisation (Vallat et al. 1999) – ein weiteres Indiz für den
engen funktionellen Zusammenhang dieser Proteine.
Insgesamt wird deutlich, dass noch längst nicht alle Möglichkeiten der
Pathogenese erblicher Neuropathien bekannt und erforscht sind. Nicht zuletzt ist die
große Zahl nicht geklärter HMSN Fälle – z.B. aus dem hier untersuchten
Patientenkollektiv - ein Ansporn, die Forschungsprojekte auf diesem Gebiet weiter
voranzutreiben.
7.7. Differentialdiagnostische Überlegungen
Bei einigen in dieser Arbeit untersuchten Patienten konnte nach Betrachtung
klinischer Angaben sowie morphologischer Befunde keine eindeutige Diagnose
gestellt werden. Nach den abgeschlossenen PMP22-Analysen erscheinen nun für
einen Teil der Patienten alternativ diskutierte Diagnosen wahrscheinlicher zu sein.
Ins Besondere sind dies Patienten, bei denen der begründete Verdacht auf ein
entzündliches Geschehen bestand. Zusätzlich zu den für die HMSN
charakteristischen Veränderungen hatten die Befunde bei diesen Patienten in
unterschiedlicher Ausprägung leukozytäre Infiltrate und Anzeichen der Vaskulitis
oder Polyneuritis gezeigt. Neben anderen Subtypen der HMSN kommt nun für 7 der
59 untersuchten Patienten eher die Diagnose eines Guillain-Barré-Syndroms (GBS),
für 3 Patienten die Chronische Inflammatorische Demyelinisierende Polyneuropathie
(CIDP) in Betracht. Wie bereits erwähnt ist die Abgrenzung von HMSN und
entzündlichen Neuropathien schwierig – sowohl bei CIDP als auch bei der chronisch
wiederkehrenden experimentellen allergischen Neuritis können
Zwiebelschalenformationen nachgewiesen werden (Pollard et al. 1975; Thomas et al.
1997). Molekulargenetische Analysen wie diese können also wie in den 9 genannten
Fällen zur Entscheidungsfindung in unklaren Fällen beitragen.
5 Patienten weisen neben der demyelinisierenden Komponente des
neuropathischen Geschehens eindeutige Zeichen der axonalen Schädigung auf. Sie
wurden in dieser Studie ebenfalls untersucht, da es zu einer solchen Schädigung in
Folge der abnormen Myelinisierung kommen kann. Die nachweislich fehlende
Aberration im PMP22-Gen legt nun den Verdacht nahe, dass es sich in diesen Fällen
vielleicht auch um primär axonale Prozesse handelt. Dies wiederum veranlasst dazu
62
- soweit bekannt - andere Genorte zu untersuchen und ist somit richtungsweisend für
die weitere Diagnostik und Forschung.
Schließlich muss bei der Befundinterpretation auch das Alter der Patienten
berücksichtigt werden. 20 der hier untersuchten Patienten waren bei Einsendung der
Biopsien älter als 50 Jahre. Im fortgeschrittenen Alter wird es natürlich immer
schwieriger, toxische Einflüsse, endokrine Erkrankungen (Diabetes mellitus),
entzündliche Geschehen, stattgehabte Traumata und andere Umweltfaktoren mit
schädigendem Einfluss auf periphere Nerven auszuschließen. Diese können den bei
HMSN auftretenden Veränderungen sehr ähnlich sein, wie in mehreren Studien
nachgewiesen werden konnte: Durch Injektion von reizenden Substanzen oder
wiederholte „tourniquet compression“ können hypertrophische, zwiebelschalenartige
Veränderungen im Nerv sogar experimentell erzeugt werden (Weller und Das Gupta
1968; Dyck 1969). Gerade unter den älteren Patienten könnten daher also auch
einige sein, deren Neuropathie nicht durch einen zu HMSN führenden genetischen
Defekt, sondern durch andere exogene wie auch endogene Prozesse hervorgerufen
wurde.
63
8. Zusammenfassung
In der vorliegenden Studie wurden 59 Patienten, die an unterschiedlichen Formen
einer hereditären motorisch-sensorischen Neuropathie erkrankt waren, auf
Sequenzveränderungen im codierenden Bereich des PMP22-Gens untersucht.
Erstmalig kam hier die Methode der Enzymatischen Mutationsdetektion (EMD) in
Kombination mit der automatisierten DNA-Sequenzanalyse an Patientenproben zum
Einsatz, deren DNA aus archivierten, paraffineingebetteten Suralnervenbiopsien
gewonnen wurde. Durch die Optimierung der EMD für die kapillarelektrophoretische
Analyse auf dem ABI PRISM 310 gelang es, eine hochaktuelle Methode mit nahezu
hundertprozentiger Sensitivität für ein effizientes Mutationsscreening zu etablieren.
So war es möglich, im ausgewählten Patientenkollektiv für 58 Patienten eine
Mutation im PMP22-Gen sicher auszuschließen. Bei Patient Nr. 18 konnte ein
Polymorphismus im Exon 3 nachgewiesen werden. Die vorliegende Untersuchung
unterstreicht also die Seltenheit von Sequenzvarianten im PMP22-Gen und gewährt
Einblick in die Häufigkeitsverteilung allelischer Varianten dieses Gens. Überdies
konnten für fünf Proben Mutationen im Cx32-Gen und für 39 Proben Mutationen im
P0-Gen ausgeschlossen werden (letzteres durch C. Vitt). Somit liefert diese Studie
die Ausgangsbasis für Untersuchungen weiterer mit HMSN assoziierter Gene wie
z.B. EGR2. Es ist zu betonen, dass mit den beschriebenen Verfahren auch nach
jahrelanger Archivierung eine valide Untersuchung und gegebenenfalls
Reklassifikation paraffineingebetteter Gewebeproben möglich ist. So ist gemäß der
erhobenen Analyseergebnisse für 15 Patienten nun eine entzündliche Ursache
(CIDP oder GBS) oder eine axonale Form der Neuropathie als wahrscheinlichere
Ursache des neuropathischen Krankheitsbildes in den Vordergrund getreten.
Insgesamt wird also deutlich, wie wichtig ein umfassendes, effizientes
Mutationsscreening in der modernen Medizin ist: Für die Patienten stellt es ein
minimal invasives diagnostisches Verfahren mit hoher Aussagekraft dar, da das
Ergebnis Grundlage für eine ausführliche genetische Beratung sowie gegebenenfalls
die rechzeitige Einleitung therapeutischer Maßnahmen ist. Nicht zuletzt sind Studien
wie diese auch vom wissenschaftlichen Standpunkt her unerlässlich: Nur durch
stetiges Wachstum des Wissens über Ursachen und pathogenetische
Zusammenhänge der hereditären Neuropathien kommt man dem Ziel, eines Tages
auch kausale, gentherapeutische Hilfen anbieten zu können, Schritt für Schritt näher.
64
9. Literatur 1 Adlkofer K, Naef R, Suter U (1997) Analysis of compound heterozygous mice
reveals that the trembler mutation can behave as a gain-of-function allele. J
Neurosci Res 49: 671-680.
2 An SF, Fleming KA (1991) Removal of inhibitor(s) of the polymerase chain
reaction from formalin-fixed, paraffin wax-embedded tissues. J Clin Pathol 44:
924-927.
3 Archer DR, Cuddon PA, Lipsitz D, Duncan ID (1997) Myelination of the canine
central nervous system by glial cell transplantation: a model for repair of
human myelin disease. Nat Med 3(1): 54-59.
4 Babon JJ, McKenzie M, Cotton RGH (1999) Mutation detection using
fluorescent enzyme mismatch cleavage with T4 endonuclease VII.
Electrophoresis 20: 1162-1170.
5 Beckmann A, Schröder JM (2000) Screening for Charcot-Marie-Tooth type 1A
and hereditary neuropathy with liability to pressure palsy in archival nerve
biopsy samples by direct-double-differential PCR. Acta Neuropathol 100(5):
459-463.
6 Bedford PD, James FE (1956) A family with the progressive hypertrophic
polyneuritis of Dejerine and Sottas. J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 19: 46-51.
7 Behse F, Buchthal F, Carlsen F, Knappeis GG (1972) Hereditary neuropathy
with liability to pressure palsies. Electrophysiological and histopathological
aspects. Brain 95(4): 777-794.
8 Bell C, Haites N (1998) Genetic aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Arch
Dis Child 78: 296-300.
9 Berciano J, Calleja J, Combarros O (1994) Charcot-Marie-Tooth disease.
Neurology. 44(10): 1985-1986.
10 Bergmann C, Schröder JM, Rudnik-Schöneborn S, Zerres K, Senderek J
(2001) A point mutation in the human connexin32 promotor P2 does not
correlate with X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth neuropathy in Germany.
Brain Res Mol Brain Res 88(1-2): 183-185.
11 Bergoffen J, Scherer SS, Wang S, Oronzi-Scott M, Bone L, Paul DL, Chen K,
Lensch MW, Chance PF, Fischbeck K (1993) Connexin mutations in X-linked
Charcot-Marie-Tooth disease. Science 262: 2039-2042.
