UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
BIANCA MOREIRA KURITA
ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDO ZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO
DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS
FORTALEZA 2017
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
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K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
CDD 615.1
BIANCA MOREIRA KURITA
ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDO ZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO
DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Vilma de Lima.
FORTALEZA 2017
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K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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K1a Kurita, Bianca Moreira.
Atividades anti-inflamatória e antirreabsortiva ósseas do Ácido Zoledrônico durante a
movimentação dentária induzida em ratos / Bianca Moreira Kurita. – 2017.
109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017.
Orientação: Profa. Dra. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.
Osteoclastos. 5. Osteoblastos.. I. Título.
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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BIANCA MOREIRA KURITA
ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDO ZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO
DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Vilma de Lima.
Aprovado em ___/___/_____
COMISSÃO EXAMINADORA
_______________________________________________ Profª. Drª. Vilma Lima (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
________________________________________________ Prof. Drª. Cristiane Sá Roriz Fonteles
Universidade Federal do Ceará – UFC
_____________________________________________
Prof. Drª. Ana Maria Sampaio Assreuy Universidade Estadual do Ceará - UECE
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1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Drª. Vilma Lima, por todos os ensinamentos e
incentivos os quais se fizeram imprescindíveis em minha vida acadêmica e
profissional.
Às professoras doutoras Cristiane Sá Roriz Fonteles e Ana Maria
Sampaio Assreuy participantes da banca avaliadora desta dissertação, pelas
considerações fundamentais para o aprimoramento deste trabalho.
Aos professores doutores Thyciana Ribeiro Rodrigues, Nylane Maria
Nunes de Alencar e Roberto César Pereira Lima Júnior, pelas correções pertinentes
por ocasião do exame de qualificação de mestrado.
Ao professor Ronaldo de Albuquerque Ribeiro (in memorian), que deixou
em nós a saudade, mas merece agradecimentos sinceros pelos ensinamentos
repassados, os quais nunca serão esquecidos. Será sempre lembrado pela pessoa
íntegra e ética que sempre foi.
Ao coordenador do programa de pós-graduação em Farmacologia,
professor doutor Pedro Jorge Caldas Magalhães pelo trabalho sólido que vem
desenvolvendo à frente deste cargo.
Aos professores do programa de pós-graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina (UFC), pelos
conhecimentos compartilhados durante as disciplinas cursadas.
À professora doutora Deysi Viviana Tenazoa Wong, pela disponibilidade e
auxílio durante as dosagens de citocinas. Agradeço também pela amizade e
palavras de otimismo.
À doutoranda Iracema Matos de Melo, pelo companheirismo durante
todos os passos deste trabalho.
Aos pós-graduandos e colegas de laboratório Rafael Reis Ribeiro e José
Carlos Ribeiro, pela cordialidade e apoio durante os experimentos.
Às alunas de iniciação científica Marina Fiúza Sarte, Tereza Cristina
Marques Forte e Lorena Araújo Silva, por toda a dedicação e ajuda.
À minha turma de pós-graduação, por terem me proporcionado momentos
de alegria e me concedido a oportunidade de construir amizades novas e sinceras.
Aos funcionários técnicos e administrativos da Universidade Federal do
Ceará Adalberto Nascimento de Lima Júnior, Laura Alves de Sousa, Célia Araújo de
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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Carvalho, Alana Carvalho Bezerra Viana, Naiara Felipe Alves, Adaulto Rodrigues de
Sousa e Gabriela Mariângela Faria de Oliveira pelo suporte concedido durante esses
dois anos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), pelo apoio científico e suporte financeiro.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Deus, que em sua infinita bondade, nunca me desamparou, mesmo nos
momentos em que duvidei, sua força e amor me levantaram e me encorajaram a
estar aonde estou. Sei que continuará a andar ao meu lado pelo restante de minha
trajetória.
Aos meu pais, Evandro e Cecy Moreira, que com muito amor me criaram
e por nenhum minuto descuidaram do meu futuro. Tudo que fiz e farei não será o
suficiente para agradecer por todo o suporte que me deram. Para vocês, meu maior
amor e gratidão.
