LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI DA HCV: STATO DELL’ARTEINFEZIONI DA HCV: STATO DELL’ARTE
M. M. CrovattoCrovatto
Prevalenza dell’infezione: 2% = 123 milioni di personeShepard C W, Finelli L, Alter M Global epidemiology of hepatitis C virus infection September. Lancet Infect. Dis. 2005; 5:558-67
Presented at CSF
• Test di screeningTest di screening
•• Test supplementare Test supplementare ImmunoblotImmunoblot
•• HCV RNA qualitativoHCV RNA qualitativo
•• HCV RNA quantitativoHCV RNA quantitativo
•• GenotipizzazioneGenotipizzazione
Presented at CSF
TEST QUANTITATIVI PER HCV RNATEST QUANTITATIVI PER HCV RNA
10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010 UI/ml
Cobas Amplicor HCV Monitor
LCx HCV Assay
ABI 7000
Versant HCV RNA 3.0 Assay
Cobas TaqMan HCV
UI/ml
UI/ml
UI/ml
UI/ml
UI/ml
Presented at CSF
EVOLUZIONE TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
PCRPCR
RealReal TimeTime
Presented at CSF
TestTest RangeRange dinamicodinamico SensibilitàSensibilità
HCVHCV 4343--69.000.000 69.000.000 UI/MLUI/ML 15 UI/ML15 UI/ML
Range dinamico e sensibilità tests eseguibili con Cobas TaqMan 48 e ABI 7000 (Real Time)
TestTest RangeRange dinamicodinamico
HCVHCV 1010--10.000.000 10.000.000 UI/MLUI/ML
ABI 7000
Ampliprep + CobasTaqMan 48
CobasTaqMan 48
Presented at CSF
AzioneAmpErase
™
Trascrizioneinversa
Analisi deidati & Calcoli
Estratto
Risultato
Denaturazione
Annealing
Estensione
PCR
Cicli PCR
Sequenza operativa
HCV
Preparazione automatizzata del campione (e QS) su COBAS Ampliprep (lisi, cattura del DNAconparticelle di vetro magnetizzate, eluizione)
Retrotrascrizione, Amplificazione e contemporanea rilevazione su Cobas Taqman 48, mediante segmentazione di una sonda oligonucleotidica specifica a doppia etichetta per il bersaglio ed una specifica per il QS (coloranti fluorescenti del reporter diversi)
Presented at CSF
Presented at CSF
AmpliLink 3.0.1 -Suggerimenti
Presented at CSF
COBAS COBAS AmpliprepAmpliprep (CAP)(CAP)
COBAS COBAS TaqManTaqMan 4848
STRUMENTAZIONISTRUMENTAZIONIPresented at CSF
Presented at CSF
y = 0,9556x + 0,11r = 0.92
p = 0,001
3,50
4,50
5,50
6,50
7,50
3,50 4,50 5,50 6,50 7,50
AMPLICOR HCV MONITOR LOG IU/ml
TaqM
an H
CV
LOG
IU/m
l
Presented at CSF
Genotipo HCV-Q Monitor
HCV-Q TaqMan
Differenza Log
2a/2c 4.4 x 105 4.37 x 104 12a/2c 4.1 x 103 1.20 x 104 0,5NT 7.7 x 105 2.04 x 105 0,63a 2.8 x 105 4.6 x 104 0,83a 4.9 x 106 2.6 x 106 0,3
2a/2c 1.2 x 105 9.2 x 104 0,53a 1.8 x 105 7.8 x 104 0,42 3 x 106 1.2 x 106 0,4
4c/4d 4.5 x 105 3.6 x 105 0,12a/2c 1.6 x 105 1.3 x 104 1,13a 4.4 x 105 4.9 x 104 1
4c/4d 5.1 x 104 2.4 x 104 0,32a/2c 2.24 x 104 3.36 x 104 0,2
2 1.86 x 103 4.23 x 103 0,4
Presented at CSF
Genotipo Amplicor TaqMan Diff. Log
2a 5.15 x 106 2.01 x 106 5150000 2010000 0,408611172
gen 4 3.86 x 106 1.09 x 106 3860000 1090000 0,549160807
2a 8.88 x 105 2.47 x 105 888000 247000 0,555716013
2a 8.74 x 104 8.6 x 104 87400 86000 0,007012981
