“Establecimiento y multiplicación in vitro de
segmentos nodales de Cordia trichotoma (Vell.)
Arráb. Ex Steud (Borragináceas).”
Autor:
Ing. Santiago José Elías Velazco
Coautores:
M. Sc. Patricia Rocha.
M. Sc. Fernando Niella.
¿Por qué Peteribí? • Especie de interés forestal
• Explotación selectiva
• Inconvenientes con su establecimiento in vitro.
¿Por qué propagación in vitro?
• Producción en masa durante todo el año
• Intercambio de germoplasma
• Útil para programas de mejoremiento genético
Objetivo:
Lograr un protocolo de desinfección eficiente para
el establecimiento in vitro de segmentos nodales
de Cordia trichotoma, y analizar distintas variables
de condiciones de cultivo, que promuevan una
mayor proliferación de brotes.
Materiales y métodos
• Rebrote de plantas madre de 4 años
• Medios de cultivo Murashige y Skoog
• WPM
• 20 gr. L-1 de sacarosa y 8 gr. L-1 de agar
• pH a 5.8 ± 0.05
• Condiciones de cría: 25 ºC fotoperiodo de
16 hs.
• 7 días bajo oscuridad.
Fase de establecimiento:
Variables de estudio.
• Número de explantes contaminados por hongos
• Número de explantes contaminados por bacterias
• Número de explantes fenolizados
• Número de explantes sobrevivientes, (verde sin contaminación o fenolización).
• Evaluación, luego de 7, 14 y 21 días de establecidos los ensayos.
Experimento 1
• Objetivo: Evaluar un protocolo de
desinfección en el que se utiliza etanol
fungicida, antibióticos, cloruro de mercurio
y lavandina.
•Dos tratamientos con 20 repeticiones cada
una.
•primer paso, inmersos en una solución de
etanol al 70 % v/v.
•fungicida (Captan® 0.5 g/l) 30 min.
•solución de antibioticos (50 mg/l de sulfato
de estreptomicina, cefotaxima y
gentamicina) 3 Hs.
•exposición a ClHg (0.3 mg/l) 10 min.
•hipoclorito de sodio al 20% v/v por 10 min.
Tratamientos y resultados
Trat. Hipoclorito
de sodio n
Contaminación % Feno-
lización
%
Sobre-
viviente
% Hongos Bacterias
T1 No 20 100 0,00 45,00 0
T2 Si 20 95 0,00 70,00 5
Explantes fenolizados
•Se logra controlar la aparición de
bacterias
•Solución de tres antibióticos se
utilizó en otras investigaciones con
buenos resultados :
Papaya, Peteribi.
• Fenolización:
ClHg , Lavandina
Experimento 2:
• Objetivo: Evaluar el aislamiento de las plantas
madres como método para disminuir la carga
microbiana de los brotes formados posterior a la
decapitación y/o poda. Además el efecto sobre la
contaminación que se obtiene con una última
inmersión sin enjuague, en una solución de
antibiótico, antioxidante y fungicida.
Pretratamiento:
• T1a y T1b decapitación de
las plantas madres y la posterior
aplicación de Captan® (20 gr L-1),
se procedió a envolver las
plantas madres con
polietileno transparente.
• T2a y T2b, decapitación de las plantas madres,
y aplicación semanal de Captan® (20 gr L-1) una
vez que los brotes tuvieron una longitud de 0.5
cm.
Tratamiento y diseño experimental
• Cuatro tratamientos con 25 repeticiones cada
una y con distribución factorial.
Protocolo de desinfección:
• Etanol (70% v/v) durante 30 seg.
• Captan® 5 g/l, durante 1 hora.
• Inmersión antibióticos. (50 mg./l sulfato de
estreptomicina, cefotaxima y gentamicina), 3 hs
• ClHg 0.03% p/v 10 min.
• T1b y T2b los explantes inmersos en una
solución de Alliette® (250 mg/l), gentamicina
(250 mg/l) y ácido ascórbico (50 mg/l), sin
posterior enjuague.
Tratamientos y resultados
Trat. Planta
madre
Inmersión
en
solución.
n
Contaminación % Feno-
lizados
%
Sobre-
vivencia
% Hogos Bacterias
T1a No
Cubierta Sin 25 8.0a 52.0 c 20.0a 40.0 a
T1b No
Cubierta Con 25 0.0 a 28.0 b 24.0a 64.0 ab
T2a Cubiertas Sin 25 12.0 a 12.0 ab 4.0a 72.0 ab
T2b Cubiertas Con 25 0.0 a 4.0 a 12.0 a 84.0 b
Total 100 5.0 24,0 15.1 65,0
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
Explantes contaminados por bacterias
Cubrir las platas madres no es practico a
nivel operativo
Experimento 3:
• Objetivo: Evaluar si la juvenilidad del
brote es un factor de alta implicancia en el
grado de contaminación de los explantos.
Tratamiento y diseño experimental:
• Decapitación plantas madres y aplicación
semanal de Captan® (20 gr L-1)
• Utilizo protocolo de desinfección
experimento 2 (T1a).
• T1 consistió en la recolección y
establecimiento de los brotes una vez que
esto alcanzaron una longitud de 5cm.
• T2 la recolección a los 10 días de haberse
efectuado el establecimiento T1.
