Alimentazione e sicurezza alimentare. III Edizione.
Salerno, Camera di Commercio. 27 gennaio 2005.
Stress ossidativo ed alimentazione
Dr. Prof. Eugenio Luigi Iorio, MD, PhDDocente Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica
Seconda Università degli Studi di Napoli
Presidente del Comitato Scientifico dell’Osservatorio Internazionale dello Stress Ossidativo,
dei Radicali Liberi e dei Sistemi Antiossidanti (Parma)
Evoluzione degli organismi viventi e status redox
Cloroplasti di piante ed alghe verdi
Cloroplasti di alghe rosse Mitocondri
Batteri mobili E. coli Rhizobacteria
Solfo-batteri rossi
Solfo-batteri verdi
EUCARIOTIPROCARIOTI
Atmosfera ossidante
Atmosfera riducenteFotosintesi con H2O
Fotosintesi con H2S
Ciclo di fissazione del C
Cyanobacteria
Batteri rossi non zolfo-dipendenti
Batteri verdi filamentosi
Batteri blu-verdi
Perdita fotosintesi
Respirazione con O2 Respirazione con O2 Respirazione con O2
Batteri fermentanti ancestrali
Perdita fotosintesi
Fonti energetiche, metabolismo e status redox nel corso dell’evoluzione
OssidiFermentazionePrimi organismi viventiAnaerobiosi4 – 5 miliardi
di anni fa
OssidiFotosintesi, H2SBatteri mariniAnaerobiosi3 – 4 miliardi di anni fa
Precipitazione ossidi negli oceani con O2
Fotosintesi, H2OAlghe blu – verdiParziale anaerobiosi (1%)
1 – 2 miliardi di anni fa
Vita solo nel mareParziale anaerobiosi (17-21%)
1 miliardo di anni fa
O2 nelle acqueRespirazioneSelezione aerobia
Fotosintesi, fermenta-zione, respirazione
Metabol. aerobio, mitocondri simbiontiOzono
Apparati cardiova-scolari e respiratorio
Vantaggio energetico
Oggi
Schema generale del catabolismo cellulare
Dai processi ossidativi l’energia per la vita
NAD+
FAD
Nutrienti
Ciclo di Krebbs
Lipidicomplessi
Glicerolo Acidi grassi
Glicidi complessi
Glucosio
Glicolisi
Piruvato
Acetil-CoA
Proteine
Amminoacidi
NH3, CO2, H2O
Prodotti semplici da substrati complessi
Estrazione diequivalenti riducenti
NADH + H+
FADH2
ATP ADP+P O2 H2O
PRODUZIONE DI ENERGIA
Confronto fra anaerobiosi ed aerobiosi
In aerobiosi si produce molto più ATP che in anaerobiosi (36 vs 2, rispettivamente)
Citoplasma
GLUCOSIO
Rendimento netto
2 ATPGlicolisi
2 piruvato
2 ATP
32 ATP
Mitocondrio
Catena respiratoriaFosforilazione ossidativa
O2
6 CO2
Rendimento netto
+
H2O
Ciclo di Krebbs
2 NADH
2 NADH
6 NADH
2 FADH2
Il doppio volto dell’ossigeno
L’ossigeno, indispensabile per la vita, può diventare, in particolari condizioni, un pericolo killer
Prime evidenze sperimentali in animali da laboratorio sul possibile ruolo tossico dell’iperossia1940-1950
Disturbi respiratori fino a comparsa di lesioni alveolari dopo prolungata esposizione ad O2 puro
1954-1955 La fibroplasia retrolenticolare è provocata dall’esposizione dei neonati ad elevata pO2
1960
Molte lesioni in vivo sono provocate dalle specie reattive dell’ossigeno
Alcune specie reattive sono utili (fagocitosi)
L’invecchiamento e almeno 50 malattie sono correlate con lo STRESS OSSIDATIVO
“The free radical man”
Malattia di Alzheimer
Stroke
Aterosclerosi
Pancreatite
Infarto del miocardio
Obesità
Malattia di Parkinson
Cataratta
Artrite reumatoide
Malattia di Chron
Diabete mellito
CancroINVECCHIAMENTO
Lo STRESS OSSIDATIVO
La rottura di un equilibrio
Lo stress ossidativo è un tipo particolare di stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), secondario ad un’aumentata produzionedelle stesse e/o a una ridotta efficienza dei fisiologici sistemi di difesa antiossidanti.
Radicali liberiAntiossidantiProtezione dalle malattie
Danno cellulare(invecchiamento
e malattie)Radicali liberiAntiossidanti Radicali liberiAntiossidantiProtezione
dalle malattieDanno cellulare
(invecchiamento e malattie)
Protezione dalle malattieProtezione
dalle malattieDanno cellulare
(invecchiamento e malattie)
Danno cellulare(invecchiamento
e malattie)
O3Ozono
H2O2Perossido di idrogeno
1O2*Ossigeno singoletto
Varietà non radicaliche
HO•Radicale idrossile
ROO•Radicale idroperossile
O2•Anione superossido
Varietà radicaliche
Specie reattive dell’ossigeno
Attività ossidante
Principali specie reattive dell’ossigeno di interesse biologico
Tutte le specie reattive dell’ossigeno, radicalichee non radicaliche, possiedono attività ossidante
Le specie chimiche reattive, radicaliche o meno, agiscono generalmente come ossidanti
L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o piùelettroni, è la base chimica dello stress ossidativo
++Radicale
(ossidante)
A A
Nuova molecola (ridotta, stabile)
Molecola bersaglio(es. doppio legame C-C)
C C
Nuovo radicale(ossidante)
CC
Elettrone spaiatoOSSIDAZIONE
H2O2 + HCl → H2O + HClO-1
-1
-2
+1
RIDUZIONE
OSSIDAZIONE
OSSIDANTE
RIDUCENTE
Acquisizione elettroni
Cessione elettroni
I radicali liberi possono innescare reazioni a catena
Inizio
Propagazione
Termine
Interazione con metalli di transizione
AO : OB
AO• + OB-Fe3+
Fe2+
Scissione di perossidiRO : OR
RO• + •OR
+hν
CH2 =CH–
R–CH2 –CH* –
AddizioneR•
= C = C =
Frammentazione
R •
R:C – C*=
A : B+hν
Fotolisi/pirolisi
A• + •B
Scissione di azocompostiRN : : NR
R• + •R
– N2
R : H
A : H
A•Trasferimento
R•
Ri-arrangiamentoR:C – C*=
=C* – C:R
Combinazione
A : B
A• + •BDisproporzione
+
– C –
– C • –
– C –
– C • –+
– C =
– C =
– C –
– C –
Nei viventi, agenti fisici, chimici e biologici sono la causa dell’innesco di reazioni radicaliche a catena
L’esempio della fotolisi dell’acqua
Produzione di ROS
rUV, rX, radiazioni ionizzanti
Virus (HIV), Batteri
Inquinanti, idrocarburi aromatici, pesticidi, farmaci
Agenti fisici
Agenti biologici
Agenti chimici
+
Acqua
O HH
Radicale idrogeno
H
Radicale idrossile
OHUV +
Acqua
O HH
Acqua
O HH O HH
Radicale idrogeno
H
Radicale idrogeno
HH
Radicale idrossile
OH
Radicale idrossile
OH OHUVUV
Numerose attività metaboliche sono in grado di generare ROS
I ROS sono quasi insostituibili “compagni di viaggio” della vita cellulare
Citocromo P450Citocromo b5
NADH deidrogenasiCitocromo ossidasi
NADPH ossidasiLipoossigenasi
Xantina ossidasi Aldeide ossidasi
Produzione di ROS nella plasmamembrana: l’esempio dei leucociti polimorfonucleati
NADPH ossidasiNADPH + O2 → NADP. + H+ + O2
.
