KONTROLA KVALITETE KRVNIH PRIPRAVAKA NA
PRIMJERU TROMBOCITNIH KONCENTRATA -
PROPISI I SMJERNICE
Prim.dr.sc. Tomislav Vuk
Hrvatski zavod za transfuzijsku medicinu
Zagreb
Zagreb, 2017
TRANSFUZIJSKO LIJEČENJE
• nezamijenjivi oblik liječenja za brojne bolesnike
• zahtjevi:
- dostupno
- pravovremeno
- kvalitetno
- sigurno
KRVNI PRIPRAVCI
• biološko porijeklo krvnih pripravaka (KP)
• ograničene zalihe
• vrijednost nadilazi pravila ekonomske struke
• nacionalni resurs
• odgovorno, racionalno i stručno upravljanje
• odgovornost svih sudionika u procesu (koncept “od vene do
vene”)
PROIZVODNJA KRVNIH PRIPRAVAKA
• biološka raznolikost početnog materijala
• kvaliteta gotovog proizvoda ovisi o brojnim faktorima
povezanim s uzimanjem, proizvodnjom i skladištenjem krvi/KP
- odabir vene i brzina protoka
- miješanje krvi s antikoagulantnom otopinom
- trajanje donacije
- volumen prikupljene krvi
- uvjeti transporta
- način proizvodnje
- uvjeti skladištenja (temperatura, trajanje, sadržaj i vrsta
hranjive otopine, itd...)
KVALITETA KRVNIH PRIPRAVAKA
PROIZVODNJA
OSIGURANJE KVALITETE KP
PRIKUPLJANJE
SKLADIŠTENJE
TESTIRANJE TRANSPORT
RUKOVANJE
PRIMJENA
KONTROLA KVALITETE KRVNIH
PRIPRAVAKA
• svaka doza krvi je zasebna serija
• stabilnost, učinkovitost, količina aktivne tvari i sterilnost ne
mogu biti ispitane u svakom KP
• statističko praćenje različitih parametara za procjenu ukupne
kvalitete
KONTROLA KVALITETE KRVNIH
PRIPRAVAKA
KRITIČNI
PARAMETRI
PRIHVATLJIVE
GRANICEMJERENJE/ANALIZA
OCJENA
KVALITETE
Sukladna zakonskim propisima, standardima i smjernicama
KONCENTRATI TROMBOCITA
• prevencija i liječenje krvarenja u
bolesnika s nasljednom ili stečenom
trombocitopenijom i/ili
trombocitopatijom
• mogu biti dobiveni iz donacije pune
krvi ili postupkom afereze
• iz pune krvi izdvajaju se na dva
načina:
- PRP (engl. platelet rich plasma)
metodom
- „buffy-coat“ (sloj leukocita i
trombocita) metodom
KONCENTRATI TROMBOCITA
• uobičajeno se 4-6 pojedinačnih doza iz pune krvi spaja
(pulira) kako bi se osigurala terapijska doza za odraslog
pacijenta
• trombociti dobiveni „buffy-coat“ metodom ili postupkom
afereze mogu biti suspendirani u plazmi ili mješavini plazme i
hranjive otopine
HZTM - od svibnja 2016. god.(omjer 30% plazme i 70%hranjive otopine)
KONCENTRATI TROMBOCITA
Učinkovitost transfuzije koncentrata trombocita ovisi o:
• broju trombocita
• trombocitnoj funkciji
• vijabilnosti trombocita
KONCENTRATI TROMBOCITA
• skladište se na temperaturi od 20-24 0C u vrećicama koje su
propusnije za kisik i ugljični dioksid, uz stalno miješanje
(trombocitni agitatori)
• rok valjanosti standardnih KT:
- uobičajeno 5 dana
- do 7 dana uz primjenu metoda redukcije patogena ili
univerzalnog bakterijskog screeninga te uz
odgovarajuće uvjete skladištenja
• KT prije skladištenja mogu biti podvrgnuti nekoj od validiranih
metoda redukcije patogena
• ovisno o indikaciji, KT mogu biti oprani fiziološkom otopinom
radi uklanjanja plazme (rok valjanosti se skraćuje na 6 sati)
KONCENTRATI TROMBOCITA
• u prevenciji TA-GVHD (Transfusion Associated Graft-Versus-
Host-Disease) primjenjuju se ozračeni KT.
