FISIOLOGÍA MICROBIANA

DOCENTE

Dra. Estela Tango

Objetivos

Conocer los requerimientos nutricionales de las bacterias.

Captación de los nutrientes.

Cultivo de los microorganismos.

Conocer el crecimiento bacteriano.

Fases de crecimiento bacteriano.

Factores ambientales para el crecimiento.

Sustancias antimicrobianas.

Metabolismo microbiano.

FISIOLOGÍA BACTERIANA

La fisiología bacteriana comprende el estudio de las funciones realizadas por estas.

Las bacterias son muy eficientes fisiológicamente, sintetizan en forma muy rápida sus componentes celulares, siendo la mayoría autosuficientes, a pesar de su simpleza estructural.

En la bacteria se desencadenan una serie de procesos químicos, que en conjunto constituyen

METABOLISMO BACTERIANO

Exigencias nutritivas de las

bacterias

Bacterias que viven exclusivamente en el hombre

Bacterias exigentes

Han perdido rutas metabólicas y dependen del

huésped para su aporte, “autótrofas”

Bacterias que pueden crecer en el hombre ó en el

ambiente

Bacterias poco exigentes

Pueden sintetizar todos sus macromoléculas

Nutrientes que se emplean en la

biosíntesis y producción de Energía

H2O

Macroelementos

Microelementos

Hierro

Factores de crecimiento

Macroelementos

Constituyen > 95% del peso seco celular

C, H, O, N, P, S, Ca++, Mg++, K+, Fe++

C, H, O, N, P, S son componentes de CH, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos

K+ : actividad de algunas enzimas

Ca++: termorresistencia esporas

Mg++: Cofactor de enzimas, forma complejos con el ATP, estabiliza ribosomas y membrana plasmática

Fe++ y Fe+++: forma parte de los citocromos y es cofactor de enzimas y proteínas transportadoras de electrones

Microelementos Se denominan también micronutrientes

Mn, Zn, Co, Cu, Mo, Ni

Se obtienen como contaminantes del H2O, matraces, componentes del medio de cultivo

Forman parte de enzimas y cofactores y facilitan la catálisis de las reacciones y el mantenimiento de la estructura de las proteínas, Ej

Zn: centro activo de algunas enzimas

Mn: facilita la transferencia de grupos fosfato

Co: componente de la vitamina B12

Fuentes de Carbono

Dióxido de Carbono (CO2) No aporta Hidrógeno ni energía.

Los organismos pueden agruparse dependiendo de la fuente de carbono en:

: Usan el CO2 como fuente de energía

ORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS.

AUTÓTROFOS

Usan nutrientes Orgánicos como

Fuente de carbono y energía

HETERÓTROFOS

Clasificación de las Bacteriassegún fuentes de carbono

Autótrofas

Heterótrofas

Carbono

Obtienen C desubstratos simples.• CO2

• CH4 Obtienen C de compuestosmás complejos.• Aminoácidos• H de Carbono• Lípidos

Los microorganismos pueden clasificarse dependiendo de la fuente de Hidrógeno o electrones:

Obtienen electronesO hidrógeno de

Compuestos inorgánicos.LITÓTROFOS

Utilizan sustancias orgánicas como

Fuente deElectrones.

ORGANÓTROFOS

Tipos nutricionales

El metabolismo es realizado mediante la utilización de dos fuentes de energía: energía libre de las oxidaciones químicas y radiación.

FOTÓTROFOSQUIMIÓTROFOS

Emplean la luz como fuente de energía.

Obtienen energía a partir de la oxidación de

compuestos orgánicos o inorgánicos.

Tipos nutricionales

Protozoos, hongos,Bacterias no fotosintéticas (mayoría de microorganismos

Patógenos)

Bacterias púrpuras y verdes no sulfúreas

Algas, bacterias púrpurasY verdes del azufre,

Cianobacterias.

TIPOS NUTRICIONALES

ORGANÓTROFOSLITÓTROFOS

ORGANÓTROFOS

HETERÓTROFOSAUTÓTROFOS

HETERÓTROFOS

FOTÓTROFOSQUIMIÓTROFOS

FOTÓTROFOS

Bacterias oxidantes del azufre,Hidrógeno, nitrificantes,

Oxidantes del hierro.