65
12 Bird TD (2000) Charcot-Marie-Tooth Hereditary Neuropathy Overview.
GeneClinics (www.geneclinics.org/profiles/cmt/details.html).
13 Bird TD, Ott J, Giblett ER (1982) Evidence for Linkage of Charcot-Marie-Tooth
Neuropathy to the Duffy Lokus on Chromosome 1. Am J Hum Genet 34: 388-
394.
14 Bolino A, Lonie LJ, Zimmer M, Boerkoel CF, Takashima H, Monaco AP,
Lupski JR (2001) Short communication: Denaturating high-performance liquid
chromatography of the myotubularin-relatet protein 2 gene (MTMR2) in
unrelated patients with Charcot-Marie-Tooth disease suggests a low frequency
of mutation in inherited neuropathy. Neurogenetics 3: 107-109.
15 Bolino A, Muglia M, Conforti FL, LeGuern E, Salih MA, Georgiou DM,
Christodoulou K, Hausmanowa-Petrusewicz I, Mandich P, Schenone A,
Gambardella A, Bono F, Quattrone A, Devoto M, Monaco AP (2000) Charcot-
Marie-Tooth type 4B is caused by mutations in the gene encoding
myotubularin-related protein-2. Nat Genet 25(1): 17-19.
16 Bornemann A, Hansen FJ, Schmalbruch H (1996) Nerve and muscle biopsy in
a case of hereditary motor and sensory neuropathy type III with basal lamina
onion bulbs. Neuropathol Appl Neurobiol 22(1): 77-81.
17 Bort S, Nelis E, Timmerman V, Sevilla T, Cruz-Martinez A, Martinez F, Millan
JM, Arpa J, Vilchez JJ, Prieto F, Van Broeckhoven C, Palau F (1997)
Mutational analysis of the MPZ, PMP22 and Cx32 genes in patients of
Spanish ancestry with Charcot-Marie-Tooth disease and hereditary
neuropathy with liability to pressure palsies. Hum Genet. 99(6): 746-754.
18 Brancolini C, Edomi P, Marzinotto S, Schneider C (2000) Exposure at the cell
surface is required for Gas3/PMP22 to regulate both cell death and cell
spreading: Implication for the Charcot-Marie-Tooth Type 1A and Dejerine-
Sottas Diseases. Molecular Biology of the Cell 11(9): 2901-2914.
19 Brancolini C, Marzinotto S, Edomi P, Agostoni E, Fiorentini C, Muller HW,
Schneider C (1999) Rho-dependent regulation of cell spreading by the
tetraspan membrane protein Gas3/PMP22. Mol. Biol. Cell 10: 2441-2459.
20 Chakravarti A (2001) Single nucleotide polymorphisms: ...to a future of genetic
medicine. Nature 409: 822-823.
21 Chance PF, Alderson MK, Leppig KA, Lensch MW, Matsunami N, Smith B,
Swanson PD, Odelberg SJ, Disteche CM, Bird TD (1993) DNA deletion
66
associated with hereditary neuropathy with liability to pressure palsies. Cell 72:
143-151.
22 Chance PF, Bird TD, Matsunami N, Lensch MW, Brothman AR, Feldman GM
(1992) Trisomy 17p associated with Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1A
phenotype: evidence for gene dosage as a mechanism in CMT1A. Neurology
42(12): 2295-2299.
23 Charcot JM, Marie P (1886) Sur une forme particulière d'atrophie musculaire
progressive, souvent familiale, débutant par les pieds et les jambes et
atteignant plus tard les mains. Revue de Médecine (Paris) 6: 97-138.
24 Croft PB, Wadia NH (1957) Familial hypertrophic polyneuritis: review of a
previously reported family. Neurology 7: 356-366.
25 De Jong JGY (1947) Over families met hereditarie disposite tot het optreten
van neuritiden, gecorreleard met migraine. Psychiat. Neurol. Bl. 50: 60-76.
26 De Vos A, Sermon K, Van de Velde H, Joris H, Vandervorst M, Lissens W,
Mortier G, De Sutter P, Lofgren A, Van Broeckhoven C, Liebaers I, Van
Steirteghem A (1998) Pregnancy after preimplantation genetic diagnosis for
Charcot-Marie- Tooth disease type 1A. Mol Hum Reprod 4(10): 978-984.
27 Dejerine J, Sottas J (1893) Sur la névrite interstitielle, hypertrophique et
progressive de l'enfance. C R Soc Biol (Paris) 45: 63-96.
28 Del Tito BJJ, Poff HEr, Novotny MA, Cartledge DM, Walker RIn, Earl CD,
Bailey AL (1998) Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic
mutation detection. Clin Chem 44(4): 731-739.
29 D'Urso D, Ehrhardt P, Muller HW (1999) Peripheral myelin protein 22 and
protein zero: a novel association in peripheral nervous system myelin. J
Neurosci Res 19(9): 3396-3403.
30 D'Urso D, Prior R, Greiner-Petter R, Gabreëls-Festen AA, Muller HW (1998)
Overloaded endoplasmic reticulum-Golgi compartments, a possible
pathomechanism of peripheral neuropathies caused by mutations of the
peripheral myelin protein PMP22. J. Neurosci. 18: 731-740.
31 Dyck PJ (1969) Experimental hypertrophic neuropathy: pathogenesis of onion
bulb formations produced by repeated tourniquet applications. Arch Neurol 20:
490-507.
67
32 Dyck PJ, Arnason B (1984). Chronic inflammatory demyelinating
polyradiculoneuropathy. Peripheral Neuropathy. Dyck PJ, Thomas PK,
Lambert EH, Bunge R. Philadelphia, Saunders: 2104-2114.
33 Dyck PJ, Chance P, Lebo R, J.A. C (1993). Hereditary Motor and Sensory
Neuropathies. Peripheral Neuropathy. Dyck PJ, Thomas PK, Griffin JW, P.A.
L, J.F. P. Philadelphia, Saunders. 2: 1094-1117.
34 Dyck PJ, Lambert EH (1968a) Lower motor and primary sensory neuron
diseases with peroneal muscular atrophy, I: neurologic, genetic and
elektrophysiologic findings in hereditary polyneuropathy. Arch Neurol 18: 603-
618.
35 Dyck PJ, Lambert EH (1968b) Lower motor and primary sensory neuron
diseases with peroneal muscular atrophy, II: neurologic, genetic and
elektrophysiologic findings in various neuronal degenerations. Arch Neurol 18:
619-625.
36 Fabbretti E, Edomi P, Brancolini C, Schneider C (1995) Apoptotic phenotype
induced by overexpression of the wilde type gas3/PMP22: its relation to the
demyelinating peripheral neuropathy CMT1A. Genes Dev 9: 1846-1856.
37 Fabrizi GM, Cavallaro T, Taioli F, Orrico D, Morbin M, Simonati A, Rizzuto N
(1999) Myelin uncompaction in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1A with
a point mutation of peripheral myelin protein-22. Neurology 53(4): 846-851.
38 Fabrizi GM, Simonati A, Taioli F, Cavallaro T, Ferrarini M, Rigatelli F, Pini A,
Mostacciuolo ML, Rizzuto N (2001) PMP22 related congenital hypomyelination
neuropathy. J Neurol Neurosurg Psychiatry 70(1): 123-126.
39 Felice KJ, Seltzer WK (2000) Severe X-linked Charcot-Marie-Tooth
neuropathy due to new mutations [G59R(G-->C), W44X(G-->A)] in the
connexin 32 gene. Eur Neurol 44(1): 61-63.
40 Gabreëls-Festen AA, Bolhuis PA, Hoogendijk JE, Valentijn LJ, Eshuis EJ,
Gabreëls FJ (1995) Charcot-Marie-Tooth disease type 1A: morphological
phenotype of the 17p duplication versus PMP22 point mutations. Acta
Neuropathol 90(6): 645-649.
41 Gabriel JM, Erne B, Pareyson D, Sghirlanzoni A, Taroni F, Steck AJ (1997)
Gene dosage effects in hereditary peripheral neuropathy. Neurology 49: 1635-
1640.
68
42 Gal A, Mücke J, Theile H, Wieacker PF, Ropers HH, Wienker TF (1985) X-
linked dominant Charcot-Marie-Tooth disease: suggestion of linkage with a
cloned DNA sequence from the proximal Xq. Hum Genet 70: 38-42.
43 Gastaut JL, Benaim J, Livet MO, Philip N (2000) Charcot Marie Tooth disease:
exacerbation in pregnancy. Rev Neurol 156(10): 778-779.
44 Griffiths LS, Schmitz B, Schachner M (1992) L2/HNK-1 carbohydrate and
protein-protein interactions mediate the homophilic binding of the neural
adhesion molecule P0. J Nerrosci Res 33: 639-648.
45 Hanemann CO, Muller HW (1998) Pathogenesis of Charcot-Marie-Tooth 1A
(CMT1A) neuropathy. Trends Neurosci 21: 282-286.
46 Harding AE, Thomas PK (1980) Genetic aspects of hereditary motor and
sensory neuropathy (type I and II). J Med Genet 17: 329-336.
