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Célula e Cultura Celular
Carlos Roberto Jorge [email protected]
CURSO TNM-5783-2020
Biomateriais – Propriedades e Avaliação
25set2020
O que é célula?
VIDA!
100 trilhões (mais de 1014) células
+ 200 células ≠
1 a 100 micrometros
1 ng de massa típica
As células são as unidades estruturais e funcionais dos organismos vivos
Retículo endoplasmático liso
O que é célula?
DNA
DNA
ácido desoxirribonucleico
Modelo da dupla hélice
proposto por Watson e
Crick em 1953
GenesSeqüência de bases rigorosamente definida
presente na dupla hélice de uma molécula de
DNA capaz de codificar um polipeptídeo.
CaracterísticasCapaz de duplicar-se.
Capaz de gerar um polipeptídeo, por intermédio
de uma molécula de RNA.
2% do DNA
Cromossomos
Organização
cromossômicahttp://www.bio.miami.edu/dana/250/25002_2.html
As células-tronco retiradas do tecido do cordão são chamadas de MESENQUIMAIS
Zigoto
Diferenciação
Aquisição do fenótipo característico
é limitada pela proliferação celular
Pode ser induzida por:
Aumento da concentração celular
Aumento da interação cél-cél / cél-matriz
Fatores de diferenciação
Desdiferenciação:
perda irreversível das propriedades
especializadas das células
Deadaptação:
as propriedades podem ser re-induzidas
com a criação da condição correta.
BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS
Expressão Gênica
Mecanismos de Regulação Gênica
1. Metilação no DNA 2. Modificação de Histonas 3. RNA não codificantes (microRNA)
Fontes
PROLIFERAÇÃO CELULAR
Ciclo Celular
4 fases:
Mitose
G1 (GAP 1)
S (Síntese do DNA)
G2 ( GAP 2)
Pontos de restrição“Checkpoints”
Proteínas de controle do ciclo celular
Cultura de Células
FONTES
Início: Harrison, 1907 / Carrel, 1912
Por ~ 50 anos => utilização de fragmentos não
desagregados
Segunda metade do Séc. XX => cultura de células Dispersas
“Tissue Culture” x “Cell Culture”
Termo Genérico
INTRODUÇÃO
Objetivo:
Desenvolver um método para estudar o comportamento de células
animais livres da influência das variações sistêmicas
Ex.: stress do experimento, homeostase normal
BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS
animal de sangue frio => rã (1907)
animais de sangue quente => interesse médico
embrião (ovo de galinha) - diversidades de células
roedores – linhagem celular contínua
tumores humanos ex.: Hela (1952)
recentemente => células de insetos (pestes/biotecnologia)
células de peixe (“fish farming”/poluição)
L-Cell => Fibroblasto subcultâneo de camundongo (1943)
COS => Célula de rim de macaco (1951)
Hela => Célula epitelial do cervix humano (1952)
CHO-K1 => Células de ovário de hamster chinês (1958)
W138 => Fibroblastos embrionários de pulmão humano (1961)
BHK21 =>”Baby hamster Kidney fibroblastos” (1962)
HEK293 => “human embryonic kidney cell” (1970)
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Per.C6 =˃ “from human retinoblast cells” (1985)
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2019
400000
Tipos de CC Tipos de CC
Tipos de CC
(3D)
Tipos de Cultura Celular
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Meios - “serum-free seletive media”
antibióticos
equipamentos (de ar limpo)
linhagens celulares
substituição de experimentos com animal
Aumento da sensibilidade
mais rápido
Fusão de células
Técnicas de recombinação gênica
Aumento das áreas de interesse
Fatores que contribuíram para o desenvolvimento
da Cultura Celular
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Vantagens da Cultura Celular
Aspectos Físicos-químicosControle do pH, temperatura,
osmolaridade, gases dissolvidos
Condições fisiológicas Controle de hormônio e
Concentração de nutrientes
Micro-ambienteRegulação da matriz, interação
célula-célula e difusão gasosa
Homogeneidade da
linhagem celular
Capacidade seletiva do
meio e clonagem
Caracterização Citologia e imuno-coloração
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Preservação Pode ser armazenada em
nitrogênio líquido
Origem, histórico, pureza
podem ser registrados
Fácil quantificação
Volumes reduzidos, acesso
direto e menores custo
Possibilidade de definir dose,
concentração e tempo
Microtitulação e robótica
Citotoxicidade e screening de
fármacos, cosméticos, etc.
