Thèse soutenue le 16 décembre 2005 par
Anne-Cécile PETIT Ingénieur ENSCR
MODIFICATION D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR MODIFICATION D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR
UNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDSUNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDS
Thèse réalisée sous la direction des Docteurs:Nicolas NOIRET
Laboratoire Synthèses et Activations de BiomoléculesSylvia COLLIEC-JOUAULT
Laboratoire Biotechnologies et Molécules Marines
Introduction
Techniques d’analyses
Dépolymérisation par les ultrasons
Dépolymérisation par catalyse métallique
Evaluation d’activités biologiques
Modifications chimiques de l’EPS
Conclusion
Plan de l’exposé
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Techniques d’analyses
Dépolymérisation par les ultrasons
Dépolymérisation par catalyse métallique
Evaluation d’activités biologiques
Modifications chimiques de l’EPS
Conclusion
Plan de l’exposé
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Introduction
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Les exopolysaccharides
Criblage parmi les isolats
Production d’EPS
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
– Diversité des structures chimiques
– Relative facilité de récupération des polysaccharides exocellulaires
– Conditions contrôlées de leur biosynthèse
– Biosynthèse en fermenteur
– Propriétés de suspension, d’épaississement, de viscoélasticité
– Formation de gels
☺
Intérêts industriels des exopolysaccharides (EPS)
Manipulation de microorganismes
Métabolites secondaires formés pendant la fermentation
Haute viscosité en solution
Modifications
• Souche bactérienne:Sous-espèce d’Alteromonas macleodii subsp. fijiensis biovar deepsane
• EPS de masse molaire élevée:
M >106 g/mol
• Composition:40-50% d’oses neutres (Glu, Gal, Rha, Fuc, Man)30-40% acides uroniques (GlcUA, GalUA)
• Hypothèse de structure:Undécasaccharide avec 3 ramifications et la présence d’un acide glucuroniquesubstitué en position 3 par un lactate
L’EPS HYD 657
Objectifs de la thèse:élargissement du champ d’application de l’HYD
657Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
3.106 g/mol pour le lot de thèse
* Brevet EP 0987010A2, Lanatech
L’HYD 657 commercialisé sous le nom « Abyssine®» possède des propriétés apaisantes en application topique cutanée*
Analyses chimiques
• Analyses qualitatives et quantitatives des résidus osidiques
Chromatographie gazeuse
Dosage des acides uroniques
Dosage des oses par la méthode Orcinol Colorimétrie
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• Dosage des métaux par spectrophotométrie de flamme
• HPSEC (High pressure steric exclusion chromatography)
Détermination des masses molaires
moyennes (Mw,Mn, Mp) et de l’indice de polydispersité
• Mesure de la viscosité par un viscosimètre rotatif
chimiquesenzymatiques
• Radiations gamma• Faisceau d’électrons• Irradiation UV• Micro-ondes• Irradiation ultrasonique
☺ Selon la littérature:• Bons rendements • Pas d’altération de la structure chimique• Peut être stoppée à tout instant• Pas de formation de produits secondaires• Distribution de masses relativement étroite
Différentes voies de dépolymérisation
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
physiquesenzymatiques chimiques
Introduction
Techniques d’analyses
Dépolymérisation par catalyse métallique
Evaluation d’activités biologiques
Modifications chimiques de l’EPS
Conclusion
Plan de l’exposé
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Dépolymérisation par les ultrasons
Origine physique de la sonochimie
Dépolymérisation par irradiation ultrasonique
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Sonificateur basse fréquence (20 kHz)
Microsonde conique ultra haute intensité (~100W) pour des volumes traités de 1-10 ml.
Sonde conique haute intensité (~300W) pour des volumes traités de 10-250 ml.
Microprocesseur
Cryostat
Les ultrasons au laboratoire
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Liquide de refroidissement
Possibilité d’une circulation en continu de la solution d’EPS
Ajout
Viscosité du solvant
Température
Volume de la solution
Fréquence d’irradiation
Concentration en EPS
Détermination des facteurs influents
Pulse
Durée d’exposition
Dépolymérisation par irradiation ultrasonique
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Cinétique de dépolymérisation
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Cinétique pour 10 ml d'EPS ( 2,5 g/L) à 60°C
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 60 120 180 240
Durée d'exposition aux ultrasons (min)
Mw
(kg/
mol
)
Durée d’exposition
Mw~200 000 g/molIp~2
Composition chimique inchangée
Viscosité proche de l’eau
1,71,8% Man
1212,3% Glc
22,221,7% Gal
7,57,3% GalA
5,56,1% GlcA
1,91,8% Fuc
3,23,4% Rha
Après 10 h d’exposition
aux ultrasonsNatifEPS
Importance de la concentration
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Concentration en EPS
100000
150000
200000
250000
300000
1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
[C]=3g/l[C]=2g/l
Mw
(g/m
ol)
