Conteúdo:
1. Biodegradação de biomassa lignificada em ambientes naturais:
organismos envolvidos, aspectos macroscópicos e microscópicos da
degradação, secreção de enzimas e outros metabólitos, mecanismos de
ação das enzimas oxidativas e hidrolíticas.
2. Produção de enzimas de origem microbiana envolvidas na degradação de
biomassa lignificada: cinética do crescimento e produção de metabólitos.
3. Controle sobre a síntese enzimática – indução e repressão.
4. Celulases, hemicelulases e oxidorredutases: estrutura, função e aplicação.
5. Organismos degradadores de biomassa amilácea, oleaginosa e protéica
6. Produção de enzimas envolvidas na degradação de amido, lipídeos e
proteínas.
7. Controle sobre a síntese enzimática – indução e repressão. 8. Lipases e
proteases: estrutura, função e aplicação.
Forma de Avaliação:
O estudante será avaliado: (i) por duas provas escritas; (ii) por sua
participação durante as aulas da disciplina
Enzimas em conversão de biomassa
Enzimas em conversão de biomassa
Porque esta foto pode servir para abrir a disciplina sobre enzimas em conversão de biomassa?
Enzimas em conversão de biomassa
Este fungo requer enzimas EXTRACELULARES para a conversão de biomassa.......................
Qual é a composição de um galho de árvore??
Qual é o alimento deste fungo??
Qual seria a forma de absorção dos nutrientes por esse fungo??
O que difere esta foto da foto anterior?
Enzimas em conversão de biomassa
O substrato colonizado corresponde a uma biomassa de "acesso" facilitado
Enzimas em conversão de biomassa 2014
Colonização intensa por um fungo verde
O substrato parece ter sido "pré-tratado"
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16
% d
a m
assa
de
ce
lulo
se
inic
ial
Tempo de biodegradação (semanas)
Trametes versicolor (WR)
Irpex lacteus(WR)
Gleophyllum trabeum (BR)
Comparativo de eficiências para a metabolização de celulose
Ascomiceto Trichoderma reesei
Basidiomicetos de decomposição branca e parda
dias
semanas
Enoki et al, Holzforschung 42(1988) 85-93
Biodegradação de biomassa lignificada em ambientes naturais: organismos envolvidos, aspectos macroscópicos e microscópicos da degradação
Referências básicas: Nilsson T. 2009. Biological Wood degradation. In: Pulp and Paper Chemistry and
Technology Volume 1, Wood Chemistry and Wood Biotechnology
Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar Henriksson
cap. 10, pp. 219-244
LEVY JF. 1987. The natural-history of the degradation of wood.
Philosophical transactions of the royal society of London - series a-mathematical
physical and engineering sciences 321: 423-433:1987
A biodegradação da madeira, e dos lignocelulósicos em geral,
constitui um importante ciclo do carbono na natureza
Pode ser indesejável nos casos onde se usa a madeira com função
estrutural: construção civil; cercas e postes em áreas rurais;
embarcações de madeira.
Biodegradação da madeira em ambientes naturais
1. Alguns insetos se alimentam de fragmentos de madeira que são posteriormente
decompostos por fungos e bactérias. “Perfuradores marinhos” usualmente
utilizam a madeira como local de refúgio e não como alimento (ambos não serão
abordados nesse tópico)
2. Para os fungos degradadores, a madeira se parece com uma série de cavidades
convenientemente orientadas rodeadas por alimento.
3. O nível de umidade é crítico.
- deve ser elevado o suficiente para a difusão de enzimas e outros
metabólitos
- não deve ser elevado em demasia para evitar a formação de ambientes
anaeróbios
- não deve ser baixo em demasia para evitar que fique abaixo do limite que
permite a sobrevivência dos microrganismos
1. Baixas concentrações de Nitrogênio nos lignocelulósicos representam
uma condição limitante para a maioria dos microrganismos
2. Um lignocelulósico quando em contato com o solo em um ambiente
natural é atacado por uma série de grupos de microrganismos que se
sucedem ao longo de todo o processo biodegradativo
a) bactérias
b) bolores primários
c) fungos de tingimento
d) fungos de decomposição branda
e) fungos degradadores de madeira (decomposição parda e decomposição
branca)
f) bolores secundários Estude e responda: do que cada grupo é capaz de se alimentar
The natural-history of the degradation of wood (LEVY JF). Philosophical transactions of the
royal society of London series a-mathematical physical and engineering sciences 321:423-
433, 1987
Biodegradação da madeira em ambientes naturais
Organismos envolvidos na biodegradação da madeira
fungos de decomposição branca
“white-rot fungi”
degradam todos os componentes
da madeira
fungos de decomposição parda
“brown-rot fungi”
degradam principalmente
polissacarídeos
fungos de decomposição
branda
“soft-rot fungi”
Degradam lignina e
polissacarídeos, porém em
velocidades muito baixas
Símbolos:
Quadrado = glucana
triângulo = polioses
Círculo = lignina
Balanço de massas dos componentes durante a biodegradação da
madeira - Decomposição de Eucalyptus grandis
60
70
80
90
100
859095100
Co
mp
onen
te (%
do
inic
ial)
Massa do lignocelulósico (% do inicial)
C
60
70
80
90
100
708090100
Co
mp
onen
te (%
do
inic
ial)
Massa do lignocelulósico (% do inicial)
B
60
70
80
90
100
708090100
Co
mp
onen
te (%
do
inic
ial)
Massa do lignocelulósico (% do inicial)
A
Parda: Wolfiporia cocos Branca, não seletivo: Trametes versicolor
Branca, seletivo: Ceriporiopsis subvermispora
Biodegradação da madeira do ponto de vista
microscópico
- As hifas do fungo penetram pelo lúmen
Três tipos de ataque da parede celular
Biodegradação da madeira do ponto de vista microscópico
2. Remoção de lignina e polioses sem
a simultânea erosão da parede
celular vegetal (tem sido
observado em fungos seletivos
para a degradação de lignina).