Ao meu marido, Lucio Kurita, que me incentivou a perseguir meus
objetivos. Seu amor, companheirismo diário e palavras de ânimo me ajudaram a
prosseguir e ultrapassar todos os obstáculos.
Aos meus irmãos, Arianne e Nacip, que mesmo de longe, sei que torcem
por mim assim como torço por eles.
Aos meus amigos Ana Larissa Lima, Marco Antônio Ribeiro, Elysderble
Nogueira, Juliana Oliveira, Edyr Freitas, Flávia Jucá, Thales Dantas e Felipe
Ramirez, pela amizade dedicada a mim e por estarem sempre presentes nos
momentos de tristeza e alegria.
À orientadora e amiga, professora Vilma, com quem construí uma relação
que vai além do laboratório. Uma amiga sincera, que sempre me incentivou e
reconheceu meus esforços.
Às amigas, Iracema Melo, Vilana Araújo, Marina Fiuza e Tereza Cristina
Marques, que me acompanharam durante o mestrado e com quem eu pude
compartilhar meus anseios, dúvidas e experiências. Obrigada pelas conversas
animadas que tivemos e pela amizade que perdurará.
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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RESUMO
A movimentação dentária induzida (MDI) combina respostas de reabsorção e neoformação ósseas, que dependem da atividade de mediadores químicos da inflamação, culminando em remodelação óssea. Tal observação tem incentivado a avaliação do efeito do ácido zoledrônico (ZOL), um bisfosfonato que inibe a atividade osteoclástica, sendo amplamente utilizado para tratamento de desordens metabólicas ósseas, como a osteoporose e metástases ósseas. Contudo a literatura não tem abordado a participação de citocinas pró-inflamatórias e a modulação do eixo RANKL-OPG durante a MDI e tratamento com ZOL. Diante, disso, avaliou-se o efeito do ZOL na remodelação óssea da MDI. A MDI foi realizada em 72 ratos Wistar anestesiados pela instalação e ativação de uma mola fechada de níquel-titânio com 50 gf, fixada ao 1° molar superior esquerdo e aos incisivos superiores. Os mesmos receberam H2O destilada, sendo considerados animais não tratados (NT - 1 ml/kg-i.v.) ou ZOL (50, 100 e 200 µg/kg-i.v.), 5 min antes da inserção do dispositivo, e no 7º dia. No dia zero, foram coletadas amostras sanguíneas para avaliação do leucograma (mm3 de sangue) e dosagem de fosfatase alcalina óssea (FAO: U/I) e mensurados os espaços entre os dentes. No 11º dia, as coletas e as mensurações foram repetidas e as gengivas e hemiarcadas removidas para as avaliações da atividade da mieloperoxidase (MPO: x 103 mg de gengiva) e dos níveis de TNF-α e IL-1β (pg/mg de gengiva), análise histomorfométrica das áreas de compressão, tração e hialinas do ligamento periodontal (LP), análise histológica por escores (0 a 3) das reabsorções radicular (RR) e óssea (RO) e análise imunohistoquímica para RANKL, OPG, TRAP e TNF-α. Os animais foram pesados diariamente durante todo o período experimental, sendo os valores encontrados, relacionados à massa do dia zero; Comissão de Ética no Uso de Animais-UFC nº 28/15. O grupo NT apresentou aumento do deslocamento dentário, escores altos para as RR e RO, aumento da atividade de MPO e dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β, maior imunomarcação para RANKL, TRAP e TNF-α no lado de compressão do LP e para RANKL e OPG no lado de tração, resultando em aumento da razão RANKL/OPG no lado de compressão (p<0,05). Não apresentaram alterações nos níveis séricos de FAO, leucograma e na análise histomorfométrica (p>0,05), mas perderam peso inicialmente, alcançado os valores basais ao 7º dia. O tratamento com ZOL nas três doses reduziu o movimento dentário de forma dose-dependente, bem como reduziuos escores de RR e RO e a atividade de MPO (p<0,05). No entanto, a maior dose de ZOL (200 µg/kg) não alterou os níveis gengivais de TNF-α e IL-1β (p>0,05). Nessa mesma dose, o ZOL reduziu a imunomarcação para TRAP no lado de compressão, OPG no lado de tração e RANKL e TNF-α em ambos os lados, resultando em decréscimo na razão RANKL/OPG nas duas regiões avaliadas (p<0,05). Ademais, o tratamento com o ZOL não induziu alterações do leucograma e não promoveu perda de peso significante em relação aos animais não tratados (p>0,05). Em suma, o ZOL reduziu a MDI por meio da inibição de biomarcadores ósseos essenciais à diferenciação e atividade osteoclástica e redução do anabolismo ósseo. Palavras-chave: Movimentação Dentária. Ácido Zoledrônico. Remodelação Óssea. Osteoclastos. Osteoblastos.