LITÓTROFOSAUTÓTROFOS

QUIMIÓTROFOS

Requerimientos de N, P, S

Pueden ser obtenidos a partir de fuentes orgánicas e inorgánicas

N: purinas y pirimidinas, aminoácidos, etc.

Aminoácidos

Reducción asimilatoria del nitrato (NO3-NH4)

P: ácidos nucleicos, fosfolípidos, proteínas, etc.

Fuente inorgánica en la forma de fosfato

S: cisteína, metionina, biotina, tiamina, etc.

La mayoría efectúa reducción asimilatoria de sulfato

Algunos requieren cisteína

Factores de crecimiento Compuestos orgánicos que la bacteria no puede

sintetizar por pérdida de enzimas de rutas metabólicas Aminoácidos: Síntesis de proteínas. Ej. Cisteína

en N.gonorrhoeae Purinas y pirimidinas: Síntesis de ácidos

nucleicos. Ej. Mycoplasmas Vitaminas: Cofactores enzimáticos Ej. Vitamina K en bacilos Gram(-) anaerobios Otros: Haemophilus NAD Heme

Captación de Nutrientes

Sistemas de transporte

Difusión pasiva

De mayor a menor concentración.

Ej.. H2O, O2 y CO2

Difusión facilitada

De mayor a menor concentración

Proteínas transportadoras de la

membrana (permeasas)

Poco empleada en procariotes

Ej.glicerol

Transporte activo

Translocación de grupo

Transporte activo

Permite concentrar nutrientes en contra de una gradiente de concentración

Requiere energía metabólica Ej ATP, ó fuerza motriz de protones

Emplea proteínas transportadoras de gran especificidad

Sistemas de transporte de proteínas ligadorasdel espacio periplásmico transportan azúcares y aminoácidos

Transporte activo

Gradiente de protones generado durante el transporte de electrones para facilitar el transporte activo.

Sistema de transporte de una sustancia en un sentido uniporte.

Sistema de transporte combinado de dos sustancias simporte.

Sistema de transporte combinado en que las sustancias se desplazan en direcciones

opuestas antiporte.

Translocación de grupo Hay modificación química de la sustancia a ser

transportada

Transporte de azúcares

Hay fosforilación del azúcar a cargo del fosfoenolpiruvato

PEP+azúcar(exterior)/piruvato+azúcar-P(interior)

Presente en bacterias anaerobias facultativas

Transporte de hierro

La captación de Fe+3 es difícil por la insolubilidad del compuesto

Muchas bacterias secretan sideróforos, los que forman complejo con el hierro

Receptores de la superficie bacteriana captan el complejo Fe-sideróforo

Liberación y reducción del hierro como Fe+2(ferroso)

Medios de cultivo

Preparados estériles que contienen los nutrientes necesarios para el crecimiento microbiano

Medios definidos

Se conocen todos los componentes (glucosa como fuente da carbono y sal de NH4 como fuente de N)

Utiles en investigación de la capacidad metabólica de un organismo.

Medios complejos

Composición química desconocida

Satisfacen las necesidades de la mayoría de las bacterias

Medios de cultivo

Componentes Peptonas

Hidrolizados enzimáticos de carne, caseína, soya

Sirven como fuente de Energía, C y N

Extractos: carne, levadura

Fuente de aminoácidos, péptidos, nucleótidos, vitaminas

Tipos de medios de cultivoMedios enriquecidos

Se usan en el aislamiento microbiano

Medios selectivos

Se usan para aislamiento de sitios no estériles

Favorecen el crecimiento de bacterias específicas

Contiene sustancias inhibitorias Ej CV y sales biliares

Medios diferenciales

Permiten diferenciar entre bacterias por sus características fisiológicas

Medios de cultivo

Medios enriquecidos Medio selectivo

Medio diferencial

30 años30 minutos

Crecimiento microbiano

Adaptación bacteriana para: Aumento de

número y masa

Crecimiento bacteriano División binaria Replicación del

cromosoma bacteriano

Se pega cada copia en diferentes partes de la membrana

Formación de tabique celular

Tiempo de generación (duplicación)

Crecimiento Microbiano:

Cambio en el número de células por una unidad de tiempodeterminada.

Tiempo de generación

(duplicación):

Tiempo requerido para que una célula se divida en dos.El tiempo puede ser minutos, hora o días.

