UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
“Efecto de las concentraciones de 2250, 3375 y 9000 ppm de
Methomyl sobre la germinación, el crecimiento y la actividad
entomopatógena de Beauveria bassiana en condiciones de
laboratorio”
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO DE
BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO
Br. JARA CARRANZA, JACQUELINE LISSETH
TRUJILLO - PERÚ
2017
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
QUE OTORGAN EL TITULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO
Dr. Orlando Gonzáles Nieves.
RECTOR
Dr. Rubén César Vera Véliz
VICE-RECTOR ACADÉMICO
Dr. Weyder Portacarrero Cárdenas
VICE-RECTOR DE INVESTIGACIÓN
Dr. Steban Alejandro Ilich Zerpa
SECRETARIO GENERAL
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DE LA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TITULO
PROFESIONAL DE BIOLOGO – MICROBIOLOGO
Dr. Freddy Mejía Coico
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. William Zelada Estraver
SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. Bertha Soriano Bernilla
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASÍTOLOGÍA
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DEL ASESOR
El que suscribe: Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg, asesor de la presente tesis titulada:
Efecto de las concentraciones de 2250, 3375 y 9000 ppm de Methomyl sobre la
germinación, el crecimiento y la actividad entomopatógena de Beauveria bassiana, en
condiciones de laboratorio.
CERTIFICA:
Que la investigación ha sido desarrollada de acuerdo al reglamento establecido por la
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en
conformidad con su correspondiente proyecto de tesis y que el informe ha sido redactado
bajo mi asesoramiento, acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.
Por ello, autorizo a Jacqueline Lisseth Jara Carranza, para continuar con el trámite del
reglamento establecido
Trujillo, Febrero del 2018
__________________________
Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg
ASESOR
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PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
Cumpliendo con las disposiciones establecidas por el Reglamento de Grados y
Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a su consideración y elevado
criterio la presente Tesis titulada: Efecto de las concentraciones de 2250, 3375 y 9000 ppm
de Methomyl sobre la germinación, el crecimiento y la actividad entomopatógena de
Beauveria bassiana, en condiciones de laboratorio., con el objetivo de obtener el título
profesional de Biólogo-Microbiólogo.
Trujillo, Febrero del 2018
_______________________________
Br. Jacqueline Lisseth Jara Carranza
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MIEMBROS DEL JURADO
------------------------------------------------------
Dra. Manuela Natividad Lújan Velásquez
PRESIDENTA
------------------------------------------------
Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg
SECRETARIO
-------------------------------------------------
Ms. C. Jaime Agreda Gaitán
VOCAL
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado dictaminador, declaran que el presente
Informe de Tesis titulado: Efecto de las concentraciones de 2250, 3375 y 9000 ppm de
Methomyl sobre la germinación, el crecimiento y la actividad entomopatógena de
Beauveria bassiana, en condiciones de laboratorio, ha cumplido con los requisitos formales
y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.
------------------------------------------------
Dra. Manuela Natividad Lújan Velásquez
PRESIDENTA
------------------------------------------------
Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg
SECRETARIO
-------------------------------------------------
Ms. C. Jaime Agreda Gaitán
VOCAL
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DEDICATORIA
A Dios,
Por darme la vida, iluminar mi mente y fortalecer mi corazón poniendo en mi
camino a personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el período de
estudio.
A mis padres,
Zoraida y Alberto, por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, su incondicional
apoyo perfectamente mantenido a través del tiempo en toda mi educación tanto
académica como en la vida, gracias por creer y fomentar en mí el deseo de
superación y el anhelo de triunfo en la vida.
A mi familia,
A mi hermana Antonella, mis abuelos, tíos y primos porque el orgullo que sienten
por mí fue lo que me hizo seguir adelante. Mil palabras no bastarían para
agradecerles su apoyo, su comprensión y sus consejos, espero no defraudarlos y
contar siempre con su valioso, sincero e incondicional apoyo.
A mis amigas
Mis mejores amigas Cajabambinas, gracias por su apoyo incondicional porque a
pesar de los distintos caminos que tomamos la amistad permanece en el tiempo y a
mis amigas universitarias con las que nos apoyamos en nuestra formación
profesional y que hasta ahora seguimos siendo amigas.
Hoy puedo ver alcanzada mi meta, gracias a todos.
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AGRADECIMIENTOS
Mi agradecimiento profundo a un gran maestro, amigo, a mí asesor al Ms. C. Juan Héctor
Wilson Krugg, que con sus conocimientos, paciencia y amplia experiencia me ha brindado
las orientaciones y el apoyo desinteresado para poder concretizar la presente investigación.
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RESUMEN
Se determinó el efecto de las concentraciones de 2250, 3375 y 9000 ppm del insecticida
methomyl sobre la germinación, crecimiento y actividad entomopatógena de Beauveria
bassiana. El efecto de methomyl sobre la germinación de B. bassiana se determinó
colocando en diferentes frascos 2 mL de cada concentración del insecticida y 2 mL de la
suspensión de esporas, obteniéndose una concentración final de 1x105 esporas/mL.
incubándose a 25ºC, durante 24 horas; y luego se realizó el conteo de esporas germinadas.