47 Hayasaka K, Himoro M, Sato W, Takada G, Uyemura K, Shimizu N, Bird TD,
Conneally PM, Chance PF (1993a) Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1B
is associated with mutations of the myelin P(0) gene. Nature Genet. 5: 31-34.
48 Hayasaka K, Himoro M, Sawaishi Y, Nanao K, Takahashi T, Takada G,
Nicholson GA, Ouvrier RA, Tachi N (1993b) De novo mutation of the myelin
P(0) gene in Dejerine-Sottas disease (hereditary motor and sensory
neuropathy type III). Nature Genet. 5: 266-268.
49 Highsmith WEj, Jin Q, Nataraj AJ, O`Connor JM, Burland VD, Baubonis WR,
Curtis FP, Kusukawa N, Garner NN (1999) Use of a DNA toolbox for the
characterization of mutation scanning methods. I: Construction of the toolbox
and evaluation of heteroduplex analysis. Electrophoresis 20: 1186-1194.
50 Hildebrandt G, Holler E, Woenkhaus M, Quarch G, Reichle A, Schalke B,
Andreesen R (2000) Acute deterioration of Charcot-Marie-Tooth disease IA
(CMT IA) following 2 mg of vincristine chemotherapy. Ann Oncol 11(6): 743-
747.
51 Holmes JR, Hansen STJ (1993) Foot and ankle manifestations of Charcot-
Marie-Tooth disease. Foot Ankle 14(8): 476-486.
52 Ionasescu VV, Searby BS, Ionasescu BR, Neuhaus IM, Werner R (1996)
Mutations of the noncoding region of the connexin32 gene in X-linked
dominant Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Neurology 47: 541-544.
53 Kalaydjieva L, Gresham D, Gooding R, Heather L, Baas F, de Jonge R,
Blechschmidt K, Angelicheva D, Chandler D, Worsley P, Rosenthal A, King
69
RH, Thomas PK (2000) N-myc downstream-regulated gene 1 is mutated in
hereditary motor and sensory neuropathy-Lom. Am J Hum Genet 67(1): 47-58.
54 Kamholz J, Awatramani R, Menichella D, Jiang H, Xu W, Shy M (1999)
Regulation of myelin-specific gene expression. Relevance to CMT1. Ann N Y
Acad Sci 14: 91-108.
55 Kamholz J, Menichella D, Jani A, Garbern J, Lewis RA, Krajewski KM, Lilien J,
Scherer SS, Shy ME (2000) Charcot-Marie-Tooth disease type 1: Molecular
pathogenesis to gene therapy. Brain 123: 222-233.
56 Keller MP, Chance PF (1999) Inherited Neuropathies: From Gene to Disease.
Brain Pathology 9: 327-341.
57 Kennedy WR, Sung JH, Berry JF (1977) A case of congenital hypomyelination
neuropathy. Clinical, morphological, and chemical studies. Arch Neurol. 34(6):
337-345.
58 Koolmann J, Röhm K-H, Wirth J (1998). Molekulare Genetik. Taschenatlas der
Biochemie. Stuttgart, Georg Thieme Verlag: 251.
59 Kösel S, Graeber MB (1994) Use of neuropathological tissue for molecular
genetic studies: parameters affecting DNA extraction and polymerase chain
reaction. Acta Neuropathologica 88: 19-25.
60 Kumar N, Cole J, Parry GJ (1999) Variability of presentation in hereditary
neuropathy with liability to pressure palsy results in underrecognition. Ann N Y
Acad Sci 883: 344-350.
61 Lupski JR, de Oca-Luna RM, Slaugenhaupt S, Pentao L, Guzzetta V, Trask
BJ, Saucedo-Cardenas O, Barker DF, Killian JM, Garcia CA, et al. (1991) DNA
duplication associated with Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Cell. 66(2):
219-232.
62 Lupski JR, Garcia CA (1992) Molecular genetics and neuropathology of
Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Brain Pathol 2(4): 337-349.
63 Madrid R, Bradley WG (1975) The pathology of neuropathies with focal
thickening of the myelin sheath (tomaculous neuropathy): studies on the
formation of the abnormal myelin sheath. J. Neurol. Sci. 25: 415-418.
64 Manfioletti G, Ruaro ME, Del Sal G, Philipson L, Schneider C (1990) A growth
arrest-specific (gas) gene codes for a membrane protein. Mol. Cell Biol. 10:
2924-2930.
70
65 Marques W, Jr., Thomas PK, Sweeney MG, Carr L, Wood NW (1998)
Dejerine-Sottas neuropathy and PMP22 point mutations: a new base pair
substitution and a possible "hot spot" on Ser72. Ann Neurol 43(5): 680-683.
66 Maxam AM, Gilbert W (1977) A new method for sequencing DNA. Proc Natl
Acad Sci U S A Feb;74(2): 560-564.
67 Mersiyanova IV, Ismailov SM, Polyakov AV, Dadali EL, Fedotov VP, Nelis E,
Lofgren A, Timmerman V, van Broeckhoven C, Evgrafov OV (2000) Screening
for mutations in the peripheral myelin genes PMP22, MPZ and Cx32 (GJB1) in
Russian Charcot-Marie-Tooth neuropathy patients. Hum Mutat 15(4): 340-347.
68 Muller HW (2000) Tetraspan myelin protein PMP22 and demyelinating
peripheral neuropathies: new facts and hypotheses. Glia 29(2): 182-185.
69 Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H (1986) Specific
enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold
Spring Harb Symp Quant Biol 51 Pt 1: 263-273.
70 Naef R, Adlkofer K, Lescher B, Suter U (1997) Aberrant protein trafficking in
Trembler suggests a disease mechanism for hereditary human peripheral
neuropathies. Mol Cell Neurosci 9(1): 13-25.
71 Naef R, Suter U (1999) Impaired intracellular trafficking is a common disease
mechanism of PMP22 point mutations in peripheral neuropathies. Neurobiol.
Dis. 6: 1-14.
72 Nagarajan R, Svaren J, Le N, Araki T, Watson M, Milbrandt J (2001) EHR2
mutations in inherited neuropathies dominat-negatively inhibit myelin gene
expression. Neuron 30: 355-368.
73 Nelis E, De Jonghe P, De Vriendt E, Patel PI, Martin JJ, Van Broeckhoven C
(1998) Mutation analysis of the nerve specific promoter of the peripheral
myelin protein 22 gene in CMT1 disease and HNPP. J Med Genet 35(7): 590-
593.
74 Nelis E, Erdem S, Van Den Bergh PY, Belpaire-Dethiou MC, Ceuterick C, Van
Gerwen V, Cuesta A, Pedrola L, Palau F, Gabreels-Festen AA, Verellen C,
Tan E, Demirci M, Van Broeckhoven C, De Jonghe P, Topaloglu H,
Timmerman V (2002) Mutations in GDAP1: autosomal recessive CMT with
demyelination and axonopathy. Neurology 59(12): 1865-1872.
75 Nelis E, Van Broeckhoven C (1996) Estimation of the Mutation Frequencies in
Charcot Marie Tooth Disease Type 1 and Hereditary Neuropathy with Liability
71
to Pressure Palsies: A European Collaborative Studie. Eur J Hum Genet 4: 25-
33.
76 Neundörfer B, Schröder JM, Claus D (1987). Familiäre Polyneuropathie mit
Neigung zu Druckparesen. Praktische Neurologie. Neundörfer B, Schimrigk K,
Soyka D. Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft. 2: 525.
77 Nicholson GA, Valentijn LJ, Cherryson AK, Kennerson ML, Bragg TL,
DeKroon RM, Ross DA, Pollard JD, McLeod JG, Bolhuis PA, et al. (1994) A
frame shift mutation in the PMP22 gene in hereditary neuropathy with liability
to pressure palsies. Nat Genet 6(3): 263-266.
78 Ohnishi A, Yamamoto T, Izawa K, Yamamori S, Takahashi K, Mega H, Jinnai
K (2000) Dejerine-Sottas disease with a novel de novo dominant mutation, Ser
149 Arg, of the peripheral myelin protein 22. Acta Neuropathol (Berl) 99(3):
327-330.
79 Olek MJ, Bordeaux B, Leshner RT (1999) Charcot-Marie-Tooth disease type I
diagnosed in a 5-year-old boy after vincristine neurotoxicity, resulting in
maternal diagnosis. J Am Osteopath Assoc 3: 165-167.
80 Pareyson D (1999) Charcot-Marie-Tooth Disease and Related Neuropathies:
Molecular Basis for Distinction and Diagnosis. Muscle & Nerve 22: 1408-1509.
81 Pareyson D, Scaioli V, Taroni F, Botti S, Lorenzetti D, Solari A, Ciano C,
Sghirlanzoni A (1996) Phenotypic heterogeneity in hereditary neuropathy with
liability to pressure palsies associated with chromosome 17p11.2-12 deletion.
Neurology 46(4): 1133-1137.
82 Parman Y, Plante-Bordeneuve V, Guiochon-Mantel A, Eraksoy M, Said G
(1999) Recessive inheritance of a new point mutation of the PMP22 gene in
Dejerine-Sottas disease. Ann Neurol 45(4): 518-522.
