Comment valider vos procédures de
nettoyage et désinfection?
Faille C., Clarisse M., Zundel S., Villain M., Derache E.
Réunion d’information
ADRIANOR 26 septembre 2013
INRA, UR 638 PIHM
369 rue Jules Guesde, 59651 Villeneuve d’Ascq
+33 (0)3 20 43 54 24
.2
Qu’est-ce qu’un biofilm?
.3
Qu’est-ce qu’un biofilm?
Communauté de micro-organismes fixés à une surface, enchâssés dans une matrice d’exopolymères
Processus naturel
Structure vivante, dynamique, en perpétuel remaniement
Dominant en milieu hostile
Structure et physiologie du biofilm => conditions d’organisation sociale proches de celles qu’établissent entre elles les cellules eucaryotes au sein des tissus
.4
Qu’est-ce qu’un biofilm?
Mode de vie ubiquitaire
Observé sur tous types de surfaces
tissus animaux & végétaux
matériaux chimiquement inertes
Observé pour tout milieu de suspension
air
liquide
aliment
.5
Les biofilms en IAA…
.6
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Chaînes de transformation des aliments : rôle majeur dans la contamination des produits
1996-1998: 40% des TIAC = conséquence d’une contamination des équipements (Haeghebaert, 2001)
+ récemment: ~ 25% des infections par les aliments dues à une contamination durant le procédé de transformation
Japon 2000: > 14 000 personnes malades par consommation de lait
contaminé (vanne encrassée)
Problème domestique
Surfaces des cuisines à l’origine de nombreuses contaminations 30% des salmonelloses
nombreuses épidémies à Campylobacter, E. coli O157
.7
Où trouve-t-on les biofilms en IAA
Ateliers (viandes, poissons, fromages, etc.)
Équipements
Murs, sols
Aération, air conditionné, écoulement des eaux usées, siphons
Équipements fermés (produits laitiers, etc.)
Circuit de fabrication
Conditionnement
Circuit de nettoyage
Cuisines collectives ou non
Surfaces en contact direct ou non avec les aliments
+/- Éponges, torchons
.8
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Aliments / ingrédients
Feuille de salade
.9
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Surfaces d’équipements
Industrie de la viande
=> Surface de réfrigérateur
ex: Listeria monocytogenes
Pisciculture
=> Surface de bassin
ex: Yersinia ruckeri
.10
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Domestique, restauration
Planche de découpe
Eponge
.11
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Domestique, restauration
Torchons
.12
Spécificités de ces biofilms
.13
Bactéries capables de se développer dans les conditions difficiles rencontrées en environnement d’ateliers
(dessiccation, présence de sel, pH acides, T° basses, …)
Surface de réfrigérateur dans l’industrie de la viande
Fromagerie [ NaCl] + pH acide
.14
Bactéries capables de résister aux procédures de nettoyage et de désinfection
Rôle de la bactérie
• Propriétés de surface
• Structure du biofilm (3D, exopolymères)
Rôle du matériau
• physico-chimie de surface
• topographie
.15
Exemples de micro-organismes pathogènes en biofilms d’environnement agroalimentaire L. monocytogenes (biofilms mixtes, adaptation au froid)
acier, polymères (tapis convoyeurs, bacs saumurage), bois (maturation fromage), siphons
filière lait, viande, poissons, légumes
Salmonella spp.
acier, ciment, polymères, verre
filières volaille, viande (abattoirs), eau
E. coli
acier (couteaux), polymères (tapis convoyeurs)
filière viande
Bacillus cereus… (cellules végétatives et spores)
acier (conduites, tanks, remplisseuses), polymères (joints), papier
filière lait, légumes
.16
Exemples de micro-organismes d’altération en biofilms en environnement d’IAA Pseudomonas spp. (biofilms hébergeant Listeria, Salmonella)
sols, aliments (viande), siphons, eau
filière lait (bas pH), viande, légumes, fruits
Bactéries lactiques
Lactobacillus sake (viande)
Carnobacterium spp. (lait, viande, poisson)
Bactéries thermorésistantes
.17
Détection de souillures
.18
Choix du protocole
Choix des méthodes de détection de l’hygiène des surfaces
Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection (CCP
essentiel à sécurité alimentaire) Surveillance au minimum quotidienne
Établissement de la validité des méthodes de surveillance pour établir si
pas de dérive
corrélation entre réponse du test et qualité hygiénique de surface :
Périodicité moindre (1-2 fois/semaine)
.19
Caractéristiques du test à prendre en compte? Vitesse
Tests biochimiques.
Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection.
Sensibilité, exactitude Tests microbiologiques, PCR, visualisation directe des surfaces
Établissement de la validité des méthodes de surveillance
Simplicité Facilité de mise en œuvre ou automatisation complète
Reproductibilité Influence du manipulateur…
Coût Méthodes par contact…
Technique reconnue Publiée ou testée par organismes reconnus
.20
Caractéristiques de la souillure à prendre en compte?
Constituants du biofilm Microorganismes / matière organique / matière minérale
Etat des microorganismes
Vivants et cultivables
VNC
Morts
Où se situe le biofilm? Accessibilité ou non
Surface place lisse / recoin / surface rugueuse
Pop. totale
Pop. Viable (CTC+)
Pop. cultivable
Prélèvement de surfaces en ateliers de la filière fromage (Alliot, 1999)
.21
Cadre de l’étude Contrat en partenariat avec l’ADRIANOR et l’ADRIANORMANDIE, et des PME agroalimentaires
Projet DIAMS (DRAF) : Diagnostic Autocontrôle Mesure des Souillures.
Objectif Diagnostic de la pertinence des produits et procédures d’autocontrôle sur la
détermination du niveau d’encrassement par des souillures complexes à l’issue des opérations de nettoyage et désinfection
.22
Outils de contrôle de l’hygiène des surfaces
Evaluation de l’hygiène des surfaces
Souillure
Tests par frottis
Non microbiologique Microbiologique (viable cultivable)
Tests par empreintes
Ecouvillons Eponges
Chiffonnettes
Boîtes contact Lames contact
Films
Visuel
Microscopique Non microscopique
Bioluminescence Cytométrie
Protéines Sucres Lipides
EPS NADPH Allergènes
.23
Approche expérimentale
.24
Méthodes d’étude Biofilms
3 souches bactériennes (IAA)
• Pseudomonas fluorescens D3-276 (produits laitiers)
• Escherichia coli CECT 434 (légumes)
• Bacillus cereus CUETM 98/4 (produits laitiers)
Matériaux Très répandus dans les IAA
• Acier inoxydable 304 2B (1)
• Acier inoxydable 304 2R (2)
• Polyéthylène (3)
• Polypropylène (4)
• Téflon (5)
Verre (6)
1 2
3 4 5
6
.25
Propriétés des matériaux
Téflon Polypropylène Polyéthylène
Acier inoxydable 2B Acier inoxydable 2R Verre
Verre Acier
inoxydable 2R
Acier
inoxydable 2B Polypropylène Téflon Polyéthylène
Rugosité moyenne
Ra (µm) <0,01 0,02 0,13 0,14 0,45 11,61
Angle de contact à
l’eau 25,5° 43,0° 50,3° 97,1° 113,0° 89,0°
.26
Mode opératoire
Production de biofilms
Méthodes test
Tests microbiologiques par frottis
Coloration
Observation Tests biochimiques
Dénombrement
Immersion horizontale Incubation 24 h à 25°C
incubation48 h à 30°C
Tests microbiologiques par empreintes
.27
Décrochement par frottis
.28
Outils de décrochement
Ecouvillons (différentes « tiges », différents matériaux de prélèvements…)
Coton (Copan)
Rayonne (Copan)
Fibre de Polyester (Texwipe)
Nylon floqué (Quantiswab, Copan)
.29
Outils de décrochement
Mousse Polyester biseautée (Enviro-Swab, 3M)
Eponge (Sponge Stick, 3M)
Chiffonnette (Grosseron)
Efficacité des outils de prélèvements, rôle du matériau
Eponge : test parmi les plus performants quelque soit le matériau
Quantiswab, Enviroswab, chiffonnette performants sur verre et aciers +/- polypropylène
Ecouvillons en rayonne et polyester, voire coton : peu performants même sur acier inoxydable
.30
Outils les plus performants: Résultats les plus élevés sur P. fluorescens et E. coli
Outils les moins performants: Résultats les plus faibles sur P. fluorescens et E. coli
Verre Inox 2R Inox 2B Polyéthylène Polypropylène Téflon
Coton
Rayonne
Polyester
Quantiswab Enviroswab Eponge
Chiffonnette
.31
Intérêts/inconvénients des prélèvements par frottis
Autorisent des analyses ultérieures variées
Facilité de mise en œuvre
Consommables bon marché
Analyse de zones +/- accessibles
