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DR. PATRICE PELLERIN
DIRECTOR TÉCNICO DE OENOBRANDS
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Enzimas
ORIGEN PRODUCCIÓN LEGISLACIÓN
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QUE son las Enzimas ?
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Clases de Enzimas: qué es el número EC?
• EC = “Enzyme commission” , parte de IUBMB
• 1er número describe el tipo de reacción EC 1. oxidoreductasas
EC 2 Transferasas (acil metil, fosforil,..)
EC 3 Hidrolasas
EC 4 liasa = el enlace covalente se rompe sin hidrólisis
EC 5 isomerasa : Glucosa en fructosa
EC 6 ligasas : crea un enlace covalente
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Clases de Enzimas: qué hidrolasas ?
• EC 3 Hidrolasas
EC 3.1 hidrólisis de enlaces éster
EC 3.2 glicosidasas
EC 3.3 hidrolisis de enlaces éter
EC 3.4 hidrolisis de enlaces péptidos
13 en total
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Clases de Enzimas : glicosilasas ?
• EC 3.2.1 rompe enlaces O- y S-glicosil
• El último dígito describe el sustrato EC 3.2.1.1 . Alfa-amilasa
EC 3.2.1.4 Celulasa
EC 3.2.1.8 endo-xilanasa
EC 3.2.1.15 Poligalacturonasa
EC 3.2.1.21 beta-glucosidasa
till EC 3.2.1.184 diacetil bacillosamine epimerasa
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Enzimas Industriales: orígenes?
• Hongos : A. niger , A. aculeatus, A. oryzae
Trichoderma longibrachiatum, reseei, harzianum
Disporotrichum dimorphosporum
Talaromyces emersonii
…
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Enzimas Industriales: orígenes?
• Bacterias: Bacillus subtilis
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus licheniformis
Escherichia Coli
…
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Enzimas Industriales: orígenes?
• Levaduras: S. cerevisiae
Kluyveromyces lactis
…
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Enzimas Industriales: orígenes?
• Plantas: Malta de cebada
Papaya
Piña
…
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Enzimas Industriales: orígenes?
• Animales: Clara de huevo
Pancreas de cerdo
Estómago del becerro
…
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Producción de enzimas por fermentación: cuáles son los principales procesos?
• Fermentación Sumergida (líquida)
• SSF : “solid state fermentation”: fermentación en estado sólido
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DSM Business Group
More than a century of enzyme technology
• En 1906...Una AMILASA de origen bacteriano es descubierta por un alumno del Instituto Pasteur de Lille, Auguste BOIDIN, fundador de RAPIDASE
…Es el origen de su empresa, y empieza a producir enzimas en Seclin (Francia)
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Fermentación Sumergida Líquida
DFS France : Seclin
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PRODUCTION
STRAIN
PRE-CULTURE
PHASE 1
PRE-CULTURE
PHASE 2
STAGE 1
INOCULUM
FERMENTATION
MAIN
FERMENTATION BROTH FERMENTATION
STORAGE
STAGE 2
SEPARATION
SOLID-LIQUID
(membranes filters)
FILTRATE
STORAGE
CONCENTRATION
(Ultra-Filtration)
_ _ _ _
FILTRATION ON
PLATE 1FILTRATE
STORAGE
CHROMATOGRAPHY
_ _ _ _
CONCENTRATION
(Ultra-Filtration)
Dairy product
AUTOLYSE/
KILLING (If necessary)
STAGE 3
STAGE 4
Liquid way
MIXING
STANDARDISATIONPACKAGING OF SOLID
ENZYME
SPRAY DRYING
(Granulation)FINAL PRODUCT
STORAGE
PACKAGING OF LIQUID
ENZYME
Solid way
STAGE 5
PERÍMETRO DE CERTIFICACIÓN DE SEGURIDAD ALIMENTARIA
FILTRATION
ON PLATE 2FORMULATION
Microfiltration
El Proceso de Producción DSM: Fermentación Sumergida Líquida
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Enzimas Industriales: mercados de aplicación?
