UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ
FACULTAD DE CIENCIAS MATEMÁTICAS, FÍSICAS
Y QUÍMICAS.
CARRERA DE ING. QUÍMICA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN DE LA CÁTEDRA DE
BIOPROCESOS
AUTORES:
BARREIRO CHERREZ JAIME ANDRES
ZAMBRANO ROMERO CARLOS JAVIER
MENDOZA CARREÑO CARLOS ALBERTO
HUIZA MENENDEZ JHON FERNANDO
CATEDRÁTICO:
Ing. Ulbio Alcívar
FECHA DE ENTREGA:
Portoviejo, 01 de Septiembre del 2015
TEMA: BIOPRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO A PARTIR DE
RESIDUOS DE CÁSCARA DE NARANJA: PROCESOS DE
SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN
1. ANTECEDENTES
Los sistemas productivos actuales tienden a un aprovechamiento lo más completo posible de
las materias primas, ya que se considera que la generación de subproductos no aprovechables
supone una pérdida económica que puede llegar a ser muy importante cuando se trabaja en
sectores como la industria alimentaria donde los márgenes comerciales son muy pequeños,
esta materia prima de bajo costo se utiliza en procesos biotecnológicos para la obtención de
productos químicos finos que se perfila como una opción atractiva para reducir la
dependencia del petróleo y, al mismo tiempo, obtener nuevos compuestos que son económica
o técnicamente inviables de obtener por síntesis química.
En el Ecuador, la provincia que posee mayor producción de naranja es Manabí especialmente
en los cantones Chone y Flavio Alfaro. La producción de la naranja en el país ha aumentado
en los últimos años, de acuerdo a la fuente del Instituto Nacional de Estadísticas y Censos, en
el país se genera un gran volumen de desechos sólidos (cáscara y bagazo), producto de la
obtención de jugo de naranja dulce, siendo deseable su aprovechamiento para la producción
de productos de alto valor agregado y la eliminación de una fuente de contaminación
importante. Actualmente, existen varios estudios encaminados al aprovechamiento de la
fracción sólida de la naranja, como substrato de bio reacción en fase sólida para la producción
a bajo costo de ácidos orgánicos, particularmente ácido L (+) láctico
2. JUSTIFICACIÓN
En la actualidad han aumentado los esfuerzos en la investigación de la producción del ácido
láctico, enfocados a disminuir costos a través de nuevos sustratos, nuevas tecnologías de
fermentación y separación, así como también nuevos microorganismos capaces de alcanzar
altas concentraciones de ácido láctico, altos rendimientos y altas productividades, esto es
debido al uso tan versátil que posee.
El ácido láctico es el hidroxiácido más sencillo que existe. Su molécula contiene un átomo de
carbono asimétrico. Presenta isomería óptica: L(+) o D(-), aunque es más común encontrarlo
como mezcla racémica. Está presente en alimentos como yogurt, suero de leche, panes, queso
y muchos otros alimentos fermentados (Menéndez-González, 1999) y es uno de los
principales intermediarios metabólicos en la mayoría de los organismos vivos, desde
procariotas anaerobios hasta humanos. El ácido láctico es ampliamente utilizado en las
industrias alimentaria, médica, farmacéutica y cosmética, como materia prima para síntesis
orgánica, como purgante en forma de lactato de calcio o lactato de magnesio, como
removedor de sales de calcio, en el curtido de pieles, en la producción de plásticos
biodegradables, agroquímicos, etc. En soluciones acuosas, el ácido láctico no ionizado existe
en equilibrio con los aniones lactato y los iones hidrógeno (Kulprathipanja y Oroskar, 1991).
Es fuertemente higroscópico y la presencia de dos grupos funcionales en su estructura (-OH, -
COOH) lo hace formar, espontáneamente, dímeros y polímeros de ácido láctico (Bello-Gil,
2007). Es soluble en éter, miscible con agua y alcohol e insoluble en cloroformo, éter del
petróleo y disulfuro de carbono. Sus dos grupos funcionales permiten llevar a cabo diferentes
reacciones químicas de oxidación, reducción, condensación y substitución del grupo alcohol
(Vaidya y col., 2005). En cuanto a las reacciones de condensación, las más importantes, por
los altos rendimientos de producto, son: Esterificación, deshidratación y aminólisis
(KirkOthmer, 2001). El ácido láctico puede producirse por biotransformación (biorreacción) o
síntesis química. Normalmente, la síntesis química requiere de caros y complejos
procedimientos de obtención y separación para lograr la pureza deseada del producto final, así
como costos significativos asociados con la disposición de los desechos (Yin y col., 1997). La
producción de ácido láctico se ha incrementado en épocas recientes, llegando a alcanzar en el
año 2002 una producción mundial de 100,000 ton/año en los sectores farmacéutico, cosmético
y químico (Purac, 2002).
