1
DNA diagnostika a principy základních metod molekulární biologie
2
Mol. biologická diagnostika• diagnostika na úrovni DNA, RNA a proteinů
• analýza kvalitativní i kvantitativní• proč se provádí
• detekce přítomnosti nukleové kyseliny specifické sekvence• např. identifikace živočiš. druhu nebo jedince
• analýza struktury (souvislé sekvence) nukleové kyseliny• stanovení genotypu
• např. detekce klinicky významných mutací a polymorfizmů• kvantifikace nukleové kyseliny (RNA) se
specifickou sekvencí• hodnocení intenzity a změny exprese genů (např.
tumory)• kvantifikace proteinů a typů jejich post-translační
modifikace• nejpoužívanější techniky
• DNA • PCR, RFLP (analýza délky restrikčních fragmentů),
elektroforéza, S-hybridizace, exprese, klonování• RNA
• reverzní transkripce, kvantifikace, N-blotting, • proteiny
• PAGE elektroforéza, W-blotting, protilátky, imuno- precipitace, ELISA, kapalinová chromatografie (HPLC), hmotnostní spektroskopie, ..
3
Izolace nukl. kyselin a proteinů• lýza buněk či tkání (lyzační pufry)
• složení pufru odpovídá záměru (lysozym, proteinázy, detergenty, chelatační činidla)
• odstranění ostatních kontaminujících částí s výjimkou požadovaného výsledného materiálu• izolace nukl. kyselin na základě
• rozdílné rozpustnosti
• adsorpce na pevný podklad
• ultracentrifugace
4
Elektroforéza DNA nebo proteinů• základní separační technika při analýze nukleových
kyselin nebo proteinů• principem separace je pohyb nabitých molekul (v
případě DNA negativně nabitých fosfátů k anodě) v elektrickém poli• v pevném nosiči (gel) a vodivém pufru
• gely • polyakrylamidové (PAGE) = vertikálně• agarózové = horizontálně
• elektroforézy horizontální či vertikální, popř. kapalinové
• rychlost pohybu v gelu je nepřímo úměrná (logaritmu) velikosti molekuly • velikost konkrétní molekuly se určí pomocí velikostních
standardů• po separaci (při určité hodnotě mV po určitou dobu) je
nutno separované molekuly zviditelnit• DNA
• dvojvláknová – ethidium bromid (interkalace) + UV• jednovláknová – SYBR green nebo barvení stříbrem
• proteiny• přímo v gelu (Coomassie modř)• po W-blottingu protilátkami na membráně
• modifikace• pulzní elektroforéza• denaturační gradientová (DDGE)• SSCP• heteroduplexy
5
Elektroforéza - postup
6
Elektroforéza DNA
7
Elektroforéza proteinů
8
Identifikace proteinů: W-blotting
9
Manipulace s nukl. kyselinami• amplifikace (n-kopií)
• Polymerase Chain Reaction (PCR)• enzymy, které specificky zasahují do jejich struktury
(spec. DNA nebo RNA)• polymerázy – syntetizují nukl. kyseliny• fosfatázy, kinázy, metylázy – modifikují• ligázy – spojují nukl. kyseliny• nukleázy – odbourávají, štěpí
• restrikční endonukleázy = sekvenčně specifické enzymy bakterií (obrana před bakteriofágy) - >3500 enzymů• rozpoznávací místo (často palindrom)• názvy podle rodového a druhového jména organizmu (např. )
• klonování do vektorů• hybridizace
• různá pevnost kovalentních a vodíkových vazeb v DNA• schopnost denaturace x renaturace• hybridizační sondy
• hybridizace na membráně, in situ (FISH)
10
Klonování DNA• jedna z nejzákladnějších metod molekulární biologie
• studium struktury a funkce genů (kódujících i regulačních oblastí)
• produkce rekombinantních proteinů (genové inženýrství)• tvorba genových (cDNA) knihoven • tvorba transgenních organizmů
• klonování = proces tvorby klonů• klon = soubor identických dceřinných buněk (organizmů)
vzniklých mitózou z jedné mateřské buňky• molekulární (DNA) klonování = tvorba klonů DNA
• tvorba rekombinantních molekul DNA množením v hostitelské buňce • rekombinantní DNA = vznikla spojením DNA fragmentu (inzertu)
a vektoru in vitro
• vektor = systém, který má schpnost přijmout cizorodou DNA a replikovat se v hostitelské buňce• plazmidové vektory• bakteriofágové vektory• umělé chromozomy (bakteriální, bakteriofágové nebo
kvasinkové)• viry
• proces klonování• příprava rekombinantní DNA (vpravením inzertu do
vektoru) • inzert – DNA izolovaná z organizmu, cDNA, produkt PCR
• přenos rekombinantní DNA do hostitelské buňky (= transformace bakterií, typicky E. coli)• chemicky nebo elektricky
• selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA• součástí vektoru je gen kódjící rezistenci k určitímu antibiotiku,
bakterie bez vektoru nerostou na půdě s antibiotikem• pomnožení rekombinantích klonů a jejich další použití
• transfekce eukaryontních buěk, exprese proteinu, …
11
Klonování DNA - využití• klonování = tvorba klonů (identických molekul
DNA)• rekombinantní DNA vznikne spojením inzertu