• Farmacéutica y salud • Diagnostic and analyses • Detergentes • Fuel etanol de 1ª y 2ª generación • Bioplásticos • Textil • Conversión de almidón • Alimentación animal • Mejora digestiva
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“Food Enzymes” : mercados de aplicación?
• Food Panadería (amilasas, galactolipasas , xilanasas,
proteasas) Lácteos (lactasa, chymosine , proteasas, lipasas) Carne (transglutaminasa) Desgomado de aceite en refinado (fosfolipasa) Cervecería: glucanasas, xilanasas, amilasas Procesado de fruta: pectinasas, xilanasas, amilasas, AG Vino Alcohol: amilasas , AG Mayonesa (fosfolipasa) Galletas y “snacks” (asparaginasa)
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Pan Cerveza Lácteos
Procesado de Frutas
Alcohol
Vino
Ejemplos de DSM « Food Enzymes » PRODUCIDAS EN SECLIN
Mayonesa
Tartas& snacks
Zumos de frutas
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Las Enzimas y el etiquetado de los Alimentos: cuales son las reglas?
• Las enzimas son “coadyuvantes” de elaboración y no “Aditivos” Ausente en el producto final
Presente pero no “funcionalmente activo”
NO se requiere etiquetado en el producto final
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Las Enzimas y el etiquetado de los Alimentos: las excepciones
• Invertasa
• Lisozima
Son considerados “Aditivos”, por lo que está sometidos a etiquetado
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Regulación de las enzimas de vino
“OIV International Enological Codex and Code”
Regulación de la EU
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18 | 04 | 2012
La aplicación de las enzimas en enología está definida por el “OIV International Enological
codex and Code”
Hasta 2013 Desde 2013
Pectinasas para la clarificación de mostos de uva
Pectinasas, celulasas, glucanasas, xilanasas para varias aplicaciones: maceración, rendimiento, clarificación , …
Beta-glucanasas para filtración de vinos
Beta-glucanasas para filtración y crianza sobre lías
Glicosidasas para la hidrólisis de precursores aromáticos de la uva
Ureasa para la prevención del carbamato de etilo en vinos
Ureasa para la prevención del carbamato de etilo
Lisozima para la prevención de contaminación microbiana durante la fermentación
Lisozima para la prevención de contaminación microbiana
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18 | 04 | 2012
Enzimas enológicas
Enzimas Producción micro-organismo
Producción técnica
Formulaciones
Polisacarido-hidrolasas : pectinasas, celulasas, glucanasas, xilanasas …
A. niger, A. aculeatus, T. longibrachiatum….
Fermentaciones sumergida o de
superficie
Líquida glicerol/ KCl
Microgranuladas maltodextrina
Glicosidasas A. niger
Glucanasas T. harzianum, T sp.
Ureasa L. fermentum
Lisozima Clara de huevo Purificada por Cromatografía
Microgranulada pura
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Enzimas, un poco de bioquímica
Qué es lo que parecen?
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La energía de activación de una reacción
Energia de
activación
Progreso de la reacción
Ene
rgía
No-enzimática
Enzimática
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Temperatura Óptima
Temperatura
Act
ivid
ad
estabilidad actividad
• La actividad enzimática es el resultado de
• Incremento de actividad a mayor Tª
• Por encima de cierta Tª las enzimas se inactivan rápidamente
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La actividad relativa en relación con la temperatura: criterios esenciales para la elección de las enzimas!
Bacterial Alpha – amilasas
Bacillus licheniformis Bacillus amyloliquefaciens
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pH óptimo
pH
Act
ivid
ad
• Las enzimas tiene un cierto rango de pH en la que son activas
• Fuera de este rango existe un fuerte decreciemento de la actividad de manera habitual
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Enzimas: son fácilmente desnaturalizables?
• pH shocks
• Calor, con excepciones
– Amilasas termoestables
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Mecanismo de desnaturalización de enzimas?
