Download - Mega Trinova Durika
-
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN TAHAN ASAM
Rabu, 11 Maret 2015
Kelompok I
Rabu , Pukul 13.30 16.30 WIB
Nama NPM
MEGA TRINOVA DURIKA 260110130098
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai TTD
(Shintya) (Benedictus)
-
PEWARNAAN TAHAN ASAM
I. Tujuan
1. Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak
tahan asam dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam (Ziehl-
Neelsen)
2. Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam
prosedur tersebut.
II. Prinsip
1. Penetrasi zat warna
Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan mikroorganisme lainnya
adalah dengan adanya suatu dinding tebal yang berlilin (lipoidal) yang
menyebabkan penetrasi oleh zat warna menjadi sulit. Akan tetapi, apabila
zat warna sudah dapat masuk, zat warna terssebut jadi tidak mudah
dibuang meskipun dengan penggunaan asam alcohol yang kuat sebagai zat
pelarutnya.
2. Pewarnaan tahan asam
Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan diferensial lebih dari satu
pewarna untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan kandungan
dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid kompleks
yang tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam.
3. Pemanasan
Pemanasan biasanya diperlukan untuk memperkuat penetrasi pewarna
dasar ke dalam sel bakteri.
4. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam
Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan
kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan,
bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri
tersebut disebut bakteri tahan asam.
-
III. Teori Dasar
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri
yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel
yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang
ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA
antara lain Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae.
Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan
penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai
bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculosis terjadi
melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).
Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai
dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan
pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung
sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai
dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan
impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan
encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi
dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan
kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok
bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna
pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol
asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang
tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan
reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna
(Lay, 1994).
Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang
panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat
lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal
manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah,
-
egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel
adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 3 m. Pada media
buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke
spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak
dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan
iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-
Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan
media selektif. Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan
kontaminan bakteri dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang
dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar
semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi
(Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001).
Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari
oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan
pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan
pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk
menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung
tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23C, untuk
menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk cepat asam
daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap
agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan
pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan
hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat
terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang
optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).
-
IV. Alat dan Bahan
5.1. Alat
1. Botol semprot
2. Bak pewarna
3. Kaca preparat
4. Kapas
5. Kertas saring
6. Korek
7. Mikroskop
8. Ose
9. Spirtus
-
5.2. Bahan
1. Air suling
2. Alkohol 70%
3. Asam alcohol (3% HCl dalam alcohol 95%)
4. Emerge oil
5. Suspensi bakteri (Tuberculosis)
6. Zat warna karbol fuksin
7. Zat warna biru metilen
V. Prosedur
Pertama-tama, menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Kaca
preparat direndam didalam larutan alcohol 70% dan kaca preparat dikeringkan
dengan menggunakan kapas. Kemudian pada salah satu sisi kaca preparat
dibuat lingkaran menggunakan spidol. Lalu nyalakan spirtus dengan korek api
dan ose di fiksasi diatas api hingga kawat ose berubah menjadi merah.
Kemudian ose didinginkan di dekat api. Setelah itu, tabung reaksi yang berisi
campuran suspensi bakteri (Tuberculosis) dibuka didekat api dan suspensi
bakteri diambil dengan menggunakan ose. Kemudian penutup tabung dan
mulut tabung difiksasi dan tabung ditutup kembali. Lalu olesan bakteri di
oleskan secara merata diatas kaca preparat, ose dan kaca preparat difiksasi.
Setelah itu, kaca preparat diletakkan diatas bak warna. Olesan bakteri
digenangi dengan pewarna karbol fuksin selama 5 menit, sambil dipanaskan di
atas penangas air. Jaga jangan sampai terlalu panas, mendidih atau kering..
Lalu zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas degan air suling. Kemudian
bilas dengan zat pewarna alcohol-asam selama 15 detik atau sampai belakang
olesan berwarna merah muda pucat. Setelah itu, olesan bakteri digenangi
dengan pewarna tanding biru metilen selama 2 menit. Lalu zat warna berlebih
dibuang dan olesan dicuci dengan air suling ,kemudian dikeringkan
menggunakan kertas saring. Lalu ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada
kaca preparat. Kemudian preparat olesan bakteri diamati dibawah mikroskop.