• pojedine tehnike redukcije patogena predstavljaju adekvatnu
alternativu zračenju (inaktivacija T-stanica)
• redukcija volumena KT - kada treba smanjiti volumno
opterećenje kod transfundiranog pacijenta
- centrifugiranjem se koncentriraju trombociti, a odstranjuje
dio supernatanta
- kada se radi o supernatantnoj plazmi, redukcija volumena
može prevenirati reakcije uzrokovane plazmom
- rok valjanosti trombocita u smanjenom volumenu je 6 sati
PARAMETRI KONTROLE KVALITETE I
UČESTALOST TESTIRANJA
• zakonski propisi / stručni standardi
• Pravilnik o posebnim tehničkim zahtjevima za krv i krvne
pripravke - NN 80/2007
• Direktiva 2004/33/EC
• Preporuke Vijeća Europe (EDQM) – detaljniji zahtjevi,
redovita revizija
• parametri – adekvatni za procjenu kvalitete proizvodnog
procesa i stabilnosti proizvoda tijekom skladištenja
UČESTALOST TESTIRANJA
• uobičajeno se testira 1% mjesečne proizvodnje ili 4 do 10
doza određenog pripravka mjesečno, a rijetko 100%-tna
proizvodnja
• statistička procesna kontrola bazirana na matematičkim
modelima
• u transfuzijskim ustanovama koje imaju veliku proizvodnju i
različite tehnologije proizvodnje, broj testiranih pripravaka
mora biti veći od statističkog minimuma da bi se uočila
moguća odstupanja od zadanih specifikacija
• rijetki proizvodi – kontrola svih doza
• promjene u proizvodnom procesu – kontrola izmjena,
validacija, pojačani nadzor u kontroli kvalitete
PLANIRANJE KONTROLE KVALITETE
• kontinuirano praćenje procesa
• mjesečni, tjedni i dnevni planovi
• plan obuhvaća sve vrste pripravaka koji se proizvode u
transfuzijskoj ustanovi
• Plan = opseg proizvodnje + frekvencija testiranja
• revizija planova u određenim intervalima
• cijeli proizvodni proces treba biti pod nadzorom (različite
tehnike priprave, oprema...)
UZORKOVANJE KRVNIH PRIPRAVAKA
ZA KONTROLU KVALITETE
1. uzorak u plastičnoj cjevčici
2. uzorak uzet u sterilno navarenu transfer vrećicu
3. cijela doza (destruktivna metoda)
UZORKOVANJE KRVNIH PRIPRAVAKA
ZA KONTROLU KVALITETE
Vrijeme uzorkovanja
Hematološki parametri – ubrzo nakon proizvodnje
Stabilnost - na isteku roka valjanosti (pH u KT)
Uzorkovani krvni pripravak treba ostati u karanteni (“zaključan” u kompjuterskom sustavu) do kraja testiranja i odluke o
daljnjem postupanju u slučaju kad rezultati odstupaju od specificiranih zahtjeva.
