Ladislav VyklickýLadislav Vyklický
IontovIontovéé kankanáály ly aktivovanaktivovanéé neuropneuropřřenaenaššeeččii
http://www.biomed.cas.cz/d331/index.html
Mozek dospělého člověka je tvořen ~50,000,000,000 neurony, které mezi sebou vytvářejí 1014 až 5 × 1014
(100-500 trillion) synaptických kontaktů
Označení „synapse“pochází od CharleseScotta Sherringtona (1857 – 1952; Anglie) v roce 1932 mu byla udělena Nobelova cena za fyziologii a medicinu.
Johannes Evangelista Purkinje1787-1869
1921 Otto Loewi (1873-1961)Ramon y Cajal (1852-1934), synaptická štěrbina
1. Sdrce 2. Sdrce
Stimulace vagu
Extracelulárnítekutina
Snížení tepovéfrekvence
Snížení tepovéfrekvence
Acetylcholin
ChemickChemickáá synapsesynapse
3
Aby látka mohla být považována za neuropřenašečmusí splňovat následující kriteria (Paton 1958) :
1. Presynaptický neuron musí obsahovat předpokládanou látkua být schopen ji uvolnit
2. Látka musí být uvolněna po stimulaci presynaptického axomu
3. Aplikace látky na postsynaptický neuron vyvolává stejný účinek jako má přirozený neuropřenašeč
4. Působení látky na postsynaptický neuron musí být farmakologicky ovlivněno stejně jako působení neuropřenašeče
5. V blízkosti synapse musí být přítomen „enzym“,ktetý neurotransmiter odstraní nebo rozloží
Definice Definice neuropneuropřřenaenaššeeččee
4
Akční potenciál přichází do presynaptického zakončení.
Otvírají se napěťově řízenéCa2+ kanály a Ca2+ vstupuje dovnitř.
Vzestup koncentrace Ca2+
spouští splynutí váčků s presynaptickou membránou.
Receptory s navázaným neuropřenašečem aktivujípostsynaptickou buňku.
Neuropřenašeč difunduje přes synaptickou štěrbinu a váže se na receptory na postsynaptické buňce.
Myelinovápochva
Extracelulárníprostor
Na+ kanál
K+ kanál
Ca2+ kanál
Neuropřenašeč se rozkládá, je transportován do presynaptického zakončení, jinou buňkou nebo difunduje pryč ze synapse.
Axon
i (elektrický proud)
Synaptická štěrbina
Molekuly neuropřenašeče
Presynaptické zakončenínervové buňky
Postsynaptickábuňka
Molekuly meuropřenašečejsou po syntéze transportovány do váčků.
1
2
3
4
5
6
7
ChemickChemickáá synapsesynapse
5
AcetylcholinAminy
DopaminNoradrenalinSerotoninHistamin
AminokyselinyGlutamátGABAGlycin
PeptidyPurinyPlyny
NOCO
Lipidy6
NeuropNeuropřřenaenaššeeččee
ChemickChemickáá signalizacesignalizace
• Receptor iontové kanály• Receptory spojené s trimerními G proteiny• Receptory mající enzymatickou aktivitu• Intracelulární receptory
7
Ionotropní receptory Metabotropní receptory
RReceptoryeceptory pro pro neuropneuropřřenaenaššeeččee
8
AcetylcholinAminy
DopaminNoradrenalinSerotoninHistamin
AminokyselinyGlutamátGABAGlycin
PeptidyPurinyPlyny
NOCO
Lipidy9
Ionotropní receptory
Metabotropní receptoryNeuropNeuropřřenaenaššeeččee
Postsynaptickádensita
Synaptickéváčky
Synaptickáštěrbina
Postsynaptickýneuron
10
DendritickDendritickéé trnytrny
11
Ionotropní receptor
Axon
Metabotropní receptor
Axon
Akčnípotenciál
Akčnípotenciál
Acetylcholin Acetylcholin
Kosterní sval
Srdeční sval
Aktivace nikotinického ACh
receptoru
Membránovádepolarizace
Akční potenciál a excitace
Kontrakce svalu
Aktivace muskarinickéhoACh receptoru
Uvolnění a-GTP + bg z heteromerických G
proteinů
bg aktivace K+ kanálů
Membránováhyperpolarizace
Snížení tepové frekvence
12
3-D rekonstrukce molekuly ACh receptoru
Iontové kanály jsou proteinové struktury tvořící póry,které umožňují tok iontů přes plazmatickou membránu
Selektivnífiltr
Senzor
Branka
Struktura iontovStruktura iontovéého kanho kanáálulu
Membrána
13
14
Neuropřenašeči aktivované iontovékanály jsou obvykle oligomerníkomplexy, které se skládají z několika podjenotek.
