![Page 1: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/1.jpg)
MİKROBİYOLOJİDE
BİYOTEKNOLOJİ
![Page 2: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/2.jpg)
Biyoteknoloji;
Genetik materyallerde moleküler düzeyde yapılan
manipulasyonlarla
yeni ve istenilen fenotipte organizmalar ve faydalı ürünler
elde etmektir
1920’li yıllar.....
1960 sonlarına doğru Arber ve Smith.... Restriksiyon endonukleazlar
![Page 3: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/3.jpg)
3
Mikrobik biyoteknoloji,
yiyecek üretimi için daha kullanışlı enzim ve organizma eldesi, üretim
sistemlerinin kolaylaştırılması, ……
Tarımsal biyoteknoloji,
gıda üretiminde kullanılan ekinleri daha verimli kılacak ya da ürüne
istenilen özellikleri kazandıracak genetik değişiklikleri sağlayan
teknoloji
Hayvan biyoteknolojisi,
hayvanların genetik yapısının değiştirilerek daha yararlı özelliklere
sahip hayvan ve hayvan ürünlerinin elde edilmesi (özellikle antikor üretimi)
başka bir canlının genini taşıyan hayvanlar (transgenik hayvanlar)
Örneğin insanda kan pıhtılaşması için gerekli olan protein geni ineklere verilerek,
ineklerin bu proteini sütünde üretmesi sağlanabilmektedir.
Klonlama……
![Page 4: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/4.jpg)
4
Adli Biyoteknoloji:
Parmak izi yöntemi,
1985’den itibaren …. DNA parmak izi yöntemi
Tıbbi biyoteknoloji
hastalıkların teşhisinde ve tedavisinde,
hastalıklı genlerin sağlam genlerle değiştirildiği gen terapisi
gelişince sinir, kas, kan hücreleri gibi insan vücudunun
çeşitli hücreleri olmak üzere özelleşen olgunlaşmamış
hücrelerin kullanıldığı stem hücresi teknolojisi,
![Page 5: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/5.jpg)
Restriksiyon endonukleazlar:
Bakterilerde dışarıdan hücrelere giren,
bazı özel gen ya da markerlar taşıyan genetik materyalleri ayrıştırarak,
mutasyonlar meydana getirmesine mani olmak
ve böylece türlerin genetik karakterlerinin stabilitesini korumakla
görevli enzimlerdir
Bakterilerin büyük bir bölümü, bir ya da birkaç türde
restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler.
E. coli RY 13 suşu EcoRI
![Page 6: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/6.jpg)
RE’lerin aktivitelerini gösterebilmeleri için bazı
optimal koşulların sağlanması gereklidir. Ör: ısı, pH, buffer vs..
Modifikasyon enzimleri?
![Page 7: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/7.jpg)
Gen Klonlaması (moleküler klonlama)
Önemli bir ürünün (ya da proteinin) sentezini kodlayan genin
ait olduğu hücre genomundan özel yöntemlerle kesilerek çıkartılması,
bunun bir taşıyıcı (vektör) DNA’sı ile birleştirilerek
alıcı bir hücreye transfer edilmesi,
bu alıcı hücrede genin ekspresyonunun sağlanması
![Page 8: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/8.jpg)
8
Nukleik asitlerin (DNA/RNA) invitro amplifikasyon yöntemleri
Çeşitli organ, doku ve sıvılardan izole edilen
genetik materyaller enzimatik olarak çoğaltılır
bu genetik ürünler
ya homolog problar kullanılarak hibridizasyon
ya da elektroforezis ve boyama sonrası direkt
görüntülenir
![Page 9: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/9.jpg)
9
![Page 10: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/10.jpg)
10
Polymerase Chain Reaction-PCR
Prensip:
Hedef genetik materyallerin (DNA/RNA*)
spesifik kısa zincirli oligonukleotid primerler yardımı ile
enzimatik olarak sayısal çoğaltılması
![Page 11: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/11.jpg)
11
Hedef DNA sekansları
İki tür spesifik oligonukleotid primerleri
(15-30 bazlık, tek iplikcikli)
