Programa de PPrograma de Póóss--graduagraduaçção em Genão em Genéética e tica e
Melhoramento de PlantasMelhoramento de Plantas
LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM
GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
EstratEstratéégias moleculares para obtengias moleculares para obtençção ão
de fungos transgênicosde fungos transgênicos
Pós-graduanda: Eng. Agr. MS Ana Paula de Souza Pallu Tozadori
Orientadora: Profa. Dra. Aline Pizzirani-Kleiner
Co-orientador: Prof. Dr. Welington Luiz de Araújo
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Sumário
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos
Introdução
Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Comparação
Considerações finais
Fungos transgênicos
Mecanismos de Integração
Construção do vetor
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos
�� Antes do microscAntes do microscóópio: cogumelo. pio: cogumelo.
�� ConotaConotaçção mão míística:stica:
-- EgEgíípcios: fermentapcios: fermentaçção = presente do Deus Osão = presente do Deus Osííris (panificaris (panificaçção).ão).
-- Gregos e Romanos: fermentaGregos e Romanos: fermentaçção = presente dos Deuses Dionão = presente dos Deuses Dioníísio e Baco.sio e Baco.
-- Romanos: cogumelos e trufas = associados a raios enviados a TerRomanos: cogumelos e trufas = associados a raios enviados a Terra por ra por
JJúúpiter.piter.
-- Cogumelos alucinCogumelos alucinóógenos: civilizagenos: civilizaçções prões préé--colombianas da Amcolombianas da Améérica Central e rica Central e
MMééxico.xico.
Ana Paula de S. Pallu Tozadori
IntroduçãoHistórico da Micologia
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos
�� PierPier Antonio Antonio MicheliMicheli (1679(1679--1737): 1737):
FUNDADOR DA MICOLOGIA.FUNDADOR DA MICOLOGIA.
-- ““Nova Nova PlantarumPlantarum GeneraGenera”” (1729). (1729).
Ana Paula de S. Pallu Tozadori
�� AntonAnton de Bari (1831de Bari (1831--1888): FUNDADOR DA 1888): FUNDADOR DA
MICOLOGIA MODERNA.MICOLOGIA MODERNA.
-- Descobertas: a natureza dos liquens, reproduDescobertas: a natureza dos liquens, reproduçção ão
sexuada em diversos fungos. sexuada em diversos fungos.
Histórico da MicologiaIntrodução
Tabela 1. Diversidade de microrganismos.
Microrganismo EspMicrorganismo Espéécies Ncies Nºº estimado Relaestimado Relaçção ão Conhecidas de espConhecidas de espéécies %cies %
BactBactééria 4 700 40 000 ria 4 700 40 000 11,7511,75
Fungo 74 000 1 500 000 Fungo 74 000 1 500 000 4,604,60
Alga 40 000 60 000 Alga 40 000 60 000 66,6766,67
VVíírus 5 000 130 000 rus 5 000 130 000 3,85 3,85
Esposito & Azevedo, 2004.
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DiversidadeIntrodução
Importância dos fungos
Figura 1. Utilizações dos fungos.
�� DoenDoençças em seres humanos, animais e plantas;as em seres humanos, animais e plantas;
�� DeterioraDeterioraçção de alimentos armazenados;ão de alimentos armazenados;
�� Fungos venenosos e Fungos venenosos e aluginaluginóógenosgenos..
Introdução
DiversidadeDiversidadeImportância Importância dos fungosdos fungos
Potencial Potencial
Busca por novas Busca por novas tecnologias tecnologias
����
��
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Transformação em fungosIntrodução
�� Final da dFinal da déécada de 70: primeiros trabalhos com transformacada de 70: primeiros trabalhos com transformaçção de ão de
fungos.fungos.
�� HinnenHinnen etet al., 1978 al., 1978 –– PROTOPLASTOS/TransformaPROTOPLASTOS/Transformaçção de linhagens ão de linhagens
de de SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae leu2leu2-- com plasmcom plasmíídio contendo o gene dio contendo o gene
leu2. leu2.
�� Case Case etet al., 1979 al., 1979 –– ESFEROPLATOSESFEROPLATOS/Transforma/Transformaçção de linhagens ão de linhagens
de de NeurosporaNeurospora crassa crassa qaqa22-- com plasmcom plasmíídio contendo o gene qa2dio contendo o gene qa2..