Trimer TetramerHexamerPentamer
Cis – loop receptory GABAGlycin AcetylcholinSerotonin
Glutamátové receptory
ATP – řízené receptory
ZZáákladnkladníí principy aktivace principy aktivace iontových kaniontových kanáállůů neuropneuropřřenaenaššeeččemem
15
Iontový kanál se nacházíve dvou konformačníchstavech:
a) zavřeném(s nebo bez agonisty) a
b) otevřeném(pouze s agonistou).
Aktivace iontovAktivace iontovéého kanho kanáálu lu agonistouagonistou
16
Agonista
Agonista
EC50 je koncentrace agonisty, která vyvolává právě 50 % maximální efekt
KKřřivka zivka záávislosti velikosti odpovvislosti velikosti odpověědi na koncentraci di na koncentraci agonistyagonisty
100%
50%
00.1 1 10 100 1000
17
Jsou zapotřebí dvě molekuly agonisty,,aby došlo k aktivaci IK
HillHillůůvv koeficientkoeficient
18
Desensitizace je stav kdy je receptor refrakterní k další aplikaci agonisty
DesensitizaceDesensitizace a pravda pravděěpodobnost otevpodobnost otevřřeneníí
19
Po je vždy <1
Při vysoké koncentraci agonisty
Agonista•přirozený•syntetický
Typy inhibice chemicky aktivovaných iontových kanTypy inhibice chemicky aktivovaných iontových kanáállůů
Agonista
Antagonista
Kompetitivní
Nekompetitivní
Blokátor
Antagonista
20
Opakovaná vazba Vlastnosti receptorů
Co urCo urččuje dobu trvuje dobu trváánníí postsynaptoickýchpostsynaptoických potencipotenciáállůů??
21
22
DNA RNA Protein Kompletace
Recyklace
Transport
10%
90%
Během 18 hodin je přibližněpolovina nově syntetizovaných ionotropních receptorůdegradována
Degradace
23
GABAminergníGlycinergní Purinergní (ATP)
CholinergníSerotonergní
Glutamátergní
ZastoupenZastoupeníí jednotlivých druhjednotlivých druhůů synapssynapsíí v CNSv CNS
24
5-hydroxytryptaminem aktivované IK (5-HT3)
ATP aktivované IK (P2x)
Glutamátem aktivované IK (GluR)
Acetylcholinem aktivované IK (ACh)
γ- aminomáselnou kyselinou aktivované IK (GABA)
Glycinem aktivované (IK)
Excitační Inhibiční
IontovIontovéé kankanáály aktivovanly aktivovanéé neuropneuropřřenaenaššeeččii;;dděělenleníí na excitana excitaččnníí a inhibia inhibiččnníí
25
MetodyMetody
26
ModelyModely
HipokampHipokampáálnlníí neuronyneurony
DRG neuronyDRG neurony
HEK293 a COSHEK293 a COS KortikKortikáálnlníí řříízkyzky
Rekombinantníreceptory Nativní receptory Synaptický přenos
27
Aplikace lAplikace láátektek
28
Aplikace lAplikace láátektek
29
Aplikace lAplikace láátektek
30
Agonista (glutamát)
Testovaná látka (neurosteroid)
TV kamera + monitor
Snímací komůrka s řízkem
Patch clampzesilovač
Miktoskop
Mikromanipulátor
Stimulator
Pipeta
Osciloskop
ElektrofyziologickElektrofyziologickáá laboratolaboratořř
31
Izolace tkIzolace tkáánněě
Izolace mozkuZchlazení na 4°C
VibratomVibratom –– zazařříízenzeníí na pna přříípravu pravu řříízkzkůů
Detail komDetail komůůrkyrky