UZORKOVANJE KRVNIH PRIPRAVAKA
ZA KONTROLU KVALITETE
Uzorak:
• reprezentativan sadržaj (homogenizacija sadržaja)
• identifikacija i sljedljivost
• očuvanje integriteta/kvalitete krvnog pripravka
- više ispitivanja iz jednog uzorka
- zatvoreni sustav uzorkovanja
• adekvatan volumen
• validirane metode
METODE ISPITIVANJA KONCENTRATA
TROMBOCITA
• određivanje volumena
• određivanje sadržaja trombocita
• određivanje sadržaja leukocita
• određivanje sadržaja proteina u opranim koncentratima
trombocita
• određivanje pH u koncentratima trombocita na isteku roka
valjanosti
• mikrobiološka kontrola
METODE TESTIRANJA
• validirane
• detaljno opisane u radnim uputama
• analizatori i reagensi – primjena u skladu s uputama
proizvođača
• dnevna kontrola kvalitete rada u laboratoriju
• sudjelovanje u vanjskoj kontroli kvalitete
Usluge vanjskih, po mogućnosti akreditiranih laboratorija,
mogu se koristiti za određena testiranja
OPREMA
Minimalni zahtjevi u kontroli kvalitete KT:
• precizna vaga
• hematološki analizator
• biokemijski analizator
• mikroskop ili druga alternativna metoda za određivanje
ostatnih leukocita
• pH-metar
• sustav za detekciju bakterija
ODREĐIVANJE VOLUMENA
• precizna vaga
masa krvnog pripravka (g) – masa vrećice (g)
specifična težina (g/mL)
volumen (mL) =
1,03 g/mL – trombociti u plazmi
1.015 g/mL – trombociti u hranjivoj otopini
volumen pripravka (ukupni)
trombociti u koncentratu (1010) / 6 x 1010
Zahtjev volumena za KT: >40 mL/ 6 x 1010 Tr
Formula:
ODREĐIVANJE HEMATOLOŠKIH
PARAMETARA - TROMBOCITI
• hematološki analizator
• specifični uzorak
• validacija mjerenja
• rasponi linearnog mjerenja
• mogućnost mjerenja visokog broja trombocita
• uzorkovanje min. 2 sata nakon priprave (stabilizacija i dezagregacija trombocita)
↑ gornje granice ↓ donje granice
razrijeđivanje druge metode
ODREĐIVANJE HEMATOLOŠKIH
PARAMETARA - LEUKOCITI
• hematološki analizator – nefiltrirani pripravci
• filtrirani pripravci – alternativna metoda određivanja ostatnih leukocita
- metode protočne citometrije
- mikroskopiranje u komoricama velikog volumena (Nageotte)
- ADAM rWBC
ODREĐIVANJE UKUPNIH PROTEINA
• koncentrati opranih trombocita
• koriste se u liječenju bolesnika s anafilaktičkim ili teškim
alergijskim reakcijama na standardne KT
• zahtjev: < 0,5 g/dozi
• visoko osjetljive metode
• metode određivanja proteina u urinu i likvoru
ODREĐIVANJE pH U KONCENTRATIMA
TROMBOCITA
• na isteku roka valjanosti
• procjena ukupne kvalitete proizvoda i uvjeta skladištenja
• mjerenje po mogućnosti u zatvorenom sustavu
• zahtjev kvalitete: pH na 22 0C
• u slučaju mjerenja na 37C potrebno je koristiti korekcijski
faktor za izražavanje vrijednosti pH na 22 0C.
TESTIRANJE NA PRISUTNOST
BAKTERIJA
BAKTERIJSKA KONTAMINACIJA
• najčešći mikrobiološki uzrok transfuzijom uzrokovanog
morbiditeta i mortaliteta!!!
Mogući uzroci:
• kontaminacija kože na mjestu venepunkcije
• asimptomatska bakterijemija u davatelja
• loši varovi
• materijali koji se koriste tijekom uzimanja krvi
TESTIRANJE NA PRISUTNOST
BAKTERIJA
• značajno se razlikuje od testiranja na virusne markere
• početna koncentracija bakterija u kontaminiranom krvnom
pripravku je obično vrlo niska
• različite bakterije pokazuju različitu dinamiku razmnožavanja
• vrlo visoka osjetljivost = porast lažno pozitivnih rezultata
• kontaminacija uzorka:
- prilikom uzorkovanja
- u laboratorijskom radu
• ograničavajući faktori kod ispitivanja KP:
- volumen uzorka za testiranje
- vrijeme
TESTIRANJE NA PRISUTNOST
BAKTERIJA
• metode kultivacije
• lančana reakcija polimeraze (PCR)
• imunofluorescentni testovi (IFA)
• enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
• elektrostatička detekcija
• bojanje po Gramu
• Surogatne metode (pad pH ili glukoze i gubitak „swirling”
fenomena)
Oprez: kod vizualno promijenjenog sadržaja pripravka treba
posumnjati na mogućnost kontaminacije!