Histórico da transformação
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Introdução
Figura 2. Número de artigos publicados sobre transformação de fungos nas
décadas de 80, 90 e 2000.
Histórico da transformação
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Introdução
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1980-1989 1990-1999 2000-2008
Décadas
Número de artigos publicados
1980-1989
1990-1999
2000-2008
Fonte: Web of Science
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Construção do vetor
�� Vetor de expressãoVetor de expressão:: plasmplasmíídiosdios bacterianos onde foram bacterianos onde foram clonadosclonados os os
genes a serem introduzidos no genoma do fungo.genes a serem introduzidos no genoma do fungo.
-- cassete de expressão contendo o gene de interessecassete de expressão contendo o gene de interesse
-- gene de resistênciagene de resistência
-- origem de replicaorigem de replicaççãoão
�� Cassete de expressãoCassete de expressão:: promotorpromotorseqseqüüência ência codificadoracodificadorasinal de sinal de poliadenilapoliadenilaççãoão ((terminadorterminador))
�� Gene de seleGene de seleççãoão:: resistência a antibiresistência a antibióóticoticocrescimento em fonte C alternativacrescimento em fonte C alternativa
�� PromotorPromotor para a expressão do gene.para a expressão do gene.
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Figura 3. Plasmídio contendo origem de replicação para E. coli e S. cerevisiae, URA3 para seleção em S. cerevisiae, resistência a amplicilina para E. coli e
seqüência ativadora upstream GAL e promotor (P-CYC).
Construção do vetor
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Figura 4. (a) e (b): procedimentos para interrupação do gene. (c): procedimento
para substituição do gene.
Construção do vetor
Fonte: Finchan, 1999.
cc
aa
bb
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Construção do vetor
�� Dois tipos de vetores:Dois tipos de vetores:
Replicativos ou autônomos
Integrativos
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Figura 5. Três modelos de integração de DNA de S. cerevisiae.
Tipo 3Tipo 3
Tipo 1Tipo 1
Tipo 2Tipo 2
Crossing-over: integração do plasmídio.
Integração ectópica. Substituição.
Mecanismos de integração
Fonte: Finchan, 1999.
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Figura 6. Interação em S. cerevisiae entre um plasmídio com “gap” no
marcador e o locus do cromossomo homólogo com o alelo mutante.
Mecanismos de integração
Fonte: Finchan, 1999.
Reparo sem crossing-over.
Reparo com crossing-over.
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Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos
�� MMéétodos Cltodos Cláássicosssicos
-- GeraGeraçção de mutantesão de mutantes
-- RecombinaRecombinaççãoão
�� MMéétodos Molecularestodos Moleculares
espontâneasespontâneas
induzidasinduzidas agentes fagentes fíísicos e qusicos e quíímicosmicos
baixa freqbaixa freqüüênciaência
ciclos sexual e ciclos sexual e parassexualparassexual
�� EstratEstratéégias moleculares:gias moleculares:
-- ProtoplastoProtoplasto
-- BiobalBiobalíísticastica
-- TransformaTransformaçção via ão via AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens
-- RNARNA
-- TransposonsTransposons}} Silenciamento gênicoSilenciamento gênico
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Protoplasto
�� Protoplastos originados a partir da digestão enzimProtoplastos originados a partir da digestão enzimáática da parede tica da parede
celular de hifas e esporos (etapa crucial): celular de hifas e esporos (etapa crucial):
-- AAçção do agente fusogênico ão do agente fusogênico polietilenoglicolpolietilenoglicol ((PEGPEG) e ) e ííons cons cáálcio (CaCllcio (CaCl22).).
-- EletroporaEletroporaçção (descrito em 1989 por ão (descrito em 1989 por WardWard & & BarnesBarnes, para , para AspergillusAspergillus awamoriawamori e e
AspergillusAspergillus nigerniger). ).
Figura 7. Protoplastos de Aspergillus niger.
ProtoplastoControle biológico
�� PlasmPlasmíídio dio pEGFPpEGFP--C1C1, , contendocontendo gene gene gfpgfp e gene de resistência a e gene de resistência a
higromicina.higromicina.