Komůrka
Nervová tkáň
Led
Žiletka
Směr vibrací žiletky
Směr posumu tkáně
ŘŘíízek z prodlouzek z prodloužženenéé mmííchychy
Fotografie řízku připraveného z prodloužené mích potkana.DS – dorzální strana, VS – ventrální strana, T – vlákno přidržující řízek k podložce, Sp5 – kaudální část jádra trigeminu
Mikrofotografie živého neuronupořízená za použitíDIC-IR mikroskopie.E – patch clampová elektroda
E
36
Gene knockout Gene knockout
DNA … gen … DNA
Genetickémanipulace
DNA … neg … DNA
Gene knockout
Bahaviorální, farmakologické a jiné testy
Germinální buňky
Germinální buňky-bez genu
AcetylcholinAminy (katecholaminy)Aminokyseliny
GlutamátGABAGlycin
PeptidyPurinyPlynyLipidy
37
Lišaj smrtihlav
Extracelulární prostor
METABOTROPNÍ GLUTAMÁTOVÉRECEPTORY
IONOTROPNÍ GLUTAMÁTOVÉRECEPTORY
CGlutamátvázajícídomena
Kanál-tvarujícídomena
RODOKMEN METABOTROPNÍCHGLUTAMÁTOVÝCH RECEPTORŮ
RODOKMEN IONOTROPNÍCHGLUTAMÁTOVÝCH RECEPTORŮ
38
Receptor Podjednotka Gen ChromozomAMPA GluR1 GRIA1 5q33
GluR2 GRIA2 4q32-33GluR3 GRIA3 Xq25-26GluR4 GRIA4 11q22-23
Kainate GluR5 GRIK1 21q21.1-22.1
GluR6 GRIK2 6q16.3-q21GluR7 GRIK3 1p34-p33KA-1 GRIK4 11q22.3KA-2 GRIK5 19q13.2
NMDA NR1 GRIN1 9q34.3NR2A GRIN2A 16p13.2NR2B GRIN2B 12p12
NR2C GRIN2C 17q24-q25
NR2D GRIN2D 19q13.1qterNR3A GRIN3A 9q31.1NR3B GRIN3B 19p13.3
Kys. glutamová
AMPA (α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate)
NMDAN-methyl-D-aspartát
Kainát
IonotropnIonotropníí glutamglutamáátovtovéé receptoryreceptory
39
AMPA receptor GluR2AMPA receptor GluR2–– /GluA2//GluA2/
NSIQIGGLFPRGADQEYSAFRVGMVQFSTSEFRLTPHIDNLEVANSFAVTNAFCSQFSRGVYAIFGFYDKKSVNTITSFCGTLHVSFITPSFPTDGTHPFVIQMRPDLKGALLSLIEYYQWDKFAYLYDSDRGLSTLQAVLDSAAEKKWQVTAINVGNINNDKKDETYRSLFQDLELKKERRVILDCERDKVNDIVDQVITIGKHVKGYHYIIANLGFTDGDLLKIQFGGANVSGFQIVDYDDSLVSKFIERWSTLEEKEYPGAHTATIKYTSALTYDAVQVMTEAFRNLRKQRIEISRRGNAGDCLANPAVPWGQGVEIERALKQVQVEGLSGNIKFDQNGKRINYTINIMELKTNGPRKIGYWSEVDKMVVTLTELPSGNDTSGLENKTVVVTTILESPYVMMKKNHEMLEGNERYEGYCVDLAAEIAKHCGFKYKLTIVGDGKYGARDADTKIWNGMVGELVYGKADIAIAPLTITLVREEVIDFSKPFMSLGISIMIKKPQKSKPGVFSFLDPLAYEIWMCIVFAYIGVSVVLFLVSRFSPYEWHTEEFEDGRETQSSESTNEFGIFNSLWFSLGAFMQQGCDISPRSLSGRIVGGVWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMVSPIESAEDLSKQTEIAYGTLDSGSTKEFFRRSKIAVFDKMWTYMRSAEPSVFVRTTAEGVARVRKSKGKYAYLLESTMNEYIEQRKPCDTMKVGGNLDSKGYGIATPKGSSLRNAVNLAVLKLNEQGLLDKLKNKWWYDKGECGSGGGDSKEKTSALSLSNVAGVFYILVGGLGLAMLVALIEFCYKSRAEAKRMKVAKNPQNINPSSSQNSQNFATYKEGYNVYGIESVKI
C - terminální část
N - terminální část
C N
C CN
N
40
LBDLigand Binding Doména
Membránová Doména
NTDN Terminální Doména
GluR2GluR2
C
N
41
GluR2GluR2
42
NR1-1aNR1-1b NR1-2a NR1-2b NR1-3a NR1-3b NR1-4a NR1-4b
NR2ANR2BNR2CNR2D
pre-mRNA
Alternativnísestřih mRNA
Sestřih
Překlad
Insert (a,b)
Kazeta
---1.2.
3.