Durée d'exposition aux ultrasons (h)
Cinétique pour 10 ml d'EPS à 60°C
Moins bonne efficacité :
Plus de liaisons à cliver
Viscosité plus importante
Importance de la viscosité
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Viscosité du solvant
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1 2 3 4 5
1
2
Évolution de la viscosité en fonction de la [C]pour T1= 30°C et T2= 60°C
Visc
osité
(mPa
s)
Concentration (g/L)
Moins bonne efficacité:
de la viscosité avec la [C]
Cavitation plus difficile à obtenir
Température importante
Pas d’amélioration proportionnelle à la
quantité d’H2O2
Combinaison H2O2/USaméliore l’efficacité
2,1214 680112 140239 1403h ultrasons
3,3118 16043 530145 6503h ultrasons,0,48% H2O2
2,991 86041 220118 7703h ultrasons,0,24% H2O2
3,952 355 590762 1503 010 020HYD 657 natif
IpMp (g/mol)Mn (g/mol)Mw (g/mol)EPS
H2O2 +))))→ 2 OH •
Influence de l’ajout de H2O2
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Ajout
400 mg d’une solution à 2g/L soumise à 3h d ’exposition aux ultrasons à 60°C:
Pas de modifications de la composition osidique
Pas d’amélioration à température ambiante
Barrière technique:puissance des transducteurs
Transmission d’énergie
Viscosité du produit
Échauffement de l’échantillon
Les Ultrasons dans l’industrie
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Semi-Batch
LEPMI UMR 5631 GRENOBLE FRANCE
Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-chimie des Matériaux et des Interfaces
Montage retenu pour le premier changement d’échelle
Réacteur à double
enveloppeRéacteur
Sonochimique
Générateur
Pompe
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Possibilité d’enrichir le
milieu en EPS
Possibilité de contrôler la température Possibilité de
régler le débit
La reproductibilité à plus grande échelle doit être vérifiéeD’autres modes de fonctionnements pourraient être envisagés
Passage à un petit pilote
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Essai réalisé avec un dispositif BF en mode pseudo batch (sans optimisation)18 g dissous dans 9 litre soumis à 15h d’ultrasons
200 000
250 000
300 000
350 000
400 000
450 000
500 000
3 6 9 12 15
Mp
(kg/
mol
)
Durée d'exposition aux ultrasons (h)
Cinétique de dépolymérisation du petit pilote en BF
EPS NatifAprès 15 h d’exposition
aux ultrasons
% Rha 3,4 3,1
% Fuc 1,8 1,8
% GlcA 6,1 5,3
% GalA 7,3 7,7
% Gal 21,7 24,5
% Glc 12,3 12,8
% Man 1,8 1,8
Mw< 300 000 g/molIp~2,5
Composition inchangée
Faisabilité vérifiée
• Détermination des facteurs les plus influents
Bilan de la dépolymérisation par les ultrasons
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Concentration en EPS
PulseTempérature
Viscosité du solvant
Volume de la solution
Ajout
Fréquence d’irradiationDurée d’exposition
– Durée d’exposition aux ultrasons
– Concentration en EPS
– Volume
– Ajout (H2O2, métal)
Facteurs les plus influents
• Bonne reproductibilité (Ecart type < 10 000)
• Rendement élevé (> 95%)
• Sans altération de la composition chimique
• Stabilité dans le temps
• Échantillons variés obtenus (20mg 18g)
chimiques
Différentes voies de dépolymérisation
physiquesenzymatiques
• Par hydrolyse acideDépolymérisation destructrice, mauvais rendements obtenus
• Par ajout d’acide nitreuxNécessite la présence de groupements aminés
• Par ozonolyseRéactions secondaires
• Par oxydation par le periodatePossibilité de former des formaldéhydes
• Par électrolyse
• Par catalyse métallique
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Introduction
Techniques d’analyses
Dépolymérisation par les ultrasons
Evaluation d’activités biologiques
Modifications chimiques de l’EPS
Conclusion
Plan de l’exposé
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Dépolymérisation par catalyse métallique
Dépolymérisation par catalyse métallique
Brevet Ifremer n°WO9708206
- Concerne la dépolymérisation de fucanes
- Obtention de faibles poids moléculaires de composition constante
- Elimination possible du métal par l’utilisation d’une résine Chélex
- Ultrafiltration utilisée pour purifier les fractions dépolymérisées
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Conditions doucesBon rendement Peut être stoppée à tout instant
☺
Réduction par NaBH4 après dépolymérisation
Dépolymérisation par catalyse métallique
1) Formation de radicaux libres très réactifs par réaction de type Fenton :
HOOH + Fe2+ → OH • + OH- + Fe3+
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
3) Scission des liaisons glycosidiques par différents mécanismes :
Hydrolyses Éliminations Réarrangements
OH + H C OH H2O + C OH
2) Abstraction d’un H du polysaccharide :
Mécanismes radicalaires envisagés
STOP1.00
H O9 %
débit 1 ml/min
2 2
BAINCHAUFFANT
AGITATEUR MAGNETIQUE
POMPE
pH STAT
REACTEUR
BURETTE
NaOH 2N
FTCuEau
2 +
Pompe péristaltique
H2O2 EPS
eau
Métal
cryostat
agitation
NaOH
0,1 NpH stat
Dépolymérisation par catalyse métallique
Au laboratoire dans un réacteur de 5 L
Montage utilisé en catalyse métallique
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pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu ou
initial