TESTIRANJE NA PRISUTNOST
BAKTERIJA
METODE KULTIVACIJE
• BacT/Alert sustav (bioMerieux)
• enhanced Bacterial Detection System (eBDS; Pall
Corporation)
• Scansystem (Hemosystem, Marseilles, France)
TESTIRANJE NA PRISUTNOST
BAKTERIJA
Univerzalni
screening
statistička
procesna
kontrola
• klinički značaj • nema većeg kliničkog značaja
• indikator sposobnosti procesa
da zadovolji zahtjeve
mikrobiološke čistoće
Koncentrati
trombocita
ZAHTJEVI KVALITETE - TROMBOCITI
Učinkovitost trombocitnih transfuzija ovisi o:
• broju i funkciji trombocita u KT
• sposobnosti njihovog preživljavanja
Broj trombocita u dozi KT ovisi o :
• broju trombocita u krvi davatelja
• volumenu darovane krvi
• gubitku trombocita uzrokovanom aktivacijom sustava
zgrušavanja tijekom uzimanja krvi
• gubitku trombocita uzrokovanom proizvodnjom,
skladištenjem, rukovanjem i transportom
ZAHTJEVI KVALITETE - TROMBOCITI
• sadržaj trombocita u standardnim KT (pool i afereza) mora
sukladno Preporukama EDQM biti najmanje 2,0 x 1011
• iako je u HZTM zahtjev da broj trombocita bude veći od 5,5 x
1010 po ekvivalentu jedne doze (>2,2 x 1011 u pool-u 4 doze),
prosječno se ostvaruju vrijednosti oko 7,5 x 1010 po jednoj
dozi u pool-u
• za liječenje neonatusa i male djece – pedijatrijske doze
manjeg sadržaja trombocita (iz produkata dobivenih
aferezom)
ZAHTJEVI KVALITETE - LEUKOCITI
• Leukociti u krvnim pripravcima jedan su od glavnih medijatora
nastanka različitih reakcija na transfuzijsko liječenje
• nepovoljno utječu i na uvjete skladištenja krvnih pripravaka
• odstranjivanje leukocita visoko učinkovitim leukofiltrima za KP
ima povoljan učinak na njihovu kvalitetu i sigurnost
transfuzijskog liječenja
• sukladno Preporukama EDQM, broj leukocita u jednoj dozi KT
iz pune krvi mora biti manji od:
0,2 x 109 kada se KT dobiva iz PRP-a
0,05 x 109 kada je proizveden iz «buffy coat-a»
ZAHTJEVI KVALITETE - LEUKOCITI
• u poolovima KT ukupni sadržaj leukocita mora biti manji od:
1 x 109 u nefiltriranim pripravcima
1 x 106 u filtriranim pripravcima
• u filtriranom KT dobivenom aferezom ukupni sadržaj leukocita
mora biti manji od 1 x 106
• sadržaj leukocita koji udovoljava zahtjevu za filtrirane KT
moguće je postići i primjenom nekih aparata za aferezu i bez
filtracije
• u nefiltriranim KT dobivenim aferezom (suspendirani u plazmi
ili u hranjivoj otopini) te nefiltriranim pool-ovima KT u hranjivoj
otopini broj leukocita mora biti manji od 0,3 x 109
ZAHTJEVI KVALITETE (pH)
pH u koncentratima trombocita ovisi o :
• koncentraciji trombocita
• temperaturi skladištenja
• površini vrećice i njezinoj propusnosti za plinove
• tipu agitacije
• sadržaju leukocita u pripravku
• sniženje pH tijekom skladištenja KT rezultat je nakupljanja
laktata, produkta anaerobnog metabolizma leukocita i
trombocita
• sniženi pH rezultira gubitkom trombocitne funkcije i
smanjenjem njihove vijabilnosti
• KT u kojima je provedena leukofiltracija prije skladištenja
imaju viši pH i pO2 te niži pCO2 u usporedbi s KT skladištenim
bez prethodne leukofiltracije
ZAHTJEVI KVALITETE - VOLUMEN
• volumen plazme ili hranjive otopine u kojoj su trombociti
suspendirani utječe na pH, metabolizam trombocita i
produkciju laktata
• u kontroli kvalitete potrebno je kontrolirati volumen koji mora
biti veći od 40 ml na svakih 6 x 1010 trombocita, kako bi pH
tijekom skladištenja ostao iznad 6,4
„SWIRLING” FENOMEN
• određivanje fenomena „swirlinga” (vizualni aspekt oblačića u
KT kada se gleda prema svjetlu) može biti postupak kontrole
kvalitete, ali i rutinska pretraga prije izdavanja KT
• gubitak „swirling” fenomena tumači se gubitkom diskoidnog
oblika trombocita, a time i njihove funkcionalnosti
• „swirling” fenomen dobro korelira s pH u KT
• prema rezultatima multicentričnog ispitivanja, 69% KT bez
„swirlinga” imalo je pH manji od 6,4 ili veći od 7,6
Bartolini F, Murphy S. A multicenter inspection of the swirling phenomenon in platelet
concentrates prepared in routine practice. Biomedical Excellence for Safer Transfusion (BEST) Working Party of the International Society of Blood Transfusion. Transfusion 1996;36:128-32.