AlternativnAlternativníí sestsestřřihih
NR1-1a
NR1-1aNR2A
NR2BNR2A NR2B
NR2A43
RNA RNA editingeditingQ/R mQ/R míísto AMPA receptorsto AMPA receptorůů tvotvořřených GluR2ených GluR2
NSIQIGGLFPRGADQEYSAFRVGMVQFSTSEFRLTPHIDNLEVANSFAVTNAFCSQFSRGVYAIFGFYDKKSVNTITSFCGTLHVSFITPSFPTDGTHPFVIQMRPDLKGALLSLIEYYQWDKFAYLYDSDRGLSTLQAVLDSAAEKKWQVTAINVGNINNDKKDETYRSLFQDLELKKERRVILDCERDKVNDIVDQVITIGKHVKGYHYIIANLGFTDGDLLKIQFGGANVSGFQIVDYDDSLVSKFIERWSTLEEKEYPGAHTATIKYTSALTYDAVQVMTEAFRNLRKQRIEISRRGNAGDCLANPAVPWGQGVEIERALKQVQVEGLSGNIKFDQNGKRINYTINIMELKTNGPRKIGYWSEVDKMVVTLTELPSGNDTSGLENKTVVVTTILESPYVMMKKNHEMLEGNERYEGYCVDLAAEIAKHCGFKYKLTIVGDGKYGARDADTKIWNGMVGELVYGKADIAIAPLTITLVREEVIDFSKPFMSLGISIMIKKPQKSKPGVFSFLDPLAYEIWMCIVFAYIGVSVV
LFLVSRFSPYEWHTEEFEDGRETQSSESTNEFGIFNSLWFSLGAFMQQGCDISPRSLSGRIVGGVWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMVSPIESAEDLSKQTEIAYGTLDSGSTKEFFRRSKIAVFDKMWTYMRSAEPSVFVRTTAEGVARVRKSKGKYAYLLESTMNEYIEQRKPCDTMKVGGNLDSKGYGIATPKGSSLRNAVNLAVLKLNEQGLLDKLKNKWWYDKGECGSGGGDSKEKTSALSLSNVAGVFYILVGGLGLAMLVALIEFCYKSRAEAKRMKVAKNPQNINPSSSQNSQNFATYKEGYNVYGIESVKI
C - terminální část
N - terminální část
V DNA …CAG… tento triplet kóduje glutamin (Q)V RNA je překvapivě …CGG… tento triplet kóduje arginin (R)
DNA RNA protein
II. Membránová oblast
arginin (R)glutamin (Q)
RNA editing
44
RNA RNA editingediting GluR2GluR2
TM4TM3
TM2 TM1
arginin (R)glutamin (Q)
RNA editing
Na+Ca2+
45
EHLFYWQFRHCFMGVCSGKPGMVFSISRGIYSCIHGVAIEERQSVMNSPTATMNNTHSNILRLLRTAKNMANLSGVNGSPQSALDFIRRESSVYDISEHRRSFTHSDCKSYNNPPCEENLFSDYISEVERTFGNLQLKDSNVYQDHYHHHHRPHSIGSTSSIDGLYDCDNPPFTTQPRSISKKPLDIGLPSSKHSQLSDLYGKFSFKSDRYSGHDDLIRSDVSDISTHTVTYGNIEGNAAKRRKQQYKDSLKKRPASAKSRREFDEIELAYRRRPPRSPDHKRYFRDKEGLRDFYLDQFRTKENSPHWEVDLTDIYKERSDDFKRDSVSGGGPCTNRSHLKHGTGEKHGVVGGVPAPWEKNLTNVDWEDRSGGNFCRSCPSKLHNYSSTVAGQNSGRQACIRCEACKKAGNLYDISEDNSLQELDQPAAPVAVTSNASSTKYPQSPTNSKAQKKNRNKLRRQHSYDTFVDLQKEEAALAPRSVSLKDKGRFMDGSPYAHMFEMPAGESSFANKSSVPTAGHHHNNPGSGYMLSKSLYPDRVTQNPFIPTFGDDQCLLHGSKSYFFRQPTVAGASKTRPDFRALVTNKPVVSALHGAVPGRFQKDICIGNQSNPCVPNNKNPRAFNGSSNGHVYEKLSSIESDV
Serin
Threonin
PKA PKA ffosforylaosforylaččnníí mmííststaa NR2B NR2B podjednotkypodjednotky NMDA receptoruNMDA receptoru
46
1 MGRLGYWTLLVLPALLVWRDPAQNAAAEKGPPALNIAVLLGHSHDVTERELRNLWGPEQA61 TGLPLDVNVVALLMNRTDPKSLITHVCDLMSGARIHGLVFGDDTDQEAVAQMLDFISSQT