Mélange de métaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Détermination des facteurs influents et des synergies
Dépolymérisation par catalyse métallique
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Influence de la températurepH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2 O
Débit d’ajout
R(H O 2/EPS)
Température
Température de 50°C retenue
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
0 20 40 60 80 100 120
T=50°CT=35°CT=20°C
Mp
(g/m
ol)
Durée de la réaction (min)
Cinétique de dépolymérisation pour différentes
températures
Conditions: pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O, débit de 0,5 ml/min, R=0,2
Influence du ratio H2O2/EPS
Conditions: T= 50°C, pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O, débit de 0,5 ml/min
l’augmentation du ratio en
H2O2/EPS , diminue la Mw
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0,025 0,05 0,075 0,1 0,15 0,175 0,20
1
2
3
4
5
6
7
8
MwIp
Évolution de la masse molaire moyenne en masse en fonction du ratio H2O2/EPS
Ratio massique en H2O2 ajouté à un temps t
Mw
(g/m
ol)
Ip
Influence du débit d’ajout du H2O2
Conditions: T= 50°C, pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O
R(H2O2/EPS) Duréed’ajout Mw (g/mol) Reproductibilité Rendement
0,1 1h2h
40-130 00040 000
MauvaiseBonne
--
0,2 1h2h
20-50 00020 000
MauvaiseBonne
82%75%
0,4 1h2h
10-20 00010 000
BonneBonne
65%65%
l’efficacité et la reproductibilité de la
dépolymérisation
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Influence de la quantité de métal
Conditions: T= 50°C, pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O (22g/L), t = 2h
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
0
25
50
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Mw
en
kg/m
ol
a
b
Nombre de ml de CuSO4, 5 H2O aqueux (22g/L) ajoutés
a) R=0,2b) R=0,4
Évolution de la masse molaire moyenne en masse en fonction de la concentration en cuivre
Système saturé pour un ratio massique de 22% / à l ’EPS
Ajout de métaux et phénomènes de chélation
Principales fonctions responsables de la chélation:
- Les fonctions carboxyliques
- Les fonctions alcools
La chélation dépend également de la nature des cations
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
OHO
OH
OHMn+
O
OH
OH
Mn+
OH
OH
O
O OH
OCOO
O
OHO
C OO Mn+
Dépolymérisation possible pour les 3 métaux
Conditions à optimiser pour chaque métal
Influence du choix du métal sur le mécanisme à vérifier
Influence de la nature du métal ajouté
Conditions: T= 50°C, pH neutre, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles de différents métaux
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Métal Mw(g/mol) Ecart type Reproductibilité
CuSO4, 5 H2O 10 000 1 100 Oui
ZnSO4, 7 H2O7 500-322 000
wM = 85 700 18 800 Non
MnSO4, H2O5 000-540 000
wM = 198 500 62 700 Non
Influence de la nature du métal ajoutépH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Métal Natif Cu Zn Mn
% Rha 3,4 2,7 2,8 2,3
% Glc 12,3 9,5 9,8 9,0
% Man 1,8 2,1 1,3 1,8
% Fuc 1,8 1,9 1,5 1,3
% GalA 7,3 7,1 7,3 7,4
% Gal 21,7 15,5 17,7 18,0
% GlcA 6,1 2,6 4,8 4,5
)sédépolyméri(Glc%)natif(Glc%
)sédépolyméri(Rha%)natif(Rha%
≈
)sédépolyméri(GlcA%)natif(GlcA%
)sédépolyméri(Gal%)natif(Gal%
≈
Conditions: T= 50°C, pH neutre, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles de différents métaux, Mw~ 20 000 g/mol
Influence de la nature du métal ajouté
Pas de sélectivité de clivage de liaisons osidiques
en fonction du métal utilisé
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Conditions: T= 50°C, pH neutre, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles de différents métaux, Mw~ 20 000 g/mol
→3)-L-Rhap-(1→3)-D-Galp-(1→4)-D-GalpA-(1→4)-D-GlcpA-(1→4)-D-Galp-(1→3)-D-Manp-(1→4)-D-Glcp-(14 4 2↑ ↑ ↑1 1 1
L-Fucp D-Galp L-Rhap3↑1
Lac-3-O-D-GlcpA
)sédépolyméri(Glc%)natif(Glc%
)sédépolyméri(Rha%)natif(Rha%
≈
)sédépolyméri(GlcA%)natif(GlcA%
)sédépolyméri(Gal%)natif(Gal%
≈
Importance de la régulation du pH
Conditions: T= 50°C, t=2h, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles des différents métaux, pH non régulé
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Profils de courbes semblables obtenus
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
0 20 40 60 80 100 120 140Durée de la réaction (min)
Mw (g
/mol
)
Zinc
Cuivre
Cinétique de dépolymérisation en présence de cuivre ou de zinc
Importance de la régulation du pH
Conditions: T= 50°C, t=2h, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles des différents métaux, pH
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Synergie Cu-Zn mise en évidence
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
0 20 40 60 80 100 120 140
Durée de la réaction (min)
Mw
(g/m
ol)
ZnSO4
CuSO4
CuSO4 + ZnSO4
Cinétique de dépolymérisation en présence de cuivre, zinc et Cu-Zn
Première extension d’échelle
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Conditions: T= 50°C, pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O, R=0,4, t=2h
Première extension à 2g d’EPS
Echelle Mp Mw Mn Ip
200 mg 8 800 10 500 4 000 2,6
