Download - BS. TS. Phạm Hùng Vân (1)
Vai troø vaø yù nghóa cuûa caùc xeùt nghieäm sinh hoïc phaân töû trong chaån ñoaùn vaø theo doõi ñieàu trò beänh vieâm gan sieâu
vi B vaø C BS. TS. Phạm Hùng Vân(1)
(1) Giaûng vieân Boä Moân Vi Sinh, Khoa Y, ÑHYD TP. HCMChuû nhieäm toå Boä Moân Vi Sinh, Khoa ÑDKTYHPhoù phoøng thí nghieäm trung taâm ÑHYDThaønh vieân chính cuûa ANSORP vaø ARFIDCoá vaán khoa hoïc Coâng Ty NAM KHOA
WHO 2001
Nhieãm vieâm gan sieâu vi B (HBV)
Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B
PCR phát hiện HBV-DNA
qPCR định lượng HBV-DNA
qPCR định lượng HBV-DNA
HBsAg [+]
HBVDNA [+]
qHBVDNA
105
ALT
ALT ALT Normal
Biopsieor Fibroscan
AFP
Bất thường
Điều trị
qHBVDNA/3th
LamR, AdfR105
Phát hiện đột biến precore
Phát hiện đột biến kháng thuốc
Schering-Plough
Nhieãm vieâm gan sieâu vi C (HCV)
Nhiễm HCV (100)(Phase cấp)
Mạn tính85% (85)
Xơ gan20% (17)
Ung thư ganXơ gan tiến triển
25% (4.5)
Khỏi
15% (15)
Ổn định80% (68)
Diễn tiến chậm75% (13)
Dieãn tieán nhieãm HCV
Genotype - 1Điều trị 48 tuần
Genotype non-1Điều trị 24 tuần
Định lượngHCV genotype
<2 log10
>2 log10 hay âm tínhHCV-RNA
Cuối điều trịHCV-RNA
Tuần 12Định lượng
Cân nhắc ngưng điều trị
Theo dõi sau 6 thángHCV-RNA
HCV RNA (+)Không đáp ứng
HCV RNA (+)Tái phát
HCV RNA (-)Đáp ứng
(2002 NIH Consensus Conference)
Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C
RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA
Ñònh genotype HCV
RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA
RT-PCR phaùt hieän HCV-RNA
Thực tế đã đòi hỏi các nhà khoa học, đặc biệt là các nhà y học phải nhanh chóng phát triển và ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, nhất là PCR và real-time PCR vào chẩn đoán và hổ trợ cho theo dõi điều trị bệnh nhân viêm gan siêu vi tại Việt Nam
PCR và real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở do vậy chúng ta có khả năng không phải bị lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngoài, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ
Nguyên tắc PCR
1
2
3
4
n
2n
DNA đích
1 Biến tính (94oC )
2 Bắt cặp (55-65o C)
3 Kéo dài (72o C)
5’ 3’
3’ 5’
MồiTaq polymerasedNTPPCR buffer + MgCl2
PCR MIX
DNA đích (Template)
30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min
Phát hiện qua kích thước (điện di) hay qua trình tự (lai)
Ct curve
Standard curve
Melt curve
Real-time PCRchạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại
Laser or UV
Camera
Thiết bị Real-time PCR
PrimersTaq polymerasedNTPPCR buffer + MgCl2
Real-time PCR MIX
Target DNA (Template)
Real-time PCR mix
Chất phát huỳnh quang
Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa hoïc bieåu hieän töø caùc
kieåu gen
Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa ñoaïn gen
Nuoâi caáy
PCR
PCR có đặc hiệu không?
PCR đặc hiệu tương đương nuôi cấy
Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện tác nhân vi sinh vật
Mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử
Tách chiết nucleic acid
Chạy PCR
Phát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả
Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực
Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực
Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực
Xác định Genotype HCV
Phương pháp real-time
Phương pháp InoLIPA
Phương pháp giải trình tự
HCV – cDNA5’NC
Real-time TQ PCR
HCV2 HCV1
HCV3
PCR sequencing
Ethanol precipitation
PCR product# 240bp
Kết hợp định lượng và định genotype HCV (bằng giải trình tự)
Xaùc ñònh genotype HCVso saùnh giaûi trình töï vaø InoLIPA (234
maãu)
Định genotype HCV hữu dụng lâm sàngchỉ có phương pháp giải trình tự 5’-NC
Phaân boá genotype HCVkeát quaû 918 maãu (21/9/2006-
29/12/2007)
1b56.96%
2c0.22%
1c0.76%
2a10.98%
2b1.09%
3a0.22%
4a0.11%
6a21.63%
6h0.22%
6b0.11%
1a7.70%
Phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV
Phương pháp PCR-RFLP
Phương pháp real-time
Phương pháp giải trình tự
PCR product# 550bp
HBV – DNA264F 827R
PCR sequencing
827R
567bp
DTCS (Becman Coulter)
PCR95oC/5min94oC/30sec55oC/30sec72oC/1min72oC/10min
40X
Ethanol precipitation
CEQ 8000
Định genotype HBV và phát hiện đột biến kháng thuốc
Kỹ thuật giải trình tự vùng rt gene (Nam Khoa)
Phát hiện kháng Lamivudine, adefovirgiải trình tựgene PreS
Vừa phát hiện nhiều vị trí đột biến (kể cả heterozygote)
Vừa cho kết quả genotype
Xác định genotype HBV Tìm đột biến kháng thuốc của HBV
BS nên cho chỉ định tìm đột biến kháng thuốc và genotype HBV khi bệnh nhân không đáp ứng điều trị lamuvidine
Kết quả xác định genotype HBVC
31%
B69%
Kết quả genotype của 455 mẫu huyết thanh bệnh nhân HBV-DNA [+]
Tyû leä % ñoät bieán YMDD455 mẫu huyết thanh bn HBV-DNA [+]
29.89
8.796.59
0.45
54.28
0
10
20
30
40
50
60
204 204+207 204+180 204+180+207 Khoâng ÑB
Ñoät bieán YMDD 455 mẫu huyết thanh bn HBV-
DNA [+] Phaân bố theo lượng virus
Promoter1762, 1764
Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen HBV precore dài khoảng 250 bp
A B
Kết quả
• Có 37 mẫu huyết thanh HBeAg (-)• Đột biến precore
• Đột biến promoter
G1896A (+) Heterozygote G1896A (-)
18 5 14
A1762T/G1764A (+)
Heterozygote A1762T/G1764A(-)
18 5 14
Tri thức sẽ chẳng bao giờ đủNếu không đem trãi nghiệm với đời
Ước vọng cũng trở thành vô nghĩaNếu cứ ngồi ôm mộng giữa chơi vơi
“Knowing is not enough, we must applyWilling is not enough, we must do”
Goethe
Phan Kim Ngọc và Phạm Hùng Vân