• Actividad de agua
• Las enzimas termoestables son mas hidrofóbicas
• Opciones para la ingeniería de proteínas
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Hidrolasa de ruptura “Exo” y “endo”
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18 | 04 | 2012
Las enzimas son una herramienta fundamental para cualquier elaboración de vino! 3 familias de Enzimas función de sus objetivos:
1. Mejora de Proceso 2. Mejora de la calidad del vino 3. Resolución de problemas
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18 | 04 | 2012
Mejora del Proceso
Mejora de la calidad
Resolución de problemas
Debates en marcha
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18 | 04 | 2012
Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo
Mejora del Prensado & rendimiento mosto
Actividades Pectinasas activas en cadenas laterales de homogalacturónico y arabinan
Ahorro de costes, mas rendimiento de mosto
Clarificación del mosto por flotación
Pectinasa activa en homogalacturónico
Ahorro de tiempo y trabajo
Clarificación del mosto por desfangado estático
Pectinasa activa en homogalacturónico
Ahorro de energía & agua
Clarificación de mostos y vinos por filtración
Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas
Sostenibilidad: menos viñedo para el mismo volumen de producción
Termovinificación Pectinasa termoestables Más calidad de mosto: flor
Menos oxidación por menor tiempo de producción antes de la FA
Enzimas de Mejora de proceso
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Fermentación
Mosto prensa Mosto yema
Dep. desfangado
Aplicación de pectinasas Para prensado& mejora del rendimiento
Despalillado
crianza / almacenamiento
Prensa
Rapidase® Extra Press Estrujado
1-3 ml / 100kg
Rapidase® Clear
1 ml / hl
enfriamiento
incrementa el mosto yema: 4 – 15% facilita& reduce el tiempo de filtración especialmente útil en prensados de uvas difíciles
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18 | 04 | 2012
Mejora de los rendimientos de prensado
Rapidase® Extra Press
Rendimiento total : 790 Litros/Ton
Chardonnay, Cooperativa Languedoc France
Enzima : 2 g/100kg
2 h at 20 °C
Rendimiento total : 825 Litros/Ton
20%
7%
15% 5 %
80%
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18 | 04 | 2012
Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo
Mejora del Prensado & rendimiento mosto
Actividades Pectinasas activas en cadenas laterales de homogalacturónico y arabinan
Ahorro de costes, mas rendimiento de mosto
Clarificación del mosto por flotación
Pectinasa activa en homogalacturónico
Ahorro de tiempo y trabajo
Clarificación del mosto por desfangado estático
Pectinasa activa en homogalacturónico
Ahorro de energía & agua
Clarificación de mostos y vinos por filtración
Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas
Sostenibilidad: menos energía utilizada
Termovinificación Pectinasa termoestables Más calidad de mosto: flor
Menos oxidación por menor tiempo de producción antes de la FA
Enzimas de Mejora de proceso
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18 | 04 | 2012
Induce la reducción accelerada de la viscosidad del mosto Facilita la agregación de las borras Accelera la decantación de los sólidos Permite conseguir borras más compactas
Modo de acción bioquímico :
hidrolisis completa de la cadena principal (homogalacturonano) de las pectinas solubles hidrolisis parcial de las cadenas laterales (ramnogalacturonano) de las pectinas solubles Facilita interacciones electro-estáticas entre las particulas de borras Disminuye la viscosidad del mosto debido a la pectina soluble
Dosis : ~ 1 a 2 g/ Hl Temperatura > 12 °C Contacto entre 1 y 12 horas
Rapidase® Clear
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18 | 04 | 2012
Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo
Mejora del Prensado & rendimiento mosto
Actividades Pectinasas activas en cadenas laterales de homogalacturónico y arabinan