NADP. + O2 → NADP+ + O2.
Superossido-dismutasi (SOD)2 O2
. + 2 H+ → H2 O2 + O2
Catalasi (CAT)2 H2O2 → 2H2O + O2
Mieloperossidasi (MPx)HCl + H2O2 → H2O + HClO
Glutatione perossidasi (GPx)2 GSH + H2O2 → 2H2O + GSSG
Batteri, endotosine, anticorpi
Generazione di NADPH + H+
Ossidazione diretta del glucosio
Attivazione NADPH ossidasi
↑ Captazione ossigeno
↑ Disponibilitàossigeno
O2.
H2O2
H2O
SOD
CAT, GPx
HClOMPx
Ruolo del processo flogistico nella patogenesi del danno tissutale da radicali liberi
L’attivazione dei leucociti polimorfonucleati
PLA2
PL AA PG
Proteases
O2O2
.
NADPH-Ox
H2O2
HClO OH.
SOD
MPxCl-
Fe/CuFenton/HW
ROOH
R-NHClR-NH2
Batteri, LPS, Ig Fe/Cu RO•/ROO •
Produzione di ROS nei mitocondri
La catena respiratoria normalmente produce piccole quantità di ROS
O2.O2 H2O2 HO. H2O
1e- 1e-
2 H+
1e- 1e-
1H+
Riduzione tetravalente (“la regola”)
Riduzione bivalenteRiduzione univalente
Riduzione bivalente
Riduzione univalente
Riduzioni uni- e bi-valente (“le eccezioni”)
O2.O2 H2O2 HO. H2O
1e- 1e-
2 H+
1e- 1e-
1H+
Riduzione tetravalente (“la regola”)
Riduzione bivalenteRiduzione univalente
Riduzione bivalente
Riduzione univalente
Riduzioni uni- e bi-valente (“le eccezioni”)
O2.O2 H2O2 HO. H2O
1e- 1e-
2 H+
1e- 1e-
1H+
Riduzione tetravalente (“la regola”)
Riduzione bivalenteRiduzione univalente
Riduzione bivalente
Riduzione univalente
Riduzioni uni- e bi-valente (“le eccezioni”)
Produzione di ROS nei microsomi
Processi ossidativi microsomiali sono all’origine della produzione di radicali liberi lesivi
Radicali liberi lesivi generati da alcune sostanze chimiche mediante processi ossidativi microsomiali Agente chimico Funzione Radicale generato Organo bersaglio/patologia
Tetracloruro di C Lavasecco •CCl3 Fegato Paraquat Erbicida R+•, O2
• Polmoni (fibrosi polmonare) FeSO4 Contaminante alimentare HO• Sovraccarico marziale O2 Ossigenoterapia HO•, O2
• Lesioni oculari (prematuri) Alotano Anestetico •CHClCF3 - Daunomicina Chemioterapico antineoplastico Q•, O2
• Cuore Adriamicina Chemioterapico antineoplastico Q•, O2
• Cuore Mitomicina C Chemioterapico antineoplastico Q•, O2
• Cuore Nitrofurantoina Antibatterico RNO2
•, O2• Polmoni (edema polmonare)
Nitrofurazone Antibatterico RNO2•, O2
• Polmoni (edema polmonare) Metronidazolo Anti-infettivo RNO2
•, O2• Polmoni (edema polmonare)
Il ruolo chiave della xantina deidrogenasi
La xantina ossidasi catalizza la formazione di anione superossido e perossido di idrogeno nel citosol
← Xantina ossidasi →
XantinaIpoxantina
H2O2H2O + O2
Acido uricoXantina
O2•O2
Xantina deidrogenasi
Le specie reattive sono direttamente coinvolte nella patogenesi del danno da ischemia-riperfusione
Disponibilità ossigeno ↓
Stato ridotto mitocondri ↑
Fosforilazione ossidativa↓
Ipoxantina Xantina Acido urico
H2O2↑ O2. ↑
Creatina-P↓
Creatina ↑ Osmolarità ↑Glicolisi anaerobica ↑
Lattato ↑
Inosina ↑
Sintesi ATP ↓
ADP ↑
AMP ↑
IMP ↑
Danno membrana
Deficit pompe
Calcio ↑citosolico
Deficit pompe
Alterazioni omeostasi ionica
Attivazione proteasi
Xantina deidrogenasi
Xantina Ossidasi
DecompartimentalizzazioneDisorganizzazione citoscheletro
Macroischemia
Infarto, bypass, trapianti
Sedentarietà
MicroischemiapO2 ↓
Acidosi
Rilascio Fe2+/3+
dalle proteine
ROO• RO•Amplificazione del danno
ROOH
Vaso sanguigno
Cellula
ROOH↑
Attacco substrati organici
Antiossidanti preventivi
Gli antiossidanti preventivi prevengono la formazione dei radicali liberi
Classe Esempi Meccanismo d’azioneTransferrina, lattoferrina, ferritina Sequestro di ferro Aptoglobina Sequestro di emoglobina Emopessina Stabilizzazione dell’eme
Sequestratori di metalli
Ceruloplasmina, albumina Sequestro di rame Carotenoidi Quenching dell’ossigeno singoletto “Quencher”
di ROS Superossido dismutasi 2O2• + 2H+ → H2O2 + O2
Catalasi
2 H2O2 → 2 H2O + O2
Perossidasi H2O2 + AH2 → 2 H2O + A LOOH + AH2 → LOH + H2O + A
Glutatione perossidasi (plasmatica)
PLOOH+2GSH→PLOH+H2O+GSSG
Glutatione perossidasi (dei perossidi fosfolipidici)
H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS–SG PLOOH+2GSH→PLOH+H2O+GSSG
Glutatione perossidasi (intracellulare)
H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS–SG LOOH+2GSH → LOH+H2O+GS–SG
Inattivatori di perossidi
Glutatione–S–trasferasi Scissione dei perossidi lipidici
La barriera antiossidante plasmatica previene il danno ossidativo cellulare bloccando i ROS nel sangue
I gruppi tiolici (-SH) sono componenti qualitativamenteimportanti della barriera antiossidante plasmatica
