LES MÉTHODES DE TRAÇAGE DES VOIES NERVEUSES
Master 1 neuroscience
Eléonore SERANORomain TERROCHAIRE
Introduction:• La coloration des neurones morts est utilisée depuis plus de 100 ans, avec l'invention de la coloration de Golgi qui a permis la première description de réseaux de neurones (rendus visibles par du chromate d'argent sur tissus morts)
• Transport antérograde identification des efférences
• Transport rétrograde identification des cellules cibles d’une ou plusieurs cellules du SNC.
• Marqueurs fluorescents les plus utilisés: - PI - NY - RITC - FB
• En 1986, introduction des marqueurs de carbocyanine: DiO, DiI (marqueur post-mortem)
I. Méthodes et Généralités
• Injection sous pression. - FB, DY, dextrans aminés sont solubles - carbocyanines nécessitent un solvant organique
• Injection iontophorétique.
• Cristaux de colorants (dye crystals)
A. Injection:
I. Méthodes et Généralités
• Absorption active. - dextrans aminés pour des axones lésées - PI, FB pour des terminaisons intactes
• Absorption passive
• Injection intracellulaire
• Transport et séquestration dans la cellule: - Transport actif vésiculaire - Diffusion latéral dans la membrane
B. Absorption
I. Méthodes et Généralités
• Pour des marqueurs fluorescents: - Directement visibles
- Possibilité d’utiliser plusieurs marqueurs en même temps
- Pas préservés sur coupe au cryostat ou paraffine
- Une trop forte fluorescence peut masquer de plus petits processus
• Pour des marqueurs non fluorescents: - anticorps spécifiques
C. Détection
II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs rétrogrades :
Transport antérograde
Transport rétrograde
Le marqueur va être absorbé aux niveau des terminaisons nerveuses et transféré vers le soma du neurone
Utilisé lors de l’étude de la dégénération des axones
projetant vers la région du cerveau qui a été détruite
Les traceurs antérogrades :
Le marqueur est injecté au niveau du soma et sera transporté jusq’aux terminaisons nerveuses
Cela permet le traçage de cibles anatomiques d’une population particulière de projection de
neurones
II. Les traceurs monosynaptiquesLes traceurs exclusivement antérogrades
Les acides aminés radiomarqués : acides aminés tritiés, précurseur métabolique, neuro-transmetteur ou intermédiaire autoradiographie
Facilement transporté par des peptides nouvellement synthétisés
Faible poids moléculaire
Propriétés hydrophiles qui limitent la diffusion à l’intérieur de la matrice extracellulaire
Sélectivité restreinte pour certaines cellules ou projections
II. Les traceurs monosynaptiquesLes traceurs exclusivement antérogrades
Les dextrans aminés:
Facilement utilisable, injection par pression ou par iontophorèse
Grandes variétés de méthodes de détections ont été développées pour eux
Peuvent se conjuguer avec de nombreux colorants fluorescents
Visibilité immédiate et production de préparation permanente
Ex : Fluoro-Ruby, Fluoro-Emerald, Biotinylated dextran amines
II. Les traceurs monosynaptiquesLes traceurs exclusivement rétrogrades
HRP (Horse radish peroxydase ou péroxydase de raifort) : révélé par la DAB (diaminobenzidine)
L’utilisation de trop grandes quantités de traceur peut compromettre la précision de la visualisation
1er traceur neuroanatomique rétrograde utilisé
La coloration est incomplète et reste limitée au soma et aux dendrites primaires
Analyse de l’ultrastructure
Détection profite des propriétés enzymatique du traceur (DAB et TMB)
L’absorption par les terminaisons nerveuses se fait par des vésicules qui contiennent l’enzyme
II. Les traceurs monosynaptiquesLes traceurs exclusivement rétrogrades
Fluoro-gold, E. Coli enterotoxin subunit B, billes microsphériques fluorescentes en
latex• Marquage sur du long terme• Temps de survie 24h à 48h• Étiquetage pendant plusieurs mois
II. Les traceurs monosynaptiques
Les traceurs antérogrades et rétrogrades
Les colorants de carbocyanides (DiI, DiO, DiAsp, DiA)
Les toxines bactériennes (sous-unités b de la toxine du choléra)
• Utilisation in vivo ou in vitro• Fluorescence intense des voies de signalisation• Fort pouvoir lipophile• Diffusion axonale lente
Se lie aux gangliosides présent sur la surface neuronale Marque de grands réseaux neuronaux
Les lectines (WGA, PHA-L)
Forte affinité pour de nombreux sucres transport spécifique efficace
II. Les traceurs monosynaptiques Les marqueurs fluorescents (TRITC, FITC, FB, TB, rhodamine …)
La biocytine et neurobiotine
• Simple à utiliser• Forte sensibilité pour le traçage• Combinaison possible avec d’autres méthodes de traçage• Non dégradé avec le temps
• Marquage très fin des arborisations axonales• Faible poids moléculaire• Forte affinité pour l’avidine (détection)
III. Les traceurs transsynaptiques
Traceurs permettant la visualisation d’un réseau neuronal
traceurs pouvant passer les barrières synaptiques présentes entre les neurones
Virus neurotropes modifiés
(Herpès, rhabdovirus)
WGA-HRPFragment C de la toxine tétanique
Lectines, fucose
radioactif, …
Les plus utilisésDépend des conditions
expérimentales
Transport transneuronal de la
périphérie
Diminution du signal dans le neurone de 2nd
ordre, …
III. Les traceurs transsynaptiques
Les virus neurotropes :
Réplication dans les cellules hôtes après le transport neuronal
Transport de la périphérie jusqu’au système nerveux central
Amplification du signal
Détection des antigènes viraux dans le corps des cellules
neuronales avec immunocytochimie
Conclusion
• De nos jours nous possédons une palette de marqueurs
• Ils sont soit antérogrades, soit rétrogrades ou les deux
• Ils ont donc des applications différentes
• La recherche de marqueur se poursuit ex: WGA-HRP transgène
Merci de votre attention !