-
VI. Data Pengamatan
Pewarna : karbol fuksin, metilen blue
Preparat : Suspensi bakteri Mycobacterium tuberculosis
Perbesaran : 10 x 100 kali
Identifikasi bakteri :
SAMPEL LITERATUR
Bentuk dan warna bakteri tidak
terlihat jelas
(http://textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html)
Bentuk Bakteri teramati,yaitu batang
Warna bakter teramati yaitu merah
VII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini praktikan melakukan praktikum pewarnaan
tahan asam. Tujuan dari praktikum ini adalah dapat mengamati dua kelompok
bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam dengan
menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam (Ziehl-Neelsen) dan dapat
memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur
tersebut. Adapun prinsip yang mendasari praktikum ini yaitu penetrasi zat
warna, pewarnaan tahan asam, pemanasan, dan impermeabilitas dinding sel
bakteri.
Pada praktikum ini, hal pertama yang dilakukan yaitu menyiapkan alat
dan bahan yang akan digunakan. Selanjutnya kaca preparat direndam didalam
-
larutan alkohol 70%, perendaman kaca preparat ini bertujuan agar kaca
preparat bebas dari mikroorganisme dan lemak yang menempel pada kaca
preparat. Setelah itu kaca preparat dikeringkan dengan menggunakan kapas
sampai berbunyi yang menandakan bahwa kaca preparat sudah bisa digunakan.
Lalu pada salah satu sisi kaca preparat dibuat lingkaran menggunakan spidol,
lingkaran ini dibuat untuk media pengamatan materi supaya pada saat
mengamati dibawah mikroskop akan lebih mudah.
Selanjutnya, spirtus dinyalakan menggunakan korek api, spirtus
berguna untuk fiksasi. Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau
penempelan suatu struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi. Hal yang
harus diperhatikan dalam proses fiksasi adalah kita hanya melewatkan objek
diatas api bukan membiarkan dia terbakar karena akan mengakibatkan
bakterinya mati dan tujuan fiksasi untuk pelekatan bakteri supaya pada saat
pencucian bakteri tidak hilang tercuci dan bakteri tidak berubah bentuk pada
saat diamati pada mikroskop. Kemudian ose difiksasi dengan melewatkannya
diatas api sampai berubah menjadi merah yang menandakan bahwa ose sudah
bebas dari kontaminasi. Ose adalah alat yang digunakan untuk memindahkan
atau mengambil koloni suatu mikroba ke media yang akan digunakan kembali.
Lalu ose didinginkan didekat api, ose yang digunakan harus dingin karena
apabila ose masih panas maka akan mengakibatkan sel bakteri yang akan diuji
mati.
Selanjutnya tabung reaksi yang berisi campuran suspensi bakteri (
Tuberculosis) dikocok dan dibuka dekat api untuk mengurangi kontaminasi.
Pengocokan ini bertujuan agar suspensi bakteri tercampur secara merata tidak
ada endapan bakteri di bagian bawah tabung. Lalu sampel diambil
menggunakan ose, ose dan tabung difiksasi. Kemudian oleskan bakteri diatas
kaca preparat secara merata. Setelah rata, kaca preparat diletakkan diatas bak
pewarna. Olesan bakteri digenangi dengan pewarna karbol fuksin dan
dibiarkan selama 5 menit, sambil dipanaskan di atas penangas air. Jaga jangan
sampai terlalu panas, mandidih atau kering. Tujuan pemberian carbol fuchsin
0,3% adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Biar sulit menembus dinding
-
dari bakteri tahan asam dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel
bakteri tersebut sehingga warna carbol fuchsin ini mampu diserap oleh sel-sel
bakteri. Namun perlu diperhatikan, pemanasan dilalukan jangan sampai
mendidih cukup samapai menguap agar sel-sel bakteri tersebut tidak rusak.