-SH Altri gruppi chimiciROS
Il sistema antiossidante è regolarmente distribuito nella cellula
Gli antiossidanti lipofili presenti nelle membrane costituiscono la prima linea di difesa contro i ROS
Vitamina E, PUFA, β−carotene
Vitamina E, β−carotene
Glutatione, GPx, SOD, selenio, ascorbato,
Ubichinolo, selenio, vitamina E, SOD, GPx
Catalasi
Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi proossidanti e processi antiossidanti
Le specie chimiche reattive possono essere sia la causa che l’effetto dello STRESS OSSIDATIVO
Specie reattive ↑ Difese antiossidanti ↓
Radiazioni,farmaci, metalli pesantiFumo di sigaretta, alcool, inquinamentoEsercizio fisico inadeguato, sedentarietà
Infezioni ed altre malattie
Ridotta assunzionee/o diminuita sintesi
e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti
Danno cellulare
Malattie cardiovascolari
Invecchiamento precoce
Altre malattie
Demenza, M. di Parkinson
Infiammazioni,tumori
Il danno ossidativo è la conseguenza di un processo articolato in diverse fasi
ROS, ROMs e metalli di transizione sono responsabili di alterazioni strutturali e/o funzionali della cellula
2. Attacco di substrati organici (es. lipidi, amminoacidi, nucleotidi, etc.)
3. Formazione di idroperossidi R-OOH
5. Alterazioni funzionali/strutturali della cellula (apoptosi, necrosi)
Agenti esterni
Superamento sistemi antiossidanti
4. Generazione di radicali alcossilici R-O•/ idroperossilici R-OO•
O2
Fe/Cu
1. Generazione di ROS (O2 •, HO•, 1O2*, H2O2 )
Attività metabolica
Gli idroperossidi (ROOH) rappresentano non solo i marker ma anche gli amplicatori del danno cellulare
Gli idroperossidi presenti nel sangue costituiscono le specie chimiche rilevate dal d-ROMs test
Agenti esterniAttività metabolica
.OH
RH
H2O
R.
O2 ROO.
R1H ROOH
R1 .
Danno ossidativo
Respirazione
Cellula
Danno ossidativo
Nucleo
Citoplasma
Vaso sanguigno
ROOH
Cellula
R-O-O-H R-O.
Fe3+Fe2+
R-O-O. R-O-O-H
H+
OH-
pH ↓
Danno endoteliale
Ossidazione LDL
Matrice extracellulare
Gli effetti dello stress ossidativo sulla struttura e sulle funzioni cellulari
Bersaglio dell’attacco dei ROS sono non solo i lipidima qualsiasi biomolecola presente nella cellula
Cellula normale(senza lesioni)
Cellula dopo l’attacco dei ROS
Perossidazione di lipidi
Modificazioni enzimatiche
Lesioni del DNA
Rottura di proteine
Perossidazione ammi-noacidi e proteine
(Per)ossidazione di carboidrati
Alterazioni dell’omeostasi ionica
La matrice cellulare: uno dei principali target delle specie reattive dell’ossigeno
Il danno della matrice extracellulare gioca un ruolo determinante nella patogenesi dello stress ossidativo
EX
TRA
CE
LLULA
R M
ATR
IXa
b1
2
3
4
5
fibronectin6
7
8
L’ossido nitrico. The molecule of the year 1992 (Science)
Le proprietà biologiche dell’ossido nitrico dipendono essenzialmente dalla sua natura radicalica
La biosintesi dell’ossido nitrico
La biosintesi dell’ossido nitrico è catalizzata dall’enzima ossido nitrico sintetasi (NOS)
NADPHO2
NO+
NH
NHH2N
H3N+ COO-
L-arginina
NADPHO2
NH
N–OHH2N
H3N+ COO-
NH
OH2N
H3N+ COO-
N-idrossiarginina L-citrullina
Meccanismo d’azione dell’ossido nitrico
Interazioni tra cellule endoteliali, piastrine e fibrocellule muscolari lisce
Ruolo dell’ossido nitrico nell’erezione
Interazioni tra neuroni e fibrocellule muscolari lisce
LumeLumevascolarevascolare
Muscolatura lisciaMuscolatura liscia
Neurone NANCNeurone NANCCorpus Corpus CavernosumCavernosum
Potenziale d’azione
L-arginina L-Citrullina +nNOS
Ca-CAM
Ca2+
NONO
LumeLumevascolarevascolare
Muscolatura lisciaMuscolatura liscia
Neurone NANCNeurone NANCCorpus Corpus CavernosumCavernosum
Potenziale d’azione
L-arginina L-Citrullina +nNOS
Ca-CAM
Ca2+
NONO
Ossido nitrico e disfunzione erettile
Meccanismi di trasduzione del segnale
ArgininaArginina NONO + + CitrullinaCitrullinanNOSnNOS
GTP cGMP + PPiGTP cGMP + PPiG. G. ciclasiciclasi
5’5’--GMPGMP
PDEPDE--55SildenafilSildenafil
RILASCIAMENTORILASCIAMENTO
ArgininaArginina NONO + + CitrullinaCitrullinanNOSnNOS
GTP cGMP + PPiGTP cGMP + PPiG. G. ciclasiciclasi
5’5’--GMPGMP
PDEPDE--55SildenafilSildenafil
RILASCIAMENTORILASCIAMENTO
Il professore Louis Ignarro, Premio Nobel per la Medicina/Fisiologia 1998
“Per le sue scoperte riguardanti l’ossido nitrico come molecola segnale nel sistema cardiovascolare”
Lo spettro d’azione dell’ossido nitrico
Un mediatore importante coinvolto in numerose funzioni di vitale importanza
NONO
CardioVascularCardioVascular
AntiAnti--InflammatoryInflammatory