�� BioensaioBioensaio: recombinante de : recombinante de C. C. rosearosea crescidocrescido emem BDABDA, com o , com o
nematnematóóideide PanagrellusPanagrellus redivivusredivivus (20(20--30). 30). IncubadosIncubados a 26a 26°°C C porpor 2 e 5 2 e 5
diasdias..
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
ProtoplastoControle biológico
Figura 8. Processo de infecção do fungo transformado observado sob microscopia
de luz e de fluorescência.
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
ProtoplastoIndústria
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
ProtoplastoIndústria
Figura 9. Construção do plasmídio pAN52-Plg1.
Fonte: Cardoso et al., 2008.
ProtoplastoIndústria
Fonte: Cardoso et al., 2008.
Tabela 2. Atividade de pectina liase.
Tabela 3. Atividade de pectina liase em diferentes fontes de carbono.
Atividade de pectina
liase 57 vezes maior
que a selvagem.
132 vezes maior que a selvagem.
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Biobalística
�� DDéécada de 90: transformacada de 90: transformaçção genão genéética de mictica de micéélio ou conlio ou coníídios de dios de
fungos filamentosos: fungos filamentosos: NeurosporaNeurospora crassacrassa ((ARMALEOARMALEO etet al. 1990)al. 1990), ,
PhytophthoraPhytophthora sppspp. . ((BAILEYBAILEY etet al. 1993)al. 1993) e e AspergillusAspergillus nidulansnidulans ((FUNGAROFUNGARO
etet al. 1995).al. 1995).
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Figura 10. Biobalística na transformação de fungos.
Biobalística
Fonte: www.bio-rad.com
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
BiobalísticaMicorriza
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
Vol. 71 (2007) , No. 1 pp.47-50.
Masahide SUNAGAWA, Hitoshi MURATA, Yasumasa MIYAZAKI and Masaya NAKAMURA
�� Transformation of the Transformation of the MycorrhizalMycorrhizal BasidiomycetesBasidiomycetes, , SuillusSuillus
grevilleigrevillei and and S. S. bovinusbovinus, by Particle Bombardment, by Particle Bombardment
�� PlasmPlasmíídio dio pHHMpHHM 192192, , contendocontendo cassetecassete de de expressãoexpressão dada
higromicina B higromicina B fosfotransferasefosfotransferase e o e o cassetecassete de de expressãoexpressão desred2desred2..
�� TransformaTransformaççãoão de de micmicéélioslios porpor biobalbiobalíística (Biostica (Bio--RadRad, CA)., CA).
BiobalísticaMicorriza
Pressão de hélio (psi)
Distância (cm)
5 8 11 14,5650 0 0 0 01100 3 2 1 01300 0 1 1 0
Pressão de hélio
(psi)
Distância (cm)5 8 11 14,5
650 0 0 0 01100 2 2 0 01300 0 0 0 0
Tabela 4. Número de transformantes de S. grevillei.
Tabela 5. Número de transformantes de S. bovinus.
�� FreqFreqüüência de transformaência de transformaçção: 1,2 e 0,6 transformantes/ão: 1,2 e 0,6 transformantes/µµg de DNA de g de DNA de S. S. grevilleigrevillei
e de e de S. S. bovinusbovinus respectivamente.respectivamente.
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos
Transformação via Agrobacterium tumefaciens
�� TransformaTransformaçção genão genéética de leveduras tica de leveduras ((BUNDOCKBUNDOCK etet al. 1995)al. 1995) e fungos e fungos
filamentosos filamentosos (De (De GROOTGROOT etet al. 1998).al. 1998).
Figura 11. Transformação genética
de fungos via A. tumefaciens.
micmicééliolio
protoplastosprotoplastosesporosesporos
corpos decorpos defrutificafrutificaççãoão
AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens
HifasHifas
CoCo--cultivocultivo
Meio lMeio lííquidoquido
SeleSeleçção dos transformantes em ão dos transformantes em placas de placas de PetriPetri
Fonte: Michielse et al., 2005.
Transformação via Agrobacterium tumefaciens
Figura 12. Transformação genética de fungos via A. tumefaciens.
Fonte: Michielse et al., 2005.
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
AlimentoAgrobacterium tumefaciens
�� Primeira transformaPrimeira transformaçção de micão de micéélio vegetativo de uma linhagem lio vegetativo de uma linhagem
comercial de comercial de A. A. bisporusbisporus..
