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Enzimi di Fase II
Prof. Giorgio Sartor
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Versione 3.4 – oct 2008
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Enzimi di Fase II
Lipofilo Idrofilo
Xenobiotico Metabolita|OH
Metabolita|OR
Fase I(ossidazione)
Fase II(sintesi)
• Variazione di polarità• Variazione di funzionalità
• Variazione di dimensioni• Variazione di carica• Variazione di solubilità
• Diminuzione dell’attività biologica• Aumentata escrezione
Escrezione
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Gli enzimi di fase II catalizzano reazioni di:
• Coniugazione con– Acido glucuronico– Glutatione – Solfato– Acetile– Aminoacidi
• Metilazione� Metallotioneine
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Gli enzimi di fase II catalizzano reazioni di:
• Coniugazione con– Acido glucuronico– Glutatione – Solfato– Acetile– Aminoacidi
• Metilazione� Metallotioneine
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Glucuronazione
• Coniugazione di xenobiotici con un H labile con acido glucuronico da acido uridindifosfoglicerico(UDPGA)
O
OH
O
OH
OH
OH
O N
O
OH
N
O
OH
O
O
POO
O
POO
O
O
OHOH
OH
OO
H
UDPGA
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Formazione di UDPGA
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Formazione di UDPGA
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Glucosio-1-fosfato
O O
OH
P
OH
O
O
O
OH
OH
P OO
O
O
O
OH
OH
OH
OH
P OO
O
O
O
OH
OH
O
OH
P
O
O
OfosfoglucomutasiEC 5.4.2.2
G6P
G1P
G16BP
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FosfoglucomutasiEC 5.4.2.2 (1C47)
G16BP
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FosfoglucomutasiEC 5.4.2.2 (1C47)
G16BP
SER-19
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Formazione di UDPG
NO
OH
NH
OOH
O
O
POO
OPOO
OPO
OO O O
OH
P
OH
O
OO
OH
OH
P OOO
O
PO
OH
O NO
OH
NH
OOH
O
O
POO
OPOO
OO
OHOH
OH
OH
+
+
UTP-glucoso-1-fosfato uridililtransferasiEC 2.7.7.9
UTP
UDPG
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Formazione di UDPGA
NO
OH
NHOOH
O
O
POO
OPOO
OO
OHOH
OH
OH NNO
N
OH
N
NH2
OH
OPOO
OPOO
OO
OH
N+
OH
NH2
O
NO
OH
NH
O
OH
O
O
POO
OPOO
O
O
OHOH
OH
OO
NNO
N
OH
N
NH2
OH
OPOO
OPOO
OO
OH
N
OH
NH2
O
HH
H+
+ +
+ +
H2O
UDP-glucoso 6-deidrogenasiEC 1.1.1.22
UDPGNAD+
UDPGA NADH
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UDP-glucoso-6-deidrogenasi
NAD+
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UDP-glucoso-6-deidrogenasi
NAD+
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Coniugazione con acido glucuronico
NO
OH
NH
O
OH
O
O
POO
OPOO
O
O
OHOH
OH
OO
NO
OH
NH
OOH
O
O
POO
OPO
OO O
OH
O
O O
OHOH
R
+
+
ROH
UDPglucuronato β-D-glucuronosiltransferasiEC 2.4.1.17
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β-UDP-glucuroniltransferasi
• L’enzima β-UDP-glucuroniltransferasiforma O-, N-, S-, C- glucuronati; – Sei forme nel fegato umano– Il cofattore è UDP-glucuronato– Induttori: fenobarbital, indoli, 3-metilcolantrene,
(fumo di sigarette).– Substrati: destrofano, metadone, morfine, p-
nitrofenolo, acido valproico, ormoni steroidei,bilirubina.
CH3
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Metabolismo degli androgeni ed estrogeni
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Metabolismo delle porfirine
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• Sindrome di Crigler-Nijar (grave): enzima inattivato; grave iperbilirubinemia; gli induttori non hanno effetto.
• Sindrome di Gilbert (lieve): ridotta attivitàenzimatica; lieve iperbilirubinemia; il fenobarbital porta la glucuronazione della bilirubina alla normalità
• I pazienti possono glucuronidare p-nitrofenolo, morfine, cloroamfenicolo.
Patologie e polimorfismo genetico
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Glucuronazione e glucuronidasi
• I coniugati vengono escreti con la bile o con le urine.
