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Clonación
Manipulación de DNA
Curso 2011-12
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El problema básico
¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula?
Uniéndolo a un vector de clonacion
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Vector de clonacion
Fenotipo seleccionable
Dianas de restricción unicas
Multicopia
DNA de replicación autónoma
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Diana única
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Plásmidos recombinantes
Quimeras
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Pasos en la clonación
•Ligación
•Crecimiento en placas de agar en medio selectivo
•Restricción del vector y del inserto
•Transformación
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Fragmentación de DNA
Enzimas de restricción
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Werner Arber
Premio Nobel de Medicina en 1978
"for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics".
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Eje de simetría doble
dabalearrozalazorraelabad
DIANAS de restricción
Secuencias palindrómicas
ana anna
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Romos Protuberantes
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Probabilidad de corte
1/4 x 1/4x 1/4 x1/4= (1/4)4 =1/256
(1/4)6 = 1/4096
(1/4)8 = 1/65536
~ 12.5x106 fragmentos
~ 781250 fragmentos
~ 48828 fragmentos
Nº fragmentos en genoma humano
Enzimas de restricción
nomenclatura
4
4
8
6
6
1/4
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IsosquizómerosEnzimas de restricción que reconocen la misma sequencia
Pueden cortar en el mismo sitio
Como NdelI y MboI GATC
O no
NarI GG CGCC
BbeI GGCGC C
EheI GGC GCC
KasI G GCGCC
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Ligación de DNA
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5´3´
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Truco para favorecer laformación de recombinantes
Impedir la religación del vector
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Extremos cohesivos compatibles
¿Podríamos digerir el recombinante con BamHI?
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….NGAT ATCN…..
….NCTA TAGN…..
….NGAT….NCTA
ATCN…..TAGN…..
….NCTA….NGAT CCTN…..
GGAN…..
….NCTA….NGATCCTN…..
GGAN…..
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Animación > Manipulation >Revolution > Players
http://www.dnaftb.org/34/concept/index.html
Premio Nobel de Química 1980
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Vectores de clonacion
Vectores plasmídicos
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Características de los vectores de clonación
•Pequeño tamaño
•Marcador genético de selección
•Sitios únicos de restricción
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ColE1
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•Mutación en las secuencias control de la replicación de ColE1 resultantes en más de 500 copias/célula
•Adición de múltiples sitios de clonaje únicos (MCS) (“poly-linker”)
Vectores mejorados
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MCS (Multi Cloning Site)
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![Page 36: Clonación Manipulación de DNA Curso 2011-12. El problema básico ¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula? Uniéndolo a un vector](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022061217/54b47a694979594d3a8b5fa4/html5/thumbnails/36.jpg)
(polylinker)
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MCS de pUC18
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MCS de pUC19
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•MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.
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pUCPlac O N-lacZ
pUCPlac O N-lacZ
IPTGXGal
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pUCPlac O N-lacZ
pUCPlac O N-lacZ
IPTGXGal
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Allolactosa
Isopropil D tiogalctósido IPTG
INDUCTORno hidrolizable
Inductor
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X-gal
Ensayo de -galactosidasa
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•MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.
•Selección de plásmidos con inserto: colonias blancas en placas con IPTG y X-Gal.
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Colonias blancas Colonias azules
+ X-gal + X-gal
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+ IPTG
Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos)
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+ inserto
- inserto
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Vectores lanzadera
Shuttle
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