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
• Desarrollar experimentalmente un proceso de obtención de ácido L (+) láctico por
medio de la biotransformación utilizando el microorganismo (Rhizopus spp.) en
medio sólido a partir de residuos de naranja
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudiar los distintos métodos de remoción de color e impurezas en el efluente,
tomando en cuenta el grado de perdida de ácido láctico que provocan.
Evaluar procesos de separación solido-liquido determinando cual es el método más
efectivo para la recuperación de la fas liquida del producto de la bioreaccion.
Calificar el proceso de producción de ácido láctico, a partir de la
fermentación de residuos de naranja por (Rhizopus spp.), a través de cinéticas de
producción de biomasa y ácido láctico, y de consumo de sustrato para demostrar que
el proceso es técnicamente viable.
4. HIPÓTESIS
H1: Existen microorganismo (Rhizopus spp.) capaces de producir acido L (+) láctico a partir de
residuo de naranja
H0: No existen microorganismo en medio solido productores de ácido L (+) láctico
5. VARIABLES
Variables Independientes
Variables Dependientes Temperatura
Cinética microbiana
PH
Producción de ácido láctico
Producción de biomasa
6. REVISIÓN DE LITERATURA
ÁCIDO LÁCTICO
Generalidades
El ácido láctico o ácido 2-hidroxipropanoico (CH3CHOHCOOH), fue aislado e identificado por
el químico Scheele en 1780 de leche agria, en 1847 fue reconocido como producto de fermentación
por Blondeaur, sin embargo no fue hasta 1881 que Littlelon inicio la producción por fermentación a
escala mundial (Altiok et al., 2006, Serna y Rodríguez, 2005).
Molécula de ácido láctico vista desde diferente perspectiva
El ácido láctico tiene un carbono asimétrico (Figura 1) lo cual da lugar a actividad óptica. Existen dos
isómeros ópticos, el D(-) ácido láctico y L(+) ácido láctico, además de una forma racémica
constituida por fracciones equimolares de las formas L(+) y D(-). A diferencia del isómero D(-), la
configuración L(+) es metabolizada por el organismo humano (Altiok, 2004). Tanto las dos formas
ópticamente activas como la forma racémica se encuentran en estado líquido, siendo incoloros y
solubles en agua. En estado puro son sólidos altamente higroscópicos de punto de fusión bajo, el cual
es difícil de determinar debido a la extrema dificultad de producir el ácido de forma anhidra; es por
esta razón que se manejan rangos de 18- 33°C. El punto de ebullición del producto anhidro esta
entre 125-140°C. Ambas formas isoméricas del ácido láctico pueden ser polimerizadas y se pueden
producir polímeros con diferentes propiedades dependiendo de la composición. Las propiedades
fisicoquímicas del ácido láctico se muestran en la Tabla 1 (Serna y Rodríguez, 2005).
Aplicaciones
Actualmente la demanda mundial de ácido láctico está en aumento, debido a sus
múltiples aplicaciones en el campo alimentario y no alimentario, en especial en la fabricación
de biopolímeros (Cui et al., 2012). Esto se debe en gran medida por la propiedad única de
tener presente en su estructura un grupo ácido carboxílico y un hidroxilo, lo cual hace
posible su participación en una ampliavariedad de reacciones químicas como
esterificación, condensación, polimerzación, reducción y sustitución, y esto contribuye a su
gran potencial como plataforma química para una amplia gama de productos con extensas
aplicaciones industriales (Altiok 2004; Pal et al., 2009).
El ácido láctico se utiliza en muchos alimentos; en su mayoría es empleado para la
producción de emulsificantes, aditivos alimentarios, aplicaciones farmacéuticas y de
cosméticos. Es un ácido orgánico muy importante con un gran mercado debido a sus
múltiples propiedades (Altiok et al., 2006). Por ejemplo, el ácido láctico y sus sales son
preferidos a otros ácidos orgánicos en la industria de alimentos ya que no dominan otros
sabores, es no volátil, no tiene olor y es clasificado como GRAS por la FDA en Estados
Unidos y por otras agencias reguladoras en otros países, algunos de sus usos es como
conservador, acidulante y potenciador de sabor en muchos alimentos o bebidas (ej., cerveza,
gelatina, quesos, entre otros) (John et al., 2007). Por otra parte, la posibilidad de la conversión
directa de ácido láctico a ácido acrílico, lo ha convertido en una importante materia prima
para la industria química (Alonso et al., 2010).