�� Gene de resistência a higromicina B.Gene de resistência a higromicina B.
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AlimentoAgrobacterium tumefaciens
�� NNúúmero de integramero de integraçções entre uma e oito, mas a maioria dos ões entre uma e oito, mas a maioria dos
transformantes de duas a quatro ctransformantes de duas a quatro cóópiaspias..
Figura 13. Southern blot com sonda hyg. Linha 1 a 19 transformantes, linha 20:
controle.
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PatógenoAgrobacterium tumefaciens
�� LeptosphaeriaLeptosphaeria maculansmaculans, L. , L. biglobosabiglobosa, , OculimaculaOculimacula yallundaeyallundae ee O. O.
acuformisacuformis foram transformados foram transformados via via AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens com com
genes genes DsRedDsRed e e gfpgfp..
�� VetoresVetores pCAMDsRedpCAMDsRed e e pCAMBgfppCAMBgfp..
Figura 14. Vetor usado para a transformação.
Agrobacterium tumefaciens
Figura 15. Micrografias de fluorescência. a-d: Oculimacula yallunde (GFP) e O. ocuformis (DsRed), co-cultivo, permitindo que o micélio das suas espécies cresçam
junto. e-h: Hifas maduras de L. biglobosa (DsRed) e L. maculans (GFP).
Patógeno
Agrobacterium tumefaciens
Figura 16. Micrografias de fluorescência. i-n: L. maculans (DsRed) e L. biglobosa(GFP) na planta.
Patógeno
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Métodos baseados no RNA
�� EstratEstratéégia alternativa: mgia alternativa: méétodos que silenciam expressão de gene todos que silenciam expressão de gene
ppóóss--transcricionalmentetranscricionalmente. .
Fonte: Meyer, 2008.
�� Três mTrês méétodos:todos:
-- RNA RNA antisenseantisense, ,
-- RibozimasRibozimas, ,
-- RNA de interferência (RNA de interferência (quellingquelling))..
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�� Vantagens do silenciamento via RNA:Vantagens do silenciamento via RNA:
-- Não considera a eficiência da RecombinaNão considera a eficiência da Recombinaçção homão homóóloga exigida para a loga exigida para a
interrupinterrupçção de genes. ão de genes.
-- Silenciamento Silenciamento éé independente do lindependente do lóócus e mediada por um sinal cus e mediada por um sinal transtrans--atuanteatuante
mmóóvel no citoplasma.vel no citoplasma.
-- Permite flexibilidade nos experimentos de inativaPermite flexibilidade nos experimentos de inativaçção gênica, jão gênica, jáá que induzem a que induzem a
supressão do gene na seqsupressão do gene na seqüüência especência especíífica e não no lfica e não no lóócuscus--especespecíífico.fico.
VantagensMétodos baseados no RNA
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�� Vantagens do silenciamento via RNA:Vantagens do silenciamento via RNA:
-- Permite o estudo de expressão gênica em um estPermite o estudo de expressão gênica em um estáágio especgio especíífico do fico do
desenvolvimento ou como o gene afeta diferentes partes do organidesenvolvimento ou como o gene afeta diferentes partes do organismo.smo.
-- Permite a diminuiPermite a diminuiçção da expressão do gene, jão da expressão do gene, jáá que algumas vezes a total que algumas vezes a total
interrupinterrupçção do gene pode ser letal para o fungo.ão do gene pode ser letal para o fungo.
VantagensMétodos baseados no RNA
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�� RNA RNA antisenseantisense hibridiza com o RNA alvo, inibindo a traduhibridiza com o RNA alvo, inibindo a traduçção ou ão ou
processamento do processamento do mRNAmRNA alvo.alvo.
RNA antisense
Figura 17. Mecanismo de silenciamento gênico via RNA antisense.
Métodos baseados no RNA
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RNA antisense
�� BiPABiPA éé uma uma chaperonachaperona molecular responsmolecular responsáável pelo dobramento da vel pelo dobramento da
proteproteíína na TaumatinaTaumatina..
Chaperona
Figura 18. Cassete de superexpressão do gene bipA.
�� PlasmPlasmíídio dio
pGpdpGpd--BiPBiP--H;H;
�� ProtoplastoProtoplasto..
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RNA antisenseChaperona
Figura 19. Northern blot dos transformantes
superexpressando o gene bipA.