Para evaluar el efecto del insecticida sobre el crecimiento de B. bassiana, se prepararon
placas de Petri conteniendo agar papa sacarosa y el insecticida a diferentes concentraciones,
así como también una placa control. Se sembró B. bassiana, por puntura en la parte central
de las placas de Petri y se incubó a 25°C durante 10 días. Para evaluar la actividad
entomopatógena se inocularon larvas de Spodoptera frugiperda con el hongo crecido en
medio con el insecticida a las concentraciones correspondientes; además del control que
fueron larvas inoculadas con el hongo crecido en agar papa sacarosa. Se encontró que
methomyl disminuye significativamente la germinación y el crecimiento in vitro de
Beauveria bassiana a 2250, 3375 y 9000 ppm. En cuanto a la capacidad entomopatógena se
encontró que methomyl no afecta la patogenicidad de B. bassiana sobre larvas de S.
frugiperda. Se concluye que el insecticida Methomyl disminuye el porcentaje de
germinación y crecimiento de B. bassiana en las concentraciones 2250, 3375 y 9000 ppm y
no afecta significativamente la actividad entomopatógena de B. bassiana sobre Spodoptera
frugiperda.
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INDICE
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ............................... ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ................................. iii
ASESOR ....................................................................................................................................... iv
PRESENTACIÓN ........................................................................................................................ v
MIEMBROS DEL JURADO .......................................................................................................... vi
APROBACIÓN .......................................................................................................................... vii
DEDICATORIA ........................................................................................................................ viii
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. ix
RESUMEN ................................................................................................................................... x
INDICE ........................................................................................................................................ xi
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 1
MATERIAL Y MÉTODO .......................................................................................................... 6
RESULTADOS…………………………………………………………………………………10
DISCUSIÓN .............................................................................................................................. .17
CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 21
RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 22
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 23
ANEXOS .................................................................................................................................... 31
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Anexo 1. Ficha técnica de METHOMEX 90 PS ............................................................ 31
Anexo 2. Insecticida METHOMEX 90 PS, principio activo methomyl .......................... 32
Anexo 3: Estructura y fórmula química de Methomyl .......................................................... 33
Anexo 4: Reactivación de cepa de Beauveria bassiana utilizada en el estudio ............... 34
Anexo 5: Evaluación de la germinación, frascos con caldo papa sacarosa, insecticida e
inoculados con B. bassiana ........................................................................................... 35
Anexo 6: Conteo de las esporas de B. bassiana en cámara de Neubauer ............................. 36
Anexo 7: Porcentaje de germinación de Beauveria bassiana frente a las diferentes
concentraciones del insecticida methomyl a las 24 horas de evaluación ............................... 37
Anexo 8: Análisis de varianza (ANOVA) del porcentaje de germinación de B. bassiana frente a las diferentes concentraciones del insecticida methomyl, utilizando el método Duncan…………………………………………………………………………………38 Anexo 9: Crecimiento radial promedio de B. bassiana (cm), a la concentración 0 ppm
del insecticida methomyl durante 10 días de evaluación ....................................................... 39
Anexo 10: Crecimiento radial promedio de B. bassiana (cm), a la concentración 2225 ppm
del insecticida methomyl durante 10 días de evaluación .................................................... 40
Anexo 11: Crecimiento radial promedio de B. bassiana (cm), a la concentración 3375 ppm
del insecticida methomyl durante 10 días de evaluación .................................................... 42
Anexo 12: Crecimiento radial promedio de B. bassiana (cm), a la concentración 9000 ppm
del insecticida methomyl durante 10 días de evaluación .................................................... 43
Anexo 13: Porcentaje de crecimiento de Beauveria bassiana frente a las diferentes
concentraciones del insecticida methomyl, a los 10 días de evaluación. ................. 44
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Anexo 14: Análisis de varianza (ANOVA) del porcentaje de crecimiento de B. bassiana
frente a las diferentes concentraciones del insecticida methomyl, utilizando el método
Duncan .......................................................................................................................... 48
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1
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades de las plantas se conocen desde que el hombre empezó a cultivar la
tierra, existen numerosas plagas que han provocado épocas de hambruna, un desarrollo
agrícola lento, y el déficit alimentario mundial.1 Se consideran como plaga agrícola a
diversas poblaciones de animales fitófagos, se trata de un criterio esencialmente económico
puesto que disminuyen la producción de los cultivos, reducen el valor de las cosechas e
incrementa sus costos de producción. Las plagas agrícolas se encuentran agrupadas en
categorías: primarias o plagas clave, secundarias o potenciales, ocasionales, migratorias,
directas e indirectas.2
Los insectos patógenos o malezas, son responsables del 37 al 50% de las perdidas
reportadas en la agricultura mundial.3 Los agricultores durante años han tratado de
mantener las poblaciones de plagas a densidades menores que aquellas que comienzan a
producir daños, con el fin de evitar deterioro en los cultivos, en el aspecto del producto
cosechado, disminución del valor nutritivo u otra cualidad que influya en el cultivo. Al ser
necesario buscar una alternativa de solución debido a que las plagas reducen el valor o
beneficio económico que se obtiene de la cosecha, se han buscado diferentes controles
utilizando recursos naturales, técnicas artificiales, entre otros, siendo el más predominante
el control químico.2
El control químico usa diversas sustancias las cuáles interfieren en el desarrollo de las
plagas ya sea en su ciclo de vida, en su comportamiento, reprimiendo sus poblaciones, estos
químicos son denominados pesticidas o plaguicidas. Existen pesticidas con números
compuestos y tienen un uso específico para la plaga a tratar, según esto se denominan:
insecticidas, acaricidas, nematicidas, fungicidas y también se incluye a los herbicidas, los
cuáles se utilizan para combatir las malezas.4
Desde los años 90 el uso de plaguicidas ha tenido una gran demanda económica,
obteniendo un crecimiento del 11% por año, alcanzando a distribuirse millones de
toneladas en diferentes partes del mundo5,6.
