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Le basi molecolari delle alterazioni della neurogenesi nella sindrome di Down
Anna Conti - DMMBM Napoli
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Ci sono alterazioni del trascrittoma
nella sindrome di Down?
Quali sono le conseguenze biologiche e
fenotipiche della disregolazione genica?
Quali geni del cromosoma 21 possono
influenzare la neurogenesi?
Le basi molecolari delle alterazioni della neurogenesi nella sindrome di Down
II CONVEGNO - Sindrome di Down DALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA - 19-20 Ottobre 2018
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Ci sono alterazioni del trascrittoma
nella sindrome di Down?
Capire i meccanismi molecolari per trovare una terapia
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Conti et al, BMC Genomics. 2007
Rapporto DS/N dell’espressionegenica per ciascuncromosoma
La trisomia del cromosoma 21 causa una globale upregolazione di geni
che mappano sul 21
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Conti et al, BMC Genomics. 2007
L’upregolazionedi geni sul cromosoma 21 disregola geni su cromosomi diversi
II CONVEGNO - Sindrome di Down DALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA - 19-20 Ottobre 2018
Volcano Plot cuori fetali trisomici vs euploidi: Circa 400 geni che mappano su cromosomi diversi
dal 21 sono disregolati
Volcano Plot neuroni in differenziamento al 65°giorno trisomici vs euploidi: in verde
i geni del cromosoma 21
Ovchinnikovet al, StemCellReports. 2018
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Conti et al, BMC Genomics. 2007
La disregolazione coinvolge globalmente due categorie geniche
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GENI UPREGOLATI:
EXTRA CELLULAR MATRIX AND CELL ADHESION
GENI DOWNREGOLATI:
MITOCHONDRIAELECTRON TRANSPORT CHAINOXIDATIVE PHOSPHORYLATION
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Dalla disregolazione genica al fenotipo clinico
II CONVEGNO - Sindrome di Down DALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA - 19-20 Ottobre 2018
MENTAL RETARDATION HYPOTONIA
TYPE 2 DIABETES AND OBESITY
IMMUNE DISORDERS
HEART DEFECTS
NEURODEGENERATION
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Quali sono le conseguenze biologiche e
fenotipiche della disregolazione genica?
Capire i meccanismi molecolari per trovare una terapia
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Il fenotipo neurale è uno dei principali target della disregolazione genica
• La sindromedi Down comportadisabilitàintellettivanel 100% deicasi
• Le persone con sindrome di Down mostrano un volume ridotto del cervellochecoinvolgeprevalentementeareecorticali, cervelletto, troncocerebrale e ippocampo.
• Questeanomaliesonogiàpresentiallanascita e hannofondamentinellavita prenatale
• Feti con DS e modellimurinidurante la gestazionemostranounariduzione del peso del cervello e del volume dell’ippocampo con un minor numero di cellule anchenelgirodentato e nelcervelletto
• Dalle prime fasidellaneurogenesi le regioniippocampalimostrano un minor numero di neuronied un maggiornumerodiastrociti
• I neuroni DS mostrano una morfologia delle spine dendritiche alterata e unadensitàridottadelle spine e dellesinapsidescrittegiànel 1888
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Anomalie del ciclo cellulare alterano il differenziamento neuronale
• La regolazionedellafase G1 del ciclocellularemantieneilrapportofraneuronidifferenziati e cellule neuraliprogenitrici
• In questafasel’attivitàdellecicline D è cruciale per la durataedilcompletamentodellafase G1
• NPC del topoTs65Dn hannoun ciclocellulareallungato e mostranolivellipiùbassi di CyclinaD1
• Un ritardo nella neurogenesi è dovuto anche alla disregolazione di fattori trascrizionaliNFATcespressi in tessuto neocorticale di modelli murini di DS.