121 FIPILGIHGGASMIMADKDPTSTFFQFGASIQQQATVMLKIMQDYDWHVFSLVTTIFPGY181 RDFISFIKTTVDNSFVGWDMQNVITLDTSFEDAKTQVQLKKIHSSVILLYCSKDEAVLIL241 SEARSLGLTGYDFFWIVPSLVSGNTELIPKEFPSGLISVSYDDWDYSLEARVRDGLGILT301 TAASSMLEKFSYIPEAKASCYGQAEKPETPLHTLHQFMVNVTWDGKDLSFTEEGYQVHPR361 LVVIVLNKDREWEKVGKWENQTLSLRHAVWPRYKSFSDCEPDDNHLSIVTLEEAPFVIVE421 DIDPLTETCVRNTVPCRKFVKINNSTNEGMNVKKCCKGFCIDILKKLSRTVKFTYDLYLV481 TNGKHGKKVNNVWNGMIGEVVYQRAVMAVGSLTINEERSEVVDFSVPFVETGISVMVSRS541 NGTVSPSAFLEPFSASVWVMMFVMLLIVSAIAVFVFEYFSPVGYNRNLAKGKAPHGPSFT601 IGKAIWLLWGLVFNNSVPVQNPKGTTSKIMVSVWAFFAVIFLASYTANLAAFMIQEEFVD661 QVTGLSDKKFQRPHDYSPPFRFGTVPNGSTERNIRNNYPYMHQYMTRFNQRGVEDALVSL721 KTGKLDAFIYDAAVLNYKAGRDEGCKLVTIGSGYIFATTGYGIALQKGSPWKRQIDLALL781 QFVGDGEMEELETLWLTGICHNEKNEVMSSQLDIDNMAGVFYMLAAAMALSLITFIWEHL841 FYWKLRFCFTGVCSDRPGLLFSISRGIYSCIHGVHIEEKKKSPDFNLTGSQSNMLKLLRS901 AKNISNMSNMNSSRMDSPKRATDFIQRGSLIVDMVSDKGNLIYSDNRSFQGKDSIFGDNM961 NELQTFVANRHKDNLSNYVFQGQHPLTLNESNPNTVEVAVSTESKGNSRPRQLWKKSMES1021 LRQDSLNQNPVSQRDEKTAENRTHSLKSPRYLPEEVAHSDISETSSRATCHREPDNNKNH1081 KTKDNFKRSMASKYPKDCSDVDRTYMKTKASSPRDKIYTIDGEKEPSFHLDPPQFVENIT1141 LPENVGFPDTYQDHNENFRKGDSTLPMNRNPLHNEDGLPNNDQYKLYAKHFTLKDKGSPH1201 SEGSDRYRQNSTHCRSCLSNLPTYSGHFTMRSPFKCDACLRMGNLYDIDEDQMLQETGNP1261 ATREEVYQQDWSQNNALQFQKNKLRINRQHSYDNILDKPREIDLSRPSRSISLKDRERLL1321 EGNLYGSLFSVPSSKLLGNKSSLFPQGLEDSKRSKSLLPDHASDNPFLHTYGDDQRLVIG1381 RCPSDPYKHSLPSQAVNDSYLRSSLRSTASYCSRDSRGHSDVYISEHVMPYAANKNTMYS1441 TPRVLNSCSNRRVYKKMPSIESDV
Non-synonymous SNP(leucin za jinou AK)
Synonymous SNP(fenylalanin za fenylalanin)
SNP SNP –– SingleSingle--nucleotide polymorphism nucleotide polymorphism NMDA r NMDA r -- NR2A NR2A podjednotkapodjednotka
SNP molekuly DNA se liší v jednom páru bazí
47
Protein proteinovProtein proteinovéé interakce NMDA receptoruinterakce NMDA receptoru
48
↑[Ca2+]i
Depolarizace
5 ms2 pA
GLY
GLU
GLYGLU
Aktivace NMDA receptoruAktivace NMDA receptoru
49
Farmakologie NMDA receptoruFarmakologie NMDA receptoru
Mg2
+
Zn2+
MK-801
Polyaminy
Kompetitivníantagonista
PCP
Neurosteroidy
Ketamin
Memantin
Nekompetitivníantagonista
Nekompetitivníantagonista -blokátor iontového kanálu
Napěťově závislý inhibitor
Use-dependentinhibitor
Agonista
Glutamát
NMDA
Koagonista
Glycin
APV 7ClKH+Ifenprodil
Ketamin
50
MgMg2+2+ je je blokblokáátortor NMDA receptor IKNMDA receptor IK
51
ExcitaExcitaččnníí synapsesynapse
10 mM Glu
1 M Glu
Glutamatový transporter
52
UvolUvolňňovováánníí glutamglutamáátutu z z presynaptickpresynaptickéé termintermináályly
53
8 nm
6.5 nm
Avogadrovo číslo = 6 . 1023
Koncentrace glutamátu = 1 mM
V = 1000 nm3
Kolik molekul Kolik molekul glutamglutamáátutu je v blje v blíízkosti NMDA zkosti NMDA receptoru breceptoru běěhem hem synapticksynaptickééhoho ppřřenosu?enosu?
