Download - Klorofilase (Siti Nur Avida) New
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
1/15
ENZIM KLOROFILASE
(Chlorophyllase)
Mata Kuliah Teknologi Enzim
(Revisi)
Oleh :Siti Nur Avida (11!1"11)
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2015
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
2/15
I. PENDAHULUAN
1.1 Enzim Klorofilas
Enzim merupakan suatu protein yang berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia.
Enzim memegang peranan dalam berbagai kehidupan baik dibidang laboratorium
atau bidang industri. Perkembangan enzim sebanding dengan adanya perkembangan
teknologi enzim. Mata kuliah teknologi enzim mempelari tentang enzim dan
pengaplikasiannya sebagai dasar pengembangan pemanfaatan enzim.
Enzim berfungsi sebagai katalisator yang mampu mengkatalisis suatu reaksi,
sehingga proses reaksi berlangsung lebih cepat. Hal ini karena setiap enzim memilikidaya katalitik yang tinggi yang digambarkan melalui aktivitasnya dan dapat
menurunkan energi aktivasi selama proses reaksi. Aktifitas enzim dipengaruhi
beberapa faktor antara lain, pH, suhu, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, dan
inhibitor (ehninger, !"#$%.&alah satu enzim yang memiliki manfaat penting dalam kehidupan adalah
enzim klorofilase. Enzim klorofilase berperan dalam metabolisme daun yaitu proses
fotosintesis. &elain itu, enzim klorofilase digunakan pada industri minyak yaitu
sebagai agen bleaching pada minyak sayur dengan cara menghilangkan senya'a
klorofilnya (hamessan, dkk., !")*%.Enzim lorofilase ditemukan pertama kali oleh +ilstater dan &toll pada tahun
!"!. lorofilase merupakan salah satu enzim yang berperan penting dalam
metabolisme dalam daun. lorofilase dapat ditemukan dalam membrane tilakoid
kloroplas dan etioplas pada tanaman tinggi, lumut, dan ganggang. Peran klorofilase
dalam mendegradasi klorofil dapat dilihat saat ter-adi perubahan 'arna hi-au men-adi
'arna kuning atau coklat, hal ini ter-adi pada perubahan 'arna buah, bunga, daun.
Hal ini ter-adi karena enzim klorofilase dapat hidrolisis klorofil menghasilkan
klorofilade dan fitol. &elain itu -uga berperan dalam reaksi hidrolisis karboksilat ester.
Enzim klorofilasi beker-a pada kondisi optimal yaitu pH #, dan suhu /. Paper ini#
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
3/15
men-elaskan tentang klasifikasi, struktur, mekanisme, isolasi, purifikasi dan
karakterisasi, dan bioinformatika enzim klorofilase.
II. PEM!AHASAN
".1 #a$a Nama
Enzim klorofilase memiliki nomor pengklafisian secara internasional yaituEC
Number0.!.!.!1 dengan nama Chlorophyllase, selain itu disebut Chlase, Chlorophyll
chlorophyllido-hydrolyase, dan Chlorophyll-chlorophyllidohydrolase. &ecara
klasifikasi, enzim klorofilase memiliki nomer E/ 0.!.!.!1 . E/ 0. artinya masuk
dalam klas hidrolase. E/ 0.!. artinya memotong ikatan ester. E/ 0.!.! artinya mampu
menghidrolisis ikatan karboksilat ester. E/ 0.!.!.!1 artinya spesifik enzim
klorofilase. Enzim ini temasuk dalam kelas hidrolase yaitu enzim yang menkatalisis
reaksi enzimatis dengan melibatkan H$2.
3ambar !. lasifikasi enzim klorofilase
"." Sr%&$%r 'an M&anism Ra&si
&truktur 04 enzim klorofilase masih belum teridentifikasi, hal ini di-elaskan
dalam beberapa -urnal dan P45 sum -uga belum menampilkan struktur enzim
tersebut. 6amun, menurut secara struktur $4 diidentifikasi bah'a struktur enzim
klorofilase memiliki tiga residu katalitik yaitu serin !1, histidin $*$, dan aspartame
!)$. 6omer pada residu katalitik tersebut sebagai posisi urutan asam aminonya
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
4/15
.