3. Formação de microcavidades na
parede secundária, causada por
fungos de decomposição branda
1. “escamação” no sentido lúmem-
lamela média, levando à diminuição
progressiva e irregular da espessura
da parede celular.
Enzimas envolvidas no processo degradativo
O processo é
extracelular
Exo-glucanase
Endo-glucanase
beta-glucosidase
CELULOSE
OLIGÔMEROS
CELOBIOSE
GLICOSE
Sinergismo na ação das celulases
Atividades relativas de celulases de Trichoderma koningi sobre a
hidrólise completa de celulose de algodão.
Enzima Atividade relativa das
celulases
Endo-glucanase < 1%
Exo-glucanase < 1%
ß-glucosidase Nenhuma
Endo-glucanase + ß-glucosidase 5%
Exo-glucanase + ß-glucosidase 4%
Endo-glucanase + Exo-glucanase
+ ß-glucosidase
103%
Caldo de cultura original 100%
Degradação da celulose
(ação das Celulases, modelo clássico)
Degradação das hemiceluloses
(ação das xilanases e enzimas acessórias)
Degradação das hemiceluloses
(ação das mananases e enzimas acessórias)
Degradação das hemiceluloses
(ação de feruloil esterases)
Éster passível de hidrólise enzimática
Enzimas envolvidas na degradação de lignina
a) Fenoloxidases
b) Enzimas que produzem peróxido de hidrogênio
C0 CI
CII
S
S+•
S
S+•
H2O2
H2O H 2 O
C 0 C I
C II
H 2 O 2
Mn3+
Mn2+
PhOH PhO
.
Mn3+
Mn2+
ou
LiP MnP
Enzimas oxidativas (peroxidases)
Enzimas oxidativas (Peroxidase versátil - VP)
Híbrido estrutural de LiP e MnP. Combina as propriedades catalíticas das 2 enzimas, oxidando substratos de LiP e MnP.
Lacase (Cu2+)
Lacase red. (Cu1+)
O2
H2O PhOH
PhO•
Enzimas oxidativas (lacases)
glicose oxidase
(intracelular)
glioxal oxidase
(extracelular)
aril-álcool oxidase
(extracelular)
Enzimas que produzem peróxido
(são acessórias às peroxidases)
Enzimas que produzem peróxido
Também MnP pode gerar H2O2 a partir da oxidação de
ácidos orgânicos como o malônico e oxálico.
O=O
H-O-O. + CO2
Doador de H
HO-(C=O)-(C=O)-OH
Mn3+ Mn2+
O=C=O + H+ + HO-C.=O
H2O2
Enzimas com descrição recente: LPMOs
Oxidação intracadeia e clivagem da celulose e também hemiceluloses
Celobiose desidrogenase (CDH)
- Atua sobre celobiose, oligômeros de glicose e mesmo celulose,
oxidando o terminal redutor
- Utiliza quinonas, Fe3+ ou O2 como aceptor de elétrons
- Pode gerar radicais hidroxila, indiretamente, via reação de
Fenton
Degradação de celulose (modelos contemporâneos)
- AA9 (anteriormente denominadas com GH61 e LPMOs
(lytic polysaccharide monoxigenases)
Complexidade dos sistemas enzimáticos revelados com os estudos
recentes de proteômica - Exemplos
G. trabeum
em madeira
P. chrysosporium em
madeira
Table S12. The number of genes encoding the lignin oxidative enzymes in V. volvacea and other basidiomycetes
species lignin peroxidase manganese-dependent peroxidase laccases versatile peroxidase
V. volvacea 0 2 11 2
C. cinerea 0 1 17 0
A. bisporus 0 2 12 0
S. commune 0 0 2 0
P. chrysosporium 10 5 0 0
P. placenta 0 0 5 0
S. lacrymans 0 0 5 0
Bao D, Gong M, Zheng H, Chen M, Zhang L, et al. (2013) Sequencing and Comparative
Analysis of the Straw Mushroom (Volvariella volvacea) Genome. PLoS ONE 8(3): e58294.
doi:10.1371/journal.pone.0058294
- Limitação da parede celular lignificada à infiltração das enzimas
(teorias emergentes sobre o processo degradativo)
A parede celular vegetal não é "porosa" o suficiente para
permitir a penetração das enzimas.