Host DefenseHost Defense
CNSCNS
PulmonaryPulmonary
GastroGastro--intestinalintestinal
GenitoGenito--urinaryurinary
ManyManyOthersOthers
NONO
CardioVascularCardioVascular
AntiAnti--InflammatoryInflammatory
Host DefenseHost Defense
CNSCNS
PulmonaryPulmonary
GastroGastro--intestinalintestinal
GenitoGenito--urinaryurinary
ManyManyOthersOthers
Ossido nitrico, stress ossidativo e malattie
Lo stress ossidativo riduce la “biodisponibilità” di NO e aumenta il livello di perossinitrito (ONOO-) “tossico”
FUNZIONI NORMALI
⇔O2•
NO•
NOSL-arg
FUNZIONI ALTERATE
⇑O2•
NO•
NOSL-arg
ONOO-
Ossido nitrico, stress ossidativo ed omocisteina
L’iperomocisteinemia è un importante fattore di rischio cardiovascolare
Dalla disfunzione endoteliale alla lesione ateromatosa
Riequilibrare un bilancio alterato
Aspirina,anticoagulanti,ACE-I, Ca-Ant
Nitrati, Ca-Ant, Statine, ACE-I, ARBs,
β-bloccanti
Formazione di trombi Vasocostrizione
Ipolipidemizzanti,ACE-inibitori, ARBs,Ca-Antagonisti, β-bl
Modifichestrutturali
Antiossidanti?NO-modulatori?
Danno ossidativo
Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi proossidanti e processi antiossidanti
Le specie chimiche reattive possono essere sia la causa che l’effetto dello STRESS OSSIDATIVO
Specie reattive ↑ Difese antiossidanti ↓
Radiazioni,farmaci, metalli pesantiFumo di sigaretta, alcool, inquinamentoEsercizio fisico inadeguato, sedentarietà
Infezioni ed altre malattie
Ridotta assunzionee/o diminuita sintesi
e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti
Danno cellulare
Malattie cardiovascolari
Invecchiamento precoce
Altre malattie
Demenza, M. di Parkinson
Infiammazioni,tumori
Cause di aumentata produzione di specie reattive
Diversi fattori fisiologici e patologici sono coinvolti nella generazione dei ROS
Farmacoterapia, radioterapia, raggi XFattori iatrogeni
Traumi, infiammazioni, infezioni, patologieda ischemia-riperfusione, neoplasie
Malattia
Stress psico-emotivo (?)Fattori psicologici
Alimentazione, alcool, fumo di sigaretta, esercizio fisico incongruoStile di vita
GravidanzaStati fisiologici
Inquinamento, radiazioniAmbiente
Cause di riduzione delle difese antiossidanti
Fattori genetici e ambientali possono contribuire alle alterazioni del sistema antiossidante
Sovraccarico del sistema microsomialeAssunzione di farmaci
Eccessiva produzione di specie reattive Eccessivo consumo di antiossidanti
Fattori genetici o iatrogeniInsufficienza dei sistemi enzimatici antiossidanti
Deficit dei meccanismi di captazione o di trasporto
Ridotta capacità di utilizzazione di antiossidanti
Sindromi da malassorbimento, malattia celiaca
Ridotto assorbimento di antiossidanti
Ipovitaminosi, diete monotoneRidotta assunzione di antiossidanti
Le differenti fonti cellulari di ROS sono responsabili dei differenti meccanismi dello stress ossidativo
Quattro fonti cellulari di ROS per almenoquattro meccanismi basilari di stress ossidativo
Stress ossidativoda modificazioni reattivedella superficie cellulare
Stress ossidativo da induzione
farmacometabolica
Stress ossidativo da variazioni
intracellulari della pO2
Stress ossidativoda ridotta efficienza del-la respirazione cellulare
Citocromo P450Citocromo b5
Xantina ossidasi Aldeide ossidasi
NADPH ossidasiLipoossigenasi
NADH deidrogenasiCitotocromo ossidasi
Assessing to monitor and to prevent oxidative stress
Tokyo, June 2004
In the field of oxidative stress the basic research is in a very advanced phase, while the clinical practice “marks time”. Therefore, the definitive “entry” of the whole oxidative stress background into the “arsenal” of healthy professionals, including clinicians, pharmacists and other therapists must be encouraged.
In particular, any clinician should examine any subject at risk or suffering from oxidative stress with specific analyses able to identify and circumstantially define the true status of the systemic/local oxidative balance (production/elimination ratio of chemically reactive species).
This new behavior of healthy professionals is the right premise not only for any antioxidant therapy prescription, when indicated, but also for a correct monitoring of either specific or antioxidant systemic/topical treatments, for a better patient’s quality of life.
Geni, stress ossidativo ed aterosclerosi (2)
L’analisi genica
Napoli C, Lerman A, Sica V, & de Nigris F.MICROARRAY ANALYSIS: A NOVEL RESEARCH TOOL
FOR CARDIOVASCULAR SCIENTISTS AND PHYSICIANS. HEART 2003; 89:597-604.