83 Patel PI, Lupski JR (1994) Charcot-Marie-Tooth disease: a new paradigm for
the mechanism of inherited disease. Trends Genet 10(4): 128-133.
84 Patel PI, Roa BB, Welcher AA, Schoener-Scott R, Trask BJ, Pentao L, Snipes
GJ, Garcia CA, Francke U, Shooter EM, Lupski JR, Suter U (1992) The gene
for the peripheral myelin protein PMP-22 is a candidate for Charcot-Marie-
Tooth disease type 1A. Nature Genet. 1: 159-165.
85 Pearce JM (2000) Howard Henry Tooth (1856-1925). J Neurol 247(1): 3-4.
72
86 Poeck K, Hacke W (1998). Polyneuropathien und hereditäre Neuropathien.
Neurologie. Poeck K, Hacke W. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-
Verlag: 644-647.
87 Pollard JD, King RHM, Thomas PK (1975) Recurrent experimental allergic
neuritis. An electron microscope study. J Neurol Sci 24: 365-383.
88 Raeymaekers P, Timmerman V, Nelis E, De Jonghe P, Hoogendijk JE, Baas
F, Barker DF, Martin JJ, De Visser M, Bolhuis PA et al. (1991) Duplication in
chromosome 17p11.2 in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1a (CMT 1a).
The HMSN Collaborative Research Group. Neuromuscul Disord. 1(2): 93-97.
89 Rieß O, Schöls L (1998a). Herreditäre Neuropathien. Neurogenetik:
Molekulargenetische Diagnostik neurologischer Erkrankungen. Berlin
Heidelberg, Springer-Verlag: 315-332.
90 Rieß O, Schöls L, Auburger G (1998b). Einführung und tabellarischer
Überblick über genetisch diagnostizierbare neurologische Erkrankungen.
Neurogenetik: Molekulargenetische Diagnostik neurologischer Erkrankungen.
Berlin Heidelberg, Springer-Verlag: 3-14.
91 Roa BB, Dyck PJ, Marks HG, Chance PF, Lupski JR (1993a) Dejerine-Sottas
syndrome associated with point mutation in the peripheral myelin protein 22
(PMP22) gene. Nat Genet 5(3): 269-273.
92 Roa BB, Garcia CA, Suter U, Kulpa DA, Wise CA, Mueller J, Welcher AA,
Snipes GJ, Shooter EM, Patel PI, et al. (1993b) Charcot-Marie-Tooth disease
type 1A. Association with a spontaneous point mutation in the PMP22 gene. N
Engl J Med 329(2): 96-101.
93 Robaglia-Schlupp A, Pizant J, Norreel JC, Passage E, Saberan-Djoneidi D,
Ansaldi JL, Vinay L, Figarella-Branger D, Levy N, Clarac F, Cau P, Pellissier
JF, Fontes M (2002) PMP22 overexpression causes dysmyelination in mice.
Brain 125(Pt 10): 2213-2221.
94 Roussy G, Lévy G (1926) Sept cas d'une maladie familiale particulière. Rev
Neurol (Paris) 1: 427-450.
95 Sachidanandam R, Weissmann D, Schmidt SC, Kakol JM, Stein LD, Marthe
G, Sherry S, Mullikin JC, Mortimore BJ, Willey DL, Hunt SE, Cole CG, Coggill
PC, Rice CM, Ning Z, Rogers J, Bentley DR, Kwok PY, Mardis ER, Yeh RT,
Schultz B, Cook L, Davenport R, Dante M, Fulton L, Hillier L, Waterston RH,
McPherson JD, Gilman B, Schaffner S, Van Etten WJ, Reich D, Higgins J,
73
Daly MJ, Blumenstil B, Baldwin J, Stange-Thomann N, Zody MC, Linton L,
Lander ES, Attshuler D, Group TiSMW (2001) A map of human genome
sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms.
Nature 15: 928-933.
96 Sahenk Z (1999) Abnormal Schwann cell-axon interactions in CMT
neuropathies. The effects of mutant Schwann cells on the axonal cytoskeleton
and regeneration-associated myelination. Ann N Y Acad Sci 883: 415-426.
97 Sahenk Z, Chen L, Freimer M (1998) A novel PMP22 point mutation causing
HNPP phenotype: studies on nerve xenografts. Neurology 51(3): 702-707.
98 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB,
Erlich HA (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science 239(4839): 487-491.
99 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory.
100 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-
terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A Dec;74(12): 5463-5467.
101 Scherer SS, Arroyo E (2002) Recent progress on the molecular organisationof
myelinated axons. J Peripher Nerv Syst 7(1): 1-12.
102 Schmalzing D, Belenky A, Novotny MA, Koutny L, Salas-Solano O, El-Difrawy
S, Adourian A, Matsudaira P, Ehrlich D (2000) Microchip electrophoresis: a
method for high-speed SNP detection. Nucleic Acids Research 28: E43-e43.
103 Schröder JM (1999). Hereditäre motorisch-sensorische Neuropathien (HMSN).
Pathologie des Nervensystems VIII. Pathologie peripherer Nerven. Schröder
JM. Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag. 8: 251-412.
104 Schröder JM, Bohl J, von Bardeleben U (1988) Changes of the ratio between
myelin thickness and axon diameter in human developing sural, femoral, ulnar,
facial and trochlear nerves. Acta Neuropathol 76: 471-483.
105 Seitz RJ, Wechsler W, Mosny DS, Lenard HG (1986) Hypomyelination
neuropathy in a female newborn presenting as arthrogryposis multiplex
congenita. Neuropediatrics 17(3): 132-136.
106 Senderek J, Bergmann C, Quasthoff S, Ramaekers VT, Schröder JM (1998)
X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth disease: nerve biopsies allow
morphological evaluation and detection of connexin32 mutations (Arg15Trp,
Arg22Gln). Acta Neuropathol (Berl) 95(5): 443-449.
74
107 Senderek J, Bergmann C, Ramaekers VT, Nelis E, Bernert G, Makowski A,
Züchner S, De Jonghe P, Rudnik-Schöneborn S, Zerres K, Schröder JM
(2003) Mutations in the ganglioside-induced differentiation-associated protein-
1 (GDAP1) gene in intermediate type autosomal recessive Charcot-Marie-
Tooth neuropathy. Brain 126(Pt 3): 642-649.
108 Senderek J, Bergmann C, Weber S, Ketelsen UP, Schorle H, Rudnik-
Schoneborn S, Buttner R, Buchheim E, Zerres K (2003) Mutation of the SBF2
gene, encoding a novel member of the myotubularin family, in Charcot-Marie-
Tooth neuropathy type 4B2/11p15. Hum Mol Genet 12(3): 349-356.
109 Senderek J, Hermanns B, Bergmann C, Boroojerdi B, Bajbouj M, Hungs M,
Ramaekers VT, Quasthoff S, Karch D, Schröder JM (1999) X-linked dominant
Charcot-Marie-Tooth neuropathy: clinical, electrophysiological, and
morphological phenotype in four families with different connexin32
mutations(1). J Neurol Sci 167(2): 90-101.
110 Senderek J, Hermanns B, Lehmann U, Bergmann C, Marx G, Kabus C,
Timmerman V, Stoltenburg-Didinger G, Schröder JM (2000) Charcot-Marie-
Tooth neuropathy type 2 and P0 point mutations: two novel amino acid
substitutions (Asp61Gly; Tyr119Cys) and a possible "hotspot" on Thr124Met.
Brain Pathol 10(2): 235-248.
111 Simonati A, Fabrizi GM, Pasquinelli A, Taioli F, Cavallaro T, Morbin M, Marcon
G, Papini M, Rizzuto N (1999) Congenital hypomyelination neuropathy with
Ser72Leu substitution in PMP22. Neuromuscul Disord. 9(4): 257-261.
112 Snipes GJ, Suter U, Welcher AA, Shooter EM (1992) Characterisation of a
novel peripheral nervous system myelin protein (PMP22/SR13). J. Cell Biol.
117: 225-238.
113 Stebbins NB, Conneally PM (1982) Linkage of dominantly inherited Charcot-
Marie-Tooth neuropathy to the Duffy locus in an Indian family. Am J Hum
Genet 34: 388-394.
114 Stögbauer F, Young P, Kerschensteiner M, Ringelstein EB, Assmann G,
Funke H (1998) Recurrent brachial plexus palsies as the only clinical
expression of hereditary neuropathy with liability to pressure palsies
associated with a de novo deletion of the peripheral myelin protein-22 gene.
Muscle Nerve 21(9): 1199-1201.
75
115 Strachan T (1994). Die Analyse menschlicher DNA. Das menschliche Genom.
Verlag SA. Heidelberg Berlin Oxford: 83-110.
116 Street VA, Bennett CL, Goldy JD, Shirk AJ, Kleopa KA, Tempel BL, Lipe HP,
Scherer SS, Bird TD, Chance PF (2003) Mutation of a putative protein
degradation gene LITAF/SIMPLE in Charcot-Marie-Tooth disease 1C.
Neurology 60(1): 22-26.
