GFE Blut Triple Target HIV-1 NAT für das Blutspenden-Screening
Silke De Zolt, Thorsten Bangsow, Ingo Schupp, Rolf Thermann, W. Kurt Roth
4. Sitzung der DGTI Sektion „Sicherheit von Blutprodukten“Travemünde, 28.03.2014
TRANSFUSION 2011
1. Fall
• im April 2007 wurde die Spende eines 44-jährigen männlichen Mehrfachspenders serologisch HIV-1 positiv getestet, die NAT im Roche Test CAP CTM v1 war negativ.
• die serologisch - und NAT negative Vorspende vom Januar 2007 wurde transfundiert und führte zu einer HIV-1 Infektion beim Empfänger.
• Untersuchungen zeigten, dass der CAP CTM v1 Test (Zielregion: gag) diese Variante stark unterquantifiziert.
2. Fall
• im Juli 2010 wurde bei einem 26-jährigen männlichen Mehrfachspender sowohl serologisch als auch mittels NAT (Virus Screening PCR Kit (VSPK v 1.1) der GFE Blut mbH) eine HIV-1 Infektion nachgewiesen.
• Die vorhergehende transfundierte Spende war ursprünglich im Screening im August 2009 und wiederholt aus der Rückstellprobe mit dem Roche CTS MPX Test (Zielregion: LTR) negativ auf HIV-1 getestet worden. Im Look Back wurde die Probe im VSPK v 1.1 PCR positiv getestet, serologisch war sie negativ.
HIV Mutationen in Deutschland
HIV Mutationen in Deutschland3. Fall
• Ein 42-jähriger männlicher Mehrfachspender wurde im Oktober 2010 das erste mal serologisch positiv auf HIV-1 getestet, in der Screening VSPK v1.1 PCR war er negativ.
• Im externen Testlabor am Pettenkofer-Institut war die Probe in der Abbott PCR positiv.
• Die Vorspende vom Juni 2010 war serologisch und in der GFE Blut PCR wie in der Abbott PCR negativ. Eine Übertragung auf den Empfänger konnte ausgeschlossen werden.
• Meldung vom Blutspendedienst am 03.11.2010.
• am 16.11.2010 lagen bei der GFE Blut erste Sequenzergebnisse vor, die das Testversagen erklärten.
4. Fall
• Ein 18-jähriger männlicher Erstspender wurde im Oktober 2010 serologisch positiv getestet, in der VSPK v1.1 Screening PCR war er negativ, ebenso im GFE Blut Bestätigungstest. Im externen Testlabor wurde er PCR positiv getestet.
• Meldung vom Blutspendedienst erfolgte am 16.11.2010.
• am 19.11.2010 konnte die identische Mutation wie im Isolat des 3. Falls im Bereich der Primerbindungsstelle identifiziert werden.
LTR Sequences From Recent HIV-1 Break-through Cases in Germany
6
(1) Clinical Isolate, Prof. Eberle, Pettenkofer Institut
(2) Consensus sequence
2. Fall --------CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTAAAGTAGTGTGTGCCC 3. Fall GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAACTGTGCTTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC 4. Fall GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAACTGTGCTTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC klin. Probe (1) GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAACTGTGCTTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC HXB2 (2) GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC ******************* *** ********** *************** 2. Fall GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCTTTATAGTCAGTGTGGAAAA 3. Fall GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACACTTTTAGTCAGTGTGGAAAA 4. Fall GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACACTTTTAGTCAGTGTGGAAAA klin. Probe (1) GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAA HXB2 (2) GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAA *************************************** ** **************** 2. Fall TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGTGAAAATAAGACCAGAGGAGCTCTC 3. Fall TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAACGAAAGTAAGACCAGAGAAGATCTC 4. Fall TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAACGAAAGTAKGACCASAGAAGTTCTC klin. Probe (1) TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGTAAGACCAGAGAAGTTCTC HXB2 (2) TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTC **************************** ***** **** **** ** ** ****
Philogenetic Analysis of the LTR Regions of HIV-1 Isolates
7
http://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/treemaker/treemaker.html
2. Fall
klin. Isolat4. Fall
3. Fall
Phylogenetic Analysis of the gag Region
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Isolat1
Isolat2
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MEGA5
Phylogenetic relationship of the New Isolates with the M Group (A-K) pol Region
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Phylogenetic Analysis of pr rt Region
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B2
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PZ.C
D.90.AN
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5180.L20571
Ref.O
.BE.87.AN
T70.L20587
Ref.O
.CM
.98.98CM
U290
1.AY
169812
Ref.O
.SN
.99.SE
MP
1300.A
J302647
0.05
MEGA5
Phylogenetic Analysis of the Whole Genome of the New Variants
B-Clade
http://www.hiv.lanl.gov/cgi-bin/phyloplace
Genetic Relationship with HIV-1 Subtype B
http://www.hiv.lanl.gov/cgi-bin/phyloplace
Genetic Relationship with Subtype B
More HIV-1 Break-through Cases
5. Case• In September 2011 a 30-years old repeat donor tested HIV-1 serology and NAT (GFE
Blut VSPK v 1.2) positive.• The preceding donation from May 2011 had been tested negative in serology and NAT
screening tests. The archive sample of this donation was thawn and newly tested in the more sensitive GFE Blut HIV-1 confirmatory NAT test. The result was weakly positive.