Recientemente la producción de plásticos biodegradables a partir de ácido láctico ha
acelerado la investigación sobre su producción como materia prima a granel (Altiok et
al., 2006). Algunos ejemplos de productos derivados del ácido láctico que han tenido una
gran demanda en los últimos años, son: termoplásticos biodegradables (ej., ácido poliláctico),
solventes verdes (ej., etil, propil, butil) y químicos oxigenados (ej., glicol de propileno) (Pal
et al., 2009; Young-Jung y Ryu, 2009).
Producción mundial
La producción mundial de ácido láctico en 2011 fue mayor a 300 000 toneladas y se estima
un incremento promedio del 10% anualmente (Higson, 2011). En la última década,
la producción de ácido láctico ha crecidoconsiderablemente, debido principalmente al
desarrollo de nuevas aplicaciones del ácido láctico, como la síntesis de ácido poliláctico y al
avance de tecnologías para su producción, donde el 90% de la producción se lleva a cabo
mediante procesos de fermentación (Cui et al., 2012).
Las principales empresas manufactureras de ácido láctico en el mundo incluyen a CCA
Biochemical BV con plantas en Europa, Brasil y Estados Unidos, Archer Daniels Midland
(ADM) y NatureWorks LLc en Estados Unidos, Musahino Chemical en Japón, Purac en
Holanda, Galactic en Bélgica, entre otras. Las cuales emplean vías tecnológicas para la
producción de ácido láctico (Datta y Henry, 2006; John et al., 2007).
Procesos de producción
El ácido láctico puede ser producido por síntesis química o biotecnológica. La producción
química, está basada en la reacción de acetaldehído con ácido cianhídrico (HCN) lo cual
produce un lactonitrilo que puede ser hidrolizado a ácido láctico (Amrane y Prigent, 1994).
Otro tipo de reacción se basa en la reacción a alta presión de acetaldehído con monóxido de
carbono y agua en presencia de ácido sulfúrico como catalizador (González et al., 2008). Este
proceso es costoso debido a que el petróleo es la base de la materia prima. Además que, las
rutas de la síntesis química producen una mezcla de L-ácido láctico y D-ácido láctico. Los
problemas de alto costo de materia prima así como la dependencia de otras industrias para su
obtención aunado a la impureza del producto, hacen de los procesos basados en
fermentaciones la mejor opción para producir ácido láctico (Narayanan et al., 2004; Fontes et
al., 2010).
La producción biotecnológica está basada en procesos de fermentación de sustratos ricos
en carbohidratos por bacterias u hongos, y tiene la ventaja de formar enantiómeros D(-) y/o
L(+), ópticamente activos, o una mezcla racémica, dependiendo del microorganismo
involucrado en el proceso, la inmovilización o recirculación del microorganismo, el pH, la
temperatura, la fuente de carbono y nitrógeno, el modo de fermentación empleado y la
formación de subproductos, siendo de mayor interés el isómero (L) porque puede ser
asimilado por el organismo y la mezcla racémica, la cual se emplea para la elaboración de
polímeros y para uso industrial (Hofvendahl y Hanh, 2000; Litchfield, 2009).
Ambos métodos para la producción de ácido láctico, químico y biotecnológico, son
asequibles, sin embargo la producción biotecnológica ofrece un gran número de ventajas
comparada con la síntesis química como el bajo costo de sustratos, temperaturas de operación
moderadas, y bajo consumo de energía (John et al., 2007). Por otra parte, la producción de
ácido láctico por procesos de fermentación ha incrementado su demanda de mercado,
particularmente en industrias alimentarias, dado a la preferencia de productos de origen
natural por parte de los consumidores, así como también en la industria de polímeros, debido
a las perspectivas de respeto al medio ambiente y por el uso de fuentes renovables en
lugar de petroquímicos (John et al., 2007).