Récupération +/- bonne de la souillure (- 1 log / microscopie)
Influence du manipulateur
.32
Méthodes par contact
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact
.33
Géloses contact: Pétrifilms™ (Coliformes et
Flore Totale, 3M)
Lames bifaces gélosées (Coliformes et Flore Totale, LiofilChem)
Boîtes contact (Flore Totale, ATL)
Résultats proches pour les 3 méthodes
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact
.34
Applicateur (500 g, 10 s)
Boites contact (RODAC, ATL) Gélose présentant ménisque convexe
Reproductibilité de pression et durée => applicateurs
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact
.35
PétrifilmTM 3M Double film
• partie inférieure contenant un milieu déshydraté (réhydratation de 30 min à 1-2 h)
• film supérieur quadrillé pour le dénombrement
Reproductibilité de pression et durée => applicateur
Lecteurs automatiques disponibles commercialement
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact
.36
Incubateur
Lames gélosées (LiofilChem) Lames biface (milieux différents)
Application manuelle
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact
.37
Intérêts / inconvénients
Facilité d’utilisation
Empreinte d’une surface => localisation précise d’une contamination
Consommables bon marché (1-2 €) +/- mini-étuves, applicateurs et portoirs commercialement disponibles
Accessibilité nécessaire • Géométrie • Surfaces plates et lisses [boîtes contact]
Récupération partielle des souillures • Bonne sur surface mouillée, moins bonne parfois sur surface sèche • +/- reproductible [ex : lames gélosées, pas d’applicateur]
Incubation longue (24 h à 72 h) Problème des cellules mortes et VNC, de résidus bactéricides
.38
Méthodes biochimiques
Outils biochimiques
.39
Méthodes par frottement + analyse (Kit)
Principe
Prélèvement par écouvillon et dosage direct (colorimétrique…) • des protéines +/- sucres réducteurs • des sucres • de l’ATP, NADP • de résidus alimentaires
Outils biochimiques
.40
Protéines : Clean-Trace Plus (3M)
Clean-Trace Instant (3M)
Pro-Clean (Hygiena)
Rida et Path-Check (R-Biopharm / Microgen)
Flash (Biocontrol)
.41
Protéines, sucres et lipides : Clean Test (LiofilChem)
Glucose/lactose : Spotcheck Plus (Hygiena)
NAD(P)/NAD(P)H : Speed Check (Ecolab)
Résidus alimentaires : Vericleen (Charm)
EPS sur surfaces d’acier : Biofilm Detector Kit (REALCO)
Outils biochimiques
Bilan efficacité
Spotcheck Plus (lactose /glucose) pas adapté aux biofilms
Vericleen et Flash : les moins performants surtout sur le Polyéthylène
Tests positifs demandant une certaine expertise Clean Trace Instant (3M) : lecture très rapide parfois nécessaire
Biofilm Detector Kit sur acier (REALCO) : étape de « nettoyage » de la surface
ProClean (Hygiena) : tige très souple, prélèvement parfois inférieur à celui des autres kits
.42
- + 1: Témoin (pas de biofilm) 2: Résultat positif orangé 3: Résultat positif violet
1 2 3
Outils biochimiques
Bilan efficacité
Tests positifs, lecture facile :
Speed Check (Ecolab) : changement de couleur très net
Ridacheck, Pathcheck (R-Biopharm / Microgen)
Clean trace Plus (3M), Clean Test (LiofilChem)
.43
Outils biochimiques
Intérêts / inconvénients
Meilleure accessibilité que méthodes par contact
Très rapides (qq secondes à qq minutes)
Très faciles à mettre en œuvre (avec gabarit usage unique [~1 €] ou acier [~25 €])
Sensibilité faible: qq µg qq 10aines µg (selon auteurs)
Influence du manipulateur (pression appliquée, schéma de prélèvement)
Outils biochimiques
.45
Conclusion
Méthodes biochimiques : méthodes rapides, relativement sensibles, bon complément aux méthodes microbiologiques
pour détecter des biofilms sur des surfaces