2g 13 300 40 400 12 700 3,2
Réadaptation des facteurs influents
Influence de l’agitation et de la géométrie du réacteur à vérifier
Reproductibilité– débit d’ajout du H2O2
– nature du métal– régulation du pH
Efficacité– R(H2O2/EPS)
– nature du métal
– régulation du pH
Bilan de la dépolymérisation par catalyse métallique
Des échantillons variés ont ainsi pu être obtenus en jouant sur les différents facteurs (200mg 2g)
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
pH
Régulation ou non
pH acide pH neutre
METALContre-ion
Quantités
Biosorption
NatureAjout continu
ou initial
Mélange demétaux
H2O2
Débit d’ajout
R(H2O2/EPS)
Température
Détermination des facteurs les plus influents
Echantillons de plus faibles masses molaires☺Réduction nécessaireEtapes de purifications
Comparaison avec les ultrasons
Introduction
Techniques d’analyses
Dépolymérisation par les ultrasons
Dépolymérisation par catalyse métallique
Modifications chimiques de l’EPS
Conclusion
Plan de l’exposé
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Evaluation d’activités biologiques
Evaluations de différentes activités biologiques
La recherche in vitro d’activités biologiques sur les fractions dépolymérisées s’est
concentrée sur 3 effets possibles :
Effet amincissant Effet anti-radicalaire
Activité immunostimulante
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Activité immunostimulante
Effet anti-radicalaire
Détermination de l ’effet amincissant
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Recherche d’un effet inhibiteur de l’activité de la lipoprotéine lipase
LDL
Intestin
lymphe
chylomicrons
chylomicrons
sang LPL
Cellule adipeuseAG
FOIE
Chylomicronsrestants
VLDL
IDL
LDL
LPL
LPL
Ajout d’héparine
Effet amincissant Effet anti-radicalaire
Activité immunostimulante
LPL Lipoprotéine lipaseAG Acide GrasVLDL Lipoprotéine de très faible densitéLDL Lipoprotéine de basse densitéIDL Lipoprotéine de densité intermédiaire
Détermination de l ’effet amincissantEffet amincissant Effet anti-radicalaire
Activité immunostimulante
fractions dépolymérisées testées
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Méthodologie utilisée
1) Détermination de la cytotoxicité in vitro :Viabilité des cellules déterminées par un test au MTT
3) Effet des fractions dépolymérisées sur l’activité LPL
[C] de 0,01 et 0,002 mg/ml
retenues
Quantification par dosage des acides
gras
N NS
NCH3
CH3
NN
Br
MTT
2) Induction de l’activité LPL-Contrôles :
0
50000
100000
Act
ivité
LP
L (c
pm)
Témoin d +
Contrôle nd +
Contrôle d -
Effet de fractions dépolymérisées sous ultrasonsEffet amincissant Effet anti-radicalaire
Activité immunostimulante
2 fractions actives
Effet dose-dépendant
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
0
50000
100000
Témoin
US 48 0,01 mg/mlUS 48 0,002 mg/ml
US 34 0,01 mg/mlUS 34 0,002 mg/ml
US BF 0,01 mg/mlUS BF 0,002 mg/ml
Effet des fractions dépolymérisées sous ultrasons sur l’activité LPL des adipocytes
51 %
38 %
10h d'expositionaux US (laboratoire)
Mw~ 100 000 g/mol Ip~ 2,5
15h d'expositionaux US (petit pilote)
Mw~ 300 000 g/mol Ip~ 2,5
4h d'exposition aux US avec ajout de Cu
Mw ~ 100 000 g/mol Ip~ 3
Act
ivité
LPL
(cpm
)
Effet de fractions dépolymérisées en catalyse métalliqueEffet amincissant Effet anti-radicalaire
Activité immunostimulante
Pas de modifications significatives
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
0
50000
100000
Témoin
CM 63(1) 0,01 mg/mlCM 63(1) 0,002 mg/ml
CM 52(4) 0,01 mg/mlCM 52(4) 0,002 mg/ml
CM 56(6) 0,01 mg/mlCM 56(6) 0,002 mg/ml
Effet des fractions dépolymérisées par catalyse métallique en présence de CuSO4 sur l’activité LPL des adipocytes
Cu, pH non régulé,R=0,4
Mw ~ 25 500 g/mol
Cu, pH régulé,R=0,1
Mw ~ 37 500 g/mol
Cu, pH régulé,R=0,2
Mw ~ 37 500 g/molAct
ivité
LPL
(cpm
)
Effet de fractions dépolymérisées en catalyse métalliqueEffet amincissant Effet anti-radicalaire
Activité immunostimulante
Fractions dépolymérisées avec un mélange
Cu-Zn actives Effet dose-dépendant
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
0
50000
100000
Témoin
CM 45(3) 0,01 mg/mlCM 45(3) 0,002 mg/ml
CM 65(3) 0,01 mg/mlCM 65(3) 0,002 mg/ml
CM 57(3) 0,01 mg/mlCM 57(3) 0,002 mg/ml
Effet des fractions dépolymérisées par catalyse métallique en présence de mélanges de métaux
sur l’activité LPL des adipocytes
Cu/Zn, pH régulé,R=0,1
Mw~ 44 400 g/mol Ip~ 3
Cu/Zn, pH régulé,R=0,4
Mw~ 11 600 g/mol Ip~ 2,7
Cu/Mn, pH non régulé,R=0,2
Mw~ 10 000 g/mol Ip~ 2,2
33 %
60 %
43 %
Act
ivité
LPL
(cpm
)
Bilan sur les effets de fractions dépolymériséesEffet amincissant Effet anti-radicalaire
Activité immunostimulante
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Les produits peuvent être classés en 3 groupes:– les produits avec effet dosedépolymérisation par ultrasons ou par catalyse métallique en présence d’un mélange Cu-Zn
– les produits inhibiteurs à une concentrationdépolymérisation par catalyse métallique en présence d’un mélange Cu-Zn
– Les produits sans effetdépolymérisation, par catalyse métallique ou ultrasons, en présence de Cu