CAMPIONI (laser capturing)
Tessutosano
Lesioni Ateroscl.
MICROARRAYCHIP GENE ANALYSIS
STRESS OSSIDATIVO: la rottura di un equilibrio
Gli idroperossidi sono marker ed amplificatoridelle lesioni da STRESS OSSIDATIVO
Aumentata produzione di ROS (O2
., HO., H2O2,…)Compromissione della barriera antiossidante (vit. C, vit. E,…)
Perossidazione di biomolecole con produzione di idroperossidi
R-OOH(una classe di ROM)
IDROPEROSSIDI (MARKER ED AMPLIFICATORI DEL DANNO)NEI LIQUIDI EXTRACELLULARI
INVECCHIAMENTO E PATOLOGIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO (ictus, infarto, diabete, demenza, m. di Parkinson, cancro, …)
I test
STRESS OSSIDATIVO:valutare per riequilibrare
VALUTAZIONE GLOBALE DELLO STRESS OSSIDATIVO
Valutare l’ “attacco” Valutare la “difesa”
PREVENZIONE E MONITORAGGIODELLE MALATTIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO
d-ROMs test, MDA, LPO, F2-isoprostani plasmatici,…
OXY-Adsorbent test, FRAP, BAP test, TAS, -SHp test…
La valutazione globale dello stress ossidativo nella sindrome di Down
Aumentati livelli di ROM e ridotto spessore della barriera antiossidante nei soggetti Down
Car
rate
lliM
( , P
orca
ro L
, R
usci
caM
) , D
e S
imon
e E) ,
Ber
telli
Aae
, Cor
si M
mIn
tJ C
lin P
harm
Res
. Xxi
(2) 7
9-84
(200
1)
Status antiossidanteStatus proossidante
d-ROMs test
Controlli (n=20)
Down (n=40)
500
0
100
200
300
400
U C
ARR
800
600
700
p<0,05500
0
100
200
300
400
µmol
i/L
800
600
700
OXY-ADS test
Controlli (n=20)
Down (n=40)
500
0
100
200
300
400µm
oli H
ClO
/mL
800
600
700
p<0,05
-SHp test
Controlli (n=20)
Down (n=40)
p<0,05
Test comunementi impiegati per valutare lo stress ossidativo attraverso la perossidazione lipidica
Acido arachidonico radicale
1114
13
1215
16
R18
R2
1114
13
1215
16
R1
Acido arachidonico radicale
8
R2
HO*H2O
Electron transfer
O2
RHR*
Radicale perossilico
1114
13
12
15
16
OOR1
8
R2
Perossido ciclico
1114
13
12
15
16
OOR1
8
R2
IDROPEROSSIDO
1114
13
12
15
16
OHOR1
8
R2
Acido arachidonico
1114
13
1215
16
R18
R2
O2
O2
d–ROMs test
PENTANOCHOCHO
MDA
TBAR test
Misurazione diretta UV
11
14
13
12
15
16
R1
Diene coniugato
8
R2
Misurazione diretta MS
Endoperossido ciclico
O
9
11
8 COOH56
12
CH3
14
13
15
16
Il principio del d-ROMs test
Know-how e sviluppo tutto italiano
1A) R–OOH + Fe2+ → R–O• + Fe3+ + OH-
1B) R–O• + A–NH2 → R–O- + [A–NH2•]+
2A) R–OOH + Fe3+ → R–OO• + Fe2+ + H+
2B) R – OO• + A – NH2 → R-OO- + [A–NH2•]+
• R–OOH è un generico idroperossido( es. da lipidi, amminoacidi…)• R-O • è il radicale alcossilico di un generico idroperossido• R-OO* è il radicale perossilico di un generico idroperossido• A-NH2 è la N, N-dietil-parafenilendiammina (cromogeno, DEPPD) • [A-NH2
•]+ è il radicale catione, colorato, della DEPPD
La procedura di esecuzione del d-ROMs test (I)
Fasi 1-3
21 3
Procedura: Un campione di sangue intero è raccolto, per digito-puntura, in un capillare (1), il quale è immerso in una provetta contenente una soluzione acida tamponata (2). Dopo aver tappato accuratamente la provetta, si procede ad una delicata agitazione (3).Spiegazione: le proteine del siero e, in particolare, la trasferrina liberano, in ambiente acido, ioni ferro, i quali catalizzano la trasformazione degli idroperossidi inizialmente presenti nel campione in radicali alcossilici e perossilici, secondo le reazioni:A) R-O-O-H (idroperossido) + Fe2+→ R-O• (radicale alcossilico) + Fe3+ + OH-
e/o B) R-O-O-H (idroperossido) + Fe3+→ R-O-O• (radicale perossilico) + Fe2+ + H+
La procedura di esecuzione del d-ROMs test (II)
Fasi 4-6
54 6
Procedura: la soluzione tamponata di sangue intero è versata, senza il capillare, in una cuvetta (4), alla quale si aggiunge una goccia di cromogeno (5). La cuvetta è tappata e delicatamente agitata (6).Spiegazione: il cromogeno, la N,N-dietil-parafenilendiammina, che è inizialmente incolore, a contattocon i radicali alcossilici e perossilici precedentemente generati nel campione di sangue, si ossida a spesedi questi ultimi, cedendo elettroni, e, quindi, si trasforma nel corrispondente radicale catione (colorato), secondo le reazioni:
C) R-O + A-NH2 → R-O• + [A-NH2 •]+ e/o D) R-O-O + A-NH2 → R-O-O• + [A-NH2
•]+dove:
• A-NH2 è il substrato cromogeno (la N,N-dietil-parafenilendiammina), e • [A-NH2
•]+ è il radicale catione (colorato in rosso) del substrato cromogeno.