• Quantification of the sample resulted in viral load of 23,4 copies/ml.
• The 15-days old red cells of the donation from May 2011 had been transfused to a 71-years old male recipient.
• In September 2011 the recipient was tested and turned out to be HIV-1negative in serology and NAT testing.
6. Case• In July 2012 a 31-years old female first time donor tested HIV-1 serology positive; in
GFE Blut NAT screening and confirmation testing she was negative.• Sequencing of the isolate identified a large deletion in the LTR region at the probe
binding site . Several other screeening tests were affected: artus-HI-Virus-1 RT-PCR-Kit (Qiagen GmbH) and Roche CTS/MPX (Roche, Molecular Systems)
CAP CTM v1
HPS CTM v1
CAS v1.5
CAM v1.5
CTS MPX
VSPK v1.1
artus DRK Abbott RT
VSPK v1.2
CAP CTM v2
Ultrio plus
Case nb.
gag gag gag gag LTR LTR LTR LTR pol LTRgag + LTR
pol + LTR
1CAP
CTM V1((+)) - + + + + + + + + (+) +
2CTS MPX
(wd) + + + - + + + + + (+) +
3VSPK V1.1
(wd) + + + + - ((+)) + + + + (+)
4VSPK V1.1
(wd) + + + + - ((+)) + + + + (+)
5VSPK
V2(wd) - + (wd)
240 IU/ml
<70 IU/ml
-23
cp/ml+
6VSPK
V2(wd)
+ - (wd) -19387 IU/ml
-3760 cp/ml
(+)
HIV-1 Break-through Cases
PEI 2012
+ consistent detection efficiency(+) moderately reduced (factor < 10) detection efficiency
((+)) highly reduced (factor >10) detection efficiency
wd withdrawn
HIV-1 NAT Failures: Consequences
• Phased Plan initiated by the PEI in 2010• Official hearing in 2011• 06/15/2012: official notification of the manufacturers of blood
components by the PEI:– Starting from 01/01/2015 all blood components must be tested
by HIV-1 NAT systems that are able to exclude or compensate for the potential underestimation or non-recognition of the respective target region
– A potential approach could be dual-taget NAT tests with two or more different target regions
– For each individual target region the LOD must meet the minimal requirements of 10,000 IU/ml per individual donation.
CAP CTM v1
HPS CTM v1
CAS v1.5
CAM v1.5
CTS MPX
VSPK v1.1
artus DRK Abbott RT
VSPK v1.2
CAP CTM v2
Ultrio plus
Case nb.