Lalu,zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling. Kemudian
dibilas dengan zat pemucat alcohol-asam selama 15 detik atau sampai latar
belakang olesan berwarna merah muda pucat. Penambahan alkohol berfungsi
untuk membilas atau melunturkan zat warna (decolorization) pada sel bakteri
(mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah mampu menyerap warna carbol
fuchsin maka dinding sel tersebut akan kembali tertutup dalam pada suhu
semula. Sehingga sebelum dilakukan penambahan asam alcohol ditunggu
samapai 5 menit. Saat penambahan asam alcohol ini, maka bakteri yang bukan
BTA akan dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak
mampu mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA.
Setelah itu, olesan bakteri digenangi dengan pewarna tandingan biru
metilen selama 2 menit. Methylene Blue merupakan pewarna tandingan atau
pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam alkohol. Zat warna
methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang permeabilitas
dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non BTA
terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA
tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak
dapat masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah. Lalu zat warna
berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling.
Setelah itu kaca preparat ditetesi dengan minyak imersi. Minyak emersi
adalah minyak yang dipakai untuk olesan pada mikroskop yang fungsinya
untuk memperjelas objek dan melindungi mikroskop itu sendiri atau
Imersi minyak merupakan teknik yang digunakan pada saat kita akan
mengamati preparat mikroskopik dengan perbesaran yang besar (10x100
-
misalnya). Minyak imersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan
dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas
menggunakan minyak imersi dibandingkan menggunakan air.
Selanjutnya kaca preparat diamati di bawah mikroskop dan hasilnya
digambar. Pada pengamatan yang dilakukan dari dari suspense bakteri
(Tuberculosis) didapatkan bentuk bakteri yaitu bentuk bakteri basil tahan asam.
Hasil Pengamatan pada praktikum kali ini sel bakterinya sulit untuk
diamati dan berbeda dengan hasil literature. Pada praktikum kali ini,,bentuk sel
bakteri Mycobacterium tubercolosis tidak terlihat batang dan warnanya juga
tidak merah sebagaimana literature.
Hal ini mungkin dapat disebabkan oleh :
1. Olesan bakteri tidak rata dan terlalu tipis sehingga sulit untuk diamati pada
mikroskop/ hasil pengamatan tidak jelas .
2. Proses penotolan dengan kertas saring yang tidak benar dan terlalu keras
sehingga bakteri sampel malah menempel pada kertas saring.
3. Fiksasi yang terlalu lama dapat menyebabkan dinding bakteri pecah
sehingga sulit untuk diamati.
4. Zat warna tidak merata masuk ke dalam dinding bakteri / proses
pewarnaan yang kurang lama.
5. Pada saat pengolesan bakteri dengan ose,ose yang digunakan masih panas
sehingga dinding bakteri pecah dan bentuknya tidak dapat diamati.
6. Pembilasan dengan air suling yang terlalu keras menyebabkan olesan
bakteri terbawa oleh air.
VIII. Simpulan
1. Dapat mengamati dua jenis bakteri yaitu bakteri tahan asam dan bakteri
tidak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam
pada bakteri tahan asam akan mempertahankan warna merah sedangkan
bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.
2. Praktikan dapat memahami cara pewarnaan bakteri tahan asam
-
DAFTAR PUSTAKA
Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons, New
Fardiaz, S., 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Jawetz, E., Joseph Melnick&Edward Aldeberg.1996. Mikrobiologi Kedokteran,
diterjemahkan oleh Edi Nugroho dan R. F Maulany.Jakarta: Penerbit Buku
kedokteran EGC.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo
Persada.
Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi.
Jakarta: UI Press.
.
-
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN SPORA
Rabu, 11 Maret 2015
Kelompok I
Rabu , Pukul 13.30 16.30 WIB
Nama NPM
MEGA TRINOVA DURIKA 260110130098
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai TTD
(Shintya) (Benedictus)
-
PEWARNAAN SPORA
I. Tujuan
1. Mengamati endospore bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan
spora (pewarnaan Klein).
2. Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam
prosedur tersebut.
II. Prinsip
1. Pewarnaan spora
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit
green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna
hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada
Bacillus subtilis.
2. Teknik aseptis
Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi
bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptis digunakan sepanjang
percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan maupun praktikan.
3. Impermeabilitas spora
Baktreri dalam bentuk spora lebih tahan terhadap disinfektan, sinar,
kekeringan, panas, dan kedinginan. Hal ini karena dinding spora lebih
bersifat impermeable dan spora mengandung sangat sedikit air, sehingga
menyebabkabspora tidak mudah mengalami perubahan temperatur.
4. Penetrasi zat warna
Tebal tipisnya sediaan. Bila sediaan terlalu tebal atau tidak rata, maka
penetrasi zat warna akan berbeda-beda.
III. Teori Dasar
Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri
mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk
-
spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua
mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar
yang tidak menguntungkan.(Dwidjoseputro, 2005)
Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama genus bacillus dan
costridium. Pada umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan
ukuran yang berbeda. Spora pada bakteri dibentuk pada kondisi secara
kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan misalnya nutrisi,
sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang digunakan untuk melihat
spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan Donner.
Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak
spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah sel),
terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal ( letak spora diantara
ujung-ujung dan ditngah-tengah terminal) ( Dwidjoseputro, 2005).
Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-
tahun bahkan berabad-abad jika berada dalam kondisi lingkungan yang normal.
Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun spora tetap
hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1
jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap
menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora
akan tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara
normal (Volk & Wheeler, 1988).
Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat
apusan preparat.Kemudian preparat diberikan malakit hujau yang berfungsi
sebagai pewarna primer yangdigunakan untuk melumuri fiksasi panas. Preparat
diuapkan diatas air mendidih dengan tujuanuntuk memperbesar pori-pori
bakteri agar pada saat pewarnaan dapat menembus dindingendospora dan
dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air dialirkan
dariatas, yang bertujuanuntuk menghilangkan malacite green dari seluruh
bagian sel endospora.Pewarnaan safranin bertujuan untuk counterstein yang
digunakan untuk melumuri bagian warnadari sel yang lain dari pada endospora.
Hasil uji bakteri Bacillus subtilis menghasilkan bakteri gram positif. Prinsip
-
pewarnaan spora didasarkan pada penggunaan zat wa rna malachite green dan
safranin dimana pada hasil pewarnaan akan menghasilkan warna hijau pada
spora dan warna merah pada sel vegatitifnya (Lay 1994).
Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh berdinding
tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh semua spesies
Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk
endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sebagai sel
vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya, terjadi
sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan
untuk menjadi spora. (Pelczar,1986).
IV. Alat dan Bahan
5.3.Alat
10. Botol semprot
11. Bak pewarna
12. Kaca preparat
13. Kapas
14. Kertas saring
15. Korek
-
16. Mikroskop
17. Ose
18. Spirtus
5.4. Bahan
8. Air suling
9. Alkohol 70%
10. Biakan padat bakteri Bacillus subtilis berumur 72 jam
11. 24 1%
12. NaCl fisiologis
13. Zat warna karbol fuksin
14. Zat warna biru metilen
V. Prosedur
Pertama-tama, menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Buat
suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di tabung
reaksi dan tambahkan karbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam suspensi tersebut.
Lalu panaskan campuran tersebut dalam pemanas air bersuhu 800 selama 10
menit, jaga jangan sampai mendidih atau kering. Kemudian sediaankan kaca
preparat dan direndam didalam larutan alkohol 70% dan kaca preparat
dikeringkan dengan menggunakan kapas. Kemudian pada salah satu sisi kaca
preparat dibuat lingkaran menggunakan spidol. Lalu nyalakan spirtus dengan
korek api dan ose di fiksasi diatas api hingga kawat ose berubah menjadi merah.