La procedura di esecuzione del d-ROMs test (III)
Fasi 7-9
Procedura:la cuvetta viene centrifugata (7) e, quindi, sottoposta a lettura fotometrica (8). I risultati del test sono visualizzati sul display e, quindi, stampati (9).Spiegazione: la centrifugazione del campione è resa indispensabile perchè a causa dellatorbidità della soluzione e dell’intenso colore rosso del sangue, non è possibile apprezzare il colore rosso del substrato cromogeno ossidato. Il fotometro, opportunamente tarato, trasformerà l’intensità del colore rilevato in termini di variazione di assorbanza a 505 nm. Tale variazione, proporzionale alla quantità di radicali generati in vitro e, in definitiva, alla concentrazione di idroperossidi inizialmente presenti nel campione di sangue, saràespressa in unità CARR.
87 9
Acropolis Fitness Center – Salerno, 31 gennaio ore 21
Un appuntamento da non perdere
Dimagrire allenandosicon il fitness anti-stress
I resultati del d-ROMs test, che indicano i livelli ematici degli idroperossidii quali, a loro volta, correlano direttamente con i livelli di radicali liberi,
sono espressi in termini di unità convenzionali di concentrazione (U CARR)
Valori di riferimento nella popolazione normale:
250-300 U CARRcioè 20.08-24.00 mg/dL di H2O2
Un aumento progressivo delle U CARR indica una gravità progressivamente crescente di stress ossidativo
d-ROMs test: interpretazione dei risultati
1 U CARR = 0.08 mg/dL H2O2
La valutazione globale dello stress ossidativoin medicina veterinaria
Valutazione globale dello stress ossidativo nelle mucche da latte nel peri-partum
-30 -15 0 +15 +30 +45 Parto Giorni
GPx (UI/mL)ROMs (U CARR)TAS (mmol/L) SOD (UI/mL)
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997.
P 2
03-4.
Stato dell’arte e prospettive future in tema di nutrizione ed integrazione antiossidante
Potenziale utilità dei test per la valutazione dello stress ossidativo
Attività anti-ossidanteStato pro-ossidante
Campioni biologici
Valutazione su
Prima dell’uso
Valutazione su
Se idoneo
Oli, eccipienti… Ortaggi, bevande…
Stato ossidativo ↓ Potenziale antioss. ↑
“Olea prima omnium arborum est” [Columella, De Rustica, 100 A. C.]
“Fra tutti gli alberi il più importante è l’ulivo”
L’olio di oliva: produzione e indici di qualità
L’olio extravergine di oliva è un’importante fonte diantiossidanti, quali tocoferoli e polifenoli
Numero di perossidi
Distribuzione del titolo di perossidi in un campionedi 20 oli extravergine di oliva testati in supermarket
Il titolo dei perossidi è uno dei più importanti indici della qualità nutrizionale di un’olio d’oliva
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Suggerimenti per la commercializzazionedi un buon olio di oliva
Conservare sempre l’olio in presenza di basse con-centrazioni di ossigeno e lontano dalla luce solare
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9.
Potere filtrante della luce (%)
Nei sacchetti destinati alla nutrizione parenterale si verificano rapidi fenomeni di perossidazione
Utilità del dosaggio dei lipoperossidi nella nutrizione parenterale
Piro
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2003
. 19:
784
–78
8.
L’assunzione di perossidi con l’alimentazione: Un possibile fattore di rischio per l’aterosclerosi
Wolff SP, et Al. Atherosclerosis. 1996. 119: 261-263
Valutazione dell’attività antiossidante totale dialcuni ortaggi e frutti mediante OXY-Adsorbent test
Più elevata attività antiossidante in alcuni ortaggi rispetto ad alcuni comuni frutti
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PEPPER TOMATO LEEK SAVOY
The normal level of antioxidant plasma barrier
I pomodori San Marzano: bentornato RE POMODORO
I pomodori sono una preziosa fonte di antiossidanti, quali caroteni e licopene
I pomodori San Marzano: bentornato RE POMODORO
I pomodori sono una preziosa fonte di antiossidanti, quali caroteni e licopene
Vegetables (tomato) vs. fruits (lemon): the different significance of OXY-adsorbent test vs. BAP test
Most vegetable show compared to fruits higher OXY-Adsorbent test and lower BAP test
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Mean values ±SD (n=10 determinations)
Attività antiossidante del “Morellino di Scansano”vs. comune bianco da tavola
Una delle possibili spiegazione del “paradosso francese”
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Relationships between oxidative stress and rearing conditions of selected animals for human nutrition
Usefulness of oxidative status assessment in veterinary medicine and food quality/safety
1. Low peroxidation level and good taste and nutrional quality of meat fromchichens reared according to the organic system (BIO). Castellini C, et al. Ital Anim Sci. 2002. 1: 291-300.
2. Dietary linolenic acid and vitamin E affect the fatty acid composition, storage stability and sensory traits of rabbit meat. Dal Bosco A et al. Meat Science. 2004. 66: 407-413.
3. Vitamin E supplementation reduces oxidative stress in growing pigs. Brambilla G, et al. J Vet Med A. 2001. 48: 33-38.
4. Low levels of oxidative stress in Cinta Senese Pigs, a historical breed free-range reared in Siena countryside. Ballerini A, et al. Journal of Veterinary Medicine A. 2003. 50 (3): 113.
5. Oxidative stress is a bio-marker of estrogen exposure in healthy veal calves.Brambilla G, et al. Analytica Chimica Acta. 2003. 483: 281–288.
Stato dell’arte e prospettive future in tema di nutrizione ed integrazione antiossidante
Potenziale utilità dei test per la valutazione dello stress ossidativo
Attività anti-ossidanteStato pro-ossidante
Campioni biologici
Valutazione su
Prima dell’uso
Valutazione su
Se idoneo
Oli, eccipienti… Ortaggi, bevande…
Stato ossidativo ↓ Potenziale antioss. ↑
Le differenti fonti cellulari di ROS sono responsabili dei differenti meccanismi dello stress ossidativo
Quattro fonti cellulari di ROS per almenoquattro meccanismi basilari di stress ossidativo
Stress ossidativoda modificazioni reattivedella superficie cellulare
Stress ossidativo da induzione
farmacometabolica
Stress ossidativo da variazioni
intracellulari della pO2
Stress ossidativoda ridotta efficienza del-la respirazione cellulare
Citocromo P450Citocromo b5
Xantina ossidasi Aldeide ossidasi
NADPH ossidasiLipoossigenasi
NADH deidrogenasiCitotocromo ossidasi
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1.