• La glucuronidasi della microflora intestinale taglia il legame con l’acido glucuronico.
• La parte agliconica può essere riassorbita ed andare incontro ad un riciclo enteroepatico.
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Glucuronazione e glucuronidasi
• Attivazione metabolica di 2,6-dinitrotoluene da parte della glucuronidasi.– La glucuronidasi rimuove l’acido glucuronico da N-glucuronide;
– Il nitro gruppo viene ridotto da N-reduttasimicrobiche;
– Il risultante metabolita epatocarcinogeno èriassorbito.
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Gli enzimi di fase II catalizzano reazioni di:
• Coniugazione con– Acido glucuronico– Solfato– Glutatione– Acetile– Aminoacidi
• Metilazione� Metallotioneine
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Coniugazione con il gruppo solfato
• Coniugazione di:– xenobiotici con un OH libero con solfato da fosfoadeninafosfosolfonato (PAPS)
N
ON
N
OHO
N
NH2
P
O
O
OO
POO
OSO
OO
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Formazione di PAPS
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Formazione di PAPS
NN
O
N
OH
N
NH2
OH
OPOO
OSO
OO
NON
N
OHO
N
NH2
P
O
OOO
POO
OSO
OO
ATPADP
adenilil-solfato kinasiEC 2.7.1.25
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• Le solfotransferasi sono enzimi ubiquitari• Cofattore è 3’-fosfoadenosina-5’-fosfosolfato(PAPS)
• Produce esteri solfati altamente idrosolubili• Eliminati con urine e bile• Xenobiotici e composti endogeni sono solfonati (fenoli, catecoli, amine, idrossilamine)
Formazione di solfati
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Meccanismo della formazione di solfati
N
ON
N
OHO
N
NH2
P
O
OOO
POO
OSO
OO
CH3
O
O
OH
CH3
H
H
H
N
ON
N
O
N
NH2
P
O
OO
OPOO
O
OH
CH3 O
O
O
CH3
SO
OO
H
H
H
+
+
PAPS
PAP
steroide solfotransferasiEC 2.8.2.15
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Metabolismo degli androgeni ed estrogeni
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• La formazione di solfati è una via metabolica ad alta affinità e bassa capacità.– La glucuronazione ha bassa affinità ed alta capacità.– La capacità è limitata dai bassi livelli di PAPS.– A bassi dosaggi prevale la formazione di solfati.– Ad alti dosaggi prevale la glucuronazione.
Formazione di solfati
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Formazione di solfati
• Esistono quattro solfotransferasi nel citosol degli epatociti umani
• Le arilsolfatasi nella flora intestinale rimuovono il solfato promuovendo il riciclo enteroepatico
• Possono attivare xenobiotici a carcinogenici se il composto coniugato è chimicamente instabile– I solfonati delle idrossilammine sono instabili.
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gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 31 -
Gli enzimi di fase II catalizzano reazioni di:
• Coniugazione con– Acido glucuronico– Solfato– Glutatione – Acetile– Aminoacidi
• Metilazione� Metallotioneine
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Coniugazione con glutatione
• Coniugazione di xenobiotici (numerosissimi substrati) con una regione elettrofila (epossido) con glutatione ridotto (GSH) – glutatione-S-transferasi
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
NH
NH
O
SO
O
O
NH2
O
O
NH
NH
O
SO
O
O
NH2
O
O
GSH
GSSG
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• Il glutatione è un tripeptide formato da glicina, cisteina, acido glutamico– Formato da γ-glutamilcisteina sintetasi (EC 6.3.2.3)
GSH
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
GLU CYS GLY
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Sintesi del GSH
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Sintesi del GSH
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 36 -
Sintesi del GSH
NH2
O
O
O
O
NH2
O
O
SH NH
OOSH
O
NH2
OO
O
O
NH2
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
+
+
ATPADP
ATPADP
glutamato-cisteina ligasiEC 6.3.2.2
CYS
GLY
GLU
glutatione sintasiEC 6.3.2.31M0W 2HGS
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Glutatione sintasi (1M0W)
γ-glutamilcisteina
omologo di ATP
Mg++
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 38 -
Glutatione sintasi (1M0W)
γ-glutamilcisteina
omologo di ATP
Mg++
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gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 39 -
Glutatione sintasi (1M0W)
γ-glutamilcisteina
Mg++
omologo di ATP
In rosso: aminoacidi basici
In verde: la superficie della proteina
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 40 -
Glutatione sintasi (2HGS)
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gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 41 -
• O-demetilazione di organofosfati• Attivazione della trinitroglicerina
– I prodotti sono glutatione ossidato (GSSG), dinitroglicerina, NO (vasodilatore)
• Riduzione di idroperossidi– Metabolismo delle prostaglandine
Coniugazione con GSH
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 42 -
Metabolismo delle prostaglandine
22
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 43 -
Metabolismo delle prostaglandine
O
O
O
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
NH
S
NH
O
O
OH
OO
NH2
O
O
O
O
+
+ H2O
leucotriene-C4 sintasiEC 2.5.1.37
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• Due tipi di reazione con il GSH– Spiazzamento di alogeni, solfati, solfonati, fosfati, nitrogruppi
– Il glutatione viene addizionato a doppi legami attivati (epossidi) come nella sintesi delle prostaglandine.