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L’iperattivazionedi STAT3 induce il differenziamento in astrociti
• L’attività trascrizionale del signaltransducer and activator of transcription 3 STAT3 è regolata dalla fosforilazione in Tyr705 o Ser727
• Entrambe favoriscono l’entrata di STAT3 nel nucleo e quindi la sua attività trascrizionale di geni astrogliogenici
• Nelle cellule trisomiche il pathway JAK-STAT è iperattivo
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Il ruolo di SonicHedgehognella neurogenesi
• Shh rilasciato da neuroni o cellule gliali si lega ai recettori Patched(Ptch) sulle spine dendritiche attivando Smoothened (Smo) che induce la trascrizione di geni target
• Viene upregolata la profilina1 ed altre proteine che regolano la crescita assonale, e la plasticità sinaptica
• Shh induce il fattore neurotrofico BDNF reprimendo il miR-206 di cui BDNF è target
• Shh in vitro regola la proliferazione e la sopravvivenza di precursori neurali NPC
• Shh stimola anche la proliferazione di NPC dell’ippocampo in adulto dove Ptch e Smo sono espressi
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L’Shhsignaling è ridotto e l’espressione di Ptch è aumentata nelle cellule neurali di modelli murini di DS
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GABA signaling e plasticità sinaptica
• Studi elettrofisiologici hanno mostrato alterazioni della trasmissione sinapticaGABAergica in soggetti con sindrome di Down
• Il neurotrasmettitore GABA (Acido Gamma-Ammino-Butirrico) agisceattraversorecettoriionotropici GABAA e metabotropici GABAB
• I recettori GABAAsonocanaliionicipermeabili al clorocostituiti da subunitàa, b e g. Durante lo sviluppo influenzano il differenziamento e la migrazione neuronale, la crescita assonale e la plasticità sinaptica
• I recettori GABABsono G-protein-coupledreceptors (GPCRs) più spesso extra-sinaptici che regolano l’eccitabilità neuronale accoppiandosi con proteine come inwardly-rectifying potassium channel (GIRK) 2
• Durante la neurogenesi sia GABAA che GABAB controllano la plasticità sinaptica anche se in periodi diversi. Le disfunzioni GABAergiche alterano la plasticità sinaptica, l’apprendimento e la memoria nella DS alterando il bilancio sinaptico eccitatorio/inibitorio
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La disfunzione mitocondriale è presente nella sindrome di Down ....
….. e influenza la neurogenesi
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Fibroblasti euploidi
Fibroblasti trisomici
Consumo di ossigeno (OCR)
Potenzialedimembrana-TMRM fluorescence
ROS - DCF fluorescence
Fibroblasti euploidi
Fibroblasti Trisomici
Network mitocondrialemtGFP
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Trombospondina e PGC-1a nellesinapsi
• Gliastrocitiinfluenzanoilmetabolismoneuronale e le trasmissionisinapticherilasciandomolecoletrofiche come le trombospondine
• In DS, la glicosilazione e la secrezione di TSP-1 sonoinibitecausandounaglobaleriduzione del numero di spine
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Torres et al., Free RadBiolMed, 2018
• Neuroni transfettati con Si-PGC-1a mostrano una riduzione della densità di spine dendritiche pari al 75% mentre un aumento del 20% siosserva in neuronicheoveresprimono GFP-PGC-1a
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Il differenziamento neuronale di iPSC con trisomia 21 ricapitola il fenotipo clinico
• I precursori neurali derivati da iPSC con trisomia 21 in differenziamento spontaneo danno origine a meno neuroni e più astrociti con uno shift dal fenotipo neuronale ad astroglia ed oligodendroglia
• I neuroni da DS-iPSC hanno neuriti meno lunghi
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• Queste differenze sono state confermate nel differenziamento neuronale di iPSC da gemelli monozigoti che differivano unicamente per il numero di cromosomi 21
• L’eliminazione di Stat3 in NeuralStemCells ha dimostrato di promuovere la neurogenesi e inibire l’astrogliogenesi
• Studi su precursori neurali corticali da DS-iPSCs hanno mostrato neuroni GABA più piccoli, upregolazione della subunità a2 downregulazione delle subunità a3 e a5 di GABAA nelle cellule trisomiche
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Quali geni del cromosoma 21
possono influenzare la neurogenesi?
Capire i meccanismi molecolari per trovare una terapia
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Geni del cromosoma 21 in grado di alterare il ciclo cellulare
• Almeno sei geni che mappano sul cromosoma 21 sembrano essere coinvolti nella alterazione delle fasi del ciclo cellulare:
– Dual specificitytyrosine-phosphorylation-regulatedkinase 1A DYRK1A
– Regulatorof calcineurin1 DSCR1/RCAN1
– Amyloid precursor proteinAPP
– Oligodendrocytetranscriptionfactors1 and 2 OLIG1/2
– Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily J Member 6 KJN6
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DYRK1A
• DYRK1A regolailpotenzialeneurogenicomodulandol’espressione di proteinedel ciclocellularecoinvoltenellatransizionedallafase G1 allafase S.