Termostabil DNA polimeraz (Taq polimeraz)
Dört tür dNTP
Tampon çözelti, MgCl2
PCR reaksiyon karışımı
![Page 12: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/12.jpg)
12
Hedef DNA sekansları
varlığı aranan, amplifiye edilmek istenen hedef DNA
kan, serumu, plazma, gaita, doku parçaları, idrar, sperm, saç teli
gibi inceleme örneklerinden ekstrakte edilerek ve
saflaştırılarak karışıma eklenir
![Page 13: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/13.jpg)
13
Primerler:
Replikasyonun başlama noktası
Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen,
bir çift kısa sentetik oligonukleotid
http://www.bio.davidson.edu
![Page 14: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/14.jpg)
14
Nükleotidler (dNTP= deoksinükleotid trifosfat )
20-200 µM (her dört nükleotit de eşit oranda)
Karışım içindeki dNTP, Taq DNA polimerazın çalışması için gerekli MgCl2’u bağlar
konsantrasyonları birbirine paralel artmalı ya da azaltılmalı…
Enzim (Taq Polymerase)
Thermus aquaticus adlı termofilik bakteriden izole edilen ısıya dayanıklı
polimeraz enzimi
Tampon çözelti, Magnezyum
Primerlerin bağlanması ve reaksiyonların gerçekleşmesi için uygun ortam ve pH
sağlayan çözelti içerisinde Tris-HCl, KCl, MgCl2 bulunmaktadır.
Ayrıca, jelatin, sığır albumini ve tween 20 gibi deterjanlarda Taq polimeraz
enzimini stabilitesi için katılabilir.
![Page 15: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/15.jpg)
15
PCR’ın aşamaları
1- Hedef DNA’nın denatürasyonu
2- Primerlerin bağlanması
3- Sentez/Uzama
Hedef
sekans
Yeni
DNA
Yeni
DNA
![Page 16: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/16.jpg)
16
PCR’ın aşamaları
1- Hedef DNA’nın denatürasyonu
Nükleotid baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının yüksek ısı
yardımı ile birbirinden ayrılması sonucu çift iplikli DNA’dan tek
iplikli DNA moleküllerinin oluşması aşamasını kapsar
Yüksek ısı: 94-96 °C
Ön denatürasyon; özellikle denatürasyonu zor olan kalıp DNA’lar için 3-5 dak. 94-96 °C
![Page 17: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/17.jpg)
17
PCR’ın aşamaları
2- Primerlerin bağlanması
(Annealing/hibridizasyon)
Primer adı verilen tek iplikçi kısa oligonükotidlerin
uygun ısı (30-60 C) ve uygun sürede
kalıp DNA üzerindeki hedef bölgelere bağlandığı aşamadır.
Çoğaltılacak hedef bölgeye komplementer
öz. başlangıç ve bitiş noktalarını sınırlar
genellikle primerlerin erime ısısının 5º C altında, (54-65º C)
30sn-1dk
![Page 18: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/18.jpg)
18
I. basamak
II. basamak
http://users.ugent.be/%7Eavierstr/principles/pcr.html
Primer sekansları 5’ ve 3’ olmak üzere iki uca sahip olup
amplifikasyon sürekli 5’ den 3’ yönüne doğru gerçekleşir
![Page 19: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/19.jpg)
19
PCR’ın aşamaları
3-Sentez
(Polimerizasyon/Uzama/Extension)
Polimeraz enzimi yardımı ile tek iplikçikli
DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’—3’
yönde uzatılması
Sentez işlemi 72º C de 1-2 dakika sürede
gerçekleştirilir
![Page 20: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/20.jpg)
20
3 basamaktan oluşan bu bir siklus yaklaşık 30 kez üst üste
tekrarlandığında hedef DNA’nın milyarlarca kopyası elde edilebilir.
![Page 21: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/21.jpg)
21
Sonuçların değerlendirilmesi
Elektroforez
PCR amplifikasyon ürünleri (amplikon)agarose ya da poliakrilamid jele
bilinen işaret DNA lar (DNA marker) ve
kontrol PCR ürünleri ile birlikteyüklenerek elektrik akımına tabi tutulurlar.
ethidium bromür ile boyanır, U.V. ışığı kullanılarak incelenir.