117 Street VA, Goldy JD, Golden AS, Tempel BL, Bird TD, Chance PF (2002)
Mapping of Charcot-Marie-Tooth disease type 1C to chromosome 16p
identifies a novel locus for demyelinating neuropathies. Am J Hum Genet
70(1): 244-250.
118 Suter U, Moskow JJ, Welcher AA, Snipes GJ, Kosaras B, Sidman RL,
Buchberg AM, Shooter EM (1992a) A leucine-to-proline mutation in the
putative first transmembrane domain of the 22-kDa peripheral myelin protein in
the trembler-J mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 4382-4386.
119 Suter U, Snipes GJ, Schoener-Scott R, Welcher AA, Lupski JR, Murphy RA,
Shooter EM, Patel PI (1994) Regulation of tissue-specific expression of
alternative peripheral myelin protein-22 (PMP) gene transcripts by two
promoters. J. Biol. Chem. 269: 25795-25808.
120 Suter U, Welcher AA, Ozcelik T, Snipes GJ, Kosaras B, Francke U, Billings-
Gagliardi S, Sidman RL, Shooter EM (1992b) Trembler mouse carries a point
mutation in a myelin gene. Nature 356: 241-244.
121 Thiex R, Schröder JM (1998) PMP-22 gene duplications and deletions
identified in archival, paraffin-embedded sural nerve biopsy specimens:
correlation to structural changes. Acta Neuropathol 96(1): 13-21.
122 Thomas PK, King RHM, Bradley JL (1997) Hypertrophic neuropathy: atypical
appearances resulting from the combination of type 1 hereditary motor and
sensory neuropathy and diabetes mellitus. Neuopathology and Applied
Neurobiology 23: 348-351.
123 Timmerman V, De Jonghe P, Ceuterick C, De Vriendt E, Lofgren A, Nelis E,
Warner LE, Lupski JR, Martin JJ, Van Broeckhoven C (1999) Novel missense
mutation in the early growth response 2 gene associated with Dejerine-Sottas
syndrome phenotype. Neurology 52(9): 1827-1832.
124 Tobler AR, Notterpek L, Naef R, Taylor V, Suter U, Shooter EM (1999)
Transport of Trembler-J mutant peripheral myelin protein 22 is blocked in the
76
intermediate compartment and affects the transport of the wild-type protein by
direct interaction. J Neurosci Res 19(6): 2027-2036.
125 Tooth HH (1886) The peroneal type of progressive musular atrophy. Lewis,
London.
126 Valentijn LJ, Baas F, Woltermann RA, Hoogendijk JE, van den Bosch NH,
Zorn I, Gabreëls-Festen AW, De Visser M, Bolhuis PA (1992) Identical point
mutations of PMP22 in Trembler-J mouse and Charcot-Marie-Tooth disease
type 1A. Nat Genet 2: 2143-2146.
127 Vallat JM, Sindou P, Garbay B, Preux PM, Anani T, Richard L, Diot M (1999)
Expression of myelin proteins in the adult heterozygous Trembler mouse. Acta
Neuropathol 98: 281-287.
128 Vallat JM, Sindou P, Preux PM, Tabaraud F, Milor AM, Couratier P, LeGuern
E, Brice A (1996) Ultrastructural PMP22 expression in inherited demyelinating
neuropathies. Ann Neurol. 39(6): 813-817.
129 Vance JM (2000) The many faces of Charcot-Marie-Tooth disease. Arch
Neurol 57(5): 638-640.
130 Vance JM, Nicholson GA, L.H. Y, Stajich J, Steward CS, Speer MC, Hung
WY, Roses AD, Barker D, Pericak-Vance MA (1989) Linkage of Charcot-
Marie-Tooth neuropathy type 1A to chromosome 17. Exp Neurol 104: 186-
189.
131 Vitt C, Fuchs C, Wiendieck K, Schröder JM, Beckmann A (2002) PMP22, P0
and Cx32 mutations in HMSN patients identified by enzymatic mutation
detection capillary electrophoresis and sequencing analysis. Acta Neuropathol
104 Number 5: 575.
132 Warner LE, Hilz MJ, Appel SH, Killian JM, Kolodny EH, Karpati G, Carpenter
S, Watters GV, Wheeler C, Witt D, Bodell A, Nelis E, Van Broeckhoven C,
Lupski JR (1996) Clinical phenotypes of different MPZ(P0) mutations may
include Charcot-Marie-Tooth type 1B, Dejerine-Sottas, and congenital
hypomyelination. Neuron 17: 451-460.
133 Warner LE, Mancias P, Butler IJ, McDonald CM, Keppen L, Koob KG, Lupski
JR (1998) Mutations in the early growth response 2 (EGR2) gene are
associated with hereditary myelinopathies. Nat Genet 18(4): 382-384.
77
134 Watson DF, Nachtman FN, Kuncl RW, Griffin JW (1994) Altered neurofilament
phosphorylation and beta tubulin isotypes in Charcot-Marie-Tooth disease
type 1. Neurology 44(12): 2383-2387.
135 Weller RO, Das Gupta TK (1968) Experimental hypertrophic neuropathy: an
electron microscopy study. J Neurol Neurosurg Psychiatry 31: 34-42.
136 Wicklein EM, Pfeiffer G, Ratusinski T, Kunze K (1997) Charcot-Marie-Tooth
Syndrom Typ I. Behinderung und Management. Der Nervenarzt 68(4): 358-
362.
137 Young P, Wiebusch H, Stögbauer F, Ringelstein B, Assmann G, Funke H
(1997) A novel frameshift mutation in PMP22 accounts for hereditary
neuropathy with liability to pressure palsies. Neurology 48: 450-452.
78
10. Anhang 10.1. Sequenzen der untersuchten Exone des PMP22-Gens Dargestellt wird die genomische DNA der Amplicons. Die Codons sind nummeriert
und mit der zugehörigen Aminosäure aufgeführt. Die Primersequenzen wurden grau
unterlegt.
Exon1
1 2 3 4 5cgcccagcgc tctcctcgca ggcagaaact ccgctgagca gaacttgccg ccaga atg ctc ctc ctg ttg
M L L L L
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25ctg agt atc atc gtc ctc cac gtc gcg gtg ctg gtg ctg ctg ttc gtc tcc acg atc gtcL S I I V L H V A V L V L L F V S T I V
26 agc gtgagtg cctggcgggg aggctccctg cgcggcccgc ccttccccat ctgggttccc agcccgtgct cctgctS
Exon2
27 28 29 30 31 32 33cactcctccc tccctccctg actcaggata tctatctgat tctctctag caa tgg atc gtg ggc aat gga
Q W I V G N G
34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52cac gca act gat ctc tgg cag aac tgt agc acc tct tcc tca gga aat gtc cac cacH A T D L W Q N C S T S S S G N V H H
53 54 55 56 57 58 59 tgt ttc tca tca tca cca aac gg tgaggctggt tttgtgctcc atgagcttgt cctcagacgc ctgtaacacgC F S S S P N
Exon3
60 61 62cgaggcagag ccctcccccg gccatggcca gctctcctaa ccaagtgtct ctttccccca gaa tgg ctg
E W L
63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81cag tct gtc cag gcc acc atg atc ctg tcg atc atc ttc agc att ctg tct ctg ttcQ S V Q A T M I L S I I F S I L S L F
82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100ctg ttc ttc tgc caa ctc ttc acc ctc acc aag ggg ggc agg ttt tac atc act ggaL F F C Q L F T L T K G G R F Y I T G
101 102 103 104 105 106 atc ttc caa att ctt gct ggtaagttg tggatggtaa agtccatgtg gaagcggggt gcatccI F Q I L A
aagt ctgcggaatg attagtttag tagaaggatg
Exon4
107ccggggtgg cggagagggg gccgctctgc catggactct ccgtcaccca gcttgtccct ctccttcccc a ggt
G
108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124ctg tgc gtg atg agt gct gcg gcc atc tac acg gtg agg cac ccg gag tggL C V M S A A A I Y T V R H P E W
125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141cat ctc aac tcg gat tac tcc tac ggt ttc gcc tac atc ctg gcc tgg gtgH L N S D Y S Y G F A Y I L A W V
142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158gcc ttc ccc ctg gcc ctt ctc agc ggt gtc atc tat gtg atc ttg cgg aaaA F P L A L L S G V I Y V I L R K
159 160 161 cgc gaa tga ggcg cccagacggt ctgtctgagg ctctgagcgt acatagggaa gggaggaagg gaa R E Stop aacagaa
10.2. Patientenkollektiv: Histopathologische und klinische Daten Nr. Geb.
Dat. Alter
w/m
1 Klinik Zwiebelschalen-formationen
Hypermyeli-nisierte / tomakulöse NF
Hypomyelini- sation
NF-Reduktion2 Regenerations-gruppen
sonstige histo-logische Auffälligkeiten
histologische Beurteilung
2 1971w
24 nächtliche Arm-schmerzen, Parästhesien der Hand, hochpatho-logische NLG (Demyelini-sation), HMSN? GBS?
wiederholt angedeutete Zwiebelschalen-formationen
zahlreiche Markschlingen, eine tomakulöse NF, z.T. breite MS
wiederholt 30% (große, normal myelinisierte Fasern)
vereinzelt Pi-Granula, keineentzdl. Zellinfiltrate
HMSN / HNPP
3 1932m
63 seit 3 J. mäßig verzögete NLG, Liquoreiweiß erhöht, Parästhesien, restless legs
wiederholt zudünn myelinisierte NF
gering selten ein Polyglykosan-körper, mononukleäre Zellen, keine frischen Infiltrate
demyelinisierende NP im Stadium der Remyelinisation, Z. n. GBS?
