Download - Egy mucin glikoprotein immunfelismerése
Egy mucin glikoprotein immunfelismerése
Uray KatalinMTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport
2011. december 9.
Mucin glikoproteinek
A mucus (nyálka) alkotórészeiTestcsatornák, mirigyek, belső szervek hámszövetei termelik
Légutak, emésztő- és urogenitális rendszer, nyál
Funkció: Hámfelület védelme a kiszáradástólmikroorganizmusoktólfizikai/kémiai ártalmaktól
Nagy molekulatömeg > 200 kDaA gének és fehérjék ismétlődő szakaszokból állnakMagas Thr és/vagy Ser tartalom
=> O-glikozileződés> 50 %
Mucinok a rosszindulatú megbetegedésekben
Mucintermelő szövetekből kiinduló karcinómák
=> Mucinok rendellenes termelődése
Szövetidegen mucin
Túltermelődés Rendellenes glikoziláció
Tumormarkerek
A mucin szénhidrát-oldalláncainak felépüléseEgészséges Tumoros
esetben
Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262
GalNAc
GlcNAc
Gal
Fuc
Sziálsav
STn
Lex
SLex
Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262
Új fehérje- és szénhidrátepitópok megjelenése
Új fehérje- és szénhidrátspecifikus ellenanyagok termelődése
STn
Lex
SLex
Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262
MUC2 glikoprotein
Gasztrointesztinális szekretált mucinvékony- és vastagbél
Ismétlődő szakasz (~ 100x):1PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQT23
Gum et al 1989 J Biol Chem 264:6480
~ 80% glikoziláció
MAb 996 monoklonális ellenanyagDurrant et al 1994 Eur J Cancer 30A:355
T T
T
T
T
T
T
T
T
P
P
P
G
Q
P
V
T
T
T
T
P
I
I
T
T
P
A MUC2 glikoprotein ismétlődő szakaszánakepitópszerkezete
Uray et al 1999, Arch Biochem Biophys 361, 65
MAb 996 ellenanyag epitópja:
Minimális epitóp: 18PTGTQ22
Optimális epitóp: 16PTPTGTQ22
Uray et al 1998 J Pept Sci 4, 319
Az epitópszerkezet pontosabb megismerése módosított epitóppeptidek segítségével
D-aminosav szubsztitúció
Glikoziláció
Az egyes aminosavak szerepe a kötődésben
PT G
T
Q
N-terminális D-aminosav szubsztitúció hatásaa MAb 996 kötődésre
Uray et al 2000 Arch Biochem Biophys 378, 25
Natív peptid1 D2 D3 D4 D
-20
0
20
40
60
80
100
0,001 0,01 0,1 1 10 100
Peptide concentration (mmol/l)
Inh
ibit
ion
%
PTPTGTQ
pTPTGTQ
ptPTGTQ
ptpTGTQ
ptptGTQ
PTPTGTQpTPTGTQptPTGTQptpTGTQptptGTQ
Peptide concentration (mmol/l)
Inhib
itio
n %
Peptidkoncentráció (mM)
Inhib
íció
s %
D-aminosav szubsztitúció az N- és C-terminális lebegő régióban:3-3 D-amino acids
Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418
Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz
0
25
50
75
100
0 24 48 72 96
Idő (óra)
Pept
id %
0
25
50
75
100
0 60 120 180Idő (óra)
Pept
id %
C-terminális D-aminosavak: Stabilitás lizoszóma kivonatban
N-terminális D-aminosavak:Stabilitás szérumban
0
20
40
60
80
100
0.001 0.01 0.1 1 10
Peptide concentration (mM)
Inhi
bit
ion
%
TPTPTGTQTPTTPTPTGTQtpttptPTGTQTPTtptPTGTQtpt
Time (hour)
Time (min)
Peptidkoncentráció (mM)
Inhib
íció
s %
Idő (óra)
Idő (perc)
0
20
40
60
80
100
0.001 0.01 0.1 1 10
Peptide concentration (mM)
Inhi
bit
ion
%
TPTPTGTQtpttPTPTGTQtpttpTPTGTQtpttptPTGTQtpt
Peptidkoncentráció (mM)
Inhib
íció
s %
D-aminosav szubsztitúció az N-terminális lebegő régióban:1-3 D-aminosav
Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz
0
25
50
75
100
0 24 48 72 96
Idő (óra)
Pept
id %
N-terminális D-amino savak: Stabilitás szérumban
Stabilitás lizoszóma kivonatban
Time (hour)
Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418
Idő (óra)
0
20
40
60
80
100
0.001 0.01 0.1 1 10
Peptide concentration (mM)
Inhi
bit
ion
%
tptPTGTQTPTtptPTGTQTPttptPTGTQTpttptPTGTQtpt
Peptidkoncentráció (mM)
Inhib
íció
s %
0
25
50
75
100
0 60 120 180Idő (óra)
Pept
id %
0
25
50
75
100
0 24 48 72 96Idő (óra)
Pept
id %