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2
Los carbamatos son sustancias orgánicas de síntesis conformadas por un átomo de
nitrógeno unido a un grupo lábil, el ácido carbámico. Este tiene un efecto neurotóxico,
actúan al igual que los organofosforados inhibiendo al acetilcolinesterasa en las sinapsis
nerviosas, en la dosis correspondiente conlleva a la muerte. Sus características principales
son su alta toxicidad, su baja estabilidad química y su nula acumulación en los tejidos,
característica que lo posiciona en ventaja con respecto a los organoclorados de baja
degradabilidad y gran acumulación7,8,9, existen más de 50 grupos carbámicos son usados
como insecticidas, herbicidas y fungicidas. Los carbamatos utilizados como insecticidas
son los alquilcarbamatos.10
El Methomex 90PS, es un insecticida sistémico pertenece a la familia de los carbamatos, su
ingrediente activo es el methomyl, de amplio espectro de acción y efecto inmediato por
contacto e ingestión. En la planta tiene actividad sistémica ascendente y aplicada al follaje
tiene movimiento translaminar. Es recomendado para el control de insectos masticadores
(lepidópteros) y picadores-chupadores (trips) en sus estados de larvas y adultos, acción
ovicida en lepidópteros y al ser absorbida por las plantas actúa rápidamente por ingestión
en larvas recién eclosionadas. Actúa sobre el sistema nervioso del insecto mediante la
inhibición de la enzima acetilcolinesterasa bloqueando la transmisión de los impulsos
nerviosos y acumulación de acetilcolina provocando excitación, hiperactividad,
descoordinación, temblores y muerte rápida de los insectos. 11
Durante las últimas décadas han ocurrido diversos cambios en cuanto al uso de la
protección química de los cultivos, y esta ha sido dirigida a la utilización de compuestos
menos tóxicos y más selectivos.12 El control químico constituye uno de los campos que más
ha avanzado y se ha desarrollado, se han invertido grandes cantidades de dinero para su
implementación, han sido considerados compuestos inevitables para el control de plaga,13
pero el fracaso del control químico como única arma contra las plagas es que carece de base
ecológica y por tanto interfiere o destruye las probabilidades de regulación
natural2.Actualmente los organismos de la unión Europea están restringiendo la
importación de productos vegetales los cuáles hayan sido tratados con químicos, las
preferencias de los consumidores europeos es por productos agrícolas naturales que
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cumplan con un desarrollo sostenible. Todos los procesos de cambio incitan a las empresas
agrarias a adaptarse a los requerimientos de los consumidores.14
La implementación del Manejo Integrado de Plagas (MIP) busca que las plagas y las
enfermedades se controlen de manera más eficiente, haciendo uso de diversas formas de
control y de forma integrada, los tipos de control que se puede utilizar son: control
biológico, cultural, mecánico, etiológico y químico.15 Según la Organización de las
Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, el MIP es un sistema de
manipulaciones de las plagas que, en el contexto del ambiente relacionado y la dinámica de
población de la especie dañina, utiliza todas las técnicas y métodos apropiados de la manera
más compatible posible y mantiene la población de la plaga a niveles inferiores a los que
causarían daño económico.16
El control biológico es un método que emplea organismos vivos, denominados también
enemigos naturales, estos reducen la densidad de la población de otros organismos plaga.
Los organismos que son utilizados en el control biológico de invertebrados, se clasifican en
cuatro categorías: parasitoides, depredadores, patógenos y competidores. Los agentes que
forman parte del control provienen de diversos grupos taxonómicos, incluyendo a los
insectos, ácaros, nematodos y microorganismos, tales como las bacterias, los virus, los
hongos y los organismos unicelulares. Al pertenecer a distintos grupos poseen diferentes
propiedades biológicas y comportamientos variados, estas diferencias hacen que unos u
otros sean más o menos exitosos como biocontroladores en una estrategia de control
determinada.17
Los hongos entomopatógenos, tienen un gran potencial para ser empleados como
biocontroladores, debido a la gran variedad de especies y amplio rango de hospedantes así
como por su crecimiento microscópico sobre la superficie de su huésped. Ciertos hongos
poseen características peculiares que les permiten sobrevivir en forma parasítica sobre los
insectos y en forma saprofita sobre material vegetal en descomposición. Todos los insectos
son susceptibles de ser afectados por algún hongo. Entre los principales hongos que
presentan estas características están: Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces.18
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Beauveria bassiana, es un hongo entomopatógeno el cuál fue descubierto causando la
muerte de gusanos de seda, se encuentra de forma natural en suelos y sobre diversos
insectos (coleópteros, dípteros, heterópteros, homópteros, lepidópteros, tisanópteros).
Según su clasificación taxonómica es un hongo imperfecto19 y al colonizar a su hospedero
le causa diversos síntomas como pérdida de sensibilidad, falta de coordinación, letargo,
inapetencia, melanización y parálisis. Con la muerte del insecto, el beneficio del control
biológico se incrementa pues la esporulación del hongo sobre el insecto y su posterior
dispersión del hongo, le permite un control más allá de la aplicación.20
Mediante la implementación del MIP, se han ido realizando diversos estudios de
interacción entre controladores biológicos y sustancias químicas, se probaron
combinaciones de DDT con Beauveria bassiana sin encontrar un efecto significativo de la
micosis en la larva del escarabajo de la papa Leptinotarsa decemlineata, otros estudios han
indicado que los insecticidas pueden inhibir el crecimiento de B. bassiana.21 Además se
probó combinaciones de B. bassiana con diversos insecticidas (carbaryl, fenvalerate,
anamectin, triflumuron y thuringiensen) observándose una compatibilidad de estos
químicos con el hongo.22
En otro estudio se estableció el efecto de los insecticidas endosulfan, clorpirifos,
fenitrotion, diazinon PM, diazinon EM, malation, isazofos y pirimifosmetil sobre B.