Kemudian ose didinginkan di dekat api. Setelah itu, tabung reaksi yang berisi
biakan padat bakteri Bacillus subtilis dibuka didekat api dan suspensi bakteri
-
diambil dengan menggunakan ose. Kemudian penutup tabung dan mulut
tabung difiksasi dan tabung ditutup kembali. Lalu olesan bakteri di oleskan
secara merata diatas kaca preparat, ose dan kaca preparat difiksasi. Setelah itu,
kaca preparat diletakkan diatas bak warna. Olesan bakteri digenangi dengan
24 1% Lalu zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas degan air suling.
Setelah itu, olesan bakteri digenangi dengan pewarna tanding biru metilen
selama 5 menit. Lalu zat warna berlebih dibuang dan olesan dicuci dengan air
suling ,kemudian dikeringkan menggunakan kertas saring. Lalu ditetesi dengan
sedikit minyak imersi pada kaca preparat. Kemudian preparat olesan bakteri
diamati dibawah mikroskop.
VI. Data Pengamatan
Pewarna : karbol fuksin, metilen blue
Preparat : Suspensi bakteri Bacillus subtilis
Perbesaran : 10 x 100 kali
Identifikasi bakteri :
Bentuk bakteri : Batang
Warna Bakteri : Biru
Warna Spora : Merah
-
VII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini praktikan melakukan praktikum pewarnaan
spora. Tujuan dari praktikum ini adalah dapat mengamati endospora bakteri
dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora (pewarnaan Klein) dan dapat
memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur
tersebut. Adapun prinsip yang mendasari praktikum ini yaitu pewarnaan spora,
teknik aseptis, impermesbilitas spora dan penetrasi zat warna.
Pada praktikum ini, hal pertama yang dilakukan yaitu menyiapkan alat
dan bahan yang akan digunakan. Selanjutnya buat suspensi bakteri yang terdiri
dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di tabung reaksi. Fungi NaCl fisiologis
berfungsi sebagai pengencer agar suspensi sampel yang akan digunakan steril
dan menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu, NaCl fisiologis
juga mempertahankan kondisi pH dari sampel suspensi. Larutan pengencer
NaCl Fisiologis steril merupakan larutan netral sehingga tidak mempengaruhi
kondisi pH.
Setelah itu tambahkan karbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam suspensi
tersebut. Lalu panaskan campuran tersebut dalam pemanas air bersuhu 800
selama 10 menit, jaga jangan sampai mendidih atau kering. Penambahan karbol
fuksin adalah sebagai pewarna untuk mewarnai bakteri dengan warna merah.
Hal ini bertujuan untuk memperbesar pori-pori bakteri agar zat warna dapat
menembus dinding endospora dan jaga jangan sampai mendidih atau kering
karena dinding bakteri akan hancur jika terlalu panas. Pemanasan pada suhu
800 bermaksud untuk membunuh sel vegetatif bakteri, sedangkan sel spora
tidak akan mati pada suhu 800, bahkan spora masih dapat hidup selama 1 jam
dalam air mendidih.
Selanjutnya membuat olesan bakteri yaitu dengan cara kaca preparat
direndam terlebih dahulu didalam larutan alcohol 70%, perendaman kaca
preparat ini bertujuan agar kaca preparat bebas dari mikroorganisme dan lemak
yang menempel pada kaca preparat. Setelah itu kaca preparat dikeringkan
dengan menggunakan kapas sampai berbunyi yang menandakan bahwa kaca
preparat sudah bisa digunakan. Lalu pada salah satu sisi kaca preparat dibuat
-
lingkaran menggunakan spidol, lingkaran ini dibuat untuk media pengamatan
materi supaya pada saat mengamati dibawah mikroskop akan lebih mudah.