Figura 20. Imunoblot com anticorpo
taumatina.
Figura 21. Relação entre secreção de
taumatina e níveis de expressão de bipA.
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RNA antisenseChaperona
Figura 22. Um fragmento do gene bipA, na posição antisense.
Figura 23. Correlação entre secreção de
taumatina e níveis de expressão do
antisense bipA.
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�� MolMolééculas de RNA com atividade catalculas de RNA com atividade catalíítica, hibridiza com RNA alvo.tica, hibridiza com RNA alvo.
�� SeqSeqüüência especência especíífica de clivagem do RNA alvo.fica de clivagem do RNA alvo.
�� Menor, mais conhecida e mais amplamente usada.Menor, mais conhecida e mais amplamente usada.
Ribozimas
Figura 24. Estrutura de uma
ribozima – Seqüência de
reconhecimento “NHH”, N: A, C,
G ou U e H: C, A ou U.
RibozimaRibozima SubstratoSubstrato
SSíítio de clivagemtio de clivagem
Métodos baseados no RNA
Fonte: Mueller et al., 2006.
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Ribozimas
�� TransformaTransformaçção de ão de A. A. giganteusgiganteus via via protoplastoprotoplasto..
ß-glucuronidase
Figura 25. Representação esquemática
do plasmídio.
Gene da ß-glucuronidase de E. coli.
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Ribozimasß-glucuronidase
Figura 26. Ensaio in vitro de sete ribozimas com o substrato uidA.
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Ribozimasß-glucuronidase
Tabela 6. Determinação in vivo da atividade de GUS após a indução da expressão
da ribozima.
Métodos baseados no RNA
�� A dupla fita de A dupla fita de RNA RNA éé transformadotransformado emem pequenaspequenas molmolééculasculas de de
RNA (RNA (siRNAssiRNAs), ), queque hibridizamhibridizam com o RNA com o RNA alvoalvo e e guiamguiam parapara um um
complexocomplexo de silenciamento (RISC), de silenciamento (RISC), queque degradadegrada o RNA o RNA alvoalvo..
RNAi ou quelling
Figura 27. Modelo de duas vias de
silenciamento de RNA. A) Durante a
fase vegetativa; B) Durante a
meiose.
Fonte: Nakayashiki, 2005.
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RNA iPatógeno humano
Figura 28. Representação esquemática da construção do plasmídio.
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
RNA iPatógeno humano
Figura 29. Análise do fenótipo dos transformantes (a) em meio com glicose
(b) meio com carboximetilcelulose.
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Transformação via transposons
�� Duas classes de Duas classes de transposonstransposons
em fungos:em fungos:
--Classe I: elementos Classe I: elementos transpontransponííveisveis
via um RNA intermedivia um RNA intermediáário usando rio usando
uma uma transcriptasetranscriptase reversa.reversa.
--Classe II: elementos Classe II: elementos transpontransponííveisveis
ao nao níível de DNA por excisão de um vel de DNA por excisão de um
ssíítio doador e reintegratio doador e reintegraçção em outro ão em outro
local do genoma.local do genoma.
Figura 30. Classes de transposons.
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Transformação via transposons
Figura 31. Vetores para uso em fungos filamentosos.
Fonte: Kempken &
Kuch, 1998.
Transformação via transposons
Figura 32. Representação da transformação de um gene alvo mediada por
transposon.
Fonte: Mullins &
Kang, 2001.
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Transposon
�� Mutante com defeitos fisiolMutante com defeitos fisiolóógicos (redugicos (reduçção do crescimento ão do crescimento
micelialmicelial, redu, reduçção da hifa aão da hifa aéérea e alterarea e alteraçção de pigmentaão de pigmentaçção).ão).
�� MutanteMutante nãonão patogênicopatogênico (Rev77), (Rev77), nãonão causacausa lesõeslesões emem folhasfolhas de de
arrozarroz e e cevadacevada..
Mutagênese insercional
TransposonMutagênese insercional
Figura 31. Representação
esquemática de inserção de impalana ORF Rev-77.
Figura 33. Patogenicidade de Rev-77.
Folhas de cevada inoculadas com (a)
selvagem e (b) mutante Rev-77.
