1
Caractérisation chimique et évaluation des propriétés cytotoxiques, pro-inflammatoires et génotoxiques
de particules fines en suspension dans l’air en milieu rural
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
La pollution atmosphérique est connue comme étant un facteur de risque majeur pour la santé humaine (Pope et al., 2009)
PM
Polluants atmosphériques
NOx SOx COx O3 COV NH3
2
INTRODUCTION
Sels Métaux COV HAP Pesticides Fraction biologique
Pollution atmosphérique
Gazeux Particulaires
Classée récemment cancérigène certain pour l’Homme (CIRC, 2013)
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
PM < 2,5 µm
PM < 0,1 µm
Alvéoles pulmonaires
Tissus pulmonaires, circulation sanguine
Fosses nasales, pharynx et larynx
Trachée, bronches et bronchioles
PM > 10 µm
PM < 10 µm
(d’après ERS, 2010)
3
INTRODUCTION Interaction des PM avec l’appareil
respiratoire
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
4
INTRODUCTION
Etudes épidémiologiques
↑ 26 % du risque de mortalité par cause cardio-vasculaire (Lepeule et al., 2012)
↑ 8 % de l’incidence du cancer pulmonaire (ERS, 2010)
↑ Maladies cardiovasculaires (Puett et al., 2011)
↑ Maladies respiratoires : asthme, bronchite et BPCO (Silverman et Ito, 2009 ; Tsai et al.,
2013)
↑ 10 μg/m3 de PM2,5 :
Exposition aux PM2,5 :
Pollution particulaire et santé
leur implication dans l'apparition de pathologies respiratoires
Des études supplémentaires sont indispensables afin de mieux comprendre :
le rôle des différents composés qui constituent les particules
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
5
OBJECTIFS
Prélèvement des particules par impaction en cascade
sur 2 sites ruraux/semi-urbains
Particules fines (PF) : PM2.5
Mécanismes physiopathologiques
Potentiel inflammatoire, apoptotique et génotoxique
? Réponse
inflammatoire Cycle Cellulaire Apoptose Dommage à l’ADN
Caractérisation chimique
Pesticides HAPs Eléments traces métalliques
Approche méthodologique
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
PLAN
• Résultats et discussion
• Conclusion générale
• Perspectives
6
• Introduction
Matériels et méthodes
• Objectifs
Echantillonnage des PM
Analyse chimique
Analyse toxicologique
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
7 Méthodologie de prélèvement Echantillonnage des PM2.5
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Staplex® modèle 236, USA
Impacteur en cascade :
L’échantillonnage des particules :
Spycker: mai – novembre 2015
Wormhout: mai – novembre 2015
Haut débit : 42 m3/h
6 étages + filtre d’arrêt
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
DUNKERQUE
LILLE
Wormhout
Steenvoorde
PLAN
• Résultats et discussion
• Conclusion générale
• Perspectives
8
• Introduction
Matériels et méthodes
• Objectifs
Echantillonnage des PM
Analyse chimique
Analyse toxicologique
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
9 Analyse chimique des PM2.5
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Pesticides
Extraction au dichlorométhane par ASE
Dosage par GC-MS : 16 HAP
HAP
Extraction au dichlorométhane par ASE
Dosage par GC-MS et LC-QTOF
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
10 Échantillons de PM
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Ces échantillons individuels ont été analysés de manière à étudier l’évolution des concentrations en pesticides durant les différentes périodes d’échantillonnage
1494 1188 531 66 128
835
Préparation des échantillons de PM2.5 pour les études toxicologiques
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
11 Échantillons de PM
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Regroupement des échantillons 5 à 11 puis 16 à 21 pour les 2 sites : W1, S1, W2, S2
1494 1188 531 66 128
835
W1 W2
S1 S2
Préparation des échantillons de PM2.5 pour les études toxicologiques
Échantillons composites de
particules fines
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
12
Caractérisation physico-chimique des échantillons de PM2.5
pour les études toxicologiques Pesticides
0
1
2
3
4
5
6
7
8
S1 S2 W1 W2 Industrie
Co
nc
en
tra
tio
n e
n µ
g/g
Concentrations en pesticides
Isoproturon
Fenpropidin
Fenpropimorph
Epoxiconazole
Métolachlor
Prosulfocarb
Profils similaires pour les périodes 1 et 2 : effet saisonnier
Quantités supérieures en périodes 2
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MATÉRIELS ET MÉTHODES