Otra forma de duplicación en procariontes es la gemación.

sistema de duplicación de organismos unicelulares, por evaginación se forma una yema que recibe uno de los núcleos mitóticos y una porción de citoplasma.

Uno de los organismos formados es de menor tamaño que el otro

FASES DEL CRECIMIENTO

CUANDO INTRODUCIMOS UNA POBLACION DEMICROORGANISMOS DENTRO DE UN MEDIO DE CULTIVOLIQUIDO, CADA ORGANISMO PRESENTA CUATRO FASESDE CRECIMIENTO TIPICAS:

FASE LAG(latencia) FASE LOGARITMICA (LOG) FASE ESTACIONARIA FASE DE MUERTE.

ESTAS CUATRO FASES FORMAN LA CURVA ESTANDAR DELCRECIMIENTO BACTERIANO

CRECIEMIENTO EXPONENCIAL N° CELULAS : 1 2 3 4 8 EXPONENTE 20 21 22 23 24

•Fase de latencia: período de adaptación , gran actividad metabólica, células no se dividen (min-horas )

•Fase exponencial o logarítmica (log): aumento regular de la población que se duplica a intervalos regulares de tiempo (G). •Los Bllactamicos actuan en esta fase

Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulación de productos tóxicos, etc.N|°cel.nuevas=n°cel.que mueren

Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es mayor que el número de células que se dividen.↓cel. viables

Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva en que se encuentren (la producción de antibióticos se lleva a cabo en la fase estacionaria).

Medición del crecimiento bacterianoMedición del número celular Recuento directo (Cámara de Petroff-Hauser)

Recuento del Nº de colonias en cultivo Ej. Un ml de una dilución de 1x10-6 produce 150 colonias,

la muestra original contiene 1.5x108 ufc/ml

Crecimiento en filtro

Medición de la masa celular Mide la capacidad de dispersar la luz, que es

proporcional al Nº

Un aumento del Nº, aumenta la turbidez y disminuye la luz transmitida

DILUCIONES

FACTORES AMBIENTALES Y CRECIMIENTO

MICROBIANO

Nutrientes

Tiempo

Oxígeno

Disponibilidad de agua

pH

Temperatura

Temperatura

mínima óptima máxima

Psicrófilos 0º C 15º C 20º C Bacterias oceánicas

Psicrótofos 0º C 20 – 30º C 35º C Bacterias deterioro de alim. Refrig.

Mesófilos 15 -20º C 20 – 45º C 45º C Mayoría de bacterias patógenas

Termófilos 45º C 55 – 65º C sup. a 65º C Bacterias, hongos y algas

Hipertermófilos 55º C 80 – 113º C 113º C Bacterias aisladas del suelo marino

Temperatura

pH

pH neutro6.5-7.5

AcidófiloLactobacillus sp.:pH<5

Presión

No afecta a microorganismos de la superficie terrestre.

Presión de 1 atmósfera.

En el océano puede alcanzar 600 – 110 atm, y Tº es de 2 – 3º C.

Barotolerantes un aumento de la presión les afecta negativamente.

Barófilos crecen a presiones elevadas.

Presión osmótica

DISPONIBLIDAD DE AGUA Todos los organismos requieren

H2O para vivir. Halófilos: microorganismos que

viven en altas concentraciones de sales.algunas bacterias se han adaptado muy bien a ambientes con altas concentraciones de sal (nacl): halotolarentes,(toleran

conentraciones de nacl) y los halófilas ( requieren nacl para

su crecimiento, moderados(6-15%) y extremos(15-30% nacl).

Osmófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de azúcares.

Xerófilos: microorganismos que viven en ambientes secos.

Concentración de oxígeno

Aerobios organismo que necesita O2 para crecer.

Anaerobio organismo que puede crecer en ausencia de O2.

Anaerobio facultativo no requieren O2 para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia.

Anaerobio aerotolerante pueden crecer con presencia o ausencia de O2.