Comparação entre os métodos
Tabela 7. Comparação entre os métodos (princípio, vantagens e desvantagens).Método Princípio Vantagens DesvantagensProtoplasto Preparação de protoplasntos usando Uso de diferentes tipos celulares Enzimas líticas alteram a taxa de transformação
enzimas de degradação da parede celular (esporos, hifas) Requer procedimento de regeneraçãoRemoção do DNA é alcançada pela adição Número de cópias de inserções de DNA é altade PEG e CaCl2 Trabalhoso
Biobalística Partículas (tungstenio, ouro) são cobertas com Não necessita de pré-tratmento Requer equipamento especialDNA e aceleradas em alta velocidade para dentroda célula
Agrobacterium Carrega dois vetores (vetor binário contendo o Uso de diferentes tipos celulares (esporos, hifas) Afetada por parametros durante o co-cultivoDNA de interesse entre uma borda de 24 bp e o Número de inserções de DNA é baixa Demanda maior tempovetor T contendo a região de virulência para trans- Permite a integração alvoferência) Simples e eficienteTransferência de DNA é alcançada durante o Alta porcentagem de transformantes com uma co-cultivo entre a bactéria e o fungo única cópia
RNA antisense RNA antisense hibridiza por pareamento Watson- Simples e barato Baixa afinidade ao RNA alvo devido a estrutura Crick para o RNA alvo secundária da molécula antisenseTradução e processamento do mRNA alvo tornan-se inibidos
Ribozimas Pequena molécula catalítica de RNA hibridiza Alta especificidade Trabalhosocom o RNA alvo Difícil predizer o melhor sítio alvoClivagem da sequencia-específica de RNA alvo As vezes baixa atividade
RNAi Dupla fita de RNA é coratada em siRNAs Alta atividade Requer a atividade de complexos de proteínassiRNAs hibridiza com o RNA alvo e guia para um Possível instabilidadecomplexo de silenciamento (RISC) que degrada oRNA alvo
Transposons Silenciamento é baseado na inativação de um gene Simples Ineficiente em vários fungospor integração de um transposon no promotor ou região codificadora
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Considerações finais
�� A importância dos fungos, aliada aos avanA importância dos fungos, aliada aos avançços despertou o os despertou o
interesse da aplicainteresse da aplicaçção de estratão de estratéégias moleculares para obtengias moleculares para obtençção ão
de fungos transformados geneticamente.de fungos transformados geneticamente.
�� Não hNão háá regra geral entre as estratregra geral entre as estratéégias e as diferentes espgias e as diferentes espéécies cies
de fungosde fungos: necessidade de otimizar cada m: necessidade de otimizar cada méétodo para cada todo para cada
espespéécie de fungo estudada. cie de fungo estudada.
�� A escolha do mA escolha do méétodo depende do objetivo.todo depende do objetivo.
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Considerações finais
SuperexpressãoSuperexpressão do genedo geneEx: Ex: superexpressãosuperexpressão de protede proteíínas e metabnas e metabóólitoslitos
ProtoplastoProtoplasto BiobalBiobalíísticastica AgrobacteriumAgrobacterium
IntegraIntegraçção ão heterheteróólogaloga(m(múúltiplas cltiplas cóópias)pias)
Atinge Atinge gene de interessegene de interesse por um spor um síítio tio ativo transcricionalmente via ativo transcricionalmente via RecombinaRecombinaçção homão homóólogaloga
ProtoplastoProtoplasto
Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori
Considerações finais
DownregulaDownregulaççãoão do genedo geneEx: reduEx: reduçção da formaão da formaçção de produtos ou eliminaão de produtos ou eliminaçção de proteão de proteíínas repressorasnas repressoras
ProtoplastoProtoplasto ProtoplastoProtoplastoAgrobacteriumAgrobacterium
Silenciamento gênico via Silenciamento gênico via RNA RNA antisenseantisense ououtecnologia do tecnologia do RNAiRNAi
DeleDeleçção do gene ão do gene ou interrupou interrupçção viaão via
RecombinaRecombinaçção homão homóólogaloga
ParcialParcial(se o gene (se o gene éé essencial)essencial)
CompletaCompleta(se o gene não (se o gene não éé essencial)essencial)
ProtoplastoProtoplasto
Silenciamento gênicoSilenciamento gênicovia via ribozimasribozimas, , transposonstransposons