![Page 22: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/22.jpg)
22
Marker Pozitif kontrol Negatif kontrol Örnekler
![Page 23: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/23.jpg)
23
M P N 1 2 3 4 5 6 M
M: Marker; P=Pozitif Kontrol; N= Negatif Kontrol;
1-7= İncelenen örnekler (2 numaralı örnek pozitif)
649 bp
![Page 24: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/24.jpg)
24
Çabuk, güvenilir, duyarlı ve spesifik
Etkenin vücutta çok az sayıda olması durumlarından daha az
etkilenir
incelenen materyalin eski* ya da kontamine olmasından etkilenmez
izolasyon ve identifikasyonu zor olan bakteriyel ve viral ajanların
belirlenmesinde yararlı
Personel hatalarını, insan gücünü minimuma indirger
![Page 25: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/25.jpg)
25
Pahalı ? ? ?
deneyimli personel
gelişmiş ekipmanlar
kontaminasyonlar
sonuçların yorumlanmasında güçlükler
![Page 26: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/26.jpg)
26
PCR’ ın kullanım alanları
Hastalıkların tanısı
Özellikle zor üreyen bakterilerin tanısında, antibiyotik kullanmış hastalarda tanı…
Toksijenik, virulens suşların saptanmasında
Antibiyotik direncinin saptanmasında
Moleküler tiplendirme çalışmalarında
Epidemiyolojik çalışmalar
Defektlerin saptanmasında
Adli tıp…………………………………
![Page 27: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/27.jpg)
27
Farklı PCR çeşitleri:
Multiplex (Çoklu) PCR:
Bir PCR ile birden fazla DNA segmentinin (hedefin),
birden fazla primer çifti kullanarak
aynı amplifikasyon reaksiyonunda çoğaltılmasını sağlar.
![Page 28: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/28.jpg)
28
M pozitif kontroller örnekler Marker
![Page 29: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/29.jpg)
29
Farklı PCR çeşitleri:
Nested PCR:
ardarda iki PCR yapılır.
İlk PCR ürünleri ikinci PCR için hedef olarak kullanılır.
İkinci PCR da ilk çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren
primerler kullanılarak asıl istenilen hedef bölge çoğaltılır ve daha özgün
ürünler elde edilir.
![Page 30: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/30.jpg)
30
Farklı PCR çeşitleri:
Reverse-Transcriptase PCR (Geri Transkripsiyon PCR/ RT-PCR):
İki aşamalı olup RNA dan cDNA sentezi (geri transkripsiyon) +
komplementer DNA nın standart PCR ile çoğaltılması aşamalarını kapsar.
![Page 31: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/31.jpg)
31
![Page 32: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/32.jpg)
Moleküler tiplendirme yöntemleri
Benzer klinik bulgulara neden olan infeksiyöz
etkenlerin, antijeniteleri ve patojeniteleri farklı alt
tipleri görülebilmektedir.
Korunma ve sağaltımda
Epidemiyolojik verilerin oluşturulmasında
![Page 33: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/33.jpg)
Serotiplendirme, biyotiplendirme, faj ile tiplendirme,
morfolojik, fizyolojik özelliklerine göre tiplendirme........