Ahorro de costes, mas rendimiento de mosto
Clarificación del mosto por flotación
Pectinasa activa en homogalacturónico
Ahorro de tiempo y trabajo
Clarificación del mosto por desfangado estático
Pectinasa activa en homogalacturónico
Ahorro de energía & agua
Clarificación de mostos y vinos por filtración
Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas
Sostenibilidad: menos energía utilizada
Termovinificación Pectinasa termoestables Mejor calidad de mosto: menor turbidez para mejor calidad del vino
Menos oxidación por menor tiempo de producción antes de la FA
Enzimas de Mejora de proceso
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18 | 04 | 2012
Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo
Mejora del Prensado & rendimiento mosto
Actividades Pectinasas activas en cadenas laterales de homogalacturónico y arabinan
Clarificación del mosto por flotación
Pectinasa activa en homogalacturónico
Time and labour savings
Clarificación del mosto por desfangado estático
Pectinasa activa en homogalacturónico
Energy savings
Clarificación de mostos y vinos por filtración
Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas
Sustainability : less energy used
Termovinificación Pectinasa termoestables Proceso no realizable sin enzimas
Enzimas de Mejora de proceso
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18 | 04 | 2012
Mejora del Proceso
Mejora de la calidad
Resolución de problemas
Debates en marcha
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18 | 04 | 2012
Mejoras de la calidad
Perfiles de actividad
Aplicadas a la etapa del proceso
Beneficios para los enólogos
Liberación de precursores aromáticos de la piel de la uva
Pectinasas , Rgasas, Maceración de pieles de uvas tintas y blancas
Incremento de aromas de uva como tioles y terpenos, ….
Taninos y otros polifenoles
Pectinasas , Rgasas, Xilanasas, celulasas
Maceracion de uvas tintas
Incremento del color y polifenoles esenciales para la calidad del vino
Aromas glicosidados de la uva no volátiles convertidos en aromas volátiles
Glucosidasa, arabinosidasa, rhamnosidasa, apiosidasa
Aplicada al vino Incremento de terpenos y norisoprenoides
Liberación de compuestos específicos de la levadura
Beta-(1,6)-glucanasas
Crianza sobre lías, batonnage
Boca, aroma, mejora de la estabilidad
Enzimas de Mejora de la calidad
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18 | 04 | 2012
Acelera y aumenta la extracción de los precursores aromáticos presentes en el hollejo de la uva durante la maceración pelicular El mosto escurrido (generalmente) no necesita nueva adición de enzima pectolíticas
Modo de acción bioquímico :
Degradación parcial de las paredes celulares del hollejo para liberar los precursores aromáticos de la uva hidrolisis avanzada de la pectina y de la protopectina , incluyendo las cadenas laterales de arabinanos hidrolisis parcial de las hemicelulasas
Dosis : entre 2 – 3 g/ 100kg Temperatura> 10 °C Contacto entre 2 y 18 h
Rapidase Expression Aroma
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Aplicación de Rapidase Expression Aroma + Rapidase Clear en Sauvignon blanc de vendimia mecánica
Rapidase Expression Aroma
Maceración en prensa ~ 2 horas a 15 °C Rapidase® Clear
1,5 g / 100kg
1 ml / hl de mosto al escurrir
+ 1 ml / hl después de 6
horas
Escurrido (55 % rendimiento)
tanque de desfangado estático + PVPP 10 g/hl
Prensa
Vendimia ~ 6 horas desde vendimia Intercambiador
hasta ~15 °C
16 horas después de escurrir la prensa :
Mosto limpio : 15 NTU, Pectina negativa
10,2 °Baumé
Intercambiador hasta 10 °C
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18 | 04 | 2012
Enzimas de Maceración
pelicular y su impacto en
el aroma de los vinos
blancos
2008
IFV , Francia
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18 | 04 | 2012
Enzimas de Maceración pelicular y su impacto
en el aroma de los vinos blancos
IFV Gaillac (France)-2008