bassiana en el manejo de la broca, Hypothenemus hampei, observándose que tenía un
efecto fungistático.23 En aislados de B. bassiana con plaguicidas de uso común en la
práctica agrícola como carbofurán y malatión como insecticidas, benomil (Benlate) y bis,
ditiocarbamato de zinc (Manzate) como fungicidas; se evaluó la compatibilidad,
encontrando en general que los aislados presentaron una inhibición mayor con los
insecticidas (en ambas concentraciones) que con los fungicidas. Con respecto a los
plaguicidas, benomil inhibió considerablemente a todos los aislados, los insecticidas
redujeron ligeramente todos los aislados.24 Por otro lado sé enfrento a B. bassiana y M.
anisopliae con Nimkol-L® para el combate de Heterotermes tenuis, encontrándose que B.
bassiana era menos sensible al químico por lo tanto más compatible que Metarhizium.25
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La compatibilidad con hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana, 26-31
Metarhizium,32 Paecilomyces fumosoroseus 33 y Lecanicillium lecanii34 De acuerdo a estos
estudios, el efecto que producen diversos agroquímicos está relacionado con la
germinación, que es de carácter irreversible y el desarrollo micelial de estos hongos.
Investigaciones se han enfocado en la influencia de varios agroquímicos en la germinación
y el crecimiento de hongos controladores in vitro, ya que todas las clases de agroquímicos
son potencialmente inhibitorios
No es posible dar conclusiones específicas acerca de la compatibilidad de todas las
sustancias químicas con lo diferentes hongos entomopatógenos, debido a que cada
microorganismo reacciona de diferente forma frente a un control químico, pero los
resultados de las diferentes investigaciones, pueden ayudar al agricultor en la
implementación de la integración de controles, así mismo estás investigaciones facilitan la
identificación de los impactos adversos del control químico sobre el biológico, por lo tanto
es necesario obtener más información sobre la compatibilidad de cepas específicas de
hongos con los agroquímicos usados en un determinado agroecosistema. Debido a lo
expuesto, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de las concentraciones de
2250, 3375 y 9000 ppm de Methomyl sobre la germinación, el crecimiento y la actividad
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MATERIAL Y MÉTODO
1. Material de estudio
• Cultivo puro de B. bassiana proporcionado por el Laboratorio de Fitopatología del
Departamento Académico de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias
Biológicas Universidad Nacional de Trujillo.
Larvas de Spodoptera frugiperda
• Methomex 90PS, cuyo componente activo es el methomyl
2. Procedimiento
2.1. Evaluación del efecto del methomyl sobre la germinación de esporas de B.
bassiana.
2.1.1. Resiembra del cultivo de B. bassiana
A partir del cultivo puro de B. bassiana se sembró por puntura en tres tubos de
ensayo de 16 x 180 mm con Agar Papa Sacarosa, los cuales se incubaron a
25ºC durante 10 días, obteniéndose cultivos jóvenes.
2.1.2. Propagación del cultivo de B. bassiana.
A partir del cultivo joven de B. bassiana se preparó una suspensión de esporas
la cual se sembró en un frasco plano conteniendo Agar Papa Sacarosa y se
incubó a 25ºC durante 10 días.
2.1.3. Preparación del inóculo de esporas
El inóculo de esporas se obtuvo agregando 10 mL de solución Tween 80 al
0.1% a cada frasco plano con Agar Papa Sacarosa que contenía a B. bassiana.
Luego se trató de liberar las esporas del hongo con la ayuda de un asa
bacteriológica, la suspensión obtenida se colocó en un matraz estéril.
Se determinó la concentración de esporas mediante el recuento en cámara de
recuento celular y se estandarizó a una concentración de 105 esporas/mL.
2.1.4. Inoculación e incubación
Se colocó 2mL de caldo papa sacarosa y el insecticida methomyl (doble
concentrado) en frascos pequeños de vidrio estériles boca ancha, 3 frascos
para cada concentración; a estos frascos se le agregó 2mL del inóculo de
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esporas de B. bassiana en cada frasco; obteniendo una concentración de
methomyl de 2250 ppm, 3375 ppm, 9000 ppm y de 1 x 105 esporas/mL.
Además, se preparó una suspensión de esporas control 0 ppm a la cual no se le
agregó insecticida. Posteriormente cada frasco se incubó a una temperatura
promedio de 25ºC, durante 24 horas.
2.1.5. Lectura
Transcurrido el tiempo de incubación se agregó gotas de azul de lactofenol en
cada uno de los frascos, luego se realizó el recuento en la Cámara de recuento
celular, contándose todas las esporas germinadas para cada concentración del
insecticida a evaluar, incluyendo el control. Con el fin de determinar el
porcentaje de germinación el recuento control fue tomado como el 100 %.
2.2. Evaluación del efecto de methomyl sobre el crecimiento de B. bassiana
2.2.1. Preparación del medio de cultivo
Se prepararó Agar Papa Dextrosa en cuatro matraces conteniendo 100 mL de
medio cada uno. El medio de cultivo fue esterilizado en autoclave y se dejó
enfriar hasta una temperatura aproximada de 45°C. Estando aún fundido el
medio, a tres de los matraces se les adicionó methomyl en cantidad suficiente
para obtener una concentración final 2250 ppm, 3375 ppm, 9000ppm
respectivamente. Al medio de cultivo contenido en el matraz restante no se le
agregó el methomyl, a fin de utilizarlo como control. Luego, los medios de
cultivo de cada uno de los cuatro matraces se sirvieron en placas de Petri
estériles (tres placas por cada concentración, incluyendo el control).