Recientemente se ha investigado la aplicación de diferentes microorganismos en los
procesos de fermentación, así como mezclas de éstos con el objetivo de alcanzar altas
concentraciones de ácido láctico, altos rendimientos y altas productividades en un menor
tiempo. Los microorganismos mayormente investigados se encuentran dentro del grupo de las
bacterias ácido lácticas (BAL) como el Lactobacillus helveticus y más recientemente el
Lactobacillus casei (John et al., 2007).
RHIZOPUS SPP
Rhizopus es un género de mohos que incluyen especies cosmopolitas de hongos filamentosos hallados en
el suelo, degradando frutos y vegetales, heces animales, y residuos.
Diagrama equemático de Rhizopus spp
Las especies de Rhizopus producen esporas asexuales y sexuales.
Las esporangiosporas asexuales se producen dentro de una estructura aguzada, el
esporangium, y son genéticamente idénticas a su padre. En Rhizopus, el esporangio es
soportado por una gran columela apofisada, y el esporangióforo asoma entre rizpodes
distintivos. Zigosporas negras se producen después de dos fusiones compatibles
de micelios durante la reproducción sexual. Y hacen colonias que pueden ser genéticamente
diferentes de sus padres.
Algunas spp. de Rizopus son agentes oportunistas de zigomicosishumana. Pueden causar
serias (y con frecuencia mortales) infecciones en humanos y en animales debido a su rápido
crecimiento a relativamente altas temperaturas. Algunas especies son patógenos vegetales.
Dos son usados en fermentación:Rhizopus oligosporus, en la producción de tempeh, un
alimento fermentado derivado de grano de soja; R. oryzae se usa en la producción de bebidas
alcohólicas, en partes de Asia y de África. Hongo filamentoso que presenta esporangióforos
sin ramificar (de hasta 2 mm x 20 µm), de color pardo oscuro que nacen de un gran nudo de
rizoides bien desarrollados. Esporangios esféricos negros (de hasta 275 µm de diámetro) con
columela. Esporangiosporas negras de 8 a 15 µm. Abundantes rizoides y zigosporas esféricas
de pared gruesa, desnuda (de hasta 200 µm de diámetro). Clamidosporas ausentes.
7. DISEÑO METODOLÓGICO
7.1. MÉTODO
La metodología de investigación que se va a aplicar tiene un enfoque de tipo cualitativo, el
cual usa la recolección de datos.
7.2. TÉCNICA
Las diferentes técnicas de ensayo de laboratorio se conoció de la metodología descrita en la
literatura (Gil-Horán, 2007; Pacho-Carrillo y Domínguez-Espinosa, 2005).
7.3. TÉCNICAS DE ANÁLISIS
Las técnicas a ser utilizadas se resumen a continuación con un breve procedimiento y fórmulas
a utilizar.
7.4. MATERIALES Y MÉTODOS
La cepa utilizada fue Rhizopus oryzae, que ha sido usada para producir ácido láctico.
Se utilizó la fermentación en estado sólido) de cáscara y bagazo de naranja con Rhizopus
orizae para la producción de ácido láctico, se llevó a cabo en un birreactor de 500ml
siguiendo la metodología descrita en la literatura (Gil-Horán, 2007; Pacho-Carrillo y
Domínguez-Espinosa, 2005). Lotes de 400 g de harina de naranja fueron adicionados con
(NH4)2SO4 como fuente de nitrógeno y CaCO3 como regulador de pH para ajustar el pH
inicial a 5
Los residuos sólidos de naranja que fueron obtenidos del mercado número 1 de Portoviejo
fueron cortados y los dejamos secar hasta alcanzar una humedad de 12% (base seca). Y
cortadas en pequeñas partículas
Los residuos de naranja fueron colocados dentro del birreactor junto con la solución de espora
durante un periodo de 8 días a 37ºC
Para la extracción del ácido de la materia sólida se lo hizo por prensado mecánico,
posteriormente se utilizó operaciones de intercambio iónico (zeolita catiónica ácida y/o
carbón activado) como pasos intermedios para la reducción de impurezas.
Luego de la biorreacción, se obtuvo ácido láctico en forma de lactato con un pH 3.4 y Así
mismo, el producto sólido obtenido presentó un exceso de azúcares no consumidos por el
Rhizopus oryzae.
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Luego de la biorreacción, se obtuvo ácido láctico en forma de lactato de calcio. El
producto obtenido presentó un pH de 3.4 con alto grado de hidrólisis. El rendimiento
másico obtenido de ácido láctico en la biotransformación fue de 8.2 mg/g equivalente al
0.82%.