L ’activité in vitro à faibles concentrations permet d’espérer une activité in vivo
Evaluations de différentes activités biologiques
- Premiers résultats de criblages encourageants
- Produits actifs à de faibles concentrations
- Applications possibles dans le domaine visé des cosmétiques
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
La recherche in vitro d’activités biologiques sur les fractions dépolymérisées s’est
concentrée sur 3 effets possibles :
Effet amincissant Effet anti-radicalaire
Activité immunostimulante
Introduction
Techniques d’analyses
Dépolymérisation par les ultrasons
Dépolymérisation par catalyse métallique
Evaluation d’activités biologiques
Conclusion
Plan de l’exposé
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Modifications chimiques de l’EPS
Modifications chimiques de l’EPS
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
Oxydation
Estérification
Modifications chimiques envisagées
Ajout de groupements chargés positivement
Oxydation
Nombre de positions OH par motif pouvant être substituées:- OH primaires: 5- OH secondaires: 22
D’où:
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
→3)-L-Rhap-(1→3)-D-Galp-(1→4)-D-GalpA-(1→4)-D-GlcpA-(1→4)-D-Galp-(1→3)-D-Manp-(1→4)-D-Glcp-(14 4 2↑ ↑ ↑1 1 1
L-Fucp D-Galp L-Rhap3↑1
Lac-3-O-D-GlcpA
Modifications chimiques de l’EPS
Dans notre hypothèse de structure:
DS maximum théorique ~ 2,45
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Degré de substitution (DS)
Mécanisme de sulfatation de l’EPS
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Sulfatation réalisée avec de l’acide chlorosulfonique et de la pyridine ou directement avec un complexe Pyr.SO3 ou DMF.SO3
Mécanisme probable:
HOR
N S
O
O
O
L. H: ↑ électrophilie de S et nucléophilie de OH
N S
O
O
O N + R O S
O
O
OH
R O H
N2 + Cl SO3H N S
O
O
O + N HCl
Toute trace d’eau doit être évitée
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Techniques d’analyse de la sulfatation
Réf.: Lijour Y., Gentric E., Deslandes E. et Guezennec J. (1994). Anal. Biochem. ,220, 244-248.Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
- Analyses infrarouges (IR)
- Analyses élémentaires
% SO3Na = % S x 3,22Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
1.35
1.40
1.45
1.50
1.55
1.60
1.65
1.70
1.75
1.80
1.85
1.90
1.95
2.00
2.05
800 1000 1200 1400 1600
Absorbance à1250 cm-1
Absorbance à1050 cm-1
Ligne de base
Abs
orba
nce
Nombre d’onde (cm-1)
Techniques d’analyse de la sulfatation
Réf.: Lijour Y., Gentric E., Deslandes E. et Guezennec J. (1994). Anal. Biochem. ,220, 244-248.Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
- Analyses infrarouges (IR)
- Analyses élémentaires
% SO3Na = % S x 3,22
Détermination du taux de sulfates par IR avec précision de ± 5%
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 5 10 15 20 25 30 35 40
% Sulfates
Abs
(125
0)/A
bs(1
050)
Résultats obtenus en Sulfatation
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Sulfatation possible avec DMF-SO3Plus grande réactivitéMoins grande toxicité
Conditions: 60 mg d’EPS mis sous forme de sel de pyridinium ensolution dans le DMF, m(complexe-SO3) = 5 x m(EPS), 45°C, sous azote, 24h
Agent desulfatation EPS %SO3Na DS
Pyr-SO3
NatifDépolymérisé sous USDépolymérisé sous CM
25-302530
0,6-0,90,60,9
Pyr + ClSO3H Natif Non reproductible -
DMF-SO3 Natif 25 0,6
N° Sel Température(°C) Solvant SO3Na
(%) DS Mw (g/mol) Rendement(%)
HYD 657 natif Ca - - 5 - 3 000 000 -
1 Pyr 45 DMF 34 1,1 18 000 48
2 Pyr Ambiante DMF 21 0,5 43 000 70
3 Pyr 45 DMF + 2 mlpyridine 34 1,1 670 000 90
4 Na 45 DMF 8 nd 15 000 25
5 Pyr 45 DMSO 5 - < 10 000 < 10%
6 Pyr 45 Sulfolane 5 - < 10 000 < 10%
Sulfatation en présence de DMF-SO3
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Conditions à optimiser
Conditions: 60 mg d’EPS natif mis sous forme de sel ensolution, m(DMF-SO3) = 5 x m(EPS), 45°C, sous azote, 24h
Cinétiques de Sulfatation en présence de DMF-SO3
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2 4 6 8 10
Durée de la réaction (h)
% S
ulfa
tes
DMF,45°C
DMF + Pyr, 45°C
DMF, TA
DMSO, 45°C
Evolution du taux de sulfate pendant les premières heures de sulfatation
Conditions:60 mg d’EPS natif mis sous forme de sel de pyridinium, m(complexe-SO3) = 5 x m(EPS)
Cinétiques de Sulfatation en présence de DMF-SO3
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Sulfatation la plus efficace:
- 2h de réaction- présence de
Pyr DSmax de 1,1
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
0 2 4 6 8 10
Durée de la réaction (h)
Mw
(g/m
ol)
DMF,45°C
DMF + Pyr, 45°C
DMF, TA
DMSO, 45°C
Evolution de la masse molaire Mw pendant les premières heures de sulfatation
Mécanisme d’acétylation de l’EPS
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ac2O + N NCCH3
O
+ CH3 COO
R O
H
NCCH3
O
+ C
O
OR CH3 + HN
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Conditions: EPS mis sous forme de sel en solution dans le DMF, ajout de n équivalent d’anhydride acétique en présence de pyridine, 45°C, sous azote, 48h
Réf.: Na et al (1999). Drug developpement and industrial pharmacy, 25(8), 917-927.
