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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
( CCD)
Bruno Henrique Ferreira
José Roberto Ambrósio Jr.
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CROMATOGRAFIA
• Método usado para separar, identificar e quantificar componentes de uma mistura;
• Método físico-químico que utiliza distribuição dos componemtes em duas fases em contato íntimo:– fase estacionária: sólido, líquido ou gel; pode
ser: introduzida numa coluna ou espalhada como um filme (suporte cromatográfico);
– fase móvel: líquido ou gás;
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Tipos de Cromatografia
• Em Papel;• Em Camada Delgada;• Por Adsorção;• Por Troca Iônica;• Por Exclusão;• Gasosa;• Líquida de Alta Eficiência.
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Cromatografia em Papel
• Utiliza pequena quantidade de amostra;• Aplicada na separação e identificação de
compostos polares;– antibióticos hidrossolúveis;– ácidos orgânicos;– íons metálicos.
• Classifica-se como: por partição ou planar líquido-líquido.
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Cromatografia por Adsorção
• Método cromatográfico líquido-sólido;• Utiliza-se uma coluna recheada com um
sólido (fase estacionária) e uma fase líquida, onde a sorção isotérmica refere-se a um aumento da concentração do material (que está em excesso na fase móvel) entre as superfícies das fases móvel e estacionária.
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Cromatografia Por Troca Iônica• Cromatografia em coluna recheada;• Utilizada para suavizar a dureza da água;
Cromatografia Por Exclusão• Distribuição seletiva e dinâmica das moléculas do soluto entre duas fases líquidas separadas, dependentes de uma estrutura estacionária contendo poros de tamanho controlado;
•o recheio é constituído por macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes
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Cromatografia Gasosa
• Separação de Gases ou substâncias volatilizáveis;
• Baseia-se na diferente distribuição das substâncias da amostra entre as fases.
• A amostra é introduzida por injeção na coluna contendo a fase estacionária.
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( HPLC)
• Cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, cheias de material especiais e fase móvel que é eluida sob altas pressões.
• Realiza separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos .
• Alta resolução, eficiência e sensibilidade.
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ADSORVENTES
• Importância na sua eficiência: tamanho e área superficial das partículas, sendo estes fatores determinantes na fixação doadsorvente na placa cromatográfica.
• Tipos: sílica, alumina, pó de celulose, pó de poliamida, etc.
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SÍLICA GEL• adsorvente mais utilizado;• preparada pela polimerização de sílica
desidratada;• poros de 10-1500 ângstrons de diâmetro;• área superficial de 200-1000 m2/g;• temperatura de ativação de 150-200ºC;• usado para separar aminoácidos, alcalóides,
açúcares, ácidos graxos, lipídeos, óleos essenciais, cátions e ânions inorgânicos, esteróides
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ALUMINA• apresenta-se em várias formas que diferem
entre si pela área superficial, energia da superfície, tamanho dos poros e, conseqüentemente, em suas propriedades cromatográficas;
• área superficial: 50-250 m2/g;• usado para separar: alcalóides, fenóis,
esteróides, vitaminas, carotenos e aminoácidos.
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VANTAGENS CCD
• insuperável flexibilidade dos sistemas cromatográficos: irrestritas mudanças de solventes, otimizando a seletividade;
• as análises de várias amostras podem ser feitas simultaneamente;
• pode-se especiar a análise para um determinado componente de interesse;
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VANTAGENS CCD
• a análise pode ser feita sob diferentes condições;
• baixo custo: pequena quantidade de amostra;
• rápido: análises simultâneas.
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DESVANTAGENS CCD
• poder de resolução limitado;• por constituir um sistema aberto, depende
de fatores ambientais: influência da umidade relativa na camada hidrofílica, podendo haver contaminação por impurezas do ar, volatilização, oxidação e fotossensibilidade.