4c 8.75 x 106 2.78 x 106 8750000 2780000 0,497963257
3a 2.02 x 107 2.28 x 107 20200000 22800000 -0,05258348
4c 8.84 x 105 4.14 x 105 884000 414000 0,329451924
2b + 3a 2.1 x 105 9.41 x 104 210000 94100 0,348629671
gen 4 2.08 x 106 9.73 x 105 2080000 973000 0,329950495
2b 4.32 x 106 1.52 x 106 4320000 1520000 0,453640159
3a 3.1 x 104 2.02 x 104 31600 20200 0,194335713
gen 2 1.2 x 106 7.88 x 105 1200000 788000 0,182655029
4a 2.36 x 104 1.11 x 104 23600 11100 0,327589024
gen 4 + gen1 4.8 x 104 3.55 x 104 48000 35500 0,131012884
3a 3.24 x 107 6.44 x 106 11000000 6440000 0,232506818
gen 4 3.9 x 105 2.31 x 105 390000 231000 0,227452627
1a 2.62 x 106 1.09x106 2620000 1090000 0,380874793
2a 4.05 x 106 9.84 x 105 4050000 984000 0,614459925
2c 3.1 x 104 2.66 x 104 31700 26600 0,076177626
Presented at CSF
Amplicor TaqMan Diff. Log
2.15 x 103 2.27 x 103 2150 2270 -0,0235874
4.49 x 103 2.91 x 103 4490 2910 0,188353352
4.92 x 106 2.04 x 106 4920000 2040000 0,382334935
8.78 x 104 1.61 x 105 87800 161000 -0,26333136
1.99 x 107 6.18 x 106 19900000 6180000 0,507864601
5.14 x 106 2.11 x 106 5140000 2110000 0,386680664
7.20 x 106 2.18 x 106 7200000 2180000 0,518876003
2.12 x 105 1.11 x 105 212000 111000 0,281012882
TL <15
TL TND
TL TND
TL <15
TL TND
TL TND
TL <15Presented at CSF
Simmonds P et al. Consensus Proposals for Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes.HEPATOLOGY2005; 42(4) : 962-973
Presented at CSF
Presented at CSF
Simmonds P et al. Consensus Proposals for Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes.HEPATOLOGY2005; 42(4) : 962-973
Differenza tra genotipi: 31-33%
Differenza tra sottotipi: 20-25%
Ricombinazione
In Russia è stata evidenziato un ricombinante contenente geni strutturali del genotipo 2k e geni non strutturali del genotipo 1b che si sta diffondendo rapidamente tra i tossicodipendenti
Ricombinanti 1a/1b descritti anche in Peru’
• Rilevamento della sequenza genomica completa del ricombinante da 3 o piu’ soggetti
• Ogni nuovo ricombinante deve avere i “breakpoints” nella stessa posizione in ciascuna sequenza
• Deve essere numerato sequenzialmente in ordine di scoperta con le lettere identificanti i sottotipi in ordine alfabetico: RF 01_1b2k
Presented at CSF
Definizione di un nuovo genotipo:
• Definizione provvisoria : richiede la sequenza della regione codificante completa, la dimostrazione della diversità rispetto agli altri genotipi mediante analisi filogenetica e l’assenza di ricombinazione
• Conferma definizione: richiede la sequenza della regione codificante di 2 o piu’ varianti da infezioni che non sono direttamente correlate epidemiologicamente
Presented at CSF
Definizione di un nuovo sottotipo:
• Definizione provvisoria : sequenza delle regioni core/E1 ed NS5B da 3 o piu ceppi provenienti da soggetti diversi
•Conferma definizione: sequenza completa di uno o più genomi
Presented at CSF