Techniques d’analyse de l’acétylation
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
- Analyses infrarouges (IR)
EPS natif
%T
EPS acétylé
%T
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000Nombre d'onde (cm-1)
1750 cm-1
C=O 1375 cm-1
CH3
1240 cm-1
C-O-C
Techniques d’analyse de l’acétylation
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification- Analyses RMN
Intégration des acétates et quantification par rapport à l’intégration des :
CH3 des Rha, Fuc et Lac Protons du squelette
Squelette du polysaccharide
2CH3
Rha, Fuc, Lac0,8-1,5 ppm
1
Acétates1,6-2,4 ppm
Irradiation du pic d ’eau
Techniques d’analyse de l’acétylation
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification- Analyses RMN
Intégration des acétates et quantification par rapport à l’intégration des :
CH3 des Rha, Fuc et Lac Protons du squelette
Acétates1,6-2,4 ppm
D2O4,7 ppm
3
Squelette du polysaccharide
1
Déconvolution DAdéterminé par 3
méthodes
CH3Rha, Fuc, Lac0,8-1,5 ppm
Résultats obtenus en acétylation
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Nombre d’équivalents d’anhydride à revoir pour l’EPS natif
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
DAEPS
Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3Mw (g/mol) Rendement
(%)
HYD 657 CMMw~40 000g/mol 2,5 2,2 2,1 23 300 50
HYD 657 USMw~300 000g/mol 2,5 2,5 2 233 000 90
HYD 657 NatifMw~3 000 000g/mol 1,1 0,8 1,1 > 1 000 000 100
Conditions: 85 mg d’EPS mis sous forme de sels de pyridinium ensolution dans DMF-Pyr (97%-3%), néq(Anhydride acétique)~20, 45°C, 48h
Faible dépolymérisation
observée
Acétylation quasi-totale pour les échantillons
dépolymérisés
Résultats obtenus en acétylation
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
DAEPS Anhydride acétique
(équiv) Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3Mw (g/mol) Rendement
(%)
20 1,1 0,8 1,1 > 1 000 000 100HYD 657natif 40 2,2 2,4 2,2 275 140 90
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Conditions: 85 mg d’EPS natif mis sous forme de sels de pyridinium ensolution dans DMF-Pyr (97-3), néq(Anhydride acétique)~40, 45°C, 48h
Nombre d’équivalents d’anhydride acétique nécessaire supérieur
Dépolymérisation importante observée
Etude de la cinétique de réaction nécessaire
Cinétique d’acétylation de l’EPS
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
2 4 6 8Durée de la réaction (h)
DA
400
500
600
700
800
900
1000
Mw (kg/m
ol)
DA
Masse molaire
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Evolution de la masse molaire Mw et du DA pendant les premières heures d’acétylation
Après 2h, DA de 2 et dépolymérisation moins importante
Conditions: 85 mg d’EPS natif mis sous forme de sels de pyridinium ensolution dans DMF-Pyr (97-3), néq(Anhydride acétique)~40, 45°C, 48h
Mécanisme d’estérification de l’EPS
N
+
R'
O
Cl
N
CO
R'
Cl
N
CR'O
+
R OH
Cl
N
C O
O HR
R'
ClN
HCl
R'C
O
OR
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Ion acyl pyridinium Neutralisation des protons
Conditions: EPS mis sous forme de sel en solution dans le DMF, ajout de n équivalents de chlorure d’acide en présence de pyridine, 45°C, sous azote, 48h
Ajout de chlorure de décanoyle et stéaroyletesté
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Techniques d’analyse de l’estérification
EPS estérifié avec une chaîne en C10
- Analyses infrarouges (IR)
EPS natif
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
3022 cm-1
CH3
2850-2950 cm-1
CH21750 cm-1
C=O
10
12
14
16
18
20
%T
20
30
40
50
60
%T
1000 1500 2000 2500 3000 3500 Nombre d'onde (cm-1)
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Techniques d’analyse de l’estérification
- Analyses RMN MASAjout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Rotation à l’angle magique (54,7°)
Elimination des contributions anisotropesRéduit la largeur des raies☺
Technique Etat Elémentobservé Procédé Avantages
UMR CNRS 6026 «RMN structurale des protéines et des interactions lipides-protéines »
HR-MAS Gel 1HAction combinée
d’une forte rotation etde l’angle magique
Elimination descontributions
anisotropes élargissantles raies
SPE-MAS
CP-MAS Solide 13CMagnétisation des spins abondants (1H) transféréeaux spins rares (13C)
Augmentation de lasensibilité et de la
résolution du signal en13C
Solidepartiellement
hydraté
13C Analogue à CP-MAS Détection des fractionsles plus mobiles
Laboratoire « Biopolymères, Interactions, Assemblages » (INRA-Nantes)
UMR CNRS 6026
«RMN structurale des protéines et des interactions lipides-
protéines »
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Techniques d’analyse de l’estérification
- Analyses RMN HR-MASAjout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
4,7 ppmeau
1,5 ppmCH3 Rha, Fuc, Lac
2,2 ppmCH2 en α des C=O
0,85 ppmCH3 des esters
1,3 ppmCH2 des esters
Chaîne en C10
DS~ 1,2
Chaîne en C18
DS~1,7
1
2
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Techniques d’analyse de l’estérification
180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm
SPE MAS EPS + chaine C10 hydrate
CP-MAS
solide
SPE-MAS