• Substrati:– Idrofobici che contengono un elettrofilo– Possono reagire non enzimaticamente
Coniugazione con il GSH
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gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 45 -
Coniugazione
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
NH
NH
O
SO
R
O
ONH2
O
O
+
+
RX
HX
glutatione S-transferasiEC 2.5.1.18
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 46 -
Glutatione S-transferasi – EC 2.5.1.18
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gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 47 -
Glutatione S-transferasi EC 2.5.1.18 (1A0F)
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 48 -
• Glutatione-S-transferasi microsomiale e citosolica
• Almeno quattro classi di glutatione-S-transferasi (α, β, γ, δ), diversi isoenzimi inducibili.– Induttori (3-metilcolantrene, fenobarbital, corticosteroidi, anti-ossidanti)
– La sovraespressione porta a resistenza (insetti DDT resistenti, piante resistenti all’atrazina, cellule tumorali resistenti alla chemioterapia)
Glutatione S-transferasi
CH3
25
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 49 -
• Escrezione dei glutatione-coniugati:– Intatti nella bile– Convertiti in acido mercapturico nei reni ed escreti nelle urine • γ-glutamiltransferasi, aminopeptidasi M
Eliminazione dei composti coniugati con il GSH
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Metabolismo del naftalene
O OHS
O
NHNHO
NH2
COOH
COOH
H
H
OHS
O
NH
NH2
COOH
H
H
OHS
O
NH2
H
HOH
OHS
O
NH
H
HOH
O
CH3
S
O
NH
OH
O
CH3
naftalenenaftalene
monoossigenasi
GSH
S-(1,2-diidro-2-idrossi-1-naftil)-glutatione
S-(1,2-diidro-2-idrossi-1-naftil)-cisteinilglicina
S-(1,2-diidro-2-idrossi-1-naftil)-cisteinaS-(1,2-diidro-2-idrossi-1-naftil)-N-acetilcisteinaAcido 1-naftilmercapturico
FASE IFASE II
26
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 51 -
γ-glutamiltransferasi
NH
NH
O
SRO
O
O
NH2
O
O
NH
O
NH2
SR
O
O
NH2
O
O
O
O
+
+
H2O
-glutamiltransferasiEC 2.3.2.2
γ
R-S-alanilglicina Glutamato
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 52 -
Gli enzimi di fase II catalizzano reazioni di:
• Coniugazione con– Acido glucuronico– Solfato– Glutatione– Acetile– Aminoacidi
• Metilazione� Metallotioneine
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gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 53 -
Coniugazione con il gruppo acetile
• Coniugazione di:– xenobiotici con un OH libero con gruppo acetile da acetil-CoA
NON
N
OHO
N
NH2
O
P
P
O
O
OO
O
O
P OO
OCH3
CH3
OH
NH
O
NH
O
S CH3
O
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 54 -
Acetilazione
• Maggiore via di biotrasformazione di amine aromatiche e idrazine
• Diminuisce la solubilità• N-acetiltransferasi (NAT)
– Il cofattore è acetil-CoA
28
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 55 -
Meccanismo della acetilazione
NON
N
OHO
N
NH2
O
P
P
OH
O
OO
O
O
P O
O
O
CH3
CH3
OH
NH
O
NH
O
S CH3
O
NH2
N
ON
N
OHO
N
NH2
O
P
PO
OH
OO
O
O
P O
O
O
CH3
CH3
OH
NH
O
NH
O
SH
NH CH3
O
+
+
AcetilCoA
CoA
arilamina N-acetiltransferasiEC 2.3.1.5
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 56 -
Gli enzimi di fase II catalizzano reazioni di:
• Coniugazione con– Acido glucuronico– Glutatione – Solfato– Acetile– Aminoacidi
• Metilazione� Metallotioneine
29
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 57 -
Coniugazione con aminoacidi
• Alternativa alla glucuronazione• Due vie principali
– Gruppo -COOH del substrato coniugato con -NH2 di glicine, serina, glutamina, richiede attivazione con CoA • Coniugazione dell’acido benzoico con glicina per dare l’acido ippurico
– Gruppi -NH2 o -NHOH aromatici coniugati con gruppi COOH di serina, prolina, richiedono attivazione con ATP
NH
OOH
O
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 58 -
• Specie specificità nell’aminoacido accettore– mammiferi: glicina– uccelli: ornitina– cani e gatti: taurina– primati non umani: glutamina
• Attivazione metabolica– Gli N-esteri di serina o prolina delle idrossilamine sono instabili e degradano a specie elettrofile reattive.