Desse fato surge a dúvida de como alguns fungos poderiam
atacar a parede celular de forma não erosiva
Erosiva versus não erosiva
Esse tópico carece de teorias bem estabelecidas e comprovadas. No
entanto, vários artigos tomados em conjunto permitem compilar
informações que indicam claramente a importância de compostos
de baixa massa molar como intermediários do processo
degradativo:
Um dos artigos mostrou de forma inequívoca que a degradação de
lignina na parede celular tem início mesmo antes de ser porosa às
enzimas
Blanchette RA, Krueger EW, Haight JE, Akhtar M, Akin DE. Cell wall alterations in
loblolly pine wood decayed by the white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora.
J. BIOTECHNOL. 53:203-213, 1997
Madeira não tratada Tratada por 2 semanas Tratada por 4 semanas
Amostra insulina 5,7 kDa mioglobina 17,6 kDa ovoalbumina 44,3 kDa
não trat não infiltra não infiltra não infiltra
2 semanas infiltra início da S2 não infiltra não infiltra
4 semanas infiltra começa a infiltrar não infiltra
8 semanas infiltra infiltra começa a infiltrar
Remoção de lignina evidenciada por TEM com contraste para lignina
Infiltração de Ovoalbumina
contendo partículas de ouro,
após 8 semanas de
biodegradação
MnP/Mn-ácido oxálico
- Enoki M, Watanabe T, Nakagame S, Koller K, Messner K, Honda Y, Kuwahara M.
Extracellular lipid peroxidation of selective white-rot fungus, Ceriporiopsis
subvermispora. FEMS MICROBIOL LETT 180:205-211, 1999
- Kapich AN, Jensen KA, Hammel KE. Peroxyl radicals are potential agents of lignin
biodegradation. FEBS LETT 461:115-119, 1999
- Kapich AN, Stefen KT, Hofrichter M, Hataka A. Involvement of lipid peroxidation in
the degradation of a non-phenolic lignin model compound by manganese peroxidase of
the litter-decomposing fungus Stropharia coronilla. BIOCHEM. BIOPHYS. RES.
COMM. 330: 371-377, 2005.
MnP/Mn-ácido oxálico/ácidos graxos insaturados
Mn3+ ou .OH
.
Mn2+ ou H2O
COOH
O2
COOH.
COOH
OO.
Abstração de H de um doador
COOH
O OH
COOH
COOH
COOH.(etapa de propagação)
(etapa de iniciação)
MnP/Mn-ácido oxálico/ácidos graxos insaturados
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
ROO.
ROOH
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
.O2
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
.OO
HOO.
OC2H5
OH
OCH3O
OCH3
O
OCH3O.
+
OC2H5
HO
OH
OCH3
OCH3
OH
OC2H5
O
AB
Peroxidação de ácidos
graxos iniciada por Mn3+ ou
OH radical
Degradação de
um modelo não
fenólico por
radicais peroxila
Degradação in vitro de
lignina contida em um
material lignocelulósico
pelo sistema MnP/ácido
linoleico
G.G.S. Cunha et al. / Enzyme and
Microbial Technology 46 (2010) 262–
267
Sistema
lacase/mediador
Origem : sistemas in
vitro desenhados para
degradação de lignina
durante o
biobranqueamento de
polpas celulósicas
BOURBONNAIS, R., PAICE, M. G., FREIERMUTH, B., BODIE, E. & BORNEMAN,
S. (1997) Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model
compounds. Appl Environ Microbiol 63: 4627-4632.
SREBOTNIK E, HAMMEL KE (2000) Degradation of nonphenolic lignin by the
laccase:1-hydroxybenzotriazole system. Journal of Biotechnology 81:179–188
Mediadores naturais de lacase
Li K, Horanyi PS, Collins R, Phillips RS, Eriksson K-EL. Investigation of the
role of 3-hydroxyanthranilic acid in the degradation of lignin by white-rot
fungus Pycnoporus cinnabarinus. ENZYME MICROBIAL TECHNOL. 28:
301-307, 2001.
Fungos de decomposição parda e a reação de Fenton
Goodell, B. Brown-rot fungal degradation of wood: our evolving view. In: Wood
deterioration and preservation – advances in our changing world. ACS Symp. Ser.
845, p.97-118, 2003.
Hammel KE, Kapich AN, Jensen KA, Ryan ZC. Reactive oxigen species as agents of
wood decay by fungi. ENZYME MICROBIAL TECHNOL. 30: 445-453, 2002.
Reação de Fenton
H2O2 + Fe2+ + H+ ----------- H2O + Fe3+ + .OH
Fe2+ pode ser gerado pela ação de Celobiose
desidrogenase
ou
por ação de hidroquinonas produzidas pelos
fungos de decomposição parda