Anaerobio estricto no crecen en presencia de O2

Microaerófilos necesitan niveles de O2 bajos (2-10%)

Presencia de O2

Aerobios Anaerobios

(ausenciaO2)Microaerofilos

Requiere(1-15%)

Obligados

O2(21%)

Aerotolerantes

No requieren

crecen peor en O2

Extrictos, obligados

O%, letal

FacultativosNo requieren

crecen mejor

en presencia de O2

Concentración de oxígeno

AerobioAnaerobio facultativo

Anaerobio estricto

Microaerófilo Anaerobio aerotolerante

•Toxicidad radicales libres:

• Sobre DNA

• Sobre la membrana celular

•¿ Donde hay

•anaerobios?

SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS

AGENTE ANTIMICROBIANO: SUSTANCIAQUIMICA QUE DESTRUYE O INHIBE LAPROLIFERANCION DE LOSMICROORGANISMOS PRODUCTO NATURAL

SINTESIS QUIMICA

PRODUCTO NATURAL: ANTIBIOTICOS LOSCUALES EN SU MAYORIA SONPRODUCIDOS POR MICROORGANISMOS.

EFECTO BACTERIOSTATICO• SE OBSERVA CUANDO SE INHIBE

LA PROLIFERACION PERO NO TIENE LUGAR LA MUERTE CELULAR.

• UN AGENTE BACTERIOSTATICO:

– INHIBE LA SINTESIS DE PROTEINAS

– ACTUA UNIENDOSE A LOS RIBOSOMAS

– PUEDE ACTUAR EL EFECTO DILUCION

– EJEMPLO:

– Streptomicina, Tetraciclina, Cloramfenicol

– Tetraciclinas y estreptomicinas (30S)

– Cloramfenicol (50S)

AGENTES BACTERICIDAS

• EVITAN LA PROLIFERACION E INDUCEN LA MUERTE, PERO NO TIENE LUGAR LA LISIS O RUPTURA CELULAR.

• SE UNEN MUY INTIMAMENTE CON SUS BLANCOS CELULARES Y NO PUEDEN ELIMINARSE POR DILUCIÓN.

• SON EJEMPLO DE ESTOS AGENTES LOS METALES PESADOS.

• Ejemplos:

• Ácido Nalidíxico, Rifampicina

AGENTES : quimioterapeúticos

• TOXICIDAD SELECTIVA: el agente es mas efectivocontra el microbio que contra el huesped animal ovegetal.

• El efecto de un agente antimicrobiano se puedeestudiar con la ayuda de:

– CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA CMI

– ANTIBIOGRAMA

– ESPECTRO DE ACCION

CMI

ANTIBIOGRAMA

Zona de Inhibición Sensibilidad de la cepa

0 a 10mm de diámetro Resistente

10 a 15mm de diámetro Medianamente resistente

15 a 25mm de diámetro Sensible

25mm o más de diámetro Muy sensible

SITIOS DE ACCION DE ANTIMICROBIANOS

• Resistencia Antibiótica Mecanismo de Resistencia:•Natural o Adquirida .Trastornos de la Permeabilidad•Cromosómica o Plasmídica . Alteraciones del Sitio Blanco•(Transposones) . Hidrólisis Enzimática

• Principios generales

• Obtención de Energía en las bacterias

•Catabolismo de los Hidratos de carbono

– Glicolisis

– Fermentaciones

– Respiración

• Catabolismo de los lípidos y aminoácidos

Metabolismo

Conjunto de reacciones químicas que tienen lugar en la célula

Anabolismo: similitud célula procariótica y eucariótica

Utilidad de las reacciones catabólicas de las bacterias para diagnóstico

Las vías catabólicas de Glicolisis y TCA son anfibólicas

Catabolismo de los compuestos orgánicos

Polisacáridos Proteínas Lípidos

Hidrólisis extracelular

Azúcares Aminoácidos Acidos grasos

(Mono y disacáridos) Glicerol

Transporte al interior de la célula

Glicólisis Desaminación Glicolisis (glicerol)

(Vías Entner-Doudoroff, Decarboxilación Oxidación

Fosfogluconato)

5.ensamblaje

4. polimerización

3.biosíntesis

2.reacciones catabólicas

1.mecanismos de entrada

etapas del metabolismo

ANABOLISMO

síntesis

CATABOLISMO

degradación

METABOLISMO

Actividades

relación, nutrición y reproducción

ATP

fosforila. n. sustrato

quimiosmosis

Poder reductor

rxn redox

NAD

NADP

REQUERIMIENTOS

materiales(nutrientes)

fuerza conductora(ATP y poder reductor)

plan (organización)