• Completamente aleatorizado con 150
repeticiones por tratamiento.
Tratamientos y resultados
Trat. Tiempo n Contaminación% Feno-
lizados
%
Sobre-
vivencia
% Hogos Bacterias
T1 Hasta
los 5 cm 150 7,3 a 1,3 a 0 a 91,3 a
T2 Luego de
10Días 150 6,6 a 1,3 a 6,6 b 85,3 a
Total 300 7 1,3 3,3 88,3
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
Brote de Cordia tichotoma (Vell.) Arráb. Ex
Steud
•Importante: Tiempo
del brote en la
planta madre.
•Diferentes a los
anteriores
experimentos
•Resultados
semejantes en
Incienso.
Fase de multiplicación:
Variables de estudio.
• Número de explantes con brotes,
• Número de brotes por explante,
• Número de hoja por brote
• Largo de los brotes.
Experimento 1:
• Objetivo: Determinar que concentración
de hormonas BAP y ANA son las que
promueven una mayor brotación de los
explantes.
• Tratamiento y diseño experimental: diseño
completamente aleatorizado con 36
repeticiones por tratamientos con una
distribución factorial.
Tratamientos y resultados
Trat. Nivel
del factor
mg/l
Nivel
del factor
mg/l n
Fenolizados
%
Explantes
Brotados %
T1 ANA 0 BAP 0 36 44,4 ab 25,0 a
T2 ANA 0 BAP 2,5 36 22,2 a 36,1 a
T3 ANA 0 BAP 5 36 50,0 b 16,7 a
T4 ANA 0,01 BAP 0 36 47,2 b 16,7 a
T5 ANA 0,01 BAP 2,5 36 22,2 a 33,3 a
T6 ANA 0,01 BAP 5 36 36,1 ab 25,0 a
Total 216 37,0 25,5
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
Tratamientos y resultados
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
Trat. ANA
mg/l
BAP
mg/l n
Nº Medio
de brotes
Nº Medio
de hojas
Largo
medio
(cm)
T1 Testigo ANA 0 BAP 0 9 1,11 a 2,33 a 1,07 ab
T2 ANA 0 BAP 2,5 13 1,00 a 2,69 a 0,62 ab
T3 ANA 0 BAP 5 6 1,00 a 2,33 a 1,20 b
T4 ANA 0,01 BAP 0 6 1,00 a 2,33 a 0,42 a
T5 ANA 0,01 BAP 2,5 12 1,00 a 2,42 a 0,50 a
T6 ANA 0,01 BAP 5 9 1,11a 2,44 a 0,42 a
Total 55 1,04 2,45 0,68
• Diferentes conclusiones
en la bibliografía
consultada.
• Fick (2007) semejantes
resultados.
• Schendelbeck (2007) y
Montavani (2001) mejores
resultados con hormonas.
Explantes con brotes.
Experimento 2:
Objetivo: Evaluar el efecto que causa el aumento
de la concentración de sacarosa combinado con
distintas frecuencias de subcultivos.
Tratamiento y diseño experimental:
• completamente aleatorizado al azar con 50
repeticiones por tratamiento,
• se evaluó dos dosis de sacarosa, combinados
con dos frecuencia de subcultivos
• testigo consistió en la utilización de 30 gr/l de
sacarosa y sin subcultivos.
Tratamientos y resultados
Trat. Sacarosa
gr/l
Repique
Días n
Explantes
Brotados %
T0 Testigo 30 no 28 53,5 a
T1 30 7 35 42,8 a
T2 30 14 27 40,7 a
T3 45 7 36 38,9 a
T4 45 14 24 12,5 b
Total 150 38,6
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
Tratamientos y resultados
Trat. Sacarosa
gr/l
Repique
Días n
Nº de
brotes
Nº de
hojas
Largo
Media
(cm)
T0 30 no 15 1,1 a 3,16 ab
0,44 a
T1 30 7 15 1 a 3,33 a
0,59 a
T2 30 14 11 1 a 3,27 a
0,48 a
T3 45 7 14 1 a 2,92 ab
0,52 a
T4 45 14 3 1 a 2 b 0,33 a
Total 58 1 3,11 0,50
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
• Mejor resultado testigo
• En Yerba mate brotación disminuye con el
aumento de las concentraciones de
sacarosa
• Estudios en papaya incremento en el
numero de brotes con el aumento de
sacarosa
Conclusiones: Fase de Establecimiento • Es posible la desinfección de segmentos
nodales de Peteribí provenientes de brotes de plantas madres de 4 años de edad, con el uso de brotes jóvenes recolectados apenas hayan alcanzado los 5 cm de longitud, más el empleo de un protocolo de desinfección que utiliza, etanol, tween 20, fungicidas, antibióticos, cloruro de mercurio y cloruro de calcio.
• El aislamiento con polietileno de los brotes de las plantas, no contribuye en forma significativa sobres los niveles de contaminación de los explantes.
Conclusiones:
Fase de Multiplicación
• El uso de hormonas BAP y ANA no promovió
una mayor brotación de los explantes, respecto
al tratamiento sin hormonas.
• El aumento de la frecuencia de subcultivos y
mayores concentraciones de sacarosa no
lograron incrementar la brotación en la fase de
multiplicación de peteribi.
Gracias por su
atención !