Rapidase® Expression Aroma en Sauvignon blanc - extracción of precursores tiólicos - Uso combinado con levaduras de liberación/conversión - Impacto global en el perfil aromático del vino
Sauvignon blanc, AOC Gaillac,
8 tn/ha
20 Brix
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18 | 04 | 2012
Enzima
Control No enzima
Rapidase Expression Aroma
Rapidase Extra Color
Levadura
Fermivin TS28
Fermicru 4F9
2 Repeticiones x x
6 h maceración at 18°C, enzimas añadidas a 2 g/100kg ~ 65 kg uvas por ensayo
Enzimas de Maceración pelicular y su impacto en el aroma de los vinos blancos
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18 | 04 | 2012
Los tioles
=> 12 micro-vinificationsen cuves de 30 Litres
CH3OH
SH
3-MercaptoHexan-1-ol (3MH)
60 ng/L
CH3OAc
SH
3-MercaptoHexyl acetato
4 ng/L
4-mercapto-4-metillpentan-2-one
0.8 ng/L
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18 | 04 | 2012
=> 12 micro-vinificationsen cuves de 30 Litres
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
3MH (ng/l) Ac3MH (ng/l)
Control
R Expression aroma
R Extra Color
Media de 4 vinos , 2 cepas de levaduras No habia 4MMP en la uva
Enzimas de Maceración pelicular y su impacto en el aroma de los vinos blancos
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18 | 04 | 2012
Mejoras de la calidad Perfiles de actividad Aplicadas a la etapa del proceso
Beneficios para los enólogos
Liberación de precursores aromáticos de la piel de la uva
Pectinasas , Rgasas, Maceración de pieles de uvas tintas y blancas
Incremento de aromas de uva como tioles y terpenos, ….
Taninos y otros polifenoles
Pectinasas , Rgasas, Xilanasas, celulasas
Maceracion de uvas tintas
Incremento del color y polifenoles esenciales para la calidad del vino
Aromas glicosidados de la uva no volátiles convertidos en aromas volátiles
Glucosidasa, arabinosidasa, rhamnosidasa, apiosidasa
Aplicada al vino Incremento de terpenos y norisoprenoides
Liberación de compuestos específicos de la levadura
Beta-(1,6)-glucanasas Crianza sobre lías, batonnage
Boca, aroma, mejora de la estabilidad
Enzimas de Mejora de la calidad
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18 | 04 | 2012
Enzimas de Maceración
pelicular y su impacto en
la calidad de los vinos
tintos
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18 | 04 | 2012
Rapidase® Extra Color
Acelera e incrementa la extracción de polifenoles durante la maceración de uvas tintas
Modo de acción bioquímico:
Degradación de las células del hollejo y pulpa para la liberación rápida de color y precursores aromáticos Hidrólisis de la pectina y protopectina, incluido cadena de rhamnogalacturano Hidrólisis de las hemicelulasas
Recomendaciones de uso Adición a vendimia estrujada al llenar el dep. de fermentación Dosis : 1 - 3 g / 100kg Temperatura > 16 °C Tiempo de contacto: durante el tiempo de fermentación
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18 | 04 | 2012
Rapidase® Extra Fruit
Favorece la extracción rápida de los precurosres aromáticos de los hollejos durante la maceración de uvas tintas Contribuye a la extracción de polifenoles
Modo de acción bioquímico: Degradación de las células del hollejo y pulpa para la liberación rápida de color y precursores aromáticos Hidrólisis de la pectina y protopectina Hidrólisis parcial de las hemicelulasas Recomendaciones de uso Adición a vendimia estrujada al llenar el dep. de fermentación Dosis : 1 - 3 g / 100kg Temperatura > 16 °C Tiempo de contacto: durante el tiempo de fermentación
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Rapidase® Extra Color
3 g / 100kg
Prensa fin de FA
Hacia la FML
Recomendaciones de uso de Rapidase Extra Color en maceración tradicional de tintos
Despalillar limitar trituración
Maceración con Rapidase Extra Color aumenta extracción de
color, estructura y perfil aromático
de los vinos
Medir contenido en sólidos
añadir Rapidase Extra Color a 3 g / 100kg
al llenar el Depósito
Vino escurrido