4 1938m
61 V. a. sensible axonale NP (seit 2 J.)
keine eine tomakulöseNF
mehrfach, einige atrophische Axone
10-20% (große und kleine markhaltige NF)
selten keine entzdl.Zellinfiltrate, Gefäße normal
HNPP
5 1996w
65 sensible Ataxie, PNP vom vorwiegend axonalen Typ
atrophischeAxone mit dicken MS, Markschlingen
50-60% viele wenige MS-Abbauprodukte, mononukleäre Zellinfiltrate, Mastzellen
chron. NP vom überwiegend axonalen Typ mit demyelinisierender Komponente, ausgeprägte Regenerations-tendenz, Z. n. GBS?
6 1939m
57 Polyneuropathie,monoklonale Gammopathie
atrophischeAxone mit dicken MS
wiederholt 30-40% vorhanden Mikroangiopathie, Blut-Nerven-Schranken-Störung?
chron. progrediente Neuropathie, teils axonal, teils demyelinisierend, Mikroangiopathie
8 1961m
35 Polyneuropathie keine wiederholt zudünn myelinisierte NF, ein demyelinisiertes Axon
geringgradig keine vereinzelt MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate
demyelinisierende Neuropathie, V. a. GBS
9 1937m
68 Wadenschmerz beimGehen EMG verdächtig
wiederholt 20%(markhaltige NF)
keine Endoneuriumödematös, MS-Abbauprodukte perivaskulär
demyelinisierende NP im Stadium der Remyelinisation, Z. n. GBS?
10 1941m
54 DM, Tetraparese nach gastrointestinalem Infekt, NLG normal, massive Denervierungszeichen, schwere axonale PNP / Polyneuritis, DD GBS
schalenförmig angeordnete Schwannzellen
wiederholt 30% (große, normal myelinisierte Fasern)
dünn bemarkte regenerierende NF
MS-Abbauprodukte, obliterative Mikroangiopathie (Vaskulitis / DM?), mononukleäres Zellinfiltrat perivaskulär
demyelinisierende NP im Stadium der Restitution, Z. n. GBS?
11 1948m
47 keine wiederholt 40% (große, normal myelinisierte Fasern)
vereinzelt dünn bemarkte NF
Pi-Granula, MS-Abbauprodukte, obliterative Mikroangiopathie (Z. n. Vaskulitis?), keine floriden entzündl. Zellinfiltrate
demyelinisierende NP im Stadium der Remyelinisation, Z. n. GBS?
12 1977w
21 demyelinisierende,akrodistal betonte, chron. progrediente sensomotorische PNP – HMSN?
zahlreich wenige, auchdemyelinisierte NF, keine segmentale Demyelinisierung
subtotaler Ausfall der großen markhaltigen NF
keine keine entzdl.Zellinfiltrate, Gefäße normal
CMT I oder DSS
13 1915w
74 reichlich wiederholt, auchdemyelinisierte NF
>90% keine Gefäßwände etwasverbreitert, keine entzdl. Zellinfiltrate
CMT I oder CIDP
14 1918w
77 seit ca. 2 Monaten Pallhypästhesie, diskretes motorisches Defizit, herabgesetzte NLG, Potentiale aufgesplittert und verlängert
schalenförmig angeordnete Schwannzellen
wiederholt 80% dünn bemarkte regenerierende NF
Subperi- und endoneurales Ödem; MS-Abbauprodukte; obliterative Mikroangiopathie (Z. n. Vaskulitis?), Mononukleäre Zellen
demyelinisierende NP, Z. n. GBS? Vaskulitis?
16 1934m
65 leichte Fußheberpareseli., atrophische Waden-muskeln, Vorfuß-hypästhesie, V. a. CMT
schalenartig angeordnete Schwannzellen
wenige dünnmyelinisierte NF
70% wiederholt MS-Abbauprodukte,Gefäßwand-veränderungen, keine entzdl. Zellinfiltrate
chronische NP vom neuronalen / axonalen Typ / CMT II
17 1920m
72 seit 5 J. Muskelschwäche, Tetraparese, Sensibilitätsstörungen, Reflexausfälle, NLG langsam / nicht messbar, schlecht eingestellter DM
schalenartig angeordnete Schwannzell-fortsätze
einzeln <5% einzelne selten MS-Abbauprodukte, Angiopathie
Neuropathie vom neuronalen Typ bei Diabetes / CMT II
18 1984m
12 CMT I? bulbäre Beteiligung, endokrine Störungen (Diabetes)
zwiebelschalenartige Veränderungen, paranodale Entmarkung
wiederholt subtotalreduziert
viele vereinzelt MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate, pseudohypertrophische Muskelatrophie
gemischte NP, CMT I / II
19 1934w
65 V. a. HMSN keine eine tomakulöse NF
vereinzelt
40-50% (große und kleine markhaltige NF)
einige kaum MS-Abbauprodukte, sehr spärliches mono-nukleäres Zellinfiltrat
gemischte NP, HMSN / HNPP
20 1966m
33 seit 6 Wochen Druckläsionen (zuvor Gewichtsreduktion) Leitungsblock, V. a. HNPP
keine Markschlingen,Markscheiden-deformitäten,
wiederholt
eine tomakulöse NF
5-10%, einige atrophische Axone
gelegentlich gelegentlich MS-Abbauprodukte u. frische Büngersche Bänder, keine entzdl. Zellinfiltrate
demyelinisierende NP, HNPP?
21 1993w
57 seit 7 J. Beschwerden, seit 5 J. Tremor (Halte- und Intentionstremor) strumpfförmige Hyp- / Dysästhesien
wiederholt Markschlingen in großer Zahl >90% selten vereinzelt MS-Abbauprodukte
hypertrophische NP, Roussy-Levy Syndrom
22 1942w
56 seit 0,5 J. Taubheitsgefühle, V.a. HNPP
eine zwei wiederholt 20-30% (große und kleine markhaltige NF)
vereinzelt Gefäße normal, keine
entzdl. Zellinfiltrate demyelinisierende NP, evtl. HNPP
26 1956w
31 Hypakusis seit Geburt (auch beim Bruder), seit 1,5 J. gangunsicher, Störung der Feinmotorik li. Hand, Hohlfüße bds. Hyperreflexie, Babinski li. positiv, verminderte NLG, Liquoreiweiß 0,42
um fast alle markhaltigen NF schalenartig angeordnete Schwannzellen
viel 50%(auch kleine markhaltige NF)
DSS, M. Refsum
32 1981m
13 Haltungsschäden,proximale Beinschwäche, kein Fersengang, herabgesetzte NLG, Spastizität
häufig zwiebelschalenartige Schwannzell-manschetten
Markschlingen hypomyelinisierteNF
70-80% spärlich subperineurales undendoneurales Ödem, MS-Abbau, endoneural zahlreiche Mastzellen
DSS
33 1970m
22 Hohlfuß und Atrophie der Unterschenkel
um fast alle NF selten Anzahl reduziert
endoneurales Ödem,kein entzündl. Zellinfiltrat
DSS
37 1961w
33 Friedreichfuß seit Geburt, verzögerte motorische Entwicklung, Ataxie, Areflexie, Muskelatrophie, Torticollis, herabgesetzte Vibrations- und Bewegungsempfindung ENG: Markscheidenläsion
häufig schalenartig angeordnete Schwannzell-fortsätze
häufig,Demyelinisation, unterschiedl. dick myelinisierte NF
hochgradig selten selten MS-Abbauprodukte, kein entzündl. Zellinfiltrat
hypertrophische NP, eher DSS als CMT I
38 1971m
23 Gangunsicherheit,Wadenkrämpfe, Atrophie des M. quadriceps bds.
sehr viele häufig, einige demyelinisierte NF
70-80% vereinzelt ELMI: leichte mitochondriale Myopathie
hypertrophische NP, eher DSS als CMT I
40 1977m
19 schwere sensomotorischeNP, NLG ca. 2 m/s, V. a. kongenitale Hypo-myelinisation / HMSN III
sehr viele sehr viele zu dünn myelinisierte NF, auch Demyelinisation
Gefäße normal, keine entzdl. Zellinfiltrate, MS-Abbauprodukte
DSS
43 1985w
12 Hohlfuß, Hammerzehen,Wadenatrophie, Tremor, kein Hacken- und Zehen-stand, NLG 13,5 m/s
sehr viele viele zu dünn myelinisierte NF
De- undRemyelinisation, Regenerations-gruppen
MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate
Hypertrophische NP, eher DSS als CMT I
44 1982w
15 sensomotorische NP(DSS)
viele, segmentale Demyelinisation
viele unverhältnis-mäßig dünn myelinisierte NF, demyelinisierte NF
De- undRemyelinisation
vereinzelt MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate
DSS
46 1961w
38 seit Jahren progrediente Atrophie der Extremitäten-muskulatur, Sensibilitäts-störungen, Elektrophysiologie: HMSN?