2.2.2. Siembra e incubación
A partir del cultivo joven de B. bassiana, se sembró por puntura en la parte
central de las placas Petri conteniendo Agar Papa Dextrosa previamente
preparadas en el paso anterior (tres placas por concentración incluidas las
placas del control); estas placas se incubaron a temperatura promedio de 25°C
durante 10 días.
2.2.3. Lectura.
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A partir del tercer día hasta el décimo día de incubación, se midió el radio de
crecimiento micelial en milímetros (mm) del hongo en cuatro direcciones,
obteniendo un radio promedio de crecimiento por día y por cada
concentración del insecticida y el grupo control. Los resultados del
crecimiento se expresaron en mm y en porcentaje de crecimiento (%C),
teniendo en cuenta el crecimiento alcanzado por el grupo control (100%) de la
siguiente manera:
* La fórmula es una regla de tres simple.
2.3. Evaluación del efecto de methomyl sobre la patogenicidad de B. bassiana.
2.3.1. Recolección e identificación de adultos de Spodopthera frugiperda
Los ejemplares en su estado larval fueron recolectados en frascos de vidrio de
boca ancha y trasladados al laboratorio de Entomología de la Facultad de
Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo para su
identificación mediante claves taxonómicas.
Posterior a su identificación, estos fueron trasladados al laboratorio de
Fitopatología donde se les retiró residuos vegetales y restos de suelo que
puedieron haber quedado impregnados en ellos.
2.3.2. Crianza de S. frugiperda.
Los insectos fueron colocados en placas de Petri y observados diariamente por
un lapso de cinco días (cuarentena).
La alimentación consistió en pedazos de hojas de lechuga, las cuales también
sirvieron para mantener la humedad. El alimento fue lavado previamente con
agua así mismo diariamente se limpiaron las placas retirando los ejemplares
muertos y colocándoles alimento fresco.
2.3.3. Propagación del cultivo de B. bassiana
Se realizará según el procedimiento dado en el punto 2.1.2.
2.3.4. Preparación del inóculo de esporas de B. bassiana.
El inóculo de esporas se obtuvo agregando 10 mL de solución Tween 80 al
0.1% a cada frasco plano con Agar Papa Dextrosa que contenía a B. bassiana.
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Luego se trató de liberar las esporas del hongo con la ayuda de una asa
bacteriológica, la suspensión obtenida se colocó en un matraz estéril.
Se determinó la concentración de esporas mediante el recuento en Cámara de
recuento celular y se estandarizó a una concentración de 107 esporas/mL.
2.3.5. Inoculación de S. frugiperda.
Los ejemplares adultos de S. frugiperda se colocarón en placas de Petri de, en
grupos de 3 ejemplares.
La inoculación de la solución acuosa conteniendo una concentración de 1 x
107 esporas/mL de B. bassiana se realizó por aspersión; un grupo fue
inoculado con esporas de B. bassiana que crecieron en medio de cultivo sin
methomyl y los otros tres grupos fueron inoculados con B. bassiana que
creció en medio con las tres concentraciones evaluadas. Se siguió
proporcionando alimento en forma equitativa al número de poblaciones de S.
frugiperda.
2.3.6. Observación de síntomas y/o signos de S. frugiperda
Después de la inoculación, se evaluó durante 10 días a los cuatro grupos para
determinar síntomas de ataque por B. bassiana como pérdida de apetito,
parálisis, muerte y momificación del insecto.
2.3.7. Aislamiento de B. bassiana a partir de S. frugiperda infectados
experimentalmente.
Los ejemplares muertos se colocaron en placa de Petri y fueron incubados en
cámara húmeda estéril a una temperatura aproximada de 25°C, hasta la
aparición del micelio en la superficie del insecto.
Posteriormente se procedió a la identificación microscópica y macroscópica
de la colonia resultante.
2.4. Análisis de datos
La determinación del efecto del insecticida methomyl sobre Beauveria bassiana, se
realizó analizando el porcentaje de germinación y el porcentaje de crecimiento
Beauveria bassiana en las diferentes concentraciones del insecticida, y los datos
fueron procesados en base a la prueba de Análisis de Varianza Unidireccional
(ANOVA), según el paquete estadístico SPSS v.22
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RESULTADOS
En la Fig. 1 se observa, la tendencia decreciente del porcentaje de germinación de
Beauveria bassiana en relación al control, conforme va aumentando la concentración del
insecticida Methomyl. En la Fig. 2 se observan las esporas germinadas de Beauveria
bassiana en las diferentes concentraciones de Methomyl.
En la Fig. 3 se observa, el decrecimiento del porcentaje de crecimiento de Beauveria
bassiana, conforme va aumentando la concentración del insecticida Methomyl. En la Fig. 4
se observa el crecimiento radial en placa, de Beauveria bassiana en las diferentes
concentraciones de Methomyl.
En las Fig. 4 se observa los síntomas y signos causados por Beauveria bassiana al ser
inoculado en larvas de Spodoptera frugiperda. En las Fig. 5 se observa las características
macroscópicas y microscópicas del hongo reaislado del insecto, luego de su muerte causado
por Beauveria bassiana al ser inoculado en larvas de Spodoptera frugiperda.