3ambar $. &truktur $4 enzim klorofilase
Enzim klorofilase memiliki substrat yang spesifik yaitu klorofil. lorofil ada
dua macam yaitu klorofil a dan klorofil b. 6amun pada pepar ini hanya fokus pada
klorofil a sa-a. Perbedaan antara klorofil a dan b hanya pada rantai pengikatnya
klorofil a mengikat /H0 sedangkan klorofil b mengikat /H2. 7eaksi kimia yang
ter-adi adalah sebagai berikut8
3ambar 0.7eaksi enzim klorofilase
Enzim klorofilase menghidrolisis klorofil menghasilkan klorofilade dan fitol
dengan bantuan H$2. Enzim klorofilase memiliki tiga residu katalitik serin, histidin
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
5/15
dan aspartam. &erin memiliki gugus 2H berfungsi sebagai nukleofil, namun serin
tersebut distabilkan oleh histidin. arena histitin memiliki dua electron bebas pada 6,
sehingga dapat mengikat H pada serin. &erin menyerang gugus ester pada rantai /,
sehingga ikatan 2 karbonil putus dan 2 memiliki elektron berlebih. 9erbentuk
kompleks enzim:substrat dan filol lepas dan terbentuk 2 ikatan rangkap kembali.
Produk fitol telah terbentuk, sehingga stuktur enzim klorofilase men-adi berubah.
H$2 memiliki nukleofil yaitu H2:akan menyrang / karbonil sehingga akan terbentuk
gugus alkohol. 7esonansi ter-adi untuk membentuk kestabilan sehingga gugus serin
terlepas dan terbentuk klorofilade. Enzim klorofilase terbentuk kembali sehingga
dapat mengikat substrat yang lain hingga dihasilkan produk dan seterusnya.
Mekanisme reaksi katalitik ter-adi secara asam basa. 5erikut mekanisme reaksi
katalitik enzimatik yang ter-adi8
3ambar 1. Mekanisme katalisis klorofilase
". Isolasi 'an Pm%rnian nzim &lorofilas
Enzim klorofilase dapat diisolasi dari beberapa organisme seperti tumbuhan
tingkat tinggi, lumut dan ganggang. 5eberapa penelitian telah berhasil mengisolasi
enzim klorofilase dari berbagai organisme antara lain8 Triticum aestivum ('heat%,
Phaseolus vulgaris, Phaeodactylum tricornutum, Capsicum annuum, Olea europaea,
Chenopodium album, dan Arabidopsis thaliana. Paper ini dibahas tentang enzim
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
6/15
klorofilase yang diisolasi dari daun tanaman ceri dengan bebepapa spesies, yaitu8
5ird cherry (Prunus padus.%, European plum (Prunus domestica.% dan &our cherry
(Prunus cerasus.%.
Proses isolasi melalui beberapa tahap yaitu ekstrasi enzim, pemurnian enzim
(homogenasi, fraksinasi ammonium sulfat, dialisis dan filtrasi gel%, dan karakterisasi .
: Ekstrasi enzim
&ebanyak 0 gram daun dalam 1 ml aseton dingin (#;% dihomogenkan
pada suhu 1< / selama menit. /ampuran disaring dan disentrifugasi
dengan kecepatan g selama ! menit. &upernatan digunakan sebagai klorofilase
a. Pelat dilarutkan dalam buffer kalium fosfat mM pH ) ( mM /l dan ,$1 ;
9riton =:!%. /ampuran disentrufugasi dengan kecepatan !$ g selama ! menit.
&epernatan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim klorofilase.
: >raksinasi Amonium sulfat
&ebanyak 0,1 g amonium sulfat ditambahkan dalam ! ml crude enzim
(ke-enuhan 0;% disentrifugasi dengan kecepatan ! g selama $ menit,
supernatan dibuang dan pelatnya dilarutkan dengan buffer dan ditambahkan amonium
sulfat hingga fraksi *;.
: 4ialisisPelat hasil fraksinasi dilarutkan dalam buffer dan di dialisis selama $1 -am pada
suhu 1ilrasi gel
&ebanyak ! ml destilat dimasukkan dalam kolom glass ($ ? 1 cm% dengan
&ephade? 3:$ dan disetimbangkan dengan buffer pH ). Enzim di elusi bersama
buffer dengan kecepatan ,0 ml@menit. adar protein diukur dengan spektrometri
pada pan-ang gelombang $# dan $* nm. Massa molekul ditentukan berdasarkan
kurva standar av vs. og Mr dibandingkan dengan protein standar sitokrom c (!$.0
k4a%, tripsin ($0.# k4a%, ovalbumin (1. k4a%, bovine serum albumin (**.
k4a%, and miosin ($. k4a% (&ytykie'icz et al., $#%.