La duración de la biorreacción de 192h puede ser extendida para lograr una mayor hidrólisis
del material biotransformable; sin embargo, para el propósito de esta investigación, que no
era el de optimizar esta fase del proceso, el tiempo de biorreacción definido fue adecuado
para producir cantidades adecuadas del producto. Naturalmente, se tuvo la desventaja de la
presencia de los productos no deseados de la hidrólisis del material biotransformable como
azúcares, proteínas, ácidos orgánicos secundarios, cationes Ca+2 y NH +1 y aniones CO3-2
y SO4 así mismo el producto solido obtenido presentó un exceso de azúcares no consumidos
por el Rhizopus oryzae (13,722.95 ppm p/v), el cual también debe tomarse en cuenta para
una segunda etapa de optimización de la biotransformación a nivel de laboratorio.
En las pruebas de separación sólido-líquido resultó que el mejor método para la recuperación
de la fase líquida del producto de biorreacción fue el prensado mecánico. Adicionalmente, se
obtuvo que la máxima cantidad de agua que puede ser utilizada para la homogeneización del
producto sólido para la posterior recuperación de la fase líquida es de 8 mL por cada gramo de
sólido en base seca obteniendo así una recuperación máxima en el prensado mecánico del 85%
del ácido láctico producido en la biotransformación.
PRENSADO MECANICO
CENTRIFUGACION FILTRACION0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
%DE
REC
UPER
ACIO
N DE
ACI
DO LA
CTIC
O
OPERACION PRINCIPALES IMPUREZAS
RETENIDAS
ACIDO LACTICO
% DE PERDIDA
CARBON ACTIVADO Azúcares, ésteres, proteínas,
Ca+2, color, ácidos orgánicos
secundarios
33.12
ZEOLITA CATIONICA NH+1 y Ca+2, proteínas, ácidos
orgánicos
58.16
CA + ZC Todas las anteriores 62.66
( Tecnol. Ciencia Ed. (IMIQ) vol. 23 núm. 2,, 2008)
9. CONCLUSIONES
Se desarrolló experimentalmente un proceso de obtención de ácido L(+) láctico por medio
de la biotransformación en medio sólido de residuos de naranja. En este proceso la
biotransformación y la secuencia de separación juegan papeles muy importantes en el diseño. El
prensado mecánico resultó ser la mejor operación de separación sólido-líquido, utilizada en
conjunto con una relación de homogeneizado de 8:1 agua-sólido en base seca para la extracción
del ácido láctico hacia la fase líquida. Así mismo, en base a la literatura de Ricardo
Heliodoro Gil-Horán, Rosa María Domínguez-EspinoSA , Juan Daniel Pacho-Carrillo se
mostró que es indispensable el uso de carbón activado como método de remoción de color e
impurezas en el efluente. Por otro lado, aunque la zeolita catiónica demostró ser adecuada para la
remoción de impurezas, no se recomienda su uso debido al alto grado de pérdida de ácido láctico
que provoca.
El diseño de fermentación y separación propuesto permitió obtener como producto final
lactato de calcio que al pasar por esterificación debe cumplir los estándares para ácido
láctico grado alimenticio, demostrándose que el proceso es técnicamente viable.
10.RECOMENDACIONES
Se recomienda llevar a cabo estudios más detallados encaminados a obtener mejores
condiciones de biorreacción que lleven al Rhizopus oryzae a consumir los azúcares degradados
durante la hidrólisis de la cáscara de naranja, y que, al mismo tiempo, permitan ofrecer un mayor
rendimiento de producción de ácido láctico durante su desarrollo. Asimismo, la optimización global
del proceso debe LLEVARSE A CABO EN PARTICULAR atendiendo al entorno económico
actual que ofrece incentivos económicos claros para el establecimiento de biorrefinerías.
11.BIBLIOGRAFIA
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MK-96-1196 in airlift bioreactors. J. Biosci. Bioeng. Pacho-Carrillo, J., Domínguez-Espinosa, R. 2005. Towards circular economy: Utilization
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Zacchi, G., Akerberg, C. 2000. An economic evaluation of the fermentative production of lactic acid from wheat flour. Biores. Technol.
Lactic acid bioproduction from orange rind:Separation and purification processesRicardo Heliodoro Gil-Horán, Rosa María Domínguez-Espinosa, Juan Daniel Pacho-Carrillo