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PREPARAÇÃO DAS CROMATOPLACAS
• limpeza: água e detergente;• secagem: em estufa;• aplicação do adsorvente: em suspensão do
adsorvente com solvente volátil:– espalhamento da suspensão com bastão de
vidro (camada não uniforme);– uso de espalhadores (camada uniforme)
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PREPARAÇÃO DAS CROMATOPLACAS
– por imersão na suspensão (camada uniforme)– placas pré-fabricadas: custo elevado;Obs: camada uniforme: menoresquantidades de amostra e maior rapidez no
desenvolvimento dos cromatogramas.
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ATIVAÇÃO DAS PLACAS
• temperaturas e tempos elevados tornamadsorventes mais ativos.
• sílica, alumina: 105-110ºC por 30-60min.• Este processo promove a remoção de vapor
d’água e outros resíduos possivelmente adsorvidos na placa.
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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL
O solvente ou mistura de solventes:• não deve reagir com o adsorvente;• deve interagir de forma diferente com cada
componente da mistura (diferente força de eluição), levando-se em conta sua polaridade, dentre outras propriedades.
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APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS
• amostras na forma de soluções em solventes bastante voláteis;
• utilizando-se uma micropipeta, aplica-se 1 gota de amostra a 1,5-2cm acima do nível inicial do solvente.
• distância entre as amostras: 1-1,5cm• faz-se uma marca a 1-1,5 cm da borda
superior da cromatoplaca.
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PREPARAÇÃO DA CUBA
• introduz-se solvente até altura de 0,5-1cm:– colocar papel de filtro nas paredes e tampar a
cuba para haver mais eficiente saturação da cuba com os vapores do solvente.
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DESENVOLVIMENTO • introduz-se a cromatoplaca levemente
inclinada, com as amostras aplicadas, jásecas, na cuba saturada de vapor de solvente, tampando-a em seguida;
• observa-se o deslocamento do solvente, o qual elui as amostras, finalizando-se o processo quando o solvente atingir a marca estabelecida próxima à borda superior da cromatoplaca, retirando-a da cuba rapidamente e secando-a.
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REVELAÇÃO
Tornar visíveis as substâncias incolores presentes nas amostras:
• luz UV, tornando as manchas fluorescentes;• adsorventes impregnados com reagentes
fluorescentes;• borrifação com H2SO4 ou H2SO4/KMnO4 e
aquecimento a 100-120ºC;• exposição a vapores de I2 em recipiente
fechado.
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FATOR DE CAPACIDADE OU RETENÇÃO (k´)
• Razão da distância percorrida pelo analitoentre FE/FM.
• Quanto maior seu valor, maior afinidade do analito pela FE em relação à FM.
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FATOR DE SELETIVIDADE (ALFA)
• é a razão entre o fator de retenção de 2 analitos.
• quanto maior seu valor, mais fácil a separação.
• alfa=1, não há separação
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FATOR DE EFICIÊNCIA (N)
• relação entre o tempo de permanência do analito no sistema e o alargamento da banda cromatográfica.
• quanto mais difícil a separação (alfa pequeno), maior o N necessário para realizar a separação.
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Características da mancha
• A mancha deve ser: Compacta, redonda ou oval.
• As causas das manchas assimétricas (caudas) são: – Insolubilidade na Fase Móvel. – Adsorção forte na Fase Estacionária.– Aplicação de quantidade muito grande da
amostra.– Dissociação.
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Para Aumentar a Reprodutibilidade
• Saturação da cuba cromatográfica;• Qualidade e quantidade da Fase Móvel;• Atividade da Fase Estacionária;• Qualidade da Fase Estacionária;• Espessura da camada delgada;• Técnica e condição da Fase móvel
(desenvolvimento, temperatura, distância percorrida pela Fase Móvel, quantidade da amostra).
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DOCUMENTAÇÃO
• Fotografia;• Scaneamento;• Xerox;• Determinação dos valores de Rs e Rf.