13 HAP
Les teneurs en HAP sont plus élevées dans les échantillons de la période 2 et dans l’échantillon industriel
0
10
20
30
40
50
60
S1 S2 W1 W2 Industrie
Co
nc
en
tra
tio
n e
n µ
g/g
Mélange
Concentration en HAP Naphtalène
Acénaphtylène
Acénaphtène
Fluorène
Phénanthrène
Anthracène
Fluoranthène
Benzo[a]anthracène
Chrysène
Benzo[b]fluoranthène
Benzo[k]fluoranthène
Benzo[a]pyrène
Indeno[1,2,3-c,d]pyrène
Dibenzo[a,h]anthracène
Benzo[g,h,i]perylène
Dibenzo[a,h]anthracène
Benzo[g,h,i]perylène
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
MATÉRIELS ET MÉTHODES Caractérisation physico-chimique des échantillons de PM2.5
pour les études toxicologiques
PLAN
• Résultats et discussion
• Conclusion générale
• Perspectives
14
• Introduction
Matériels et méthodes
• Objectifs
Echantillonnage des PM
Analyse chimique
Analyse toxicologique
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
15 Analyse toxicologique
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Matériel biologique
Cellles BEAS-2B (x100)
Lignée cellulaire : BEAS-2B / ECACC - référence 95102433
Cellules épithéliales bronchiques humaines
Non cancéreuses
Infection par le virus hybride Ad12-SV40
Capacités métaboliques (Garcia-Canton et al., 2013 ; Uppstad et al ., 2010 )
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
16 Analyse toxicologique
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Mécanismes physiopathologiques
Cytotoxicité (LDH et DHm)
Indicateurs de dommage à
l’ADN/réparation
Indicateurs d’apoptose
Indicateurs d’arrêt du cycle cellulaire
PM2.5 rurales (S1, S2, W1 et W2)
Cellules BEAS-2B (24 et 48h)
Mélange de pesticides commerciaux
EO PM2.5 (S1EO, S2EO, W1EO et W2EO)
PM2.5 industrielles
Réponse inflammatoire
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
PLAN
• Conclusion générale
• Perspectives
17
• Introduction
• Objectifs
Résultats et discussion : Effets toxicologiques des PM
• Matériels et méthodes
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
18 Étude toxicologique des PM
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Cytotoxicité
Profils similaires pour chaque échantillon
• Concentration non létale : 16 µg/cm2
• Concentration modérément létale: 64 µg/cm2
Détermination des concentrations d’intérêt
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
19 Étude toxicologique des PM
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Réponse inflammatoire
* *
* *
*
*
*
*
* *
* *
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t
Mix
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IL-6 après 48h
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* * * 0 2 4 6 8
10 12 14 16 18
S1-
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Ind
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EO
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Mix
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Mix
Pes
t*10
Qu
an
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cy
tok
ine
s (
pg
pa
r µ
g d
e
pr
oté
ine
s)
IL-8 après 48h
o Site+N°échantillon – Concentration
o EO = Extrait organique
Profils similaires pour les 2 interleukines Effets inflammatoires plus prononcés pour l’exposition aux particules Relation dose/réponse (16 ou 64) Réponse plus importante pour la période1 (S1 et W1) Léger effet pour les EO et le mélange
de pesticides commerciaux
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
20 Étude toxicologique des PM
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Evaluation du potentiel génotoxique
o 5 biomarqueurs – 4 actions différentes
o Protéines Chk1 et Chk2: interruption du cycle cellulaire lors des transitions
o Protéine P53 suppresseur de tumeur, si phosphorylé → production de p21
o H2A.X: indicateur de cassures double brin de l’ADN
• ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated • ATR: Ataxia Telangiectasia and Rad3-Related protein • Chk: Checkpoint kinase • MDM2: Murine Double Minute 2 • H2A.X: Histone
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
21 Étude toxicologique des PM
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Chk1, Chk2, p53 et p21 :
Arrêt du cycle cellulaire
* *
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*
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* * *
*
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t
Mix
