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Metodi di studio delle proteine :
• determinazione della quantità• determinazione della struttura primaria (sequenza a.a.)• determinazione della struttura 3D
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Spettrofotometro
monocromatore
cuvetta
rivelatore
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Determinazione della quantità di proteina:1. Assorbimento alla luce ultravioletta
Principio: gli aminoacidi aromatici (tirosina e triptofano) hanno un massimo di assorbimento a λ= 280 nm
Svantaggi: Interferenze con acidi nucleici (~10x aa.) --> approssimatività
Vantaggi : rapidità, possibilità di correzioneProteine (mg/ml) = 1.55 A280 - 0.76 A260
(spesso usato per una miscela di proteine)
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La legge di Lambert e Beer
A = ελcl
A = assorbanza alla lunghezza d’onda λελ = coeff. di estinzione molarec = concentrazione molarel = lunghezza del cammino ottico (1 cm)
(spesso usato per proteine purificate)
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Determinazione della quantità di proteina:2. Metodo di Bradford
Principio: colorazione con Coomassie Brilliant Blue dei gruppi -SH, A595
Svantaggi : dipende dal contenuto di a.a. della singola proteina - difficoltà di standardizzazione
Vantaggi : rapidità di esecuzione
(spesso usato per una miscela di proteine)
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μg BSA
A695
10 20 30 40 50 60 70 80
Determinazione per interpolazione graficarispetto ad una curva standard
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Determinazione della quantità di proteina:3. Metodo di Lowry
Principio: formazione di complessi colorati con i reagenti (rame in condizioni basiche)
Svantaggi : Interferenze con tamponi comuni (TRIS, HEPES, PIPES) e detergenti
Vantaggi : riproducibilità rispetto allo standard
(spesso usato per una miscela di proteine)
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μg BSA
A695
10203040506070 80
Determinazione per interpolazione graficarispetto ad una curva standard
Sulla base dei seguenti datisperimentali, ottenuti in un saggio con il metodo di Lowry, calcolare il valore dellaconcentrazione (in mg/ml) del campione X
5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 30 ml 40 ml 60 ml
BSA 1 mg/ml 0.093 0.157 0.250 0.298 0.413
Campione X diluito 1:2
0.120 0.354
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Elettroforesi = migrazione in campo elettrico
Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabili. In opportune condizioni di pH presentano una carica elettrica + o – e quindi sono in grado di migrare in un campo elettrico.
Se V = voltaggio applicatoe d = distanza tra gli elettrodi
E = V/d gradiente di potenziale
La molecola di carica q (coulomb) subisce una forza Eq (newton)Se f = coefficiente frizionale, la velocità di migrazione v è data da :
v = Eqf
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Supporti per l’elettroforesi
• Agarosio
E’ un polimero di agarobiosio (polisaccaride componente dell’agar).Viene sciolto al calore in opportuno tampone, versato nella cella elettroforetica e lasciato raffreddare
O
OOH
OH CH2OH
O OH
O
OO
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Supporti per l’elettroforesi
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Il supporto agisce da setaccio molecolare
_
+
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5 5 45 65Electrophoresis Time (Minutes)
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Colorazione delle bande di proteine.1
Blu di Coomassie Rosso di Ponceau
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Colorazione delle bande di proteine.2
Silver staining
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+ - + - +
G93ASOD1
MouseSOD1Mouse/G93A-SOD1
G93
A-S
OD
1
Individuazione di attività enzimatica mediante colorazione specifica
Colorazione delle bande di proteine.3
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Detection is the step where you generate and acquire signal. The signal can be captured using autoradiography films, storage phosphor screens and image acquisition systems, depending upon your labeling method and the required levels of sensitivity and resolution
Detection
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Quantitation
background
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Discontinuous SDS-PAGEPoly-Acrylamide Gel Electrophoresis in SDS
“stacking gel”(4% acrilammide, pH6.8)
“resolving gel”(12% acrilammide, pH8.8)
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In un gel di acrilammide e SDS la mobilità relativa di una specie molecolare è proporzionale al log della massa molecolare.
Determinazione del PM di una proteina mediante SDS-PAGE
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La carica elettrica di una proteina dipende dai residui aa carichi (acidi o basici) esposti sulla superficie.
Le proteine hanno un PUNTO ISOELETTRICO (pI) che corrisponde al valore di pH a cui hanno carica nulla.
+
+
+
+
_
_
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ISOELECTROFOCUSINGLe proteine si possono separare elettroforeticamente in base ai loro pI
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La corsa elettroforetica viene effettuata in un gel in cui è stato preformatoun gradiente di pH utilizzando una miscela di polianfoliti.
Al punto isoelettrico (pI) la carica netta è = 0 e pertanto la mobilità elettroforetica è = 0.
IEF = Iso-Electro-Focusing = focalizzazione isoelettrica
1 2 3 4
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Sfruttando contemporaneamente due diverse proprietà delle proteine si può ottenere una migliore separazione elettroforetica di
miscele molto complesse (ad es. estratti citoplasmatici totali).
Elettroforesi bidimensionale
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Elettroforesi di DNA
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Separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di
agarosio colorato con etidiobromuro
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Si possono separare anche frammenti di DNA che differiscono di un solo nucleotide
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Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
Inizio corsa
Fine corsa (oligonucleotide libero)
Complessi oligonucleotide/proteina
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Problema:Dai seguenti dati sperimentali ottenuti con il metodo di
Lowry usando uno standard di BSA determinare la concentrazione molare di una proteina X di PM 10000 Da.
0.3700.175Proteina X diluito 1:10
0.3950.2680.1430.072BSA 1 mg/ml
60 μl40 μl20 μl10 μl5 μl
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Problema:Rappresentare i seguenti dati sperimentali con un istogramma dei valori medi e deviazioni standard delle serie di misure.
1.351.041.481.52Trattamento C
1.381.131.270.83Trattamento B
0.951.201.471.31Controllo
Misura 4Misura 3Misura 2Misura 1
Come potreste valutare se i tre trattamenti differiscono rispetto ai valori di controllo ?