Validação
Replicatas e variabilidade
Economia de reagentes
Controle de concentração
e tempo
mecanização
Redução do uso
de animalBTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS
Limitações da Cultura Celular
Manualidade, contaminação química
ou microbial, contaminação cruzada
Local de trabalho, incubação,
controle do pH, acondicionamento e
descartes de material com risco biológico
Capital para equipamentos e material de
consumo: meio, soro, plásticos
habilidade
Controle
ambiental
Quantidade
e custo
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desdiferenciação
Expressão de marcadores
Histologia, citologia, microambiente
Instabilidade fenotípica
Identificação da célula
Instabilidade genética Heterogeneidade, variabilidade
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Tipos de CC
Tipos de CC
(3D)
Tipos de Cultura Celular
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Evolução da Linhagem Celular
Evolução da Linhagem Celular
Cultura Primária:
O primeiro de uma série
de processos seletivos
Linhagem celular
Linhagem celular contínua:
Reflexo da variação genética
deleção/mutação p53
> telomerase)
aneuplóide
Transformação:
Uma alteração permanente
no fenótipo da célula
espontânea ou induzida
Imortalização
Aberações no controle do crescimento
malignidade
Ex.: Fibroblasto humano
Euploide - ~50 gerações
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Imortalização: Freqüentemente perde a habilidade de diferenciar
Ex.: 3T3; BHK21-C13 não causam tumoração
Aberações no controle do crescimento
Malignidade = potencial de tumoração: a célula desenvolve a
capacidade de gerar tumores evasivos se
implantada in vivo
TransformaçãoUma alteração permanente
no fenótipo da célula
Espontânea ou induzida
Instabilidade Genética => é maior na CC
Transfecção/transformação (bactérias)
Maior propagação
Mutantes não são eliminados
→
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INSTALAÇÕES
E
EQUIPAMENTOS BÁSICOS
•
Planejamento de um Laboratório de CC
Palavra Chave: ASSEPSIA
Considerações:
Nova construção x Converter uma área já existente
• Onde ficaram: passagem de ar/gás; fluxo
Facilidades: sala de lavagem
esterilização
transporte de material
•
Limitações estruturais•
Largura das portas; altura•
• Normas: Biossegurança
GMP
Piso / teto / paredes
Escadas
Tráfego: pessoas/carrinho
Janelas: vedação/insufilm
Espaço entre equipamentos
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Questões Gerais
Quantas Pessoas? Quanto tempo? Tipo de cultura?•
no de Fluxos
manipulação de biorreatores
dissecção de tecidos animais
Sugestão: 12 Fluxos / 50 pessoas
2 Fluxos / 8-10 pessoas
• Qual espaço Físico?
O Lab. CC tem de acomodar 6 principais funções:
Manipulação estéril
Incubação
Preparação
Lavagem
Esterilização
armazenamento
BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS
BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS
Equipamentos Básicos
Fluxo Laminar
Incubadora com CO2
Tanque criogênico
Microscópio Invertido
Centrífuga
Sistema Purificador de água
Autoclave
Freezer - 80
Manipulação de Células
Sub-cultura
Sub-cultura → passagem/transferência
Cultura primária → Sub-cultura → linhagem Celular → cepa celular
Finita (20 – 80 gerações)
Contínua
Número de passagem número de gerações
Designação da linhagem celular:
NHB 2 – 2/3
LT 156
NCI
Banco de células: ATCC – American Type Culture Collection
T47D = HTB-133
MCF-7 = HTB-22
Normal Human Brain
derivada da mesma fonte
clone
Número de gerações (para célula finita)
Lung Tumor
Número da Biopsia
laboratório: Nacional Cancer Institute
HEK 293
Human Embrionic Kidney
293° experimento de Frank Graham’s (1970, Holanda)
Quando deve ser feita a sub-cultura ?