Nomenclatura genotipi di HCV: proposta modificaNomenclatura genotipi di HCV: proposta modificaNom. Attuale Nom. Proposta Ceppo Regione sequenziata
Genotipo 2
2j 2k RU169 NS5B,3’UTR
2l 2j BA047 NS5B,3’UTR
2e 2n NL50 C/E1,NS5B
4f/2f 2o FR4 C/E1,NS5B
f 2p NL33 C/E1,NS5B
2k 2q BA045 NS5b,3’UTR
Genotipo 3
10a 3k HPCJK049E1 Genoma completo
Genotipo 4
4a 4r Z4 C/E1
4 alfa 4n 1359 C/E1
4 beta 4o 2153 C/E1,NS5B
Genotipo 6
7d 6c Th846 C/E1,NS5B
7b 6d VN235 Genoma completo
7a 6e VN540 C/E1,NS5B
7e 6f BB7 NS5B
7c 6f Th271 C/E1,NS5B
11a 6g HPCJK046E Genoma completo
9a 6h VN004 Genoma completo
9b 6i Th555 C/E1,NS5B
9c 6j Th553 C/E1,NS5B
8b 6k VN405 Genoma completo
8a 6l VN507 C/E1
Simmonds P. et al. Hepatology, October 2005:962-973
Differenza tra i genotipi a Differenza tra i genotipi a livello livello nucleotidiconucleotidico: :
31% 31% -- 33%33%Differenza tra i sottotipi:Differenza tra i sottotipi:
20% 20% -- 25%25%
Presented at CSF
Nuova classificazione propostaNuova classificazione propostaGenotipo 1Sottotipi:
1a,1b,1c,1d,1e,1f,1g,1h,1i,1j,1k,1l
Genotipo 2Sottotipi:
2a,2b,2c,2d,2e,2f,2g,2h,2i,2j,2k,2l,2m,2n,2o,2p,2q
Genotipo 3Sottotipi:
3a,3b,3c,3d,3e,3f,3g,3h,3i,3k
Genotipo 4Sottotipi:
4a,4b,4c,4d,4e,4f,4g,4h,4i,4j,4k,4l,4m,4n,4o,4p,4q,4r,4t
Genotipo 6Sottotipi:
6a,6b,6c,6d,6e,6f,6g,6h,6i,6j,6k,6l,6m,6n,6o,6p,6q
Genotipo 5Sottotipi:
5a
Simmonds P. et al. Hepatology, October 2005:962-973
Presented at CSF
Regione strutturale Regione non strutturale
ORF (9379-9431 nt)
Precursore della poliproteina
traduzione
Modificazioni co- e post-traduzionali
Signalasi cellulari dell’ospite
Proteinasi NS2-NS3 Zn-dipendentedell’HCV Proteinasi serinica dell’HCV NS3
C
Core
E1
Glicoproteinedell’envelope
E2 p7
Viroporina
NS2
Proteinasi
Zn-dipendente
Proteinasiserina-dipendenteElicasiNTPasi
NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B
3’NC
Ancoraggio alla membrana
Proteina regolatrice dell’RNA polimerasi
RNA polimerasi RNA-dipendente
Cofattore di NS3
5’NC (IRES)
Presented at CSF
Genotipizzazione mediante Ibridizzazione Inversa
Presented at CSF
INNOLIPA HCVPresented at CSF
0
100
200
300
400
500
600
NUM
ERO
GEN
1
GEN
2
GEN
4
1a 1b 2a/2c
2b 3a 4c/4d
5a CO
INF
NO
N TIP
GENOTIPI
FREQUENZA GENOTIPI 2000-2004
GEN 1GEN 1 2222
GEN 2GEN 2 1616
GEN 4GEN 4 1919
1a1a 5757
1b1b 522522
2a/2c2a/2c 332332
2b2b 44
3a3a 176176
4c/4d4c/4d 2121
5a5a 22
COINFCOINF 1313
NON TIPNON TIP 66
Presented at CSF
Richieste ripetute di genotipizzazione (2000-2004):
2x 131
3x 19
4x 7 Media: 17 mesi Range 1-59
5x 1
6x 7
8x 1
Tot. 166=236 test
Il genotipo è risultato sempre lo stessoIl genotipo è risultato sempre lo stesso
Presented at CSF
Genotipizzazione mediante sequenziamento
Presented at CSF
Cy5.5
Cy5
Core
5’NC5’NC
EnvelopeGlicoproteine
RNAPolimerasi
3’NC
La regione sequenziata dell’HCV-RNA è la 5’ NC ( 186 basi )
TRUGENETM HCV 5’NC KIT
C NS2E2 NS3E1 NS4 NS5A NS5B
ProteasiElicasi
Metalloproteasi
Viral RNA (9400 nucleotides)Viral RNA (9400 nucleotides)