Moleküler tiplendirme
Lipopolisakkarid ve yağ asitlerin saptanması
Protein saptanması
Nukleik asitlerin saptanması
PCR a dayalı metodlar
![Page 34: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/34.jpg)
34
Epidemiyolojik açıdan tiplendirme yöntemlerinin başlıca kullanım amaçları
•Salgınların kaynağı ve yayılma yolları hakkındaki hipotezlerin test edilmesi
•Hastalıkların epidemiyolojik olarak birbirleri ile ilişkisinin belirlenmesi
•Re-aktivasyon ile yeni infeksiyonların birbirinden ayırt edilmesi
•Hastane infeksiyonları ile toplumsal kaynaklı infeksiyonların belirlenmesi
•Laboratuvar kontaminasyonlarının saptanması
•Populasyondaki epidemi klonlarının belirlenmesi, buna göre kontrol
yöntemlerinin değerlendirilmesi
![Page 35: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/35.jpg)
35
Tiplendirme yöntemlerinin yaygın kullanılabilmesi için sahip olması gereken kriterleri
• Tiplendirebilirlik
•Ayrım gücü
•Tekrarlanabilirlik ve Stabilite
•Kullanım kolaylığı, maliyeti, testin süresi, kullanım spektrumu
•Sonuçların kolayca yorumlanabilir olması
•Sonuçların laboratuvarlar arasında paylaşılabilir olması
![Page 36: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/36.jpg)
36
Moleküler tiplendirmede kullanılan bazı önemli terimler
Klon:
Ortak bir atadan gelen, genetik olarak aynı bir ya da daha fazla
organizmadır
Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar:
Belli bir bölgeden ya da belli bir zaman diliminde hastalardan toplanan
örneklerden izole edilen ve ortak bir kaynaktan geldikleri düşünülen
izolatlardır
Genetik olarak ilişkili izolatlar (klonlar):
Genetik tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da
ortak bir atadan köken aldıklarını düşündürecek kadar yakın olan
izolatlar
![Page 37: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/37.jpg)
37
Salgın suşu:
Aynı türün hem epidemiyolojik (zamna, yer, ortak kaynak) hem de
genetik olarak ilişkili aynı genetik profile sahip izolatlar
Endemik suş:
Belli bir populasyonda infekte hastalardan sıklıkla izole edilen,
tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da yakın
ilişkili bulunan ancak direkt epidemiyolojik bir bağlantı gösterilemeyen
izolatlar
![Page 38: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/38.jpg)
38
Yakın ilişkili izolatlar:
Salgın suşundan yalnızca bir genetik olay bakımından farklı olan
izolatlar
Olası ilişkili izolatlar:
Salgın suşundan iki genetik olay bakımından farklı olan izolatlardır. Bu
izolatlar salgın suşu ile aynı genetik soydan olabilir ancak genetik olarak
yakın ilişkili değildir
İlişkisiz izolatlar:
Salgın suşundan üç genetik olay bakımından farklı olan izolatlar
![Page 39: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/39.jpg)
39
Pulsed-Field Gel Electrophoresis
(PFGE)
![Page 40: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/40.jpg)
40
Moleküler tiplendirme yöntemleri içerisinde altın standart
Düz elektroforez yöntemlerinde 30-50 kb’dan daha büyük
DNA molekülleri büyüklükleri farketmeksizin aynı hızla aynı
miktarda hareket ederler, jel içerisinde göç ederler. Bu da
jel üzerinde tek bir bant olarak gözlemlenir.
Eğer DNA elektoforez işlemi sırasında yön değiştirmeye
zorlanırsa, birbirlerinden ayrımı yapılabilecek şekilde farklı
bantlar oluşur. Bu da tiplendirmeyi olanaklı hale getirir.
![Page 41: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/41.jpg)
41
Lizis aşamasında DNA nın parçalanmaması gerekir,
Büyük DNA molekülleri ise kolay kırılabilir özelliktedir +
pipetleme gibi işlemleri yapmak çok zordur
Sıvı ya da katı besiyerinde üretilen bakteriler düşük erime ısılı
agarozda karıştırılıp kalıplara dökülürler. Lizis işlemleri bu agar
blokları içerisinde yapılır.
Lizis aşaması sonucunda agar bloklarının içerisinde bulunanan
çıplak DNA molekülleri uygun restriksiyon enzimleri aracılığı ile
kesilir,
özel elektroforez işlemi başlatılır.
![Page 42: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/42.jpg)
42
Yöntemin ayrım gücü çok yüksek
Zaman alıcı ve kompleks bir yöntem
Laboratuvarlar arasında standardizasyon problemi
![Page 43: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/43.jpg)
43
![Page 44: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/44.jpg)
44
Blotlama,
Elektriksel ortamda jel üzerinde göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan
proteinlerin veya nükleik asitlerin
bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmesi
Southern Blotlama
E.M. Southern adlı bilim adamı 1975
Herhangi bir kaynaktan elde edilen DNA’ nın analizi için kullanılan membran blotlama ve görüntüleme tekniği
![Page 45: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/45.jpg)
45
1- DNA izolasyonu:
Genomik ya da plazmid DNA’sı değişik yöntemlerle ekstrakte edilir.