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TEMPRANILLO DE RIBERA DEL DUERO D.O
MACERACIÓN ENDEP DE 50 L
50kg uvas despalilladas & estrujadas
SO2 T 50mg/l
3 condiciones x 3 tiempos de Maceración x 2 replicados = 18 ENSAYOS
CONTROL, sin enzima. Maceración t : 4 , 8 and 12 días
RAPIDASE EXTRA COLOR a 3g/100kg. Maceración : 4 , 8 and 12 días
RAPIDASE EXTRA FRUIT at 3g/100 kg Maceración : 4, 8 and 12 días
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18 | 04 | 2012
Enzimas de Maceración pelicular y su impacto
en el contenido en polifenoles
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Anthocyanins (g/l) Tannins (g/l)
Control
R Extra Color
R Extra Fruit
Tempranillo, 12 días de maceración FA completa Antes de la FML
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18 | 04 | 2012
Enzimas de Maceración pelicular y su impacto
en el Índice de Polifenoles
0
10
20
30
40
50
60
Drain wine Press wine
Control
R Extra Color
R Extra Fruit
Tempranillo, 12 días de maceración FA completa Antes de la FML
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18 | 04 | 2012
Enzimas de Maceración pelicular y su impacto
en el color del vino
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Color Intensity A 420nm A 520nm
Control
R Extra Color
R Extra Fruit
Tempranillo, 12 días de maceración FA completa Antes de la FML
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18 | 04 | 2012
y el impacto de la
maceración con
enzimas en el pH y
acidez del vino?
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18 | 04 | 2012
Enzimas de Maceración pelicular y su impacto
en el pH y acidez del vino después de 12 días
de maceración
Tempranillo, 12 días de maceración FA completa Antes de la FML
0
1
2
3
4
5
6
pH TA (g/l) K+ (g/l)
Control
R Extra Color
R Extra Fruit
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18 | 04 | 2012
Mejoras de la calidad
Perfiles de actividad Aplicadas a la etapa del proceso
Beneficios para los enólogos
Liberación de precursores aromáticos de la piel de la uva
Pectinasas , Rgasas, Maceración de pieles de uvas tintas y blancas
Incremento de aromas de uva como tioles y terpenos, ….
Taninos y otros polifenoles
Pectinasas , Rgasas, Xilanasas, celulasas
Maceracion de uvas tintas
Incremento del color y polifenoles esenciales para la calidad del vino
Aromas glicosidados de la uva no volátiles convertidos en aromas volátiles
Glucosidasa, arabinosidasa, rhamnosidasa, apiosidasa
Aplicada al vino Incremento de terpenos y norisoprenoides
Liberación de compuestos específicos de la levadura
Beta-(1,6)-glucanasas
Crianza sobre lías, batonnage
Boca, aroma, mejora de la estabilidad
Enzimas de Mejora de la calidad
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Precursores aromáticos Glicosidados: hidrólisis enzimática secuencial
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Fermentación Dep. Clarificación
Prensa
2-3 ml / Hl
libera los aromas volátiles (terpenos, norisoprenoides) desde sus precursores no volátiles por estar con enlaces glicosilicos
Aplicación de Glicosidasas
Rapidase Revelation Aroma Glu, Ara, Rha, Apio-sidases
storage
Rapidase Revelation Aroma
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85
Liberación de geraniol desde sus precursores en vinos de Moscateles
0
50
100
150
200
250
300
350
400 Control
DP . AR 2000 à
10g/hl
Control
DP . AR 2000 à
10g/hl
DP . AR 2000 à
5 g/hl
DP Control
DP . AR 2000 à
5 g/hl
SM . Témoin
SM . AR 2000 à
5 g/hl
Diferentes concentraciones
Rapidase Revelation aroma
Diferentes concentraciones
Rapidase Revelation aroma
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18 | 04 | 2012
Conclusión
las enzimas juegan un
papel fundamental en el
proceso de elaboración
del vino
una mejor compresión de
los mecanismos
moleculares de acción,
permiten el diseño de
mejores enzimas, y más
específicas
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18 | 04 | 2012
MUCHAS
GRACIAS