D-aminosav szubsztitúció a C-terminális lebegő régióban:1-3 D-amino acids
Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz
Stabilitás lizoszóma kivonatban
Stabilitás szérumban
Time (min)
Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418
Idő (óra)
Idő (perc)
D-aminosavakkal szubsztituált peptidek térszerkezeteNMR spektroszkópia alapján
TPTPTGTQTPTtpTPTGTQtpt
tptPTGTQTpt
Tőke et al 2007 BBRC 358, 739
0
20
40
60
80
100
0.001 0.01 0.1 1 10
Peptide concentration (mM)
Inhi
bit
ion
%
TPTPTGTQTPTTPTPTGTQTPttPTPTGTQTPTtPTPTGTQTPt
Peptidkoncentráció (mM)
Inhib
íció
s %
0
25
50
75
100
0 24 48 72 96Idő (óra)
Pept
id %
0
25
50
75
100
0 60 120 180Idő (óra)
Pept
id %
Stabilitás lizoszóma kivonatbanC- terminális D-aminosavakkal
Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz Részleges stabilitás szérumbanN-terminális D-aminosavakkal
D-aminosav szubsztitúció az N- és C-terminális lebegő régióban:1-1 D-aminosav
Time (min)Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418
Idő (perc)
TPTPTGTQTPT
MAb 996 kötődés
Szérum stabilitás
Lizoszóma stabilitás
tPTPTGTQTPtHatékony ellenanyag kötődés, részleges stabilitás
tpTPTGTQtptHatékony ellenanyag kötődés, proteázokkal szembeni stabilitás
D-aminosav szubsztitúció hatása
A MUC2 epitóp peptid glikozilezése
16PTPTGTQ22
16PT(GalNAcα) PTGTQ22
16PTPT(GalNAcα) GTQ22
16PTPTGT(GalNAcα) Q22
16PT(GalNAcα) PT(GalNAcα) GT(GalNAcα) Q22
Inazu & Mizuno, Noguchi Institute, Japan
Glikoziláció hatása a MAb 996 kötődésre
0
20
40
60
80
100
0.0001 0.001 0.01 0.1 1
Peptide concentration (mmol/L)
Inh
ibit
ion
%
PTPTGTQ
PT(GalNAc)PTGTQ
PTPT(GalNAc)GTQ
PTPTGT(GalNAc)Q
PT(GalNAc)PT(GalNAc)GT(GalNAc)Q
16PTPTGTQ22
16PT(GalNAcα) PTGTQ22
16PTPT(GalNAcα) GTQ22
16PTPTGT(GalNAcα) Q22
16PT(GalNAcα) PT(GalNAcα) GT(GalNAcα) Q22
IC50 (μM)
39256.4
> 1000> 1000
16PTPTGTQ22Peptidkoncentráció (mM)
Inh
ibíc
iós
%
Variábilitás megengedettPro-szubsztitúció gyengíti a kötődést
Savas és nagy térkitöltésű aminosavaknagymértékben gyengítik a kötődést
T19 X G20 X
Az epitóp egyes aminosavjainak szerepe a MAb 996 ellenanyag kötődésben
T
PXGTQ
0 1 2 3
PAGTQ
PCGTQ
PDGTQ
PEGTQ
PFGTQ
PGGTQ
PHGTQ
PIGTQ
PKGTQ
PLGTQ
PMGTQ
PNGTQ
PPGTQ
PQGTQ
PRGTQ
PSGTQ
PTGTQ
PVGTQ
PWGTQ
PYGTQ
OD(405)
P
PTXTQ
0 1 2 3
PTATQ
PTCTQ
PTDTQ
PTETQ
PTFTQ
PTGTQ
PTHTQ
PTITQ
PTKTQ
PTLTQ
PTMTQ
PTNTQ
PTPTQ
PTQTQ
PTRTQ
PTSTQ
PTTTQ
PTVTQ
PTWTQ
PTYTQ
OD(405)
S
P
A
W
I
E
D
Csak a Ser (részben Ala, Gly, Leu)helyettesítheti a natív Thr-t
Hasonló méretű, apoláros aminosavakés Glu helyettesítheti a Gln-t
T21 X Q22 X
Az epitóp egyes aminosavjainak szerepe a MAb 996 ellenanyag kötődésben
PTGTX
0 1 2
PTGTA
PTGTC
PTGTD
PTGTE
PTGTF
PTGTG
PTGTH
PTGTI
PTGTK
PTGTL
PTGTM
PTGTN
PTGTP
PTGTQ
PTGTR
PTGTS
PTGTT
PTGTV
PTGTW
PTGTY
OD(405)
PTGXQ
0 1 2
PTGAQ
PTGCQ
PTGDQ
PTGEQ
PTGFQ
PTGGQ
PTGHQ
PTGIQ
PTGKQ
PTGLQ
PTGMQ
PTGNQ
PTGPQ
PTGQQ
PTGRQ
PTGSQ
PTGTQ
PTGVQ
PTGWQ
PTGYQ
OD(405)
S
A
G
L L
I
E
V
M
Az epitóp magjában a Gly20, Thr21 és Gln22 bármilyen helyettesítése csökkent ellenanyag kötődést okoz
A Thr19 helyettesítése növelheti az ellenanyag felismerést
Thr19 glikozilációja is növelheti az ellenanyag felismerést
18P GT T Q22
LIMVE
SAGL
NMVFKI
SAP
Az epitópszerkezet megismerése módosított epitóppeptidekkel
D-aminosav szubsztitúció:
MAb 996 kötődés +
stabilitás
Glikoziláció: 16PTPTGTQ22
Az egyes aminosavak szerepe a kötődésben
PT G
T
QPeptid – ellenanyag
kölcsönhatás megismerése
Lehetőség aktív specifikus
immunterápiára
Köszönetnyilvánítás
Hollósi MiklósMajer Zsuzsa
Vass Elemér
Mike PriceCRC, University of Nottingham
Tugyi ReginaTőke Orsolya OTKA
ETTEACR
SorosCRC
Medzihradszky-Schweiger Hedvig
Bősze SzilviaKiskó Mária
Schlosser Gitta Mák Marianna
Toshiyuki InazuMamoru Mizuno