54
8 nm
6.5 nm
Kolik molekul Kolik molekul glutamglutamáátutu je v blje v blíízkosti NMDA zkosti NMDA receptoru breceptoru běěhem hem synapticksynaptickééhoho ppřřenosu?enosu?
Odpověď:
1 molekula glutamátu (0.6)
55
8 nm
6.5 nm
Jakou drJakou drááhu urazhu urazíí molemolekula kula glutamglutamááttu bu běěhem hem 1 ms1 ms??
Difúze a Brownův pohyb
56
8 nm
6.5 nm
Jakou drJakou drááhu urazhu urazíí molemolekula kula glutamglutamááttu bu běěhem hem 1 ms1 ms??
Odpověď:
1 μm
1 μm
57
ExcitaExcitaččnníí postsynaptickpostsynaptickéé proudyproudy
58
AMPA receptor EPSC
NMDA receptor EPSC
Regulace uvolRegulace uvolňňovováánníí glutamglutamáátutu
59
Glutamát
Metabotropní GLUreceptor
Presynaptický neuron
„„UptakeUptake““ glutamglutamáátutu
Glutaminsyntáza
60
bicuculine, strychnine, CNQX, TTXNMDA mEPSC
Kolik NMDA receptorKolik NMDA receptorůů je aktivovje aktivovááno bno běěhem EPSC? hem EPSC?
61
bicuculine, strychnine, CNQX, TTXNMDA mEPSC
S = i/U (50 pS)i = 50.10-12 x 40.10-3
i = 2 pA
? otevřených iontových kanálů20 pA / 2 pA = 10
? NMDA receptorůPo = 10%100 NMDA receptorů
Kolik NMDA receptorKolik NMDA receptorůů je aktivovje aktivovááno bno běěhem EPSC? hem EPSC?
62
Kolik NMDA receptorKolik NMDA receptorůů je aktivovje aktivovááno bno běěhem EPSC? hem EPSC?
1 μm
100 nm
10 nm
63
Trvá asi 1s od doby co NMDA receptor vstoupil do synapse než z ní opět vystoupí
Receptory se v membrReceptory se v membráánněě pohybujpohybujíí
64
AMPA receptory lišící se podjednotkovým složením
DvDvěě rrůůznznéé glutamglutamáátergntergníí synapse na neuronu mohou msynapse na neuronu mohou míít t postsynaptickypostsynaptickyjak AMPA tak NMDA receptory s rjak AMPA tak NMDA receptory s růůzným zným podjednotkovýmpodjednotkovým slosložženeníímm
NMDA receptory lišící se podjednotkovým složením
65
NMDA receptor
AMPA receptor1 s
AMPA a NMDA receptory
NMDA receptory
RelativnRelativníí zastoupenzastoupeníí AMPA a NMDA receptory se mAMPA a NMDA receptory se můžůže me měěnit.nit.