• L’overespressionetransgenica di DYRK1A in vitro allunga le fasiG1 e S e quindirallenta la produzione di progenitorineurali. Ciò coincide con la riduzionedeilivellinucleari di Ciclina D1 mediata da DYRK1A.
• Topitransgenici per DYRK1A mostrano deficit di memoriaedalterazionidellatrasmissionesinaptica
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Arbones et al, PharmacolTher, 2018
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RCAN1, DYRK1A e il pathway dellacalcineurina
• L’entrata del Calcionellacellulaattiva la calcineurinachepromuovel’entratadegliNFATcnelnucleo
• La localizzazione e attività di NFATc sono regolati dalla sua fosforilazione
• RCAN1 inibiscel’azionedellacalcineurina e DYRK1A inibisceiltrasferimento di NFATcnelnucleo
• Il topo NFATc- mostra tratti fenotipici simili alla DS
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RCAN1 ----NFATc4 ----
Conti et al, BMC Genomics. 2007
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Genichepossonoinfluenzareilrapportoneuroni/astrociti
• APP– L’overespressione di APP e deisuoiprodotti di clivaggio: APP
solubile e AICD stimolano la cascata JAK-STAT e quindil’astrogliogenesi e inibiscono la neurogenesi.
– Il silenziamento di APP ristabilisceilcorrettodifferenziamentoneltopo Ts65Dn.
• DYRK1A– Il pathway di signaling di STAT vieneinfluenzato da DYRK1A
mediante la fosforilazione di STAT3 pertantol’overespressionedel gene potenziail signaling aumentandol’astrogliogenesi.
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Genicandidati per la disfunzionemitocondriale
• NRIP1/RIP140– Diminuiscel’efficienzadeimitocondrie ne altera la morfologia
• DYRK1A e DSCR1/RCAN1– Controllano PGC-1a attraversoil pathway calcineurina/NFAT
• SUMO3– Aumental’attivitàrepressivadi NRIP1 ediminuiscel’attivitàtrascrizionaledi PGC-1a
• PREP1– Reprime PGC-1a eigenidifusione OPA1 e MFN2
• ETS2– Attival’apoptosimitocondrialemediatada p53 e la caspasi-3 inducendo la
mortecellulare• APP e SOD1
– Inducono stress ossidativo• CBS
– Influenzal’attivitàmitocondrialeregolandonegativamenteiprocessi di metilazione• ITSN1
– Regolail pathway apoptoticomitocondriale
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NRIP/RIP140 è un repressorediPGC-1a edeisuoi target
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Scarpulla, BBA, 2011
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Fol
dch
ange
CTR siRNA5nM siRNA 20nM
RIP140 PGC1alpha
Il silencing di RIP140 in fibroblasti DS produce upregolazione di PGC-1a e dei suoi target e migliora la funzionalità mitocondriale Izzo et al, HumMolGenet, 2014
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I miRNA del cromosoma 21
• La overespressione di hsa-let-7c induce alterazionidellamorfologianeuronale e dellasinaptogenesi
• La regolazione del citoscheletro di actina è essenziale per l’arborizzazionedendritica
• I miRNA let-7 hanno come target validatimembri del pathway del citoscheletro di actinacome PAK1, DIAPH2, RDX and ITGB8, oltre a LIN-41, un fattorechepromuove la rigenerazioneassonica
• let-7c ha come target diretto MECP2 3’ UTR e ne regolailivelliproteiciin cellule neuronaliumane. I modellianimali e neuronali con deficit di Mecp2 mostranoalterazionidellacrescitadendritica e dellaconnettivitàsinaptica
• Il MiR-155 reprimeilfattore di trascrizione TFAM cheregola la biogenesimitocondriale
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Let-7c influenza l’attivitàmitocondrialereprimendol’espressio
nedi ANT1
• L’overespressione con un mimicodi let-7c downregola ANT1 ediltarget validato DICER
• L’eperimentoreciprocodisilenziamentoupregolaidue geni
II CONVEGNO - Sindrome di Down DALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA - 19-20 Ottobre 2018
BBA, 2008
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
ANT1
DICER
CTR miR let-7c 25nM
Fol
dch
ange
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Genicheinibisconoirecettori GABA
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• Lo studio dellosviluppoembrionaledell’ippocampo ha mostratounaalterazionedeiprofili di espressionedellesubunitàdeirecettori GABAAspecialmentedelle a3 cheeranodownregolate in tutte le regionidell’ippocampodurantetutte le epoche di sviluppo
Milenkovicet al, Brain StructFunct, 2018
• L’ipotesi è cheAPP, in particolareilframmentotossico b-amyloid (1–42), inibisca la subunità a3 facilitandoildifferenziamentoneuronaleprematuro
• Altro link fra trisomia 21 e GABA signaling viene dal gene KCNJ6 che codifica la G-proteincoupled GIRK2. Una extra copia di KCNJ6 nel topo Ts65Dn mice causa overespressione sia del gene che della proteina GIRK2 nell’ippocampo e nella corteccia
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Matriceextracellulare e neurogenesi
• Le molecole di adesione cellulare influenzano molti aspetti dello sviluppo neurale inclusi la migrazione cellulare, e il pattern dendritico
• L’overespressione di DSCAM nei neuroni ippocampali inibisce l’arborizzazione dendritica in maniera compatibile con il fenotipo dendritico in DS.