2- Restriksiyon endonükleazlar (RE) ile kesim:
Bir önceki aşamada saf olarak elde edilen DNA süspansiyon ve RE’lar
birlikte inkube edilir. Bu süre içerisinde RE’lar DNA üzerinde
spesifik bölgeleri keser ve böylece farklı büyüklüklerde DNA
segmentleri oluşur.
3- Elektroforez:
Fragmentlere ayrılmış DNA’lar, büyüklüklerine göre elektriksel bir
ortamda jelde büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar
oluştururlar.
![Page 46: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/46.jpg)
46
4- Membrana transfer
Jel üzerindeki DNA’ların, nitrosellüloz ya da naylon membranlaraaktarılma aşaması
Kapiller transfer, elektroforetik transfer, vakumla transfer
Prensibi;sıvı bir akımda jeldeki DNA’nın destek tabakaya geçmesidir.
Transfer oranı DNA parçalarının büyüklüklerine,
jeldeki kalıntılara,
sıvının pH sı gibi özelliklerine bağlıdır
![Page 47: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/47.jpg)
47
![Page 48: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/48.jpg)
48
![Page 49: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/49.jpg)
49
![Page 50: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/50.jpg)
50
![Page 51: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/51.jpg)
51
![Page 52: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/52.jpg)
52
5- Denatürasyon ve Fikzasyon:
Membran üzerine transfer edilen DNA bantları 0.5 N NaOH ilemuamele edilerek denatüre edilir
= çift iplikçikli DNA, bazlar arası bağlar koparak, tek iplikçikli halegelir.
Naylon membran 80º C ye ısıtılarak iplikçiklerin membran üzerine fikzeedilmesi (yapışması) sağlanır.
![Page 53: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/53.jpg)
53
6- Hibridizasyon:
3 temel adımda gerçekleşir;
a) prehibiridizasyon: özgül olmayan bağlanmaları en aza indirmek içinblotlanması tamamlanan membranın bloklanması
b) hibridizasyon: hedef DNA ile probun birleştiği aşama
c) hibridize olmayan probların yıkanması ve görüntülenme aşaması
![Page 54: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/54.jpg)
54
![Page 55: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/55.jpg)
55
6- sonuçların gözle görülmesi
Kullanılan probun özelliğine göre otoradiografi, ya da özel boyamayöntemleri ile oluşan hibrib bantlar gözle görülür hale getirilir.
![Page 56: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/56.jpg)
5656
Northern Blotlama
J.Alwine ve G. Stark, 1979
Herhangi bir kaynaktan elde edilen RNA’ nın analizi
RNA nın izolasyonu
Elektroforez
Membrana aktarma
Blotting
RNA nın saptanması
Bu teknikten, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya
organlardaki mRNA seviyesini belirlemede ve viral RNA ları saptamada yararlanılır
![Page 57: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/57.jpg)
575757
Dot/Slot Blotlama
DNA /RNA’nın elektroforez yapılamadan membrana damlatılması ve bu membranda sabitlendikten sonra özgül dizilimlerinin belirlenmesi
Klinik materyalden DNA izolasyonu,İki ya da beş katlı seri dilüsyon,Her dilüsyondan naylon membran üzerine damlatma,Denatürasyon ve fikzasyon,Hibridizasyon,Otoradiografi ile görüntüleme.
Çalışılan örnekteki DNA miktarı önemli, genellikle fazla miktarda DNA ile çalışılması gerekmektedir
![Page 58: MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİcdn.istanbul.edu.tr/FileHandler2.ashx?f=biyoteknoloji-2015.pdf · restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler. E. coli RY 13 suşu EcoRI ... 3-](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040815/5e5c0f351266a44eb327ea7d/html5/thumbnails/58.jpg)
585858
In situ Hibridizasyon
Doku, organ ve hücrelerdeki özgül nükleik asitlerin belirlenmesi
Hücre ve doku içindeki hedef nükleik asidin lokalizasyonunu belirleme imkanı sağlar
5 temel adımda gerçekleşir;
•Dokuların işlenmesi(fikze edilme ve kesilme)
•Spesifik olmayan bağlanmaların engellenmesi
•Hibridizasyon
•Yıkama
•Görüntüleme