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
7/15
: Aktivitas klorofilase dan penentuan konsentrasi substrat&ebanyak ,0 ml ekstrak enzim ditambah ,! ml substrat dalam aseton dan !
ml buffer natrium fosfat mM pH ). 4iinkubasi dalan ruang gelap selama 0 menit
dengan suhu 0< /. 7eaksi dihentikan dengan menambahkan $ ml aseton
dingin dan $ ml n heksana. /ampuran di vortek dan disentrifugasi $ menit dengan
kecepatan !$ g. Aktifitas diukur pada pan-ang gelombang *11, **$, dan ) nm
(spektrometer B:Bis He'lett:Packrd model #10%. apisan atas mengandung
klorofil a dan ditentukan konsentrasinya menggunakan rumus berikut 8
5erdasarkan proses pemurnian enzim klorofilase dengan beberapa tahapan,
diperoleh hasil pemurnian sebagai berikut8
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
8/15
9iga macam tamanan ceri diatas menun-ukkan tingkat kemurnian yang berbeda.
4ilihat dari proses pemurniannya, tahap homogenasi memiliki nilai kadar protein
yang besar dibandingkan tahap selan-utnya. Hal ini ter-adi karena pada tahap
homogenasi masih banyak pengotor enzim klorofilase dan enzim yang terekstrak
masih sedikit. Aktifitas dari ekstrak tersebut memiliki aktivitas yang lebih kecil, hal
ini menun-ukkan bah'a enzim tersebut masih belum murni dan memiliki tingkat
kemurnian ! kali. 9ingkat kemurnian enzim klorofilase sebanding dengan semakin
banyak proses pemurniannya. Aktivitas enzim didefinisikan kemampuan enzim dalam
! nanomol enzim menghidrolisis substrat klorofil a per menit per mg protein.
Proses pemurnian menggunakan kromatografi kolom dengan menggunakan
sephade? /:$. >raksi yang dihasilkan ada ):# fraksi protein. 6amun yang
terindentifilasi sebagai enzim klorofilase hanya dua fraksi di simbolkan dengan >!
dan >$. 3rafik yang dihasilkan adalah berikut8
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
9/15
etiga -enis tanaman ini menun-ukkan hasil filtrasi yang berbeda berupa
konsentrasi protein dan aktivitas spesifiknya. 9anaman 5ird cherry memiliki fraksi >!
lebih besar dari pada >$. 9anaman European plum dan &our cherry memiliki fraksi >!
lebih besar dari pada >$. Perbedaan fraksi ini menun-ukkan perbedaan massa molekul
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
10/15
enzim klorofilase yang diisolasi. Hasil massa molekul enzim klorofilase yang
dihasilkan adalah berikut8
Penentuan massa molekul enzim klorofilase sebagai hasil pengeplotan grafik
antara av (koefisien partisi pada kromatografi filtrasi gel% terhadap log massa
molekul. Perbedaan dapat dilihat hari hasil massa molekul tiap fraksi dalam satuan
k4a. >raksi ! memiliki ukuran molekul lebih besar dari pada fraksi $. >! akanterelusi bersama fase gerak terlebih dahulu dibandingkan >$.
&elan-utnya penentuan pH optimum enzim klorofilase dilakukan dengan
memvariasikan kondisi pH buffer yang digunakan selama proses hidrolisis. pH
divariasi 0C 1C C *C )C ),$C ),1C ),*C ),#C #C #,$C #,1C #,*C #,#C ", !, !!, dan !$.
&ebanyak ,0 ml ekstrak enzim, ,! ml klorofil a dalam aseton ,! mM dan ! ml
buffer kemudian diukur aktivitasnya. Hasil optimasi pH enzim klorofilase adalah8>raksi ! (>!%
: 5ird cherry pH #
: &our cherry pH ): European plum pH ),#
>raksi $ (>$%
: European plum pH )
: 5ird cherry pH ).#: &our cherry pH #
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
11/15
arakterisasi yang terakhir adalah penentuan nilai m. m adalah konsentrasi
substrat yang dibutuhan untuk mencapai setengah dari kecepatan reaksi maksimal.