HCV-RNA Virale (9400 nucleotidi)
Presented at CSF
Presented at CSF
GT
CA
Micro
Cel™
Cas
sett
e
G
T
Laser
Filters
Excitation
of Cyanine DyesPhotomultiplier
Tubes
B. C
hanz
y, C
H A
nnec
y, 2
000
Presented at CSF
ImageLenses
ObjectLenses
Filters
Laser
Gel
PhotodetectorCy5.5Photo
detectorCy5
ImageLenses
OpenGeneOpenGene™ ™ SystemSystem OpticalOptical ArrayArray
Cy5.5
Presented at CSF
ImageLenses
ObjectLenses
Filters
Laser
Gel
PhotodetectorCy5.5Photo
detectorCy5
ImageLenses
OpenGeneOpenGene™ ™ SystemSystem OpticalOptical ArrayArray
Cy5
Presented at CSF
Correlazione con un cromatogramma
N
N
Presented at CSF
Allineamento e Chiamata delle BasiA C G T
Presented at CSF
Presented at CSF
Presented at CSF
Presented at CSF
Campioni Reattività InnoLipa
Genotipo Sequenziamento
CQ NeQas7531 3,4,6 1b 1b
HCV 05-01 NeQas 3,4,6,13,14,15 1b + 3a 1b
HCV 05-02 NeQas 13,14,15 3a 3a
HCV 05-03 NeQas 13,14,15 3a 3a
HCV 05-04 NeQas 3,4,6 1b 1b
HCV 05-05 NeQas 6,19,20 5a 5a
HCV 05-07 NeQas 6,13,14,15 3a+5a 3a+5a
HCV 05-08 NeQas 3,4,5 1a 1a
Presented at CSF
CONFRONTO InnoLipa-Sequenziamento su 90 90 campioni
Per 82 (91,1%)82 (91,1%) i genotipi sono risultati concordanti
5 (5,6%)5 (5,6%) campioni non tipizzabili con il test InnoLipasono stati tipizzati mediante sequenziamento
In 3 (3,3%)3 (3,3%) casi il test InnoLipa ha evidenziato la presenza di coinfezione mentre il sequenziamento ha rilevato un genotipo unico
Presented at CSF
1 1a 1b 2 2a 2b 2c 3a 4 4a 4c
1 1 3 3
1a 4
1b 4 19
2 4 1
2a/2c 1 16 1
2b 1
3a 15
4 3 1 1
4c/4d 1 3
SEQUENZIAMENTOSEQUENZIAMENTOIn
noLipa
Presented at CSF
Risultati ottenuti mediante sequenziamento di una porzione della regione 5’UTR di ceppi provenienti
da soggetti con doppia infezione con il test InnoLipa
2b + 3a 3a
1b + gen 4 gen 1
2a/2c + 4c 2a
SequenziamentoIn
noLipa
Presented at CSF
Pattern di reattività con il test di ibridizzazione inversa
Sequenziamento
6 6 1b1b
3,6,93,6,9 1b1b
6,9,10,116,9,10,11 2a2a
6,9,10,116,9,10,11 2a2a
5,6,16,17,185,6,16,17,18 GenGen 44
Risultati ottenuti mediante sequenziamento di una porzione della regione 5’UTR di ceppi con
reattività non interpretabili secondo il test InnoLipa
Presented at CSF
Zhang W. et al Mol. Diagn. 2005;9(2):81-7
Test di screening e conferma : Preparazione e valutazione di un chip per rilevare simultaneamente anticorpi anti-HCV diversi (anti-core, NS3,NS4 ed NS5): evidenziate sensibilità e specificità elevate maggiori del test ELISA ed elevata concordanza con il RIBA
Evoluzione………..Evoluzione………..
Presented at CSF
Genotipizzazione:• Sequenziamento contemporaneo di altre regioni
Laperche S. et al J Clin Microbiol 2005;43(2): 733-739
• TaqMan Real-TimeRolfe K.J. et al J Clin Virol 2005;34:115-121
Evoluzione………..Evoluzione………..
• Pyrosequencing
Elahi E. et al J Virol Meth 2003;109: 171-176
• Spettrometria di massaKim YJ et al Clin Chem 2005;51:1123-1131Cook L. et al Clin Chem 2005;51.1091-1092
Presented at CSF