zahlreich zahlreich 70% fast keine normalen markhaltigen NF
sehr selten MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate
DSS
50 1923w
73 eine hyper-myelinisierte NF
vereinzelt 30-40% wiederholt entzdl. Zellinfiltrat perivaskulär
axonale Neuropathie mit demyelinisierender Komponente bei chron. Vaskulitis
51 1937 59 hochgradige, auf die Beine beschränkte, axonale PNP
vereinzelt eine tomakulöseNF
wiederholt, auch demyelinisierte Axone
80-90% (Faszikel unregelmäßig betroffen)
vereinzelt keine entzdl. Infiltrate CIDP oder HMSN oder HNPP
52 1963w
46 V. a. tomakulöse PNP, symptomatisch seit einigen Monaten, Läsionen des N. ulnaris, medianus, peroneus
es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet
53 1948m
51 zwei zahlreicheMarkschlingen, eine tomakulöse NF
spärlich, De- und Remyelinisation
60% (beson-ders kleine, auch große markhaltige NF)
vereinzelt selten MS-Abbauprodukte, axonale Einlagerungen, endoneurales Ödem, Gefäße normal
gemischte / axonale NP, HSAN I / HNPP
55 1950m
50 V.a. CIDP keine hypermyelinisierteNF, eine tomakulöse NF
wiederholt gering selten vereinzelt MS-Abbauprodukte; spärliche T-Zellinfiltrate
HNPP? / Vaskulitis / Polyneuritis?
56 1954m
45 Engpasssyndrome,Peroneusparese bds., eingeschränkte Fein-motorik, NLG 35m/s, Antigangliosid IGM erhöht
keine hypermyelinisierteNF
einige
20-30% einige kein lockeres Myelin im ELMI, keine entzdl. Zellinfiltrate
hyper-/ hypomyelinisieren-de NP mit axonaler Komponente
57 1945m
55 Kompressionssyndrome,NLG 30-36 m/s, sensomotoeisch gemischte PNP
einmal zwiebel-schalenartig angeordnete Schwannzellfortsätze
Markschlingen, zwei tomakulöse NF
vereinzelt
40-50% (große und kleine markhaltige NF)
anstelle großer, markhaltiger NF wiederholt regenerierende NF
zahlreiche MS-Abbauprodukte, Büngersche Bänder, leichtes Ödem, Mastzellen
axonale NP (aufgrund d. HNPP), Mikroangiopathie
58 1954w
46 keine segmentaleDe- oder Remyelinisation
Markschlingen, eine tomakulöse NF
selten 20% vorhanden kaum MS-Abbauprodukte, leichtes Ödem, keine entzdl. Zellinfiltrate, Gefäße normal
gemischte NP
59 1956w
44 V. a. Spastische Spinalparalyse, DD HMSN, Paraspastik der Beine, Beginn vor 16 J., Demyelinisation der Pyramidenbahn, ENG pathologisch, Atrophie Gyrus prä- und postzentralis
schalenförmig angeordnete Schwannzellen, keine segmentale Demyelinisierung
wiederholt, evtl.sekundär demyelinisiert
40-50% fokal Verlust markloser Axone
vorhanden kaum MS-Abbauprodukte, subperineurales Ödem, keine entzdl. Zellinfiltrate, Gefäße normal
CMT V, axonale NP
60 1970w
29 Pallhypästhesie,Fallneigung, kein Blindgang möglich, EMG: gemischte PNP
zahlreich eine tomakulöseNF, Mark-schlingen, hyper-myelinisierte NF
wiederholt, eine demyelinisierte NF
kaum, vereinzelt degenerierende NF
vereinzelt keine entzdl.Zellinfiltrate; Gefäße z.T. kollabiert
demyelinisierende NP mit axonaler Komponente HNPP?
61 1970m
30 V. a. tomakulöse NP (seit 1999)
es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet
64 1935w
75 asymmetrische,multifokale sensomotorische NP sowie distal betonte symmetrische, sensomotorische axonale NP, V. a. HNPP
es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet
68 1954m
46 V. a. HMSN es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet
69 1984m
16 V. a. tomakulöse NP es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet
AC48 1990m
8 Areflexie, distaleMuskelschwäche, Laufen erschwert, Z. n. Achillotomie, NLG 44,8 m/s, zunehmend Arme betroffen
viele viele zu dünn myelinisierte NF
90% wiederholt MS-Abbauprodukte,keine entzdl. Zellinfiltrate
Neuropathie vom gemischten Typ, Sonderform der HMSN
AC78 1986m
11 DSS bei der Schwester, Vater auch betroffen, verminderte NLG, Pes cavo-varo-adductus bds.
einige, segmentale Demyelinisation
Markschlingen wiederholt
NF-Dichte 70-80% reduziert (große u. kl. markhaltige NF)
vereinzelt vereinzelt MS-Abbauprodukte
Hypo- / Hypermyelinisa-tionsneuropathie
AC103 1994m
3 V. a GBS / CIDP schalenförmig angeordnete Schwannzellen
relativ dick myelinisierte große Axone
ELMI: viele demyelinisierte NF, alle markhaltigen NF zu dünn myelinisiert, große nichtmyeli-nisierte Axone
NF Dichte 70-80% reduziert, keine akute Degeneration
De- und Re-myelinisations-vorgänge
MS-Abbauprodukte, subperineurales Ödem,Liquoreiweiß erhöht, Gefäße normal, Lymphozyten endo- und epineural, ELMI: Makrophagen
eher CIDP als CH
AC491 1977m
20 kongenitaler Klumpfußbds., Mutter auch betroffen, ENG/EMG: senorische und motorische PNP
schalenartig angeordnete Schwannzellen
Markschlingen, dadurch vereinzelt verdickte Markscheiden
wiederholt, auch demyelinisierte NF
50% (alle Faszikel)
vereinzelt kaum MS-Abbauprodukte
CMT I
NPA3B
1927m
72 V.a. CMT I / Vaskulitis Fußheberparese bds., Parästhesie der Unterschenkel
einige einige 50-60% (große und kleine markhaltige NF)
einige vereinzelt MS-Abbauprodukte, Mikroangiopathie, keine entzdl. Zellinfiltrate
gemischte NP mit Mikroangiopathie CMT I + DM?
V1 1988w
4 Mo. generalisierte Anfälle, Muskelhypotonie, Makroglossie, Fußdefomitäten
wiederholt große Anteile keine selten keine eindeutigen Entzündungszeichen, metachromatische Substanzen, Gefäße normal
Neuropathie vom demyelinisierenden Typ
V2 1950m
39 Torticollis spasmodicus keine häufig große, dünn myelinisierte Axone
gelegentlich Zeichen des akuten NF-Unterganges
eine keine entzdl.Zellinfiltrate
entwicklungsbe-dingte Hypomyelinisation
V3 1984m
13 V. a. axonale NP DD HMSN Klumpfuß / Hohlfuß?
wiederholt zudünn myelinisierte NF
gering, fokal vermindert
hypomyelinisierte NF, die Regenera-tionsgruppen sein können
ELMI: V. a. gering-gradige mitochondriale Myopathie, endoneurales Ödem, Pi-Granula
Hypomyelinisation, nicht typisch für HMSN, evtl. mitochondriale Myopathie.