Gli obesi (BMI>30) livelli significativamente piùelevati di ROM rispetto ai controlli (BMI<23)
Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stile di vita e prevenire le conseguenze dell’obesità
BMI>30(n=12)
BMI<23(n=12)
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Base
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Riduzione significativa del livello di ROS con riposo e antiossidanti dopo un gara ciclistica di gran fondo *
Il d-ROMs test è utilissimo per monitorare lo stress ossidativo e la terapia antiossidante negli atleti
*150 kmDopo 10 giorni di terapia (n=6)
p ≤ 0.001 vs riposo iniziale0
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Riposo (n=12)
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2 giorni dopo la corsa (n=6)
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Livelli significativamente più elevati di ROM nei forti bevitori rispetto ai non bevitori
Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stile di vita e prevenire le conseguenze dell’alcool
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Forti bevitori(n=45)
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1: 1
3-18
.
Le donne che assumono contraccettivi orali hanno livelli significativamente elevati di ROM nel siero
Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stile di vita e per prevenire le coseguenze legate alla pillola
Pillolan=28
Controllin=28
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Integrazione antiossidante: una reale necessità?
Con il “padre” degli antiossidanti, l’americano Lester Packer, a Milano e con l’inventore del d-ROMs test, Mauro Carratelli,
in un supermarket di San Francisco (CA, USA)
Assessment of food supplementation bioavailability using the d-ROMs test as a marker of oxidative stress
Cornelli U, et Al. J Nutr. 2001. 131: 3208-3211
La composizione di un comune integratore
Una miscela efficace di antiossidanti
1 mgVitamin B6
48 µgSelenium5 mgZinc10 mgL-cysteine30 mgFlavonoids (from citrus)20 mgCoenzyme Q10
30 mgVitamin C0.05 mgβ-carotene0.4 mgVitamin A5 mgVitamin E
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9. 1
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7-13
0La terapia antiossidante riduce significativamente lo stress ossidativo nelle vasculopatie periferiche
Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stress ossidativo nel corso della terapia antiossidante
Controlli (n=12)Pazienti (n=15)
Dopo la terapiaPrima della terapia0
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Ruolo protettivo di classici NO-donatori e della ni-troaspirina sulla generazione di ROS da riperfusione
Il d-ROMs test è utile per monitorare trattamentispecifici nello stress ossidativo da isch-riperfusione
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Dopo 30’ IS. Dopo 5’ RIP. Dopo 15’ RIP. Dopo 30’ RIP.
Fisiol. NO-ASA DETA-NO *p < 0.05 fisiol vs. basale°p < 0.05 NO-ASA e DETA-NO vs. fisiol.
**p < 0.05 DETA-NO vs. NO-ASA
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La terapia antiossidante riduce significativamente il livello di stress ossidativo nella demenza senile
Utilità del d-ROMs test nel monitoraggio dello stress ossidativo in pazienti con malattia di Alzheimer
p<0.01 (pz vs contr)p<0.05 (prima vs dopo)
Controlli (n=11)Pazienti (n=11)
Dopo la terapiaPrima della terapia0
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p<0,01p<0,01
Riduzione significativa (30-40%) del livello di ROM dopo terapia antiossidante nel photo-aging
Utilità della valutazione dei ROM nel monitoraggio dello stress ossidativo nel photo-aging
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Settimana 2 Settimana 4 Settimana 6P<0,005 per ambedue i gruppis vs. basale
Settimana 8
Terapia L+S (n=10) Terapia S (n=10) NO antiossidanti (n=10)
L: acido α-lipoico (0.5 mg) + melatonina/emblica (15 mg), gel nano-colloidale S: ascorbato (45 mg) + tocoferolo (5 mg) + luteina (3 mg) + α-lip. (2.5 mg) caps.
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553-
465.
La terapia idropinica, specie se associata a fango-balneoterapia, riduce il livello di stress ossidativo
Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stress ossidativo nel corso di trattamenti termali
SOLO TI (n=19)TI + FBT (n=16)
Dopo la terapiaPrima della terapia0
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Nel diabete, un regolare regime dietetico riducesignificativamente il livello di stress ossidativo
Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stress ossidativo e le sue conseguenze nei diabetici
Controlli (n=12)Diabetici (n=15)
Dopo la dietaPrima della dieta0
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Il Parco Nazionale del Cilento (provincia di Salerno)
L’area che rivendica i natali della Dieta Mediterranea
Assessment of oxidative stress in school children of 3 cities of Southern Italy (10 to 13 years, n=180)
A screening for d-ROMs test showed a trend to high levels of oxidative stress may be due to lifestyle
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Substantial changes in the distribution of nutrients and caloric intake after 44 years of study
A possibile cause of increased oxidative stress
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Substantial changes in the Body Mass Index (BMI) during 44 years of study
A possibile cause of increased oxidative stress
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Significantly increased levels of ROMs in obese children
The epidemic of obesity (WHO)
Atabek ME, Vatansev H, Erkul I. Oxidative stress in childhood obesity. J Pediatr Endocrinol Metab. 2004. 17(8): 1063-8.
OBJECTIVE: To measure products of free radical damage in childhood obesity. METHODS: Plasma free radicals were assayed in 24 children with exogenous obesity and 24 non-obese healthy controls. A new colorimetric method was used that measures the generation of peroxy radicals (D-ROMs test), first products of the reaction between free radicals and oxygen. RESULTS: D-ROMs levels were higher in the obese children than in the non-obese group (33.3±10.1 mg% of H2O2 vs. 22.8±2.8 mg% of H2O2; p<0.001). Moreover, D-ROMs levels were higher in children with hyperlipidemia than in children with normolipidemia (49.6±3.1 mg% of H2O2 vs. 27.8±3.2 mg% of H2O2; p<0.001). D-ROMs level was positively correlated with waist-hip ratio, serum total cholesterol, serum triglycerides, serum low-density lipoprotein-cholesterol, systolic blood pressure, diastolic blood pressure and fasting blood glucose in obese children. In a multivariate regression model for obese children, the independent correlates for D-ROMs level were systolic blood pressure (p <0.001) and serum total cholesterol (p <0.001), with the total variance explained being 82%. CONCLUSION: Our study demonstrates for the first time that there was increased D-ROMs levels in obese children and adolescents and suggests that increased systolic blood pressure associated with hyperlipidemia may independently contribute to increased oxidative stress in childhood obesity.