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Fig.1. Porcentaje de germinación de Beauveria bassiana en las concentraciones de 2250,
3375 y 9000ppm del insecticida methomyl, a las 24 horas de incubación.
a: p<0.05 Existe diferencia significativa
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Fig.2. Observaciones microscópicas de esporas germinadas de Beauveria bassiana en las
concentraciones de 0, 2225 y 3375ppm del insecticida Methomyl, aumento de 10x.
g: Espora germinada
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Fig.3. Porcentaje de crecimiento de Beauveria bassiana en las concentraciones de 2250,
3375 y 9000ppm del insecticida Methomyl, a las 24 horas de incubación a una temperatura
de 25°C.
a: p < 0.05 Existe diferencia significativa
100%
39.05%
11.72%
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Fig.4. Crecimiento radial, en placa, de Beauveria bassiana, frente a diferentes concentraciones del insecticida Methomyl, a los 10
días de incubación.
CONTROL
0 ppm
Methomyl
2250 ppm
Methomyl
3375 ppm Methomyl
9000 ppm
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Fig. 5. Síntomas y signos observados en las larvas de Spodoptera frugiperda colonizadas
con B. bassiana procedentes de 0, 2250 y 3375 ppm de Methomyl.
SINTOMAS/ SIGNOS
0 PPM
2250PPM
3375PPM
Presencia de micelio blanco
algodonoso
+
+
+
Melanización + + +
Regurgitación + + +
Diarrea + + +
Pérdida del apetito + + +
Movimiento errático + + +
Letargo + + +
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Fig. 6. Larvas de Spodoptera frugiperda colonizadas con B. bassiana procedente de A.
Medio con 0 ppm de Methomyl. B. Medio con 2250 ppm de Methomyl C. Medio con 3375
ppm de Methomyl. D Conidias y conidióforo típico de B.bassiana, observadas al aumento
de 40 X.
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DISCUSIÓN
Según los datos obtenidos se observa que a diferentes concentraciones de
methomyl la germinación de Beauveria bassiana presenta una tendencia decreciente,
encontrándose que a medida que aumenta la concentración del insecticida, el porcentaje de
germinación del hongo disminuye (Fig. 1). Estadísticamente se observa que hay diferencia
significativa en las tres concentraciones utilizadas de methomyl, lo cual nos indica que en
las diferentes concentraciones utilizadas hay un efecto diferente en la germinación de
Beauveria bassiana.
El efecto de las diferentes concentraciones del insecticida sobre el porcentaje de
germinación de Beauveria bassiana puede deberse a que la espora pasa por dos fases de
germinación importantes, la fase inicial se denomina hinchamiento hidrostático, debido a
que la espora empieza a hincharse, lo cual se debe al efecto de la hidratación, en este
proceso la espora empieza a absorber los nutrientes de su medio35. En los ensayos
realizados se utilizó el medio papa sacarosa en el cuál se diluyó al insecticida methomyl,
esté presenta una alta solubilidad en agua11, 36 favoreciendo su dilución, ingresando a la
espora y evitando que está siga la siguiente fase denominada hinchamiento metabólico, en
la cual la espora utiliza los nutrientes absorbidos para la generación de su pared interna, la
cual formara parte del tubo germinativo37.
En los resultados obtenidos también se observa que en las concentraciones de
2250ppm y 3375 ppm hay un porcentaje de germinación, esto puede haberse dado debido a
que las esporas son capaces de absorber compuestos orgánicos y transformarlos por medio
de enzimas en compuestos asimilables para su desarrollo, además debido a la variabilidad
genética entre esporas se puede dar un proceso de diferentes niveles de resistencia a
diversos compuestos químicos por varios mecanismos38, 39.
En relación al efecto de las diferentes concentraciones del insecticida methomyl
sobre el crecimiento de B. bassiana, estadísticamente se puede observar que existe
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diferencia significativa en las concentraciones evaluadas. A mayor concentración se pudo
observar un efecto inhibitorio en el crecimiento del hongo en comparación con el control
(Fig. 3), se evidencia que en las concentraciones de 2250 y 3375 ppm hubo crecimiento
pero el hongo pasó por un proceso fungistático es decir su crecimiento se retardó, esto se
debe a que el insecticida interfiere en los mecanismos que están implicados en la
producción de nuevos materiales celulares además el hongo utiliza vías metabólicas
alternas para reducir o evitar la adsorción del compuesto químico 35,40.
Methomyl, es un insecticida sistémico de amplio espectro de acción perteneciente al
grupo químico de los carbamatos, su nombre químico según la IUPAC se encuentra
registrado como S-metil (EZ)-N-(metilcarbamoiloxi) tioacetimidato. Es utilizado en
diferentes cultivos entre ellos alcachofa, alfalfa, espárrago, frijol, maíz y tomate con el fin
de controlar insectos masticadores (lepidópteros), picadores-chupadores (trips) en sus
estados de larvas y adultos36, 41.
Este insecticida tiene un efecto inmediato por contacto e ingestión, se adhiere a la
enzima acetilcolinesterasa evitando que está pueda hidrolizar el neurotransmisor
acetilcolina, esté al no hidrolizarse se sintetiza constantemente con lo consiguiente no se
interrumpe el impulso nervioso, ocasionando excitación, hiperactividad, descoordinación,
temblores y muerte rápida en los insectos42. En las plantas tiene actividad ascendente y
aplicada al follaje presenta un movimiento translaminar, así mismo al ser absorbido por las
plantas su acción es inmediata por ingestión de larvas eclosionadas36.