V4 1993w
1 muskuläre Hypotonie,statomotorische Entwicklungsretardierung, Balkenhypoplasie, zentralnervöse Myelinisierungshemmung, Makrozephalie
keine dünn myelinisierteAxone
keine osmophile Granula in perivaskulären Fibroblasten und Gefäßwandzellen
Myelinisierungs-hemmung
V5 1995m
1 hypotonestatomotorische Entwicklungsverzögerung, V.a. Mitochondropathie
z.T. schalenartig angeordnete Schwannzellen
zu dünneMarkscheiden
keine lipidhaltige Substanzenperivaskulär, keine entzdl. Zellinfiltrate
hypomyelinisieren-de NP bei Entwicklungs-störung
V6 1986m
3 zerebrale Anfallsleiden,statomotorische und mentale Retardierung
keine wiederholt nichtvermindert
keine atrophische Axone, z. T. verdichtetes Axoplasma, keine entzdl. Zellinfiltrate, Gefäße normal
Entwicklungsverzö-gerung? V.a. Glykogenose
V8 1991w
5 ENG o. B., im EMG V. a. HMSN
zahlreiche zudünn myelinisierte NF
50% keine entzdl.Zellinfiltrate
Hypomyelinisation vom Lyon Typ
V14 1930m
60 Schwäche in Beinen und Händen
z.T. verdickte MS zahlreiche hypomyelinisierte NF
20-30% (große und kleine markhaltige NF)
einige leichte Vaskulitis, z.T. MS-Abbau
NP vom axonalen Typ mit Hypomyelinisation, leichte Vaskulitis
V18 1998w
3 verdickte MS und Markschlingen
häufig deutlicheReduktion
keine entzdl.Zellinfiltrate gelegentlich metachromatische Ablagerungen
kongenitale Hypo- und Hypermyelinisa-tionsneuropathie
V23 1990w
1 Hypotonie,Kardiomyopathie, V. a. Dysmorphiesyndrom (Hypochondroplasie)
wiederholthypomyelinisierte NF
geringe Dichte großer markhaltiger NF
keine entzdl.Zellinfiltrate
neurogene Muskelatrophie bei spinalem oder zentralen Prozess, myopathische Komponente
V63 1997m
2 V.a. neurogeneMuskelschwäche, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, Pulmonalstenose, hyper-trophe Kardiomyopathie, Knicksenkfuß, Schwer-hörigkeit, NLG 31 m/s, distal verminderte Muskelsilhouette
häufig fast aus-schließlich große, markhaltige NF mit zu dünnen MS, ELMI: vollständig demyelinisierte Axone
gering (markhaltige NF), ELMI: Ausfall einiger markloser NF, axonale Degeneration
kaum MS-Abbauprodukte, axonale Einlagerungen, keine entzdl. Zellinfiltrate, Gefäße normal
(kongenitale) Hypomyelinisa-tionsneuropathie mit De- und Remyelinisierung
1 Alter bei Einsendung in Jahren (wenn nicht anders angegeben) 2 bezogen auf große, markhaltige Nervenfasern Abkürzungen: bds. = beidseits
CH = Congenitale Hypomyelinisationsneuropathie CIDP = Chronische Inflammatorische Demyelinisierende Polyneuropathie CMT = Charcot-Marie-Tooth Krankheit Cx32 = Connexin 32 DD = Differentialdiagnose DM = Diabetes mellitus DSS = Déjerine-Sottas-Syndrom ELMI = Elektronenmikroskop EMG = Elektromyographie ENG = Elektroneurographie entzdl. = entzündlich GBS = Guillain-Barré-Syndrom Geb. Dat. = Geburtsdatum HMSN = hereditäre motorisch-sensorische Neuropathie HNPP = Hereditäre Neuropathie mit Neigung zur Drucklähmung
HSAN = Hereditäre sensorische axonale Neuropathie J. = Jahre li. = links m = männlich M. = Morbus M. = Musculus MS = Markscheiden N. = Nervus NF = Nervenfaser(n) NLG = Nervenleitgeschwindigkeit NP = Neuropathie o. B. = ohne Befund PNP = Polyneuropathie re = rechts US = Unterschenkel V. a. = Verdacht auf
w = weiblich Z. n. = Zustand nach z. T. = zum Teil
10.3. Übersicht der Analyseergebnisse
Exon 4 (Roa-Primer) Probe Ergebnis Exon 1 Exon 2 Exon 3 4a* 4b* EN ?, S 0 2 0 EN 0 S 0 EN ?, S 0S 0 EN ?, S 0 3 0 EN ?, S 0 EN 0 S 0 S 0
4 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0 5 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0 6 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0 8 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0
EN 0 9 0 EN 0 EN 0 EN 0 S 0
10 0 EN 0 EN 0 S 0 S 0 EN ?, S 0 11 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0
EN 0 12 0 EN ?, S0 S 0 S 0 S 0
13 0 EN 0 EN 0 EN 0 S 0 S 0 EN ?, S 0 14 0 EN 0 S 0 EN 0 EN 0
16 0 EN ?, S0 EN ?, S 0 EN 0 EN 0, S 0 17 0 S 0 EN ?, S 0 S 0 S 0 EN 0 18 PM EN 0, S 0 S 0 EN:PM
S: PM S 0 EN 0
19 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 20 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0 21 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 22 0 S 0 S 0 S 0 S 0 26 x EN ?, S 0 EN 0 - S 0 32 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 33 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 37 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0 EN 0, S 0 38 0 EN 0 EN 0 S 0 EN 0, S 0 40 x EN 0 EN 0 - EN 0, S 0 43 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0
S 0 44 0 EN 0, S 0 S 0 S 0 EN ?
46 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 50 x EN ?, S 0 EN ?, S 0 - EN 0, S 0 51 x EN ?, S 0 EN ?, S 0 - EN ?, S 0 52 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN ?, S 0 53 0 EN ?, S0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0 55 0 EN ?, S0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 56 0 EN ?, S0 EN 0 EN 0, S 0 57 0 EN 0 EN 0, S0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 58 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 59 0 EN 0 EN ?, S0 EN 0 EN 0, S 0 60 0 EN ?, S0 S 0 S 0, EN 0 EN 0, S 0 S 0 61 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 64 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 67 0 S 0 S 0 S 0 S 0 68 0 S 0 S 0 S 0 S 0 69 0 S 0 S 0 S 0 S 0 AC48 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 AC78 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0
EN 0
AC103 0 EN 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 AC491 0 EN 0 EN 0, S 0 EN 0 EN 0, S0 NPA3B 0 EN 0, S 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 V1 0 EN 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 V2 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 S 0 V3 0 EN 0 EN 0 S 0 EN 0, S 0 V4 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN ?, S 0 V5 0 EN 0 EN 0 EN 0 S 0 V6 x EN 0 EN ?, S 0 - EN 0, S 0 V8 0 EN 0 S 0 EN 0 S 0 V14 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 V18 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN 0 S 0 V23 0 EN 0 EN ?, S 0 S 0 EN 0, S 0 V63 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0
* Zu Beginn wurde mit Primern nach den Angaben von G.A. Nicholson gearbeitet; die Arbeitsgruppe amplifizierte Exon 4 in zwei Abschnitten a und b (Nicholson et al. 1994) Abkürzungen:
EN = Endonukleasereaktion S = Sequenzierung 0 = keine Mutation ? = Auffälligkeiten in der Analyse PM = Polymorphismus - = Analyse nicht durchführbar x = die Analyse konnte nicht für alle Exone durchgeführt werden
11. Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. J. M. Schröder, dem
Direktor des Institutes für Neuropathologie der RWTH Aachen, für die Überlassung
des Promotionsthemas sowie die Förderung und Unterstützung meiner Arbeit
bedanken. Durch ihn war es mir möglich, einen faszinierenden Einblick in die aktuelle
molekulargenetische Forschung zu gewinnen und in eigenständiger Arbeit auf
diesem Gebiet Erfahrung zu sammeln.
Besonders dankbar bin ich darüber hinaus Herrn Dr. rer. nat. A. Beckmann für
die hervorragende fachliche Betreuung in den vergangenen drei Jahren. Stets fand
er Zeit zur Entwicklung von Arbeitsstrategien, Diskussion der Ergebnisse und gab
wertvolle Ratschläge. Ohne sein Engagement wäre die vorliegende Arbeit in der
Form nicht möglich gewesen.
Meiner Studienkollegin C. Vitt sei an dieser Stelle ebenfalls großer Dank
ausgesprochen. Die gute, zuverlässige Zusammenarbeit mit ihr, die vielen
konstruktiven Gespräche und Ihre einzigartige Freundschaft waren mir in den
vergangenen Jahren unverzichtbar.
Für die vielen praktischen Tipps im Labor möchte ich ganz besonders Frau E.
Pascual danken. Auch allen anderen Mitarbeitern des Institutes für Neuropathologie
sei für die freundliche Unterstützung und gute Arbeitsatmosphäre gedankt.
Außerordentlich dankbar bin ich meinen Eltern, die mir mein Medizinstudium
ermöglichen und meine wissenschaftliche Tätigkeit gefördert haben.
Nicht zuletzt möchte ich meinem Ehemann M. Nellessen danken für sein
Interesse an meiner Arbeit, seine kritischen Fragen und seine große moralische
Unterstützung.
Abschließend sei all jenen gedankt, die hier nicht explizit erwähnt wurden,
aber direkt oder indirekt zum Gelingen meiner Doktorarbeit beigetragen haben.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Vor- und Zuname: Cordula Nellessen, geb. Fuchs
Geburtsdatum: 6. Juli 1977
Geburtsort: Düren, Ortsteil Birkesdorf
Familienstand/Kinder: verheiratet/keine
Staatsangehörigkeit: deutsch
Konfession: römisch-katholisch
Eltern: Gregor Fuchs
Pia Fuchs-Dransfeld
Geschwister: Johannes Fuchs
Schullaufbahn
1983 bis 1987 Johann-Kaspar-Kratz-Grundschule, Golzheim
1987 bis 1996 Gymnasium am Wirteltor, Düren
17.06 1996 Abitur
Hochschulstudium
Oktober 1996 Immatrikulation an der RWTH Aachen für das Fach
Humanmedizin
September 1998 Physikum
August 1999 Erstes Staatsexamen
April 2002 Zweites Staatsexamen
April 2002 – März 2003 Praktisches Jahr mit dem Wahlfach Dermatologie
April 2003 Drittes Staatsexamen
Seit September 2003 Tätigkeit als Ärztin im Praktikum, Abteilung für Innere Medizin,
St. Elisabeth Krankenhaus Geilenkirchen