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t*10
48h
Chk1
Chk2
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64
Mix
Pes
t
Mix
Pes
t*10
48h
p53
p21
o Observations pour Chk1, Chk2 et p53:
• Relation dose/réponse
• S2, W2 et Ind effets plus marqués ainsi que leur EO
• Réponse pour le mélange de pesticides
o Observation p21:
• Effet majeur pour les EO et les mélanges de pesticides
o Effet toujours plus marqué à 48h
Arrêt du cycle cellulaire plus marqué pour S2, W2 et leur EO et les mélanges de pesticides
Evaluation du potentiel génotoxique
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
Étude toxicologique des PM
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Evaluation du potentiel génotoxique 22
*
* * *
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0
5
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t
Mix
Pes
t*10
MF
I n
or
ma
lis
ée
pa
r µ
g d
e
pr
oté
ine
s
p53 - 48h o Effet plus marqué à 48h
o Observations:
• Relation dose/réponse
• S2, W2 et Ind effets plus marqués
• EO de S2 et W2: réponse importante
• Réponse pour le mélange de pesticides
Présence de biomarqueurs indiquant l’apoptose pour S2, W2 et leur EO et
les mélanges de pesticides
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
P53 : Apoptose (mort cellulaire programmée)
Étude toxicologique des PM
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Evaluation du potentiel génotoxique 23
* *
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* * *
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16
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Mix
Pes
t*10
MF
I n
or
ma
lis
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pa
r µ
g d
e p
ro
téin
es
H2A.X - 48h
H2A.X indiquant l’atteinte à l’ADN et sa réparation:
o Effet toujours plus marqué à 48h
o Observations:
o Relation dose/réponse
o S2, W2 et Ind effets plus marqués
o Moins de réponse pour les EO
o Réponse pour le mélange de pesticides
Indicateur de dommages à l’ADN (cassures et réparations) pour S2, W2 et
les mélanges de pesticides
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
PLAN
24
• Introduction
• Objectifs
• Matériels et méthodes
• Résultats et discussion
Conclusion générale
• Perspectives
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
25
CONCLUSION GÉNÉRALE
Effet inflammatoire : échantillons printaniers (fraction biologique des particules et ETM ?)
Génotoxicité : effet notable pour échantillons automnaux et Ind et leur EO (64 µg/cm2) : riches en HAP et en pesticides
Effets notables : mélanges pesticides
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
Effets plus marqués après exposition:
• aux PM2.5-0.3 (64 µg/cm2)
• aux extraits organiques (64 µg/cm2 )
• de 48h
PLAN
26
• Introduction
• Objectifs
• Matériels et méthodes
• Résultats et discussion
Perspectives
• Conclusion générale
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
27
PERSPECTIVES
Dosage des ETM
Dopage des échantillons de PM par des pesticides
Dosage de toxines bactériennes et fongiques
et dénombrement/identification des espèces microbiennes
Etude du cycle cellulaire
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
28
REMERCIEMENTS
Merci de votre
attention
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
29
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Étude toxicologique des PM Rôle de Chk1 et Chk2 (rappel)
Chk1 et Chk2 sont des points de contrôle capables :
-d’induire l’arrêt du cycle cellulaire
- d’initier l’entrée de la cellule sur la
voie de l’apoptose
30
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Étude toxicologique des PM Rôle de P53 (rappel)
P53 capable :
- d’induire l’arrêt du cycle cellulaire
- d’initier l’entrée de la cellule sur la voie de l’apoptose si réparation inefficace
31 Étude toxicologique des PM
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Phosphorylation de H2AX (rappel)
DSB
P
γH2AX
Protéines de réparation
γH2AX : réponse précoce aux cassures double-brin de l’ADN (DSB)
Signal majeur pour le recrutement des protéines de réparation de l’ADN dans les régions endommagées
Réparation incomplète ou inefficace
Mort cellulaire par apoptose
(Jeggo et Lobrich 2007 ; McKinnon et Caldecott , 2007)
Mutations ou translocations
chromosomiques
Instabilité génomique
développement du cancer
(Su, 2006)
47ème congrès du GFP, Nancy, 15 au 18 mai 2017