Coniugazione con aminoacidi
30
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 59 -
Meccanismo della coniugazione con aminoacidi
N
ON
N
OHO
N
NH2
O
P
P O
OH
OO
O
O
P O
O
OCH3
CH3
OH
NH
O
NH
O
S
O
O
O
NH2
HH
N
ON
N
OHO
N
NH2
O
P
P OOH
OO
O
O
P O
O
OCH3
CH3
OH
NH
O
NH
O
SH
NH
OO
O
H H
+
+
glicina N-benzoiltransferasiEC 2.3.1.71
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 60 -
Gli enzimi di fase II catalizzano reazioni di:
• Coniugazione con– Acido glucuronico– Glutatione– Solfato– Acetile– Aminoacidi
• Metilazione� Metallotioneine
31
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 61 -
• Via metabolica che diminuisce la solubilità• Metiltransferasi
– Trasferisce un gruppo -CH3 a O, N, S, C– Cofattore: S-adenosilmetionina (SAM)
• Substrati sono: fenoli, catecoli, amine, metalli (Hg, As, Se)
Metilazione
N
N
ON
OHN
NH2
OH
S+
CH3
NH2
O
O
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 62 -
Sintesi di S-adenosilmetionina
32
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 63 -
Sintesi di S-adenosilmetionina
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 64 -
Sintesi S-adenosilmetionina
PO O
O
O
P OO
O
O
P
O
O
ON
N
ON
OHN
NH2
OH
S+
CH3
NH2
O
O
N
N
ON
OHN
NH2
OH
OPO
O
O
PO
O
O
P
O
O
O
NH2
O
O
SCH3
+ +
+ + H2O
metionina adenosiltransferasiEC 2.5.1.6 trifosfatasiEC 3.6.1.25
ATP MET
SAM
33
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 65 -
Metionina adenosiltransferasiEC 2.5.1.6 (1O9T)
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 66 -
Metiltransferasi
• Varie metiltransferasi– fenolo O-metiltransferasi, – catecolo O-metiltransferasi, – N-metiltransferasi, – S-metiltransferasi
34
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 67 -
Meccanismo della metilazione
N
N
ON
OHN
NH2
OH
S+
CH3
NH2
O
ONH2R
NNO
N
OH
N
NH2
OH
SNH2
OO N
HCH3R
+
+
amino N-metiltransferasiEC 2.1.1.49
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 68 -
Meccanismo della metilazione
N
N
ON
OHN
NH2
OH
S+
CH3
NH2
O
O
OH
OH
NN
O
N
OH
N
NH2
OH
SNH2
OO O
OH
CH3
+
+
catecolo O-metiltransferasiEC 2.1.1.6
35
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 69 -
Catecolo O-metiltransferasiEC 2.2.1.6 (1VID)
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 70 -
Catecolo O-metiltransferasiEC 2.2.1.6 (1VID)
36
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 71 -
Mercurio
Hg
NO
O
N
N
OH
PO
OO
O
N
NH2
POO
OPOO
OO
OH
N+
OH
NH2
O
H+
Hg2+
NO
O
N
N
OH
P
O
OO
O
N
NH2
POO
OPOO
OO
OH
N
OH
NH2
O
HH
RHg+
Hg2+
+ +
+
mercurio(II) reduttasiEC 1.16.1.1 ++RH H+
alchilmercurio liasiEC 4.99.1.2
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 72 -
Gli enzimi di fase II catalizzano reazioni di:
• Coniugazione con– Acido glucuronico– Solfato– Glutatione– Acetile– Aminoacidi
• Metilazione� Metallotioneine
37
gs © 2001-2008 ver 3.4 Enzimi di Fase II - 73 -
Metallotioneine
• Le metallotioneine (MT) sono peptidi e proteine ubiquitarie a basso peso molecolare ad alto contenuto in aminoacidi solforati e metalli.