Densidade da cultura: logo após atingir confluência
(obs.: se deixar mais de 24 horas = recuperação mais lenta)
Exaustão do meio = queda do pH
Tempo desde a última sub-cultura (7 dias)
Troca 3 –4 dias
Outros procedimentos requeridos: Aumentar estoque
Mudança de frasco ou meio
Frequente troca de meio
Perfusão contínua
Células pouco conhecidas:
Início das passagens = usar razão 2 ou 4
Concentração Celular na Sub-cultura:
Regra Geral: 1.104 – 5.104 células / mL
Culturas mais frágeis:
endotélio, primeiras passagens do epitélio
Aconselha-se 1.10 5 células / mL
Subcultura da Cultura em Suspensão:
Critérios similares aos da cultura em monocamada
Concentração Celular NÃO maior que 1.106 células / mL
Contagem de células
Congelamento / Descongelamento
Razões para congelar as células:
1. Instabilidade gênica
2. Senescência
3. Transformação
4. Instabilidade fenotípica devido a seleção e dediferenciação
5. Contaminação por microorganismos
6. Contaminação cruzada
7. Falha na Incubação
8. Poupar tempo e material na manutenção de linhagens que não
serão usadas imediatamente
9. Necessidade de distribuição/transporte
Estágios de Criopreservação
Pescoço largo
Pescoço estreito
Vapor
N2 líquido
Tipos de Criofreezeres:
1oC/min → -70 oC → N2 líq (-196oC)
2 min máx
DMSO → 5-10%
Glicerol →10-15%
CUIDADOS:
Descongelamento
Manipulação Rápida
Explosão
DMSO (luvas x pele)
Protetor de Face
ASSEPSIA
Técnicas assépticas: combinação de procedimentos com objetivo de reduzir a probabilidade de contaminação
Manutenção da esterilidade bom senso, experiência
Tipos de contaminação: bactéria, micoplasma, levedura, fungo
Fontes de contaminação: operador, atmosfera, superfícies, soluções, equipamentos, fonte de aquisição das células
Minimização da contaminação:
1) checar a cultura regularmente a olho nú ou ao microscópio;
2) manter a cultura sem antibiótico por determinado período;
3) checar reagentes quanto à esterilidade (fabricante);
4) não compartilhar frascos de reagentes de uso;
5) estabelecer seu próprio método de trabalho “estéril”.
Ambiente de trabalho: calmo; portas e janelas fechadas; acesso restrito; isolado de culturas microbiológicas e de
animais; equipamentos relacionados; atividades não estéreis em outro local.
Superfície de trabalho: limpa e arrumada
Importante: Muito Treino e álcool 70%!!!BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS
Classificação dos OGMs quanto ao grupo de risco:
→ grupo 1: provavelmente não provocam doenças no homem ou nos animais;
→ grupo 2: germes patogênicos capazes de causar doenças em seres humanos
ou animais. Geralmente não apresentam um perigo sério, medidas profiláticas
são conhecidas, risco de propagação limitado;
→ grupo 3: germes patogênicos que costumam provocar doenças graves em
seres humanos ou animais. Propagação via hospedeiro infectado, medidas
profiláticas e de tratamento bem estabelecidas;
→ grupo 4: agentes infecciosos patogênicos que geralmente causam doenças
graves em seres humanos ou animais. Transmissão direta ou indireta,
geralmente não se conhece tratamento eficaz e as medidas profiláticas não são
bem estabelecidas.
Nível de Biossegurança (NB): nível de contenção necessário para permitir o
trabalho com OGM de forma segura, com risco mínimo para o operador e para o
ambiente.
Aplicações da CC
Aplicações Gerais
Biotecnologia
Proteínas Recombinantes
Glicosilação
=>Retornar células
corrigidas ao paciente
Implante de células =>
Doença de Parkinson
Insulina
Musculatura esquelética
Células do próprio indivíduo x célula de feto
Terapia Gênica
Transfectar genes normais
em células deficientes
Terapia Celular
Bioensaios
Cultivo celular 3D
Homem em um Chip
Medicina individualizada
https://www.youtube.com/watch?v=1ya8-bjRHVs&feature=youtu.be
Bioimpressão 3D: Desafios e Aplicações (Dra Janaina Dernowsek, Bioedtech)
Bioimpressão 3D
Células troncos com Pluripotência induzidas IPS’s
Medicina regenerativa
Questões éticas
Obrigado!!!