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1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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ABSTRACT
BONE ANTI-INFLAMMATORY AND ANTIRREABSORTIVE ACTIVITIES OF ZOLEDRONIC ACID DURING INDUCED TOOTH MOOVEMENT IN RATS
The induced tooth movement (ITM) combines bone resorption and neoformation that depends on chemical mediators of inflammation, thus culminating in bone remodeling. This observation has encouraged the evaluation of the effect of zoledronic acid (ZOL), a bisphosphonate that inhibits osteoclastic activity, being widely used for treating bone metabolic disorders, such as osteoporosis and bone metastasis. However, literature has not addresses the participations of proinflammatory cytokines on RANKL-OPG axis modulation during MDI and ZOL treatment. On this, we evaluated the effect of ZOL on bone remodeling of ITM. ITM was performed in 72 anesthetized Wistar rats by the installation and activation of a nickel-titanium coil-spring, with 50 gf, fixed on upper left 1st molar and upper incisors. The same received distilled water, being considered as non-treated group (NT - 1 ml/kg-i.v.) or ZOL (50, 100 e 200 µg/kg-iv), 5 minutes before the dispositive insertion, and on 7th day. On day zero, blood samples were collected for leukogram assay (mm3) and bone alkaline phosphatase dosage (BALP: U/I), and the space between the teeth were measured. On the 11th day, the collects and measures were repeated and the gingivas and hemimaxillas were removed for myeloperoxidase activity dosage (MPO: 103 mg of tissue) and TNF-α e IL-1β gingival levels analysis (pg/mg of tissue), histomorphometric analysis of periodontal ligament areas of compression, traction and hyalines, histological evaluation by scores (0 to 3) of root and bone resorptions and immunohistochemical staining for RANKL, OPG, TRAP, TNF-α e IL-1β. The animals were weighted daily during the all-experimental period, and then, were related to basal values; Ethics Committee on the Use of Animals-UFC nº 28/15. The NT group, had an increase of tooth movement, high scores of root and bone resorption, increased activity of MPO and high gingival levels of TNF-α e IL-1β, intense immunostaining for RANKL, TRAP e TNF-α on the compression side and for RANKL and OPG on the traction side of periodontal ligament, resulting on increased RANKL/OPG ratio on compression side (p<0.05). Still, they do not presented changes in serum levels of BALP, in total and differential leukogram assay and histomorphometric analysis (p>0.05), but they lost weight initially, being the initial weight, recovered from the 7th day. ZOL treatment in three doses used reduced tooth movement in a dose-dependent manner, as well as resulted in low scores of root and bone resorption and reduction of MPO activity. However, ZOL in the high dose (200 µg/kg) did not change TNF-α e IL-1β gingival levels (p>0.05). Still, this dose reduced the immunostaining of TRAP on compression side, OPG on traction side and RANKL and TNF-α on both sides, resulting on a decrease of RANKL/OPG ratio on both regions analyzed (p<0.05). In addition, ZOL treatment did not induce changes on leukogram values and body mass variation in comparison to the animals that received dH2O (p>0.05). In short, ZOL reduced the ITM by decreasing bone biomarkers essential for osteoclastic differentiation and activity and reducing bone anabolism. Keywords: Tooth movement. Zoledronic Acid. Bone remodeling. Osteoclasts. Osteoblasts.