ZAHTJEVI KVALITETE (STANDARDI)
OPRANI KT
• oprani koncentrati trombocita pripravljaju se postupkom
pranja trombocita, uobičajeno fiziološkom otopinom
• cilj je smanjiti sadržaj proteina na manje od 0,5 g/pripravku,
uz gubitak trombocita do maksimalno 20%
KT U SMANJENOM VOLUMENU
• KT u smanjenom volumenu pripremaju se centrifugiranjem KT
i odvajanjem većeg dijela supernatanta
• trombociti ostaju suspendirani u 10-20 ml po ekvivalentu
jedne doze u pool-u
ZAHTJEVI KVALITETE (STANDARDI)
• zakonske odredbe
• stručni standardi
100% 90% 75%
sterilitet broj leukocita broj trombocita
UPRAVLJANJE
NESUKLADNIM
REZULTATIMA QC
Nesukladan
nalaz kontrole
kvalitete
Povećani opseg
kontrole kvalitete
Slučajna varijacija
u procesuSustavna greška
Analiza korjenskog
uzroka
Korektivne
radnje
Narušena stabilnost i pouzdanost procesa =
100%-tna kontrola
Kada se izolira i ukloni uzrok nesukladnosti –
privremeno pojačani nadzor za potvrdu
učinkovitosti
STATISTIČKA ANALIZA
• rezultat kontrole kvalitete krvnog pripravka kao izračunska
vrijednost mora biti sljedljiv do originalnog rezultata mjerenja
• prikladne statističke metode za određeni proces
- deskriptivna statistika
- distribucijski grafovi
- kontrolne karte
STATISTIČKA ANALIZA
Parametri VolumenTrombo-citi
1. dan
Trombo-citi
5. danLeukociti pH
Sterili-
tet
Zahtjevi>40 mL/
6x1010 tr.
>5,5x1010/
1 dozi
>5,5x1010/
1 dozi
<0,2x106/
1 dozi>6,4 neg
broj test. doza 695 695 124 128 228 304
% zadovoljava 99,86 98,42 98,39 100,00 100,00 99,67
srednja vrijed. 62 7,45 7,08 0,016 7,36
St. dev. 9 0,99 0,94 0,017 0,14
min. 35 4,60 3,89 0,001 6,90
max. 99 11,17 10,21 0,081 7,66
median 61 7,45 7,01 0,011 7,32
< od standarda 1 11 2 - 0
> od standarda - - - 0 -
% pouzdanosti/
% zadov.stand.