Significant low values of d-ROMs test but not significant reduced barrier thickness in obeses
d-ROMs test and OXY-Adsorbent test are useful methods to monitor oxidative stress in obesity
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BMI<23 BMI>30
BMI<23: n=12; 54±6 yrBMI>31: n=12; 55±7 yr
Antioxidant status (OXY-A)
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BMI<23: n=12; 54±6 yrBMI>31: n=12; 55±7 yr
Prooxidant status (d-ROMs)
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001.
The Second International ConferenceOxidative Stress & Aging
Maui, Hawaii, April 2-5 2001:the first presentation of d-ROMs test in US
The genuine napolitan hand-made pizza: the “Queen of the Mediterranean diet”
Pizza is an hand made and wood oven baked product to be eaten as “espresso” food
Festa della Pizza (Salerno, Southern Italy): the biggest Pizza Festival of the World…
… which born to defend the identity of Italian genuine pizza worldwide.
The first certified “napolitan genuine hand-made pizza” of the world
A very important step in the process of qualifying of Italian products (science manager Dr. Iorio)
The original recipe of the “napolitan genuine hand-made pizza”
The triumph of Mediterranean diet
Leavening time: 6-8 hoursWood oven temperature: 400-450°C
Baking time: 60-90 sec
Disk:Wheat floor 1700 gWater 1 L (<20°F, pH 6.7)Natural yeast 2.5-5 gMarine salt 50 gGuarnishing:Extra-virgin olive oil 5 gTomato 30 gBuffalo Mozzarella chease 50 gPecorino/Parmigiano chaese 4 gBasilSalt
Assessing to monitor and to prevent oxidative stress
Tokyo, June 2004 – Larissa, October 2004Thessaloniki, November 2004 -
– Elea, december 2004 – SALERNO 2005
The clinician should examine any subject at risk or suffering from oxidative stress with specific tests able to identify and circumstantially define the true status of the systemic/local oxidative balance (production/elimination ratio of chemically reactive species). This new behavior of healthy professionals is the right premise not only for any antioxidant therapy prescription, when indicated, but also for a correct monitoring of either specific or antioxidant systemic/topical treatments, for a better patient’s quality of life.
Scheda per la valutazione dello stress ossidativo (Iorio, 2002)
Per un migliore inquadramento del paziente
AnnotazioniInterventi terapeutici consigliatiRisultati BAP-test 1Risultati d-ROMs test 1Anamnesi patologica prossimaAnamnesi patologica remotaVerdure (porzioni/giorno)Attività fisica (ore/settimana)Frutta (porzioni/giorno)FarmaciForte bevitoreAssunzione di alcoliciFumo di sigarettaArea di residenzaAltezzaPesoTelefonoIndirizzoProfessioneStato civileData di nascitaLuogo di nascitaCognomeNome
d-ROMs test: le linee-guida per la prevenzione ed il monitoraggio dello stress ossidativo
Uno strumento preziosissimo per la pratica clinica
Linee guida per monitorare lo
STRESS OSSIDATIVO
301 – 320 U CARR 250 – 300
U CARR 321 – 400 U
CARR < 250
U CARR > 400
U CARR
La condizione border-line
Come orientarsi
301 – 320 U CARR (condizione border line)
Anamnesi ed esame obiettivo
Dieta sbilanciata
Esercizio fisico inadeguato
Riequilibrare la dieta
Monitorare l’allenamento
Malattia in atto
Suggerimenti per migliorare stile di vita
Trattamento specifico + suggerimenti
Ripetere il test dopo 3 mesi (in media)
Ripetere il test dopo 3 mesi
Nessuna evidenza di malattia in atto
Ulteriori indagini diagnostiche
Possibile malattia in atto
BAP TEST
Terapia antiossidante (se positivo BAP TEST)
The d-ROMs test is a useful test to predict the first atherothrombotic event
Ridke et al. Circulation, 2004
Livelli normali di colesterolo totale possono essere associati con elevati livelli di ROM
Lo STRESS OSSIDATIVO potrebbe essere un fattore di rischio indipendente D
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<200 mg/dL(n=21)
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26%
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22%
>200 mg/dL(n=46)
52%
29%
14%
5%
Nel 48% dei casi, soggetti normocolesterolemici possono
avere livelli anche elevati di ROM
<300 U CARR (normale)
301-320 U CARR (borderline)
361-400 U CARR (SO medio)
321-360 U CARR (SO medio-basso)
>400 U CARR (SO elevato-elevat.mo)
Livelli di stress ossidativo (SO) sulla base del d-ROMs test
L’approccio integrato della “rivoluzione antiossidante”
Come orientarsi
Controllare periodicamente il proprio livello di stress ossidativo con test semplici, affidabili e precisi.
Ridurre l’esposizione del proprio organismo a fattori ambientali che inducono il rilascio di radicali liberi, curando l’igiene dell’ambiente di vita e di lavoro: limitare il contatto con l’aria inquinata, evitare o ridurre l’esposizione al fumo passivo, alle radiazioni ed ai campi elettromagnetici, ecc.
Migliorare il proprio stile di vita: ridurre/abolire il fumo di sigaretta, ridurre il consumo di bevande alcoliche e superalcoliche, praticare attività fisica con esercizi a bassa intensità (30’ di camminata veloce senza interruzione, tre volte alla settimana, secondo Cooper)
Cucinare e mangiare in maniera antiossidante, privilegiando il modello alimentare “mediterraneo”; in particolare consumare pane e pasta integrali e crucifere (broccoli e cavoli), favorire alcuni matrimoni alimentari ad azione sinergica (es. pomodoro ed olio extravergine di oliva), assumere molta frutta colorata di stagione e… bagnare eventualmente il pranzo con un bicchiere di buon vino rosso!
Integrare, quando necessario, l’alimentazione con antiossidanti, sotto il diretto controllo del medico, e dopo aver effettuato un’accurata valutazione di laboratorio.