66
DlouhodobDlouhodobéé zmzměěny ny úúččinnosti innosti synapticksynaptickééhoho ppřřenosu enosu
((Long Term Potentiation Long Term Potentiation –– LTPLTPLongLong Term Term DepressionDepression -- LTD) LTD)
67
Experientální uspořádání
Test
Kontrola
CA3 neurony
Schafferovykolaterály (z CA3
neuronůCA1
neuron
DrážděníSchafferových
kolaterál TEST
DrážděníSchafferových
kolaterál KONTROLA
Hipokampus
Potkaní mozek
Am
plitud
a EP
SC (
mV)
CA1
neur
ony
Am
plitud
a EP
SC (
mV)
CA1
neur
ony
CA1 neuron bez depolarizace
CA1 neuron s depolarizací
DlouhodobDlouhodobáá potenciacepotenciace synapticksynaptickééhoho ppřřenosu LTPenosu LTP
68
Vysokofrekvenční stimulaceNízkofrekvenční stimulace
Mírné zvýšení [Ca2+] Značné zvýšení [Ca2+]
Zvýšení [Ca2+]
Ca2+/Calmodulin kináza a protein kináza CCa2+ závislá fosfatáza
Fosforylované synaptické proteiny
Defosforylované synaptické proteiny
LTP
LTD
AMPA receptorNMDA receptor
69
PresynaptickPresynaptickýý mechnismusmechnismus LPTLPT
Presynaptická část
Presynaptická část
Postsynaptická část
Postsynaptická část
Am
plitud
a EP
SC
Am
plitud
a EP
SC
LTP
Kontrola
[Ca2+]
NO, CO …Indukce LTP
70
[Ca2+]
1. 1. PoPosynapticksynaptickýý mechnismusmechnismus LPTLPT
Indukce LPT
Am
plitud
a EP
SC
Kontrola
Am
plitud
a EP
SC
bez Mg2+
LTP
Presynaptická část
Postsynaptická část
NMDA receptory AMPA receptory
AMPA receptor EPSC
NMDA receptor EPSC
71
[Ca2+]
Indukce LPT
Kontrola
Am
plitud
a EP
SC
LTP
Am
plitud
a EP
SC
Presynaptická část
Postsynaptická část
NMDA receptoryAMPA receptory
Fosforylace
2. 2. PoPosynapticksynaptickýý mechnismusmechnismus LLTTPP
72
ExcitotoxicitaExcitotoxicita
73
Fyziologie a patologie NMDA receptorFyziologie a patologie NMDA receptorůů
• LTP • Vývoj• Synaptický přenos
• LTP • Vývoj• Synaptický přenos
NMDA receptoryNMDA receptoryNMDA receptory
• Zvýšená excitabilita• Poruchy kognitivních funkcí• Neurodegenerace (excitotoxicita)
• Zvýšená excitabilita• Poruchy kognitivních funkcí• Neurodegenerace (excitotoxicita)
+
-74
Kontrola Glutamát 30 min
ExcitotoxicitaExcitotoxicita
A B
Synaptickéreceptory
Mimosynaptickéreceptory
Syndrom „čínské restaurace"
75
80 s100 μM glutamátu na 2s
Vliv Vliv glutamglutamáátutu na intracelulna intraceluláárnrníí koncentraci Cakoncentraci Ca2+2+
76
ExcitotoxicitaExcitotoxicita • Hromadění K+ extracelulárně• Nedostatečný uptake glutamátu• Zvýšená extracelulární koncentrace
glutamátu• K+ vyvolaná depolarizace neuronů• K+ vyvolané zvýšené uvolňování glutamátu• Dlouhodobá aktivace NMDA receptorů• Snížená míra blokády NMDA receptorů Mg2+
77
Mechanismus bunMechanismus buněčěčnnéé smrtismrti
78
• Alzheimerova choroba • Důsledky mozkové příhody• Tramatické poškození mozku • Parkinsonova choroba• Tardivní dyskinezie• Huntingtonova choroba• Amyotrofická laterální skleroza• Olivopontocerebellar degenerace• AIDS• Alergická encefalomyelitida
““GlutamGlutamáátergntergníí““ teorie vzniku:teorie vzniku:
• Epilepsie• Anxieta• Deprese• Schizofrenie• Chronická bolest• Léková závislost
Výrazná neurodegenerace Další
79
AcetylcholinAminy (katecholaminy)Aminokyseliny
GlutamátGABAGlycin
PeptidyPurinyPlynyLipidy
80
α (alfa) podjednotka (6) GABRA1, GABRA2, GABRA3, GABRA4, GABRA5, GABRA6 β (beta) podjednotka (3) GABRB1, GABRB2, GABRB3γ (gama) podjednotka (3) GABRG1, GABRG2, GABRG3 δ (delta) podjednotka (3) GABRDε (epsilon) podjednotka GABREπ (pi) podjednotka GABRPθ (theta) podjednotka GABRQ
ρ (rho) podjednotka GABRR1, GABRR2, GABRR3 (ty se však nespojují s GABRA –Q podjednotkami, ale homooligomerizují se navzájem a vytvářejí GABAA-ρ receptors (dříve GABAC receptory) – Vyskytují se v sítnici.