99/95 99/85 99/85 95/99 99/95 99,5/
99,8
Tablica: Rezultati kontrole kvalitete Koncentrata trombocita sa
smanjenim brojem leukocita pool 4 doze iz sloja leukocita i trombocita –
HZTM 2016. godina
STATISTIČKA ANALIZA
Grafikon: Histogram za broj trombocita u Koncentratima trombocita sa
smanjenim brojem leukocita pool 4 doze iz sloja leukocita i trombocita –
HZTM 2016. godina
0 4 7 34 67119 127
337
0
50
100
150
200
250
300
350
400
do 4,5 4,5 do 5 5 do 5,5 5,6 do 6 6,0 do6,5
6,5 do7,0
7 do 7,5 7,5 i više
fre
kve
ncij
a (N
)
trombociti 1. dan (Nx10e10/d)
KONTROLA KVALITETE KONCENTRATA TROMBOCITA-SBL/POOL BC
STATISTIČKA
ANALIZA
Kontrolna karta: - s
Mjerna jedinica: Gornja kontrolna granica GKG 8,12
Od: 5,5 Do: Srednja vrijednost Sred. vr. 7,52
očekivani maksimalni raspon = Donja kontrolna granica DKG 6,92
Donja granica standarda DG (stand.) 5,50
Gornja kritična granica (s) GKG (s) 1,38
Srednja vrijednost (s) Sred. vr. (s) 0,96
Donja kritična granica (s) DKG (s) 0,54
Grafički prikaz rezultata mjerenja:
n * E10/dozi
Koncentrat tombocita sa smanjenim brojem leukocita dobiven iz sloja leukocita i trombocita - pool 4 doze
Standardne vrijednosti: Rezultati
Raspon: Srednja vrijednost
Pripravak:
Parametar:
Period:
Broj trombocita prvog dana skladištenja
2017 - mjesečno
x
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
n *
E1
0/d
oz
i
GKG Sred. vr. Broj trombocita prvog dana skladištenja DKG DG (stand.)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
s
mjeseciGKG (s) Sred. vr. (s) s DKG (s)
Grafikon. Primjer x-σ
kontrolne karte za praćenje
broja trombocita u KT sa
smanjenim brojem
leukocita pool 4 doze iz
sloja leukocita i trombocita
Kontrolna karta: - R
jedinica mjere: Gornja kontrolna granica GKG 8,18
od: 5,5 do: Srednja vrijednost Sred. Vr. 7,35
očekivani maksimalni raspon Donja kontrolna granica DKG 6,51
Donja granica standarda DG (stand.) 5,50
Gornja kritična granica raspona GKG (R) 2,61
Srednja vrijednost raspona Sred. Vr. (R) 1,15
Grafički prikaz rezultata mjerenja:
Period:
Pripravak:
Parametar:
raspon
Koncentrat tombocita sa smanjenim brojem leukocita dobiven iz sloja leukocita i trombocita - pool 4 doze
Broj trombocita prvog dana skladištenja
lipanj 2017.
n * E10/dozi
Vrijednosti prema standardu
srednja vrijednost
Rezultati
x
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
8,50
9,00
9,50
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
sre
dn
ja v
rije
dn
os
t
GKG Sred. Vr. Broj trombocita prvog dana skladištenja DGK DG (stand.)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
ras
po
n
Radni daniGKG (R) Sred. Vr. (R) R
STATISTIČKA
ANALIZA
Grafikon: Primjer x-R
kontrolne karte za
praćenje broja trombocita
u KT sa smanjenim
brojem leukocita pool 4
doze iz sloja leukocita i trombocita
PRAĆENJE REZULTATA I KOREKTIVNE
MJERE
• ciljevi kontrole kvalitete KP:
- postizanje i održavanje kvalitete KP na visokom nivou
- zadovoljenje zahtjeva/potreba/očekivanja korisnika
- učinkovito i sigurno transfuzijsko liječenje
• rezultati kontrole kvalitete trebaju biti kontinuirano nadzirani i
evaluirani
• u slučaju odstupanja – pravovremena analiza korijenskih
uzroka i provedba odgovarajućih korektivnih mjera
• o svim navedenim aktivnostima potrebno je održavati zapise i
izvještavati odgovorne osobe u transfuzijskoj ustanovi
ZAKLJUČAK
• važnost kontinuiranog praćenja kvalitete KP
• specificirani zahtjevi regulirani zakonima, EU Direktivama i Preporukama Vijeća Europe (EDQM)
• osiguranje kvalitete svakog segmenta u lancu od uzimanja krvi do izdavanja KP
• korektivne mjere u slučaju odstupanja
• unapređenje kvalitete
• dobrobit pacijenata
HVALA!