solide partiellement hydraté
- Analyses RMN 13C CP-MAS et SPE-MASAjout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Mise en évidence de la rigidificationdu système
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Techniques d’analyse de l’estérification
- Analyses élémentaires
Formule moléculaire théorique d’une unité répétitive : C69H107O57
Calcul du pourcentage théorique attendu en chacun des éléments en fonction du DS
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
DS voisins et supérieurs à 1,1 pour l’ajout de chaînes
grassesen C10 et C18
Résultatsthéoriques
Analysesélémentaires
EPS Chaîneajoutée
%C %H %N %C %H %N
Formulemoléculaire DS
En C10 65,23 9,18 0,86 65,35 9,15 0,79 C264H446O75N3 1,6Dépolymérisésous US En C18 69,93 10,40 0,69 69,82 10,61 0,52 C354H632O72N3 1,4
En C10 62,25 8,59 1,07 62,10 8,72 0,87 C204H338O69N3 1,1Natif
En C18 70,41 10,50 0,66 70,71 10,73 0,63 C372H666O73N3 1,45
Bilan des modifications chimiques de l’EPS
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Mise en place de caractérisations et de quantifications par des techniques d’analyses adaptées
Etudes plus poussées à envisager en fonction de l’intérêt
Faisabilité de modulations chimiques de l’EPS, natif ou dépolymérisé, par groupements classiques
Optimisations en cours
Obtention de façon reproductible de fractions sulfatées, acétylées ou estérifiées par des chaînes grasses pouvant être criblées
Introduction
Techniques d’analyses
Dépolymérisation par les ultrasons
Dépolymérisation par catalyse métallique
Evaluation d’activités biologiques
Modifications chimiques de l’EPS
Plan de l’exposé
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Conclusions
Bilan général et perspectives
– En dépolymérisation par les ultrasons:
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
• Faisabilité de cette voie confirmée ;
• Obtention d’échantillons de masses molaires inférieures à 300 000 g/mol en mode semi-batch avec recirculation de la solution ;
• Mise en évidence d’une nouvelle voie combinant dépolymérisation physique et chimique ;
• Possibilité d’activités dans le domaine visé des cosmétiques mise en évidence.
– En dépolymérisation par catalyse métallique :
Bilan général et perspectives
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
• Utilisation des métaux n’ayant pas fait l’objet d’études dans la littérature ;
• Obtention de façon reproductible des échantillons de masses molaires comprises entre 5000 et 100 000 g/mol ;
• Possibilité d’activités dans le domaine visé des cosmétiques mise en évidence.
• Détermination des facteurs influents sur la reproductibilité et l’efficacité de la dépolymérisation ;
Bilan général et perspectives
– En fonctionnalisation chimique:
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
• Obtentions de nouvelles molécules d’EPS natif et dépolymérisé ;
• Obtention d’échantillons sulfatés, acétylés ou estérifiés par des chaînes grasses de façon reproductible ;
• Mise en place de techniques d’analyses adaptées ;
• Possibilité de nouveaux criblages d’activités biologiques
Remerciements
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Laboratoire « RMN structurale des protéines et des interactions lipides-protéines »
M. le Docteur Arnaud Bondon
Laboratoire « Organométalliques et catalyse, Chimie et électrochimie moléculaire »
M. le Docteur Jean-Pierre Hurvois
Laboratoire « Biopolymères,
Interactions, Assemblages » (INRA)
Mme le Docteur Corinne Rondeau
Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-Chimie des Matériaux et des Interfaces
M. le Professeur Nicolas Gondrexon
Norbert VölkelStephanie Röper
Guillaume Hersant
Mes directeurs de thèse et l’ensemble du personnel des
deux laboratoires
Thèse soutenue le 16 décembre 2005 par
Anne-Cécile PETIT Ingénieur ENSCR
MODIFICATION D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR MODIFICATION D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR
UNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDSUNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDS
Thèse réalisée sous la direction des Docteurs:Nicolas NOIRET
Laboratoire Synthèses et Activations de BiomoléculesSylvia COLLIEC-JOUAULT
Laboratoire Biotechnologies et Molécules Marines
chimiquesphysiquesenzymatiques
Différentes voies de dépolymérisation
• Les endopolymérases• Les exopolymérases
Avantages:Absence de produits secondairesMenée en conditions douces
Inconvénients: haute sélectivitéNécessite une connaissance exacte des structuresNe peut être généralisée
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
physiques chimiques
LEPMI UMR 5631 GRENOBLE FRANCE
Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-chimie des Matériaux et des Interfaces
Essai réalisé avec un dispositif HF en mode batch pur2g dissous dans 1 litre soumis à 15h d’ultrasons
Dépolymérisation possible
Modification chimique observée en CPG au niveau
du galactose
Influence de la fréquence d’irradiation
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
100
150
200
250
300
350
3 6 9 12 159,6