IonotropniIonotropni GABAGABAAA receptoryreceptory
BarbiturátyDiazepam (Valium)EthanolInhalační anestetika
(vliv anxiolytický, hypnotický)
GABAA receptory jsou tvořeny pěti podjednotkami – vždy obsahují α a βpodjednotky – nejčastější podjednotkovésložení je α2β2γ
IonotropniIonotropni GABAGABAAA receptoryreceptory
AcetylcholinAminy (katecholaminy)Aminokyseliny
GlutamátGABAGlycin
PeptidyPurinyPlynyLipidy
83
Glycinový receptor se skládá z pěti podjednotek
α-podjednotka (α1-4) GLRA1, GLRA2, GLRA3, GLRA4(váže glycin)
β-podjednotka (GLRB)
Iontový kanál je propustný pro Cl-
Tento typ receptoru je exprimován především v míše
Existují jak čisté glycinergní synapse tak smíšenéglycinergní a GABAminergní
IonotropniIonotropni glycinový receptorglycinový receptor
84
Strychnos nux-vomica LStrychnin
Farmakologie glycinovFarmakologie glycinovéého receptoruho receptoru
85
AcetylcholinAminy (katecholaminy)
DopaminNoradrenalinSerotoninHistamin
AminokyselinyPeptidyPurinyPlynyLipidy
86
Typ Iono/Metabotropní Mechanismus Účinek
5-HT1 Gi/Go Snižuje hladinu cAMP Inhibitory
5-HT2 Gq/G11 Zvyšuje IP3 and DAG. Excitační
5-HT3 Ligand-gated Na+ and K+ kanál. Depolarizace Excitační
5-HT4 Gs Zvyšuje hladinu cAMP Excitační
5-HT5 Gi/Go Snižuje hladinu cAMP Inhibiční
5-HT6 Gs Zvyšuje hladinu cAMP Excitační
5-HT7 Gs Zvyšuje hladinu cAMP Excitační
5-HT receptor
Serotoninové receptory modulujíuvolňování řady neuropřenašečuglutamátu, GABA, dopaninu, noradrenalinu, acetylcholinu….
SerotoninovSerotoninovéé receptoryreceptory
5-HT3 jsou ionotropní receptory –složené z pěti podjednotek HT3A – HT3E – jsou exitační.
CNS – úzkostPNS – nocicepce (C vlálkna)
87
AcetylcholinAminyAminokyselinyPeptidyPurinyPlynyLipidy
88
ACh RECEPTOR –PODJEDNOTKOVÉ SLOŽENÍ
α podjednotka ACh receptoru:
4 transmembránové oblasti (M1, M2, M3, M4)
2 mimomembránové oblasti (extracelulární pr., cytosol)
8 nm
2,5 nm
Extracelulárníprostor
Cytosol
Extracelulárníprostor
Cytosol
ACh RECEPTOR –POHLED SHORA
Cytoplazmatickédomény
Extracelulárnídomény
Membránovédomény
17 nACh podjednotek
Nervový typ Svalový typ
(α1)2β1δε
(α1)2β1δγ
(α3)2(β4)3 Automomní ganglia
(α4)2(β2)3 CNS
(α3)2(β4)3
(α7)5
NikotinickýNikotinický Ach receptorAch receptor
89
Na+ kanál ve svalu
Ca2+ kanál
AChR kanál
NeuronálníNa+ kanál
K+ kanál
Uvolnění ACh
Acetylcholinesterasa
Acetylcholin(ACh)
Bungarus fasciatus
Alfa-Bungarotoxin
Tubocurarin
Strychnos Toxifera
Sarin (Organofosfáty)
90
Botulotoxin (klobásový jed) je produkován bakteriíClostridium botulinum. Je to možná absolutněnejúčinnější jed - 100 g by stačilo k vyhubení celého lidstva. BT – brání presynaptickým vesikulům, aby splynuly s membránou a uvolnily ACh.
Acetylcholin
Nervová plasticita - paměťProbouzeníPozornost
Alzheimerova choroba(inhibitory cholinesterázy)
CholinergnCholinergníí ppřřenos v CNSenos v CNS
91
AcetylcholinAminy (katecholaminy)AminokyselinyPeptidyPurinyPlynyLipidy
92
93
PurinergnPurinergníí receptory receptory
Purinergní receptory
Ionotropní receptory –(P2X1 – P2X7)hetero nebo homotrimery; kanál je propustný pro Na+/Ca2+
CNS i PNSmoduluje srdeční činnost, tonus hladkých svalových vláken cév, nocicepce)
Metabotropní receptory –(P2Y1 -P2Y15; jen některé u člověka, ↑Ca2+ nebo ↑↓cAMPCNS? PNS pravděpodobně společně s noradrenalinem)
AcetylcholinAminyDopaminNoradrenalinSerotoninHistaminAminokyseliny
GlutamátGABAGlycin
PeptidyPurinyPlyny
NOCO
Lipidy94
Ionotropní receptory
Metabotropní receptoryZZáávvěěrr
… a jestli máte pocit, že byste rádi studovali iontové kanály - tak
vám pomůžeme. [email protected]
Děkuji za pozornost95