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Enzimas de restricción y electroforesis
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Enzimas de restricción
• Son endonucleasas específicas capaces de reconocer secuencias palindrómicas de DNA y cortar los enlaces fosfodiéster del material genético en un punto específico.
• Palindrómicas quiere decir que leen en direcciones opuestas el mismo orden de nucleótidos.
5’ G T T A A C 3’
3’ C A A T T G 5’
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Tipos de endonucleasas
• Endonucleasa Tipo I – corta lejos de la sucuencia que reconoce, ya sea río arriba o río abajo.
• Endonucleasa Tipo II – cortan dentro de la secuencia que reconocen.
• Endonucleasa Tipo III – cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.
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Enzimas de restricción
• Son suceptibles a cambios en temperatura, pH, etc.• Estas enzimas se obtienen de células bacterianas.• El nombre de estas está dado según el género y la
especie de la bacteria de dónde se aisló por primera vez esta enzima.
• La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, la cuarta letra indica la cepa y el número al final indica el número de enzima que se ha aislado de esa cepa.
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Enzimas de restricción
• Por ejemplo:
EcoRI
• Otros ejemplos:– BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de
Bacillus amyloliquefaciens
– SmaI – la primera que se aisló de Serratia marcesens
– HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de Haemophilus influenzae
Escherichia(género)
coli(especie) cepa R
Primera enzima aisladade ese organismo.
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Tipos de corte • “Sticky” o pegajosos – es
más fácil para volver a ligarse los extremos.– Ejms.
• EcoRI
• Bam HI
• HindIII
• “Blunt” o abruptos– Ejm.
• SmaI
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Enzimas de restricción
• Las endonucleasas son de gran importancia para la ingeniería genética, ya que permiten desarrollar técnicas de clonación.
• Además, te permite realizar mapas de restricción y determinar si existe homología entre otras moléculas de DNA.
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Electroforesis
• Se define como el movimiento de partículas de carga bajo la influencia de un campo eléctrico a través de un medio semisólido.
• Este medio puede ser de agarosa o de poliacrilamida.
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Electroforesis• El DNA es de carga
negativa, por lo que las partículas migran del electrodo negativo (cátodo) al electrodo positivo (ánodo).
• Esta migración es inversamente proporcional al peso molecular de las muestras.
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Electroforesis
• Materiales necesarios para llevar a cabo una electroforesis:– Gel de agarosa –
generalmente se utiliza de 1% - 2% de agarosa.
– Cámara de electroforesis – contiene los electrodos
– “Power supply” – genera el campo eléctrico
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Electroforesis
– Amortiguador de electroforesis - usualmente TBE 1X; facilita la migración de DNA y mantiene una estabilidad
– Bromuro de etidio – compuesto carcinógeno que se entrecruza entre las moléculas de DNA y cuando se irradia con luz ultravioleta emite fluorescencia.
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Electroforesis
– “Loading dye” – compuesto que se añade a las muestras de DNA; contiene glicerol, que le da peso a la muestra y no permite que se salgan de la fosa, y bromofenol azul que tiñe la muestra de color azul y sirve como indicador de migración
– Lámpara de UV – permite ver las bandas generadas
– Cámara – para tomar una foto de la gel
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Electroforesis