METABOLISMO

Respiración anaerobia

láctica alcoholica

Fermentación

METABOLISMO

ANAEROBIO

12 metabolitos precursores

ATP

Poder reductor

Respiración aerobia

glicolisis

ciclo Krebs

ruta pentosa fosfato

METABOLISMO

AEROBIO

METABOLISMO

METABOLISMO

Usos de la Energía en las bacterias

Capacidad de realizar trabajo

Biosíntesis de moléculas biológicas a partir de precursores simples

Transporte activo a través de la

membrana plasmática

Trabajo mecánico: Movilidad

Obtención de Energía en las bacterias de interés médico Reacciones de óxido-reducción

Transferencia de e desde un dador (agente reductor) a un aceptor (oxidante) con liberación de Eº libre

La Eº liberada se almacena como: ATP

NADH

Los transportadores de e son: NAD y NADP Aceptan 2 e y un protón y ceden un

protón

FAD Transportan 2 e y 2 protones

FMN

ADP + Pi + E ATP + H2O

Generación de ATP

• 1.- Fosforilación a nivel de sustrato

• 2.- Fosforilaciónoxidativa(Transporte de electrones):

FLUJO ENERGETICO Y DE CARBONO

ALTERNATIVAS DE GENERACION DE LA ENERGÍA

1. Respiración aeróbica

Comp. orgánico

NO3-

CO2

CO2

ATP

BiosíntesisO2

Flujo de e- Flujo de C

2. Respiración anaeróbica

Comp. orgánico

ATP Biosíntesis

S0 SO4-2 aceptores orgánicos de e-

Flujo de e- Flujo de C

Respiración aeróbica

Vía final común para la oxidación completa de aminoácidos, ácidos grasos y carbohidratos

Suministra productos intermedios clave ( -cetoglutarato, succinil coA, oxaloacetato) para biosíntesis de aa, lípidos, purinas y pirimidinas

Respiración Transferencia de e desde

el NADH y FADH2 a aceptores como el O2

Los e fluyen desde los transportadores con potenciales de reducción más negativos a los más positivos

El acepto final de los e es el O2

Acoplamiento con la fosforilación oxidativa

Vía glicolítica

Presente en todos los organismos

Es la principal vía para el catabolismo de la glucosa

Actúa en presencia ó ausencia de O2

Etapas

Transformación de la G6P en dos triosas fosfato (Etapa preparativa)

Transformación de las triosas fosfato en ácido pirúvico

Obtención de ATP por fosforilación a nivel de sustrato

Vía glicolítica

Vía de las pentosas

Proporciona precursores como pentosas

Produce Gliceraldehido 3-P que puede ser convertido en piruvato

Se produce NADPH para las reacciones de biosíntesis ó se convierte en NADH siendo utilizado para obtener energía

Balancear el potencial

redox

Regenerar el NAD+

Fermentaciones

Fermentación alcohólica(levaduras)

Fermentación homoláctica(Lactobacillus spp.)

FERMENTACION

a) Utiliza una fuente de energía en ausencia de un aceptor externo de electrones

b) El donador de e se oxida por completo y después de algunos intermedios queda reducido

TIPOS DE FERMENTACIONES

a) F. Alcohólica hexosa CO2 + etanol Levaduras Zymomonas

b) F. Homolactica hexosa ac. Láctico Streptococcus Lactobacillus

c) F. Heterolactica hexosa ac. láctico Leuconostoc

etanol, CO2

d) F. Propiónica lactato Propionato Propionibacterium(acetato, CO2) Clostridium propionicum

e) F. Ac. mixta hexosa Butanol Enterobacterias

2,3 butanodiol E. Coli, Shigella

acetato, formato, lactato, succinato Salmonella

f) F. Ac. butírica hexosa Butirato lostridium butiricum

Acetato, H2 + CO2

g) F. Butanólica hexosas butanol Clostridium butiricum

Acetato, acetona, etanol

Catabolismo de los lípidos

Importante fuente de energía para bacterias

Triglicéridos y ácidos grasos

glicerol y ác.grasos

lipasas

Dihidroxiacetona-P

vía glicolitica

-oxidación

Catabolismo de los aminoácidos

Transaminación

alanina

Ac.pirúvico