En la evaluación de la actividad entomopatógena, se tuvo en cuenta utilizar las
concentraciones en las que se observó crecimiento, es así que se utilizó esporas de B.
bassiana las cuáles fueron aisladas de los medios con concentraciones de 2250ppm y
9000ppm. Así mismo se utilizó larvas de S. frugiperda estás al ser inoculadas por B.
bassiana presentaron la sintomatología típica, como el movimiento errático, la
momificación y el crecimiento micelial del hongo sobre la superficie del insecto, luego de
la muerte de éste43 (Fig. 5).
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Methomyl, según los ensayos realizados tiene un efecto decreciente en la
germinación y en el crecimiento de B. bassiana pero se determinó que el hongo no perdió
su capacidad entomopatógena a pesar de a ver crecido en un medio envenenado; el hongo
posiblemente utilizó al insecticida soló como fuente de nutrientes pero no afecto en el
mecanismo de acción de B. bassiana es así que según las investigaciones esté hongo
entomopatógeno desarrollaría el siguiente mecanismo; la espora se adhiere a la cutícula de
la larva de S. frugirperda, posteriormente desarrolla su tubo germinativo el cuál penetrara
al interior del cuerpo del insecto y un apresorio ayudándole a la fijación en la cutícula del
insecto, en esta fase se produce un mecanismo físico y químico, siendo el físico la presión
ejercida por la hifa, la cual permite el rompimiento de la área esclerosada y membranosa de
la cutícula. El mecanismo químico se da debido a la acción enzimática, dónde proteasas,
lipasa y quitinasas causan descomposición del tejido en la zona de penetración44, 45.
Además el hongo puede ingresar al insecto a través de las aberturas corporales como,
espiráculos, cavidad bucal y otras aberturas externas. En estos ambientes las esporas se
desarrollan con mayor facilidad debido a la humedad46, 47.
Posterior a la penetración, la hifa llega al hemocele en dónde se producen reacciones
de defensa por parte del insecto como fagocitosis y formación de compuestos
antimicrobianos el hongo en defensa produce blastosporas las cuáles se multiplican y
dispersan produciendo micotoxinas, B. bassiana produce una toxina llamada beauvericina
la cual paraliza las células del insecto bloqueando la respuesta inmunológica., así mismo
estás actúan en el sistema circulatorio utilizando la hemolinfa como sustrato, en el sistema
digestivo provocan regurgitación, diarrea, pérdida de apetito y en el sistema respiratorio se
obstruyen los espiráculos48, 49, 50 .
Como efecto entomopatógeno del hongo se producen una serie de comportamientos
anormales en el insecto como: convulsiones, descoordinación, deja de alimentarse, entra en
un estado letárgico finalmente produciéndose la muerte.
Al morir el insecto, el hongo forma masa micelianas, las cuales permiten al hongo
esparcirse al salir por las regiones intersegmentales siendo así un inóculo potencial para
infectar a otros insectos51, 52, 53.
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Según estudios sobre compatibilidad, se ha demostrado que el insecticida methomyl
no ejerce efectos letales sobre los hongos entomopatógenos54, así mismo nos proporcionan
información sobre la capacidad que tiene B. bassiana para poder utilizar productos
fitosanitarios como fuente de alimento, siendo menos sensible al químico por lo tanto más
compatible25, 55. En otros estudios se observó efectos fungistático del insecticida sobre B.
bassiana, inicialmente se observó un ligero retardo en la germinación y crecimiento del
hongo, especialmente en las pruebas sobre germinación conidial, sin embargo pasadas 24
horas se observó homogeneidad en el crecimiento al comparar el resultado con los
controles56. En los ensayos realizados se puede comprobar la compatibilidad de methomyl
en las concentraciones de 2250ppm y 3375 ppm, el hongo utilizó la composición química
del insecticida en su germinación y crecimiento, así mismo se observó el efecto
fungistático en el crecimiento de B. bassiana el cuál se dio por un tiempo de 24 horas para
la concentración de 2250ppm y 120 horas en 3375ppm.
B. bassiana fue evaluada con diversos insecticidas (carbaryl, fenvalerate, anamectin,
triflumuron, thuringiensen entre otros), a dosis subletales observándose una compatibilidad
de estos químicos con el hongo22, 23. En los ensayos realizados se utilizó dosis letales
observándose compatibilidad pero pasando por un efecto fungistático, por lo cual se puede
determinar que el uso de concentraciones bajas con respecto a las utilizadas
convencionalmente en el control de insectos hace que sea posible utilizar un agente
biocontrolador.
Otros autores no explican la importancia de la acción conjunta de un hongo
entomopatógeno y un agente químico, está unión introduce múltiples factores de
mortalidad sobre los insectos objetivo, lo que puede representar una ventaja en el manejo
de plagas y retrasar alguna expresión de resistencia a nuevos insecticidas, especialmente
cuando se piensa en reducir las poblaciones de insectos plaga con una ecología compleja57.
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CONCLUSIONES
Al incrementarse la concentración de methomyl de 2250 a 9000 ppm disminuye
significativamente la germinación y el crecimiento de Beauveria bassiana.
El methomyl a las concentraciones de 2250, 3375 y 9000 ppm de methomyl no afecta
significativamente la actividad entomopatógena de Beauveria bassiana sobre
Spodoptera frugiperda.
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RECOMENDACIONES
Evaluar la compatibilidad de methomyl y B. bassiana en campo, teniendo en cuenta las
condiciones ambientales, el tipo de cultivo, la densidad de la plaga a controlar y la
concentración del insecticida.