gag gag gag gag LTR LTR LTR LTR pol LTRgag + LTR
pol + LTR
1CAP
CTM V1((+)) - + + + + + + + + (+) +
2CTS MPX
(wd) + + + - + + + + + (+) +
3VSPK V1.1
(wd) + + + + - ((+)) + + + + (+)
4VSPK V1.1
(wd) + + + + - ((+)) + + + + (+)
5VSPK
V2(wd) - + (wd)
240 IU/ml
<70 IU/ml
-23
cp/ml+
6VSPK
V2(wd)
+ - (wd) -19387 IU/ml
-3760 cp/ml
(+)
HIV-1 Break-through Cases
PEI 2012
+ consistent detection efficiency(+) moderately reduced (factor < 10) detection efficiency
((+)) highly reduced (factor >10) detection efficiency
wd withdrawnfactor 5.1
factor 3.4
factor 5.2
Analytische NWG des Pol-Amplikons auf Plasmid-Ebene
8 Kopien
Nachweisgrenzen mit Konfidenzgrenzen
Wahrscheinlichkeit
95%-Konfidenzgrenzen für VAR00001
Schätzer Untergrenze Obergrenze0,950 3,303 2,212 10,145
1,6 Kopien: 50 % NWG
LTR: Genotypenerkennung - Plasmide
Diese Genotypen werden von der pol-PCR sehr gut detektiert
Übersicht gBlocks®: Einzelamplikons
GenotypCt dRn 95% NWG
LTR Pol Gag LTR Pol Gag LTR Pol Gag
B2
29,971
26,100
23,21 165.821 1.452.691 1.373.146 4,8 7,0 1,51 0 00 0 0
C1
25,680
23,280
22,94 1.628.090 1.841.849 1.379.215 2,0 7,0 1,00 1 00 0 1
A10
23,320
23,272
24,66 1.987.185 2.263.904 1.120.573 5,1 2,2 2,60 0 20 0 0
01AE0
23,360
24,712
25,45 1.389.418 889.339 1.230.931 2,6 2,4 2,60 2 00 0 0
02AG0
23,780
24,842
25,31 1.742.500 926.166 1.179.805 2,2 0,8 2,60 2 21 0 2
06cpx0
23,830
24,512
24,46 1.717.613 1.065.496 1.233.858 3,4 2,2 3,11 1 10 0 0
G0
23,840
22,950
24,25 1.897.044 1.976.783 944.853 4,8 3,3 2,30 1 30 0 0
N0
25,200
26,643
1.874.800 352.972 2,0 3,50 4 43 0 7
O0
26,210
25,026
1.863.910 727.335 2,6 2,00 3 50 0 4
P1
24,260
24,255
1.651.085 893.267 1,3 2,00 2 53 0 6
Fall10
23,121
25,971
26,78 1.899.116 2.029.010 1.247.679 2,4 2,0 3,10 0 00 0 0
Sensitivität für einzelne PCRs, Dual und Triple bei In Vitro Transkripten
Gesamt LTR pol gag dual triple
HIV-1 Moleküle/PCR
IST SOLL IST SOLL IST IST IST SOLL IST SOLL
50 12 12 12 12 12 12 18 18 18 1825 12 12 12 12 11 12 18 18 18 18
12,5 11 12 12 12 11 12 18 18 18 186,25 9 12 12 12 9 12 17 18 18 18
3,125 8 12 12 12 4 12 18 18 17 18
1,5625 2 12 9 12 3 12 14 18 13 180,78125 1 12 6 12 1 12 9 18 10 18
0 0 12 0 12 0 12 0 18 2 1895% NWG 10,75 2,02 18,57 3,79 2,66
Dual versus Triple Target PCR
Vergleich der Sensitivität bei Ausfall einer Sonde
In IU/ml bei 100µl In-put Volumen entsprechend IVD Validierung
dualdual ohne
LTR
dual ohne
poltriple
triple
ohne gag
triple
ohne LTR
triple
ohne polHIV-1 v2
95%
NWG257 695 702 274 266 240 300 455
Faktor max. 2.7 Faktor max. 1.1
Dual versus Triple mit Testversagern
Extrahiertes Material: Testversager und Zellkulturmaterial im Vergleich
MW CP HIV-1 BRK 2010
MW CP HIV-1 West 2010
MW CP HIV-1 West 2012
MW CP HIV-1 ZKÜ
LTR 26,05 32,87 30,34
pol 31,13 41,00 30,10 32,25
gag 31,30 40,36 32,72 31,76
LTR-pol 27,87 33,56 29,98 31,00
LTR-gag 26,19 32,50 32,66 30,04
pol-gag 30,84 35,45 29,78 31,32
triple 28,42 34,09 29,90 31,17
GFE Blut Triple Target HIV-1 PCR
Sensitivität LC 480 ABI 7500
96er Pool 100 µl Einzel 96er Pool 100µl Einzel
95% NWG 730 351 800 378
KI 544 - 1261 263 - 619 556 - 1860 319 - 481
50% NWG 303 150 326 176
KI 189 - 455 82 - 223 154 - 585 141 - 213
Spezifität: 99,91%
- Nachweisgrenze (NWG) in IU bezogen auf 1ml Einzelspender Plasma- Einsatz jeweils 100µl Probenvolumen - Effektives Probenvolumen in PCR: 12,5 µl
KI: Konfidenzintervall
Danke für die Aufmerksamkeit
FIZ Frankfurt