• L’espressione di DSCAM è modulata durante lo sviluppo ed è localizzata nelle membrane sinaptiche durante il periodo di maggiore arborizzazione dendritica corticale e la formazione delle spine dendritiche
II CONVEGNO - Sindrome di Down DALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA - 19-20 Ottobre 2018
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Il runt-related transcription factor RUNX1
• Neimammiferi RUNX1 gioca un ruolocrucialenellaregolazionedellosviluppo del sistemanervoso (Wang and Stifani 2017)
• Runx1 regolaanche la crescitaassonale
• La disregolazione di Runx1 ha mostrato di causareapoptosineuronalemassiva
• Runx1 è espresso neiprecursorineuralideirecettoriolfattori dove regolailciclocellulareattraversol’inibitoredellakinasiciclinadipendente p21
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Ci sono alterazioni del trascrittoma
nella sindrome di Down?
Quali sono le conseguenze biologiche e
fenotipiche della disregolazione genica?
Quali geni del cromosoma 21 possono
influenzare la neurogenesi?
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Capire i meccanismi molecolari per trovare una terapia
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Strategieterapeutiche:Contrastare SHH
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Chen et al. Int J Mol Sci. 2018
SAG
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DYRK1A è un master regulator del fenotipo neurale
Non stupisce quindi che sia stato in questi anni il principale target terapeutico
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Arbones et al, PharmacolTher, 2018
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Strategieterapeutiche:Ancoracontro DYRK1A
• ALGERNON (ALteredGEnerationofNeurons) è un inibitorediDYRK1A piùspecifico di EGCG usato in epocaprenatale per prevenire deficit cognitivinel topo Ts1Cje.
• In progenitorineurali da DS-iPSripristinaivalori di Cyclin D1 econtrasta i difettiproliferativi
• Il trattamentoprenatale non è ancorarealistico ma ALGERNON stimolaanche la neurogenesinell’adultodimostrando un potenzialeterapeuticonellaneurodegenerazione
“FlowersforAlgernon” è un racconto
di fantascienza del 1959 di Daniel Keyes
trasformato in romanzo nel 1966
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ConclusioniterapeuticheStimolare PGC-1A
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CHROMOSOME 21 TRISOMY
Ca2+
PPARg
Ca2+
MOBILIZATION
IP3R
Ca2+IP3R
NRIP1PGC-1a
MITOCHONDRIAL BIOGENESIS
NRF1/2, ERRa
DYRK1A
DSCR1
CnA/NFATc HEART
DEVELOPMENTCnA/MEF2
OPA1
MITOCHONDRIAL CRISTAE MORPHOLOGY
PPARγ agonists
PGC-1α activators
SUMO3
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GRAZIE ADMMBMLucio NitschAntonella IzzoSimona PaladinoNunzia MolloMaria NittiFerdinando BonfiglioRita GenesioRita CicatielloRosanna MancoFlorianaFabbriniPaola D’AgostinoRosa Negri
IEOS-CNRGaetano CalìFlaviana GentileGiuseppe MatareseClaudio ProcacciniDeriggioFaicchia
UNIVERSITY OF FOGGIANazzareno CapitanioClaudia PiccoliRosella Scrima
DBSMarina Prisco
UNIVERSITY OF FERRARAPaolo PintonSimone Patergnani
TIGEMElena PolishchukRoman Polishchuk
DSBAMaria D'ArmientoCarlo Olla
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19-20 Ottobre 2018
Le basi molecolari delle alterazioni della neurogenesi nella sindrome di Down
Anna Conti - DMMBM Napoli