Investigar el efecto del insecticida methomyl frente a otros hongos usados como
controladores biológicos.
Determinar la concentración exacta para la dosis en campo teniendo en cuenta la
compatibilidad con B. bassiana.
Aislar hongos entomopatógenos en cultivos expuestos a insecticidas, con la finalidad de
obtener cepas nativas resistentes.
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13418-900,
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ANEXOS
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Anexo 1. Ficha técnica Methomex 90 PS
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Anexo2. Insecticida Methomex, principio activo methomyl.
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Anexo 3. Estructura y fórmula química de methomyl.
FÓRMULA UIMICA: C5H10N2O2S
TIPO DE PLAGUICIDA: Insecticida
CLASIFICACIÓN : Carbamato
PESO MOLECULAR: 162.21
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Anexo 4. Reactivación de cepa de B. bassiana utilizada en el estudio.
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Anexo 5. Evaluación de la germinación, frascos con caldo papa sacarosa e insecticida los
cuales fueron inoculados con B.bassiana.
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Anexo 6. Conteo de las esporas de B. bassiana en cámara de Neubauer.
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Anexo 7. Porcentaje de germinación de Beauveria bassiana frente a las diferentes
concentraciones del insecticida methomyl, a las 24 horas de evaluación.
Concentración
methomyl
(ppm)
Germinación (%) de Beauveria bassiana
1 2 3 4 Promedio Porcentaje
0 15.97 16.12 16.18 14.39 15.67 100%
2275 4.84 4.70 3.31 2.43 3.82 24%
3375 0.95 0.75 0.70 0.66 0.77 5%
9000 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0%
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Anexo 8: Análisis de varianza (ANOVA) del porcentaje de germinación de B. bassiana
frente a las diferentes concentraciones del insecticida methomil, utilizando el método
Duncan.
Pruebas post hoc Subconjuntos homogéneos
Germinación de Beauveria bassiana
Duncana
Concentración de Methomyl N
Subconjunto para alfa = 0.05
1 2 3 Methomyl 9000ppm 4 ,0000 Methomyl 3375ppm 4 ,7650 Methomyl 2250ppm 4 3,8200 Methomyl 0ppm 4 15,6650
Sig. ,160 1,000 1,000
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.
a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 4,000.
ANOVA Germinación de Beauveria bassiana
Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig. Entre grupos 632,217 3 210,739 404,774 ,000 Dentro de grupos
6,248 12 ,521
Total 638,465 15
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Anexo 9: Crecimiento radial promedio de B. bassiana (cm), a la concentración 0 ppm del
insecticida methomyl durante 10 días de evaluación.
Anexo 10: Crecimiento radial promedio de B. bassiana (cm), a la concentración 2225 ppm del
insecticida methomyl durante 10 días de evaluación.
Ensayo
Radio de la colonia (cm)
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
1 0.34 0.43 0.50 0.54 0.64 0.73 0.83 0.91 1.03 1.05
2 0.33 0.42 0.49 0.54 0.61 0.73 0.80 0.91 0.99 1.11
3 0.42 0.63 0.81 1.00 1.19 1.58 1.78 1.99 2.31 2.72
Promedio 0.37 0.49 0.60 0.69 0.81 1.01 1.14 1.27 1.44 1.63
Ensayo
Radio de la colonia (cm)
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
1 0.16 0.25 0.34 0.38 0.47 0.48 0.60 0.57 0.61 0.71
2 0.00 0.00 0.14 0.18 0.25 0.27 0.29 0.33 0.33 0.39
3 0.00 0.00 0.14 0.25 0.35 0.49 0.59 0.63 0.74 0.81
Promedio 0.05 0.08 0.21 0.27 0.36 0.41 0.50 0.51 0.56 0.64
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Anexo 11: Crecimiento radial promedio de B. bassiana (cm), a la concentración 3375 ppm del
insecticida methomyl durante 10 días de evaluación.
Anexo 12: Crecimiento radial promedio de B. bassiana (cm), a la concentración 9000 ppm del
insecticida methomyl durante 10 días de evaluación.
Ensayo
Radio de la colonia (cm)
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.10 0.14 0.14 0.18 0.18
2 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.10 0.13 0.16 0.16 0.18
3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.23 0.21 0.22
Promedio 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.07 0.09 0.18 0.18 0.19
Ensayo
Radio de la colonia (cm)
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
2 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Promedio 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
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Anexo 13: Porcentaje de crecimiento de Beauveria bassiana frente a las diferentes
concentraciones del insecticida methomyl, a los 10 días de evaluación.
Tratamientos ppm
Día 10 Porcentaje
0 1.63 100%
2250 0.64 39.05%
3375 0.19 11.72%
9000 0.00 0.00%
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Anexo 14: Análisis de varianza (ANOVA) del porcentaje de crecimiento de B. bassiana
frente a las diferentes concentraciones del insecticida methomyl utilizando el método
Duncan.
Pruebas post hoc
Subconjuntos homogéneos
ANOVA
Crecimiento de Beauveria bassiana
Suma de
cuadrados gl Media
cuadrática F Sig. Entre grupos 5,543 3 1,848 32,707 ,000 Dentro de grupos
2,034 36 ,056
Total 7,577 39
Crecimiento de Beauveria bassiana
Duncana
Concentración de Methomyl N
Subconjunto para alfa = 0.05
1 2 3 Methomyl 9000ppm 10 ,0000 Methomyl 3375ppm 10 ,0710 Methomyl 2250ppm 10 ,3590 Methomyl 0ppm 10 ,9450
Sig. ,508 1,000 1,000
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.
a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 10,000.
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