6ilai m merupakan hasil pengeplotan pada persamaan linier inevear:5urk. &emakin
kecil mmaka kemampuan enzim menarik substrat semakin besar. Hasil penentuan
menzim klorofilase adalah berikut8
Pengaruh inhibitor dapat menurunkan aktivitas ker-a enzim klorofilase tersebut.
&el di preinkubasi $1 -am pada suhu 1 dera-at. 4itambahkan ! mM ion logam
dan modifikasi gugus fungsi, kemudian diinkubasi kembali dalam tempat gelap
selama 0 menit dengan suhu 0 dera-at dan diukur akifitasnya aktivitas diambil nilai
aktivitas yang tertinggi. Aktivitas yang dilihat adalah aktivitas relatif dari enzim
tersebut yang artinya nilai aktivitas enzim di catatan sebagai aktivitas paling tinggi.
Pengaruh inhibitor Mg$Dmemiliki aktivitas relatif paling besar, hal ini dimungkinkan
karena dalam substrat enzim klorofilase -uga mengikat Mg$D. &ehingga sisi katalitik
enzim klorofilase sudah mengenali ion tersebut. Hasil yang diperoleh saat pengu-ian
pengaruh inhibitor adalah berikut 8
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
12/15
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
13/15
". !ioinforma$i&a
5ioinformatika enzim klorofilase dibandingkan dari beberapa organisme
penghasil enzim klorofilase. 2rganisme tersebut antara lain Arabidopsis thaliana 1,
Arabidopsis thaliana , Chenopodium album, Citrus sinensis,danTriticum aestivum.
3ambar berikut merupakan hasil 5A&9 untuk mendeteksise!uencebatas kemiripan
homologi. enzim ini bukan diisolasi dari tanaman ceri tetapi tanaman gandum yang
memiliki presentase homologi kurang dari $; dan memiliki kemiripan dengan hasil
se!uence pada organisme mamalia penghasil hormone sensitive lipase. &ehingga
enzim klorofilase memiliki motif lipase. &elain itu dilaporkan adanya residu katalitik
enzim klorofilase yaitu serin !1, histidin $*$, dan aspartame !)$. 6omer pada
residu katalitik tersebut sebagai posisi urutan asam aminonya. Presentase homologi
dari beberapa organism Triticum aestivum Arabidopsis thaliana 1, Arabidopsisthaliana , Chenopodium album, danCitrus sinensisadalah $;, 1*,0;, 10,1;,
0),*;, dan 1,);.
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
14/15
3ambar . Hasil seFuence asam amino enzim klorofilase
".* Pn%$%+
".*.1 Ksim+%lan
: Enzim klorofilase termasuk -enis enzim hidrolase: Enzim klorofilase memiliki substrat klorofil, menghirolisis klorofil menghasilkan
klorofilide dan fitol.
: Enzim klorofilase optimum pada pH ),# dan #: Enzim klorofilase memiliki residu katalitik serin !1, histidin $*$, dan aspartame
!)$
DAF#AR PUS#AKA
-
7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New
15/15
Arkus, A.G., iani, dan Gez, M, Goseph., $*. "evelopment o# $igh- Troughput
puri#ication method and a continous assay system #or Chlorophyllase. %&A,
"onald"an#orth Plant &ciences, Elsivier8 Analytical 5iochemistry, 00, "0:
"#
hamessan, A., ermasha, &., dan Mollimard, ., !"". Optimi'ation o#
Chlorophllase-Cataly'ed $ydrolytic Activity in a (icellar Ternary &ystem,
)iotechnol, Appl.5iochem, $$, 0$):010
ehninger, A. . !"#$."asar-dasar )io*imia, Gilid !. Gakarta 8 Erlangga.
&ytykie'icz, Hubert dkk. $!0.)iochemical characterisation o# chlorophyllase #rom
leaves o# selected Prunusspecies + A comparative study. 4epartment of
5iochemistry and Molecular 5iology, &iedlce niversity of 6atural &ciences
and Humanities, &iedlce, Poland. Bol *, 1):1*