• Si ipotizza che giochino un ruolo:– nella fissazione dei metalli in tracce (Zn++, Cu++),– nel controllare la concentrazione di questi ioni, – nella regolazione dei flussi degli ioni ai distretti cellulari,
– nella neutralizzazione dei metalli tossici (Cd++, Hg++) e nella protezione dallo stress indotto dai metalli.
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Distribuzione
• Le metallotioneine sono presenti in tutti gli organismi: animali, vegetali e microrganismi.
• Negli animali queste proteine posseggono polimorfismo genetico e sono abbondanti nei tessuti parenchimali(fegato, rene, pancreas e intestino).
• La loro concentrazione dipende da specie, tessuto, età, sesso ed altri fattori non ancora completamente identificati
• Nonostante che le metallotioneine siano proteine citoplasmatiche si sono trovate accumulate nei lisosomi e nel nucleo.
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Trasporto di metallotioneine
• Schema ipotetico del trasporto di metalli pesanti attraverso l’epitelio branchiale di molluschi bivalvi.– M: metalli in traccia;– MT: metallotioneine.
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Turnover delle metallotioneine
• Schema del turnover di MT in cellule di molluschi bivalvi (Isaniet al., 2000).
– M: Metalli; – MTF: Fattori di Trascrizione;
– MTI: Inibitori di Trascrizione.
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Classificazione
• Il nome deriva dal fatto che hanno un alto contenuto di zolfo e metalli. Tale contenuto varia a secondo del metallo (fino ad oltre il 20% in peso)
• Nei mammiferi sono caratterizzate da un peso molecolare di 6000-7000 Da, contengono da 60 ad 68 amino acidi di cui 20 Cys che legano 7 equivalenti di ione metallico bivalente. Mancano di aminoacidi aromatici. Tutte le Cys sono in forma ridotta e sono coordinate con ioni metallici.
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Classificazione – Le metallotioneine
• La superfamiglia delle the metallotioneine è definita come quella che comprende i peptidi che assomigliano alla metallotioneina renale equina che ha le seguenti caratteristiche:– Basso peso molecolare– Composizione:
• Alto contenuto in Cys, basso contenuto in aromatici.• Sequenza caratteristica.
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Classificazione – Le famiglie
• Una famiglia di metallotioneine è caratterizzata da una particolare sequenza ed è legata ad una o più specie. – I membri di una determinata famiglia appartengono solo a
quella e si pensa siano correlati da un punto di vista evoluzionistico
– Ogni famiglia è identificata da un numero e dalla specie. – Per esempio: Famiglia 1: vertebrati.
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Classificazione
• Le sottofamiglie– Si definiscono sottofamiglie di metallotioneine quegli
insiemi di proteine che oltre i caratteri propri delle famiglie condividono un insieme di caratteri più stringenti.
– Per esempio: m1, m2…
• I sottogruppi– Un sottogruppo rappresenta un insieme di sequenza
correlate filogeneticamente. In un albero filogenetico rappresentano un ramo.
– Per esempio: m2U2 = MT-2 di ungulati, sottogruppo della sottofamiglia m2.
• Le isoforme– Sono i membri di sottogruppi, sottofamiglie e famiglie. – Per esempio MT-1E umana.