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K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.
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1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Vias de indução da transcrição gênica de fatores que estimulam a osteoclastogênese 19
Figura 2 Ligação do osteoclasto maduro à matriz óssea 20 Figura 3 Vias de indução da transcrição gênica de fatores que estimulam a
osteoblastogênese 21 Figura 4 Resposta inflamatória após aplicação de uma força 25 Figura 5 Desenhos esquemáticos dos processos de reabsorção óssea alveolar no lado de
compressão e neoformação óssea alveolar no lado de tração 28 Figura 6 Estrutura química de um bisfosfonato, destacando-se a ligação P-C-P. Os ligantes
R1 e R2 podem variar de acordo com cada tipo de fármaco 33 Figura 7 Fórmulas moleculares de um bisfosfonato não-nitrogenado, como exemplo, o
Clodronato, e de bisfosfonatos nitrogenados, como o Alendronato de Sódio e Ácido Zoledrônico. 34
Figura 8 Mecanismo de ação dos N-BFs 36 Figura 9 Estrutura química do Ácido Zoledrônico 38 Figura 10 Representação esquemática do modelo de MDI por mola fechada Ni-Ti e
administração de ZOL 46 Figura 11 Fotografia ilustrativa do modelo de movimentação dentária induzida 47 Figura 12 Fotomicrografia das raízes do primeiro molar superior esquerdo do rato 50 Figura 13 Fotomicrografias ilustrando os delineamentos para quantificação das áreas de
compressão e tração do ligamento periodontal 52 Figura 14 Fotomicrografia com delineamento para a quantificação das áreas hialinas do
ligamento periodontal 53 Figura 15 Fotomicrografia com delineamento para as análises histológicas de reabsorções
radiculares e ósseas 54 Figura 16 Movimentação dentária induzida (MDI) durante 11 dias por mola fechada de Ni-Ti
com 50 gf 58 Figura 17 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea em animais submetidos à MDI por
mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 59 Figura 18 Análise histomorfométrica dos sítios de compressão (A) e de tração (B) e áreas
hialinas do ligamento periodontal pós 11 dias de MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 61
Figura 19 Fotomicrografias dos cortes transversais das raízes distovestibulares 62 Figura 20 Atividade da mieloperoxidase no tecido gengival de hemiarcadas controles e
submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 63 Figura 21 Níveis de TNF-α e IL-1β no tecido gengival de hemiarcadas controles e
submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 64 Figura 22 Contagens das imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP 66 Figura 23 Imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP no lado de compressão de
hemiarcadas controles e submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 67 Figura 24 Imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP no lado de tração de
hemiarcadas controles e submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 68 Figura 25 Leucograma de animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 69 Figura 26 Efeito do Ácido Zoledrônico (ZOL) na variação da massa por 11 dias em animais
submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 70 Figura 27 Modelo hipotético do efeito do ZOL na remodelação óssea da MDI 81
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LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 Escores referentes à extensão de reabsorções radiculares (RR) e ósseas
(RO) nos lados de compressão 53
Tabela 1 Efeito do ácido zoledrônico nas reabsorções radiculares e ósseas após 11
dias de MDI 60
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABC Complexo avidina-biotina-peroxidase
ADP Adenosida disfosfato
AMPc Adenosida monofosfato cíclica