Selanjutnya, spirtus dinyalakan menggunakan korek api, spirtus
berguna untuk fiksasi. Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau
penempelan suatu struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi. Hal yang
harus diperhatikan dalam proses fiksasi adalah kita hanya melewatkan objek
diatas api bukan membiarkan dia terbakar karena akan mengakibatkan
bakterinya mati dan tujuan fiksasi untuk pelekatan bakteri supaya pada saat
pencucian bakteri tidak hilang tercuci dan bakteri tidak berubah bentuk pada
saat diamati pada mikroskop. Kemudian ose difiksasi dengan melewatkannya
diatas api sampai berubah menjadi merah yang menandakan bahwa ose sudah
bebas dari kontaminasi. Lalu ose didinginkan didekat api, ose yang digunakan
harus dingin karena apabila ose masih panas maka akan mengakibatkan sel
bakteri yang akan diuji mati.
Selanjutnya tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri (Bacillus
subtilis) dikocok dan dibuka dekat api untuk mengurangi kontaminasi. Lalu
sampel diambil menggunakan ose, ose dan tabung difiksasi. Kemudian oleskan
bakteri diatas kaca preparat secara merata. Setelah rata, kaca preparat
diletakkan diatas bak pewarna. Olesan bakteri digenangi dengan 24 1%
selama 2 detik. Lalu,zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air
suling. Proses pencucian ini menyebabkan por-pori dinding spora yang semula
melebar,kembali mengecil. Tahapan ini lah yang mengakibatkan dekolorisasi
dengan asam-alkohol tidak akan melarutkan zat warna karbol fuksin pada
spora.
Kemudian olesan bakteri digenangi dengan pewarna tandingan biru
metilen selama 5 menit. Tujuan pemberian biru metilen adalah memberi warna
background (pewarna sekunder). Hal ini berfungsi untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam
alkohol. Lalu dibilas dengan air suling dan dikeringkan dengan kertas saring.
Penotolan dengan kertas saring harus hati-hati agar olesan bakteri tidak
terbawa / menempel pada kertas saring.
-
Setelah itu kaca preparat ditetesi dengan minyak imersi. Minyak emersi
adalah minyak yang dipakai untuk olesan pada mikroskop yang fungsinya
untuk memperjelas objek dan melindungi mikroskop itu sendiri atau
Imersi minyak merupakan teknik yang digunakan pada saat kita akan
mengamati preparat mikroskopik dengan perbesaran yang besar (10x100
misalnya). Minyak imersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan
dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas
menggunakan minyak imersi dibandingkan menggunakan air.
Selanjutnya kaca preparat diamati di bawah mikroskop dan hasilnya
digambar. Pada pengamatan yang dilakukan dari sampel air liur didapatkan
bentuk bakteri yaitu bentuk bakteri basil tahan asam.
Pada saat praktikum, terjadi kesalahan yang mengakibatkan olesan
bakteri pada kaca preparat hilang dan menyebabkan praktikan susah
menemukan bentuk bakteri yang terdapat pada suspensi. Faktor-faktor yang
menyebabkan hal tersebut yaitu :
Olesan bakteri tidak merata
Biakan spora suspensi bakteri belum matang, seharusnya umur biakan
bakteri yang digunakan 72 jam. Tapi pada praktikum kali ini umur biakan
hanya 24 jam. Menyebabkan spora belum matang,sehingga karbol fuksin
tidak masuk secara sempurna dan sulit diamati
Fiksasi yang terlalu lama juga dapat menyebabkan dinding bakteri pecah
sehingga sulit untuk diamati
Pembilasan dengan air suling yang terlalu keras yang menyebabkan olesan
bakteri terbawa oleh air.
Proses penotolan dengan kertas saring yang tidak benar dan terlalu keras
yang mengakibatkan olesan bakteri menempel pada kertas saring.
VIII. Simpulan
1. Endospora bakteri dapat diamati dengan mengggunakan prosedur
pewarnaan spora .
2. Praktikan dapat memahami pewarnaan spora dengan baik.
-
3. Hasil pengamatan :
Badan vegetative : warna biru
Spora : warna merah muda
Sel vegetatif : bentuk batang
-
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : PT Gramedia.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo
Persada.
Pelczar, chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Volk, W.A dan Margaret Fwheeler. 1988. Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh:
Markham, M.sc.Jakarta: Erlangga.