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Classificazione – I clan
• Un clan è un insieme di proteine che dividono delle caratteristiche non già definite:– Struttura,– Proprietà termodinamiche,– Affinità per i metalli– Proprietà funzionali– …
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p1, p2, p2v, p3, pec, p21
Da 45 a 84 AAs; due regioni ric he di Cys (dominio 1 e dominio 3) separate da una regione con poche Cys(dominio 2)
15piante
[YFH]-x(5,25)-C-[SKD]-C-[GA]-[SDPAT]-x(0,1)-C-x-[CYF]
pDa 53 a 56 AAs; 9 Cys; una Tyr, una His; contine residui non comuni
14procarioti
K-C-A-C-x(2)-C-L-C
f4Da 55 a 56 AA; 9 Cys; un pattern CCC; contiene His e Phe
11funghi IV
C-X-K-C-x-C-x(2)-C-K-C
f1Da 25 a 33 AA; 7 Cys8funghi I
C-G-C-S-x(4)-C-x-C-x(3,4)-C-x-C-S-x-C
ci105 AA, 31 Cys, multiplo pattern CCC, una Tyr7
ciliatiuna sequenza
n1, n262 e 74 AAs; 18 Cys, contiene una Tyr6
nematodiK-C-C-x(3)-C-C
d1, d2Da 40 a 43 AA; 10 Cys conservate5
ditteriC-G-x(2)-C-x-C-x(2)-Q-x(5)-C-
x-C-x(2)D-C-x-C
e1, e2Da 64 a 67 AA; 20 Cys ; due domini strutturali, contenenti 9 e 11 Cys che legano 3 e 4 ioni bivalenti rispettivamente
4echinodermiP-D-x-K-C-[V,F]-C-C-x(5)-C-x-C-
x(4)-C-C-x(4)-C-C-x(4,6)-C-C
c1, c2, cda 58 a 60 AA; esistono varianti con e senza Met N-terminale; 18 Cys totalmente conservate; due domini, ognuno con 9 Cys che legano 3 ioni bivalenti
3crostacei
P-[GD]-P-C-C-x(3,4)-C-x-C
mo1, mo2, mog, moDa 64 a 75 AA; da 18 a 23 Cys, minimo 13 totalmente conservate; due domini
2molluschi
C-x-C-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-C-x(3)-C-x-C-K
m1, m2, m3, m4, m, a, a1, a2, b, ba, t
Da 60 a 68 AA; 20 Cys (21 in un caso), 19 totalmente conservate; due domini strutturali, contenenti 9 e 11 Cysche legano 3 e 4 ioni bivalenti rispettivamente. Il gene ècomposto di 3 esoni, 2 introni
1vertebrati
K-x(1,2)-C-C-x-C-C-P-x(2)-C
SottofamiglieCaratteristicheFamigliaSequenza
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Struttura
• Nonostante che le sequenze aminoacidichesiano diverse hanno caratteristiche strutturali simili:– Forma a manubrio,– Due domini,– Diverse unità tetraedriche Me(II)-Cys,– Tutte le Cys coinvolte nel legame con lo ione metallico
– Pressoché assente la struttura secondaria.
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Cu-Metallotioneina da Saccharomyces Cerevisiae(1AQR)
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Cu-Metallotioneina da Saccharomyces Cerevisiae(1AQR)
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mareSubunità α (1QJH)
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mareSubunità α (1QJH)
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mareSubunità β (1QJL)
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mareSubunità β (1QJL)
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Cd-Metallotioneina umana (1MHU)
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Cd-Metallotioneina umana (1MHU)
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Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Struttura genica
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Aspetti funzionali
• La più importante delle funzionalità delle metallotioneine è la loro inducibilità da una serie di agenti e condizioni:– Ioni metallici d10 (Cu++, Zn++, Cd++, Tl+, Pb++…)– Ormoni– Citochine– Fattori di crescita– Promotori tumorali– Stress
• È dimostrato il loro aumento fisiologico durante la proliferazione cellulare:
MT-Zn++ + Apo-Zinc-fingers → MT + Zn++- Zinc-fingers
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Determinazione
• Le MT sono proteine ricche in cisteina con affinità elevata per i metalli pesanti
• La concentrazione di MT è quantificata valutando il contenuto in Cys
• Reazione di ELLMAN (standard GSH)
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• Il glutatione è un tripeptide formato da glicina, cisteina, acido glutamico.
GSH
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
GLU CYS GLY
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SS
NN
OO
OO
OO
S N
OO
OSR
SHN
OO
O
+RS +
ditiobisnitrobenzoato, DTNB
Reazione di ELLMAN
Assorbimento a 412 nm
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Referenze sul WEB
• Vie metaboliche – KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/
• Degradazione degli xenobiotici: http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html
• Struttura delle proteine: – Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/– Hexpasy
• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/• Enzyme (Enzyme nomenclature database):
http://www.expasy.org/enzyme/– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/
• Enzimi: – Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry
http://www.atsdr.cdc.gov
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Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna a Ravenna
Giorgio Sartor - [email protected]