(cizorodé DNA) s vektorem• aplikace
• studium funkce izolovaných genů• studium regulačních oblastí genů• fyzikální a genetická analýza genomů• exprese cizorodých genů a tvorba
rekombinantních proteinů
12
Příklad – komerční klonovací vektor
13
Klonování - postup
14
ATB selekce transformovaných bakterií
15
Klonování DNA není klonování organizmu
16
Enzymy pro manipulaci s DNA• všechny enzymy mají substrátovou
specifitu – tedy DNA nebo RNA• restrikční endonukleázy
• sekvenčně specifické enzymy produkované kmeny většiny bakterií (slouží jim k degradaci cizorodé DNA , např. plazmidu nebo bakteriofága)
• dnes známo cca 3 500 enzymů (procca 160 různých sekvencí)• název podle rodového a druhového
jména bakterie• např. Eco (E. coli), Hae (Haemophilus
aegypticus), Sau (Staphyloccocus aureus)
• rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů – 4 – 8bp (rozpoznávací místo je často palindrom) a tak štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bází a podle rozpoznané sekvence
• vznikají restrikční fragmenty ( restrikční mapa)
• DNA polymerázy• připojování nukleotidů v 5’ 3’ směru
17
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)• charakterizace DNA pomocí
jejího štěpení enzymy - restrikčními endonukleasami na fragmenty• identifikace a analýza produktů
štěpení se provádí elektroforetickým dělením
• za daných podmínek vzniká reprodukovatelný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce (= počtu bazí)• počet i délka fragmentů je pro
daného jedince specifická • využití
• mutací v daném úseku DNA se může ztrácet nebo naopak vytvářet restrikční místo• RFLP často následuje po
amplifikaci DNA pomocí PCR k definitivnímu určení genotypu
• určení totožnosti (forenzní účely, paternita)
18
Hybridizace nukl. kyselin• používá se k vyhledávání
známých sekvencí v genových knihovnách a na chromozomech
• využívá se schopnosti DNA denaturovat (při vysoké teplotě) a zpětně renaturovat • kovalentní vazby kostry jsou
mnohem pevnější než vodíkové vazby mezi páry bází
• při přítomnosti značené sondy část komplementární sekvence DNA renaturuje s ní
• provádí se • přímo na buňkách• po blottingu na membráně• na řezech tkání (in situ)
• sondy• značeny radioaktivně (32P, 35S)• značení fluorescenční
• např. FISH (fluorescent in situ hybridisation)
19
Southern hybridisation
20
FISH
21
cDNA knihovny• geny má určitý živočišný
druh v kompletní výbavě v jádře každé jednotlivé buňky
• ovšem exprese jednotlivých genů je specifická pro jednotlivé tkáně a různé situace• zdraví nemoc• ovlivňení nějakou látkou
bez ovlivnění
• pokud se izoluje RNA z nějaké tkáně či skupiny buněk, přepíše se reverzní transkripcí do cDNA a ta se naklonuje do bakterií, vzniká tzv. icDNA knihovna, ve které se dají vyhledávat specifické geny, porovnávat kvantita jejich exprese atd.
22
Microarrays
23
PCR• popsal v r. 1983 Kary Mullis, 1993
Nobelova cena• princip
• enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (denaturace ~95°C, annealing ~60°C, extenze ~72°C)
• komponenty reakční směsi pro PCR• voda• pufr• dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGT)• MgCl2• termostabilní DNA polymeráza (například
Taq z bakterie Thermus aquaticus) • oligonukleotidové sondy (“primery”)• templátová DNA
• teplotní režim• 1) 95ºC 2‘ iniciální denaturace• 2) 96ºC 30‘‘denaturace• 3) 40-72ºC 20‘‘ annealing• 4) 72ºC 30‘‘ elongace
• kroky 2 – 4 celkem 30x• 5) 72ºC 5‘ závěrečná elongace• 6) 4ºC 10‘ zchlazení
24
PCR• produkt PCR reakce je možno
zviditelnit UV světlem po elektroforetickém rozdělení (nejč. v horizontálním 1 - 3% agarózovém gelu) a obarvení interkalačními barvivy
25
Sekvenování DNA• metoda ke zjištění primární sekvence
úseku DNA• nejčastěji se používá modifikací tzv.
Sangerovy metody• je založena na PCR a používá kromě základních
nukleotidů ještě značené ddNTP (= terminátor reakce katalyzované DNA polymerázou)• radioaltivně značené ddNTP – nutné 4 separátní
reakce• fluorescenčně značené ddNTP – pouze 1 reakce
26
Sekvenování DNA
27
DNA diagnostika• proč se provádí
• detekce přítomnosti nukleové kyseliny (detekce přítomnosti specifické sekvence)• např. identifikace živočiš. druhu• identifikace jedince (forenzní)
• analýza struktury (souvislé sekvence) nukleové kyseliny
• stanovení genotypu • např. detekce klinicky významných
mutací a polymorfizmů• dědičné choroby• mutace v onkogenech a supresorových
genech v nádorech • kvantifikace nukleové kyseliny se
specifickou sekvencí• microarrays
• cytogenetika • chromozomové aberace• karyotyp
28