9,8
10
10,2
10,4
10,6
10,8
11
MpViscosité
Mp
(kg/
mol
) Viscosité
Durée d'exposition aux ultrasons (h)
Cinétique de dépolymérisation en HF
Fréquence d’irradiation
Durée d’exposition aux ultrasons à ajuster en fonction du volume de
solution
• Ultrasons les plus efficaces au voisinage de la sonde
• Difficulté d’homogénéiser un volume trop important
Volume de la solutionInfluence du volume
Solution d’EPS à 2g/L soumise à 3h d ’exposition aux ultrasons:
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Problème du changement d’échelle posé
M p M w M n Ip
10 m L 146 000 145 900 56 400 2,6
100 m L 182 800 184 500 86 800 2,1
Modifications chimiques de l’EPS
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
EPS Natif
Catalyse métallique Ultrasons
1aModifications
chimiques2a
Modifications chimiques
Modifications chimiques
Applications potentielles
2b
1b
5 voies sont envisageables:
3
Mécanisme de phosphatation de l’EPS
Différents mécanismes peuvent être envisagés:
- formation d’un carbamate phosphate:
- phosphatation de l’EPS:
NH2
C
O
NH2 H3PO4
R OHC
O
NH2 H3PO4OR
NH3+ +
H2NC
O
NH2
+ HO P
O
OHOH NH2 C
O
O P
O
OH
OH+
R OH
O P
O
OH
OH
R + O P
O
O
OH
R P OH
OH
O
+ O P
O
O
OH
R P
OH
O
O R + O P
O
O
OH
R R
Réf: M.I. Khalil et al. Carbohydr. Polym. 48 (2002) 255-261
Réf: D.Sacco et al. Carbohydr. Res. 184 (1988) 193-202
Ajout de groupements cationiques
O
ON(CH3)3
Exemple de la glycine bétaïne:
Réf: R. Auzély-Velty et al, International Journal of biological macromolecules, 31 (2003) 123-129
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
(CH3)3NO
OH
DCC
+Cl
(CH3)3NO
O N
NH
Cl
N C N
+
DMAP
N
NMe2
DCU
N
NMe2
CO
N(CH3)3Cl
+
N
NMe2
+ ROC
O
N(CH3)3
ClC
NH
NHO+
R OH
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Techniques d’analyse de l’ajout de groupements cationiques
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification- Analyses infrarouges (IR)
HYD 657 natif
13
14
15
16
17
18
19
20
21
%T
11
12
13
14
15
16
17
18
%T
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Nombre d'onde (cm-1)
Après ajout de bétaïne
1756 cm-1
C=O
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Techniques d’analyse de l’ajout de groupements cationiques
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
- Analyses RMN CP-MAS
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Présence de bétaïnates sur
l’EPS confirmée mais pas quantifiée
CP-MASEPS natif
CP-MASEPS natif avec ajout de bétaïne
180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm180 160 140 120 100 80 60 40 20 (ppm)
165 ppmC=O bétaine
57 ppmCH3 bétainate
Oxydation de l’EPS
Radical organique nitroxyle: le TEMPO
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
N
O
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
N
O
1
Oxydant actif : le cation nitrosonium
N
O
2
Formes mésomères et encombrement expliquent sa
stabilité
Oxydation sélective des alcools I
Système TEMPO-hypochlorite de sodium-
bromure de sodium étudié
Mécanisme d’oxydation de l’EPS
N
O
N
OH
N
O
Br
BrO
ClO
Cl
RCH2OH
RCHO
N
O
N
OH
N
O
Br
BrO
ClO
Cl
RCOONaSoutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Conditions retenues pour l’oxydation de l’EPS
Conditions retenues à partir de l’étude bibliographique :
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
pH9,2-9,7
Températurebasse 0-5°C
Arrêt de la réactionajustement pH faible
Quantités de réactifs0,02 éq en TEMPO
0,2 éq en NaBr2,2 éq en NaOCl
Réduction en fin de réaction
Techniques d’analyses de l’oxydation
- Analyses infrarouges (IR)
• augmentation de la bande de vibration des carboxylates à 1612 cm-1
• absence de bande d’absorption à 1730cm-1
- Dosage colorimétrique des acides uroniques
EPS % d’acidesuroniques
% de fonctions alcoolsprimaires oxydées Mw(g/mol) Ip
Rendement%
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
Natif oxydé (1) 52% 50 620 000 2,3 87
Natif oxydé (2) 45% 36 783 000 2 87Dépolymérisépar US oxydé 43% 32 246 500 2,5 89
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Sélectivité de la réaction
Dépolymérisation de l’EPS natifOxydation partielle
Résultats d’oxydation de l’EPS
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
Durée de la réaction (min)
NaO
H a
jout
é (µ
mol
)
Facteurs pouvant expliquer les résultats observés
- la cinétique de la réaction
- notre EPS est un polysaccharide chargé
Ajout de groupements chargés négativement
Ajout de groupements chargés positivement
OxydationEstérification
Les quantités de réactifs devront être adaptées à l’EPSHYD 657
Réaction plus lente
Disponibilité différente de l’oxydant réel
Électrode de référence ECS
Solution d’EPS à 2g/L
dans tampon phosphate pH ~ 7,2 + H2O2
Électrode de travail: graphite
Verre fritté
Carbone vitreux (anode)
Dépolymérisation par Électrolyse
– Étude préliminaire réalisée en voltamètrie où différents systèmes ont été étudiés: tampon phosphate, EPS, ajout d’H2O2, ajout de métal...
– Première étude en électrolyse:
Après 2000 C, Mw= 620 000 g/mol avec Ip=2,8Après 4000 C, Mw= 275 000 g/mol avec Ip=2,7Après 6000 C, Mw= 100 000 g/mol