ANOVA Análise de Variância
ATP Adenosina trifosfato
AP Proteína Ativadora
AppCCl2p Adenosina-5’-beta-gamma-diclorometileno-trifosfato
Apppi Éster do ácido trifosfórico 1-adenosina-5-3-[3-metilbut-3-enil]
BSA Albumina sérica bovina
BFs Bisfosfonatos
BMP Proteína morfogenética óssea
c Cemento
C Controle
CCL Quimiocina motivo (C-C) ligante
CMO Conteúdo mineral ósseo
CMOs Células da medula óssea
CXCL Quimiocina motivo (C-X-C) ligante
C-fms Receptor para o fator estimulador de colônias
C-Jun Proteína codificada pelo gene Jun
d Dentina
DKK Dickkopf
DL Raiz distolingual
DV Raiz distovestibular
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática
EphB Receptor de efrina B
FAO Fosfatase alcalina óssea
FCG Fluido crevicular gengival
FGF Fator de crescimento fibroblástico
FPP Farnesil pirofosfato
FPPS Farnesil pirofosfato sintetase
Gf Gramas força
Gp Glicoproteína
GGPP Geranil-geranil pirofosfato
GGPPS Geranil-geranil pirofosfato sintetase
G-MCSF Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos
H2Od Água destilada
H-TAB Hexadecil-trimetil-brometo de amônio
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ICAM Proteína de adesão intercelular
IFN Interferon
IGF Fator de crescimento insulínico
IL Interleucina
INT Raiz intermediária
IPP Isopentenil pirofosfato
IV Intravenosa
JAK Janus quinase
K7M3 Células de osteosarcoma murinho
lp Ligamento periodontal
LPR Receptor de lipoproteína
LPS Lipopolissacarídeo
M Raiz mesial
MAPK Proteíno-quinases ativadas por mitógenos
MDI Movimentação dentária induzida
ML Raiz mesio-lingual
MPO Mieloperoxidase
mRNA RNA mensageiro
NaCl Cloreto de sódio
NAFTc Fator nuclear de células T ativadas
NaPO4 Fosfato de sódio
NF-κB Fator nuclear κ-B
Ni-Ti Níquel-Titânio
NO Óxido nítrico
NT Não tratado
NT-x Telopeptídio N-terminal
N-BFs Bisfosfonatos nitrogenados
oa Osso alveolar
OCN Osteocalcina
ONMB Osteonecrose dos maxilares induzida por bisfosfonatos
OPD O-fenilenodiamina
OPG Osteoprotegerina
OSF Fator estimulante de osteoblastos
OSM Oncostatina M
OSX Osterix
p Polpa
PBS Tampão fosfato-salino
PG Prostaglandina
pH Potencial hidrogêniônico
PTH Hormônio da paratireoide
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qPCR Reação em cadeira de polimerase em tempo real
RANK Receptor ativador do fator nuclear-κB
RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear-κB
RAW 264.7 Células de linhagem macrofágica murina
RFA Reação de fase aguda
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
RO Reabsorção óssea
RR Reabsorção radicular
RT-PCR Transcriptase reversa- reação em cadeia de polimerase
RUNX Fator de transcrição relacionado a RUNT
SMAD Proteína SMAD
SP Substância P
STAT Transdutor de sinal e ativador da transcrição
TGF Fator transformador do crescimento
TLR Receptor Toll-like
TNF Fator de necrose tumoral
TRAF Receptor associado ao TNF
TRAP Fosfatase ácida tartarato-resistente
UFC Universidade Federal do Ceará
V-CAM Proteína vascular de adesão celular
VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular
VO Volume ósseo
VT Volume de tecido
ZOL Ácido Zoledrônico
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K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 16 2. REVISÃO DE LITERATURA 18 2.1 Remodelação óssea 18 2.2 Movimentação dentária e inflamação 23 2.3 Estudos da movimentação dentária induzida (MDI) 29 2.4 Bisfosfonatos 32 2.5 Ácido Zoledrônico 38 3. JUSTIFICATIVA 42 4. OBJETIVOS 43 4.1 Geral 43 4.2 Específicos 43 5. METODOLOGIA 44 5.1 Seleção de animais 44 5.2 Fármacos, reagentes e anticorpos 44 5.3 Protocolo experimental 45 5.2.1 Modelo de Movimentação Dentária Induzida (MDI) 45 5.3.2 Grupos experimentais 47 A. Grupos não-tratados 47 B. Grupos ácido zoledrônico (ZOL) 47 C. Grupos controles 48 5.4 Quantificação dos espaços interdentais 48 5.5 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea 49 5.6 Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal 49 5.7 Histologia de reabsorções radiculares e ósseas alveolares 53
5.8 Dosagem da atividade da mieloperoxidase (MPO) gengival 54
5.9 Dosagens dos níveis gngivais de TNF-α e IL-1β 55 5.10 Análise imunohistoquímica para detecção de TNF-α, RANKL, OPG e TRAP 56
5.11 Análise do leucograma 57 5.12 Análise da variação de massa corpórea 57
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1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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5.13 Aspectos éticos 57 5.14 Análise estatística 57 6.RESULTADOS 58 6.1 Quantificação dos espaços interdentais 58 6.2 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea 58 6.3 Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal 59 6.4 Histologia das reabsorções radiculares e ósseas 60 6.5 Atividade da mieloperoxidase gengival (MPO) 63 6.6 Análise dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β 63 6.7 Análises imunohistoquímicas 64 6.8 Leucograma 69 6.9 Variação de massa corpórea 70 7. DISCUSSÃO 71 8. CONCLUSÃO 82 Referências 83 Apêndices 105 Apêndice A - Controles negativos para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP 105
Apêndice B - Aparelhos e instrumentos laboratoriais 106 Apêndice C- Soluções e materiais de consumo 108 Anexo 109 Anexo A - Aprovação da comissão de ética no uso de animais 109
16
1 INTRODUÇÃO As repercussões de fármacos que afetam o metabolismo ósseo, como os
antirreabsortivos, a exemplo dos bisfosfonatos, têm sido investigadas especialmente em
modelos animais (KAIPATUR et al., 2013; FERNANDEZ-GONZÁLEZ et al., 2016). Os
bisfosfonatos nitrogenados são utilizados no tratamento de desordens metabólicas
ósseas, como osteoporose e metástases ósseas (JUNG et al., 1973; BROOM et al.,
2014). Dentre eles, destaca-se o ácido zoledrônico, um potente inibidor de osteoclastos,
utilizado como adjuvante quimioterápico (BARNADAS et al., 2014) e para o tratamento
de fraturas na osteoporose pós-menopausa (CHÁVEZ-VALENCIA et al., 2014). O uso de
bisfosfonatos nitrogenados, principalmente o ácido zoledrônico, por períodos
prolongados, impossibilita o manejo odontológico dos pacientes, uma vez que o risco de
osteonecrose dos maxilares aumenta (GHONEIMA; ALLAN; WINDSOR, 2010). Esta
condição se caracteriza por exposição do tecido ósseo decorrente da incapacidade de
cicatrização do epitélio (KOHSLA et al., 2007). Diante disso, o tratamento ortodôntico e
outras intervenções cirurgicas orais são contraindicados durante a terapia com
bisfosfonatos nitrogenados (KRISHNAN; PANDIAN; KUMAR, 2015).
O osso é um tecido especializado rico em Ca2+ que se encontra em
remodelação óssea contínua. Esse processo depende da atividade de osteoclastos, que
reabsorvem o osso em desuso da matriz óssea, osteoblastos que recompõem a matriz,
formando um novo osso, e osteócitos que regulam a atividade dessas células (DATTA et
al., 2008; RUCCI, 2008). A remodelação óssea é o processo que renova o tecido ósseo,
mantendo a força e a homeostasia óssea, que se inicia logo após o nascimento e
perdura até a morte. Em mulheres na menopausa tende a diminuí-la, mas não a torna
inexistente (CLARKE et al., 2008). A mesma, depende da atividade orquestrada de
osteoclastos e osteoblastos, os quais se intercomunicam pela expressão de proteínas e
receptores que regulam a diferenciação, proliferação e atividade dessas células (ZHAO
et al., 2006; PEDERSON et al., 2008; MARTIN; SIMS, 2005; TANG et al., 2009). O osso
também sofre influência expressiva do sistema imune, uma vez que clastos e blastos
expressam receptores para leucócitos, citocinas e quimiocinas, os quais regulam o
processo