Deyse de Souza DantasDeyse de Souza Dantas
Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. Guimarães PereiraPesquisador do Departamento de Genética e Evolução
Instituto de Biologia da UNICAMP
Co-orientador: Dr. Francisco Javier Medrano MartínPesquisador Visitante do LGE
Estudos de relação estrutura-Estudos de relação estrutura-função da Hipoxantina-Guanina-função da Hipoxantina-Guanina-Xantina Fosforibosiltransferase Xantina Fosforibosiltransferase
(HGXPRT)(HGXPRT)
HGXPRTHGXPRT - Reação
Hipoxantina
Guanina
Xantina
Xantosina 5’-monofosfato (XMP)
++
5’-Fosforibosil-pirofosfato
Inosina 5’-monofosfato (IMP)
Guanosina 5’-monofosfato (GMP)
Pirofosfato
HGXPRT
Mg2+
• Domínio Archaea.
• Isolado da fossa oceânica de Okinawa, NE do Oceano Pacífico, a 1395 m de profundidade.
• Cocos irregulares, tufo polar de flagelo, cresce em temperatura de 80ºC a 102ºC (98ºC), salinidade de 2,4% NaCl, pH entre 5,0 e 8,5.
• Genoma seqüenciado em 2001.
• Gene da HPRT: 462 nucleotídeos; proteína de 153 aminoácidos, peso molecular calculado de 15,6 kDa. www.bio.nite.go.jp/ngac/e-home/ot3-
e.html
Pyrococcus horikoshii Pyrococcus horikoshii e sua e sua HGXPRTHGXPRT
ImportImportânciaância
• Validar a proteína de Pyrococcus horikoshii como uma HGXPRT.
• Auxiliar no conhecimento dos mecanismos envolvidos na estabilidade desta proteína.
• Obter um melhor entendimento da atividade enzimática e do papel dos resíduos do sítio ativo no mecanismo de catálise.
HGPRT - HGPRT - Trypanosoma cruziTrypanosoma cruzi - Dímero - Dímero
AlinhamentoAlinhamento
Os loops estão identificados pelas caixas amarelas e as mudanças mais significativas estão assinaladas com setas
verde
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Mudanças significativas no Loop IMudanças significativas no Loop I
Leu por Met que mantém o caráter hidrofóbico e o volume ocupado pela cadeia lateralLeu por Ala ambos são alifáticos, tendo uma cadeia lateral sem carga
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Leu
Met
• Ser por Arg ambos são polares, mas Arg possui cadeia lateral comprida e com carga positiva
• Ser por Phe ambos são aminoácidos neutros mas Ser é polar e Phe apolar aromático
• TAMANHO
Mudanças significativas no Loop IIMudanças significativas no Loop II
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Loop IIILoop III
Domínio mais conservado das PRTs
Forma uma cavidade de ligação para ribose e o 5`fosfato do PRPP ou do
nucleotídeo purínico
O Asp115, no final do loop, foi proposto como sendo a base geral da
reação enzimática. Este resíduo faz ponte de H
com o N7 da base
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Loop I
Loop II Loop III
Loop IV
Mudanças significativas no Loop IVMudanças significativas no Loop IV
Aspartato por Glutamato ambos são ácidos
Arginina por Lysina ambos são básicos
MetodologiaMetodologia
PCR
Transformação bactérias
competentes (DH5)
Clonagem em
Vetor
Seleção dos clones
positivos PCR de colônia
Seqüênciamento
Transformação de bactérias competentes BL21 (DE3)
Seleção dos clones
positivos PCR de colônia
Extração em média escala
Espectroscopia de absorção,
fluorescência, CD, DLS, espectrometria de massa, proteólise
limitada e desnaturação térmica
Modelagem
Purificação
Estudos estruturais
Proteína
insolúvel
Proteína
solúvel
Ensaios de expressão
HGXPRTHGXPRT - Reação
Hipoxantina
Guanina
Xantina
Xantosina 5’-monofosfato (XMP)
++
5’-Fosforibosil-pirofosfato
Inosina 5’-monofosfato (IMP)
Guanosina 5’-
monofosfato (GMP) Pirofosfato
HGXPRT
Mg2+
Ligação a GMP-Ligação a GMP-agaroseagarose
• Loop I• Tem arginina, não liga a GMP.• T= 25°C• T= 75°C
• Mutações na Lys52 (T.cruzi) não compromete a estabilidade da proteína, mas tem grande efeito sobre a lig. ao GMP, reduzindo muito a afinidade da enzima por este substrato.
HGXPRTHGXPRT - Reação
Hipoxantina
Guanina
Xantina
Xantosina 5’-monofosfato (XMP)
++
5’-Fosforibosil-pirofosfato
Inosina 5’-monofosfato (IMP)
Guanosina 5’-
monofosfato (GMP) Pirofosfato
HGXPRT
Mg2+
Ligação do PirofosfatoLigação do Pirofosfato
0 20 40 60 80 1001,0
1,2
1,4
1,6
Fo/F
[Pirofosfato] (mM)
1 10 100
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
Fo/F
[Pirofosfato] (mM)
Kd=4,7± 0,1
1 10 100
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
Fo/F
[Pirofosfato] (mM)
Kd=4,7± 0,1
F.I.Máximo de emissão não sofre influênciaCada Monômero – 1 sítio de ligação – kdissoçiação do liganteWenck et al., 2004 HGPRT de T. cruzi, afinidade de ligação ao pirofosfato
320 340 360 380 400
2
4
6
Comprimento de onda (nm)
Fluo
resc
ênci
a
A
320 340 360 380 400
2
4
6
Comprimento de onda (nm)
Fluo
resc
ênci
a
320 340 360 380 400
2
4
6
Comprimento de onda (nm)
Fluo
resc
ênci
a
Comprimento de onda (nm)
Fluo
resc
ênci
a
A
320 340 360 380 400
2
4
6
Comprimento de onda (nm)
Fluo
resc
ênci
a
A
320 340 360 380 400
2
4
6
Comprimento de onda (nm)
Fluo
resc
ênci
a
320 340 360 380 400
2
4
6
Comprimento de onda (nm)
Fluo
resc
ênci
a
Comprimento de onda (nm)
Fluo
resc
ênci
a
A
Cinética EnzimáticaCinética Enzimática
• Kcat/Km - Eficiência catalítica
• Kcat - Quantidade de reações por min – Constante catalítica dependente da temperatura
• Km - parecido com as outras
320 340 360 380 4000
1
2
3
4
5
6
Fluo
resc
ência
Comprimento de onda (nm)
exc = 280 nmexc = 295 nm
320 340 360 380 400320 340 360 380 4000
1
2
3
4
5
6
0
1
2
3
4
5
6
Fluo
resc
ência
Comprimento de onda (nm)
exc = 280 nmexc = 295 nmexc = 280 nmexc = 295 nmexc = 280 nmexc = 280 nmexc = 295 nmexc = 295 nm
Fluorescência intrínseca da HGXPRTFluorescência intrínseca da HGXPRT
• Máximo de emissão a 340 nm.
Apagamento de fluorescência - Apagamento de fluorescência - AcrilamidaAcrilamida
320 340 360 380 4000
2
4
6Fl
uore
scên
cia
Comprimento de onda (nm)320 340 360 380 400320 340 360 380 400
0
2
4
6
0
2
4
6Fl
uore
scên
cia
Comprimento de onda (nm)
A
0 200 400 600 8001.0
1.4
1.8
2.2Fo
/F
[Acrilamida] (mM)
exc = 295 nm
0 200 400 600 800
exc = 280 nm
Fo/F
[Acrilamida] (mM)
3
5
7
10 200 400 600 800
1.0
1.4
1.8
2.2Fo
/F
[Acrilamida] (mM)
exc = 295 nm
0 200 400 600 8000 200 400 600 8001.0
1.4
1.8
2.2
1.0
1.4
1.8
2.2Fo
/F
[Acrilamida] (mM)
exc = 295 nm
0 200 400 600 800
exc = 280 nm
Fo/F
[Acrilamida] (mM)
3
5
7
10 200 400 600 8000 200 400 600 800
exc = 280 nm
Fo/F
[Acrilamida] (mM)
3
5
7
1
3
5
7
1
B C
1 + KSV [Q]FoF
=1 + KSV [Q]FoFFoF
=
Equação Stern-Volmer (Birks, 1970)
Fo = intensidade de fluorescência na ausência do apagador;
F = a intensidade de fluorescência na presença do apagador;
KSV = a constante de Stern-Volmer e
[Q] = a concentração do agente apagador.
A constante de Stern-Volmer, KSV, é um parâmetro que fornece informação sobre a acessibilidade do fluoróforo ao agente
apagador.
0 50 100 150 2001.0
1.2
1.4
1.6
Fo/F
[CsCl] (mM)0 50 100 150 200
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Fo/F
[CsCl] (mM)
exc = 295 nmexc = 280 nm
0 50 100 150 2001.0
1.2
1.4
1.6
Fo/F
[CsCl] (mM)0 50 100 150 2000 50 100 150 200
1.0
1.2
1.4
1.6
1.0
1.2
1.4
1.6
Fo/F
[CsCl] (mM)0 50 100 150 200
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Fo/F
[CsCl] (mM)0 50 100 150 2000 50 100 150 200
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Fo/F
[CsCl] (mM)
exc = 295 nmexc = 280 nm
BA
Apagamento de fluorescênciaApagamento de fluorescência
0 50 100 150 200 250 300 3501.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Fo/F
[KI ] (mM)0 50 100 150 200 250 300 350
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8Fo
/F
[KI ] (mM)
exc = 295 nmexc = 280 nm
0 50 100 150 200 250 300 3501.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Fo/F
[KI ] (mM)0 50 100 150 200 250 300 3500 50 100 150 200 250 300 350
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Fo/F
[KI ] (mM)0 50 100 150 200 250 300 350
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8Fo
/F
[KI ] (mM)0 50 100 150 200 250 300 3500 50 100 150 200 250 300 350
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8Fo
/F
[KI ] (mM)
exc = 295 nmexc = 280 nm
B A
CsCl
KI
Proteólise LimitadaProteólise Limitada
Quimiotripsina
Proteinase K
Subtilisina
0 h
8 h
4 h
2 h
1 h
0.5
h
Tripsina
0 h
4 h
2 h
1 h
0.5
h0.
25 h
8 h
ON
Rg = 4.3 nmMw = 103 kDaRg = 4.3 nmMw = 103 kDa
Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
Hexâmero em solução
Caracterização estrutural por SAXSCaracterização estrutural por SAXS
A B C
A B C
90°90°Cr
ysta
lstr
uctu
reSA
XS m
odel
90°90°90°90°Cr
ysta
lstr
uctu
reSA
XS m
odel
90°90°90°Crys
tals
truc
ture
SAXS
mod
elCr
ysta
lstr
uctu
reSA
XS m
odel
Estrutura vs. Modelo (SAXS)Estrutura vs. Modelo (SAXS)
Denaturação QuímicaDenaturação Química
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Circular dichroismFluor. maxFluor. center of mass
Unfo
lded
fra
ction
(Ap
p.)
[GdnHCl] (M)0 1 2 3 4 5 60 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Circular dichroismFluor. maxFluor. center of mass
Circular dichroismCircular dichroismFluor. maxFluor. maxFluor. center of massFluor. center of mass
Unfo
lded
fra
ction
(Ap
p.)
[GdnHCl] (M)0 2 4 6
30
40
50
Radi
usof
gyra
tion
(Å)
[GdnHCl) (M)0 2 4 60 2 4 6
30
40
50
30
40
50
Radi
usof
gyra
tion
(Å)
[GdnHCl) (M)
A B0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Circular dichroismFluor. maxFluor. center of mass
Unfo
lded
fra
ction
(Ap
p.)
[GdnHCl] (M)0 1 2 3 4 5 60 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Circular dichroismFluor. maxFluor. center of mass
Circular dichroismCircular dichroismFluor. maxFluor. maxFluor. center of massFluor. center of mass
Unfo
lded
fra
ction
(Ap
p.)
[GdnHCl] (M)0 2 4 6
30
40
50
Radi
usof
gyra
tion
(Å)
[GdnHCl) (M)0 2 4 60 2 4 6
30
40
50
30
40
50
Radi
usof
gyra
tion
(Å)
[GdnHCl) (M)0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Circular dichroismFluor. maxFluor. center of mass
Unfo
lded
fra
ction
(Ap
p.)
[GdnHCl] (M)0 1 2 3 4 5 60 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Circular dichroismFluor. maxFluor. center of mass
Circular dichroismCircular dichroismFluor. maxFluor. maxFluor. center of massFluor. center of mass
Unfo
lded
fra
ction
(Ap
p.)
[GdnHCl] (M)0 2 4 6
30
40
50
Radi
usof
gyra
tion
(Å)
[GdnHCl) (M)0 2 4 60 2 4 6
30
40
50
30
40
50
Radi
usof
gyra
tion
(Å)
[GdnHCl) (M)
A B
SAXS
Resumo do andamento do projeto
Genes PCR Clonagem Expressão PurificaçãoCaracterização
Estrutural através
técnicasespectroscópicas
CaracterizaçãoEstrutural
através técnica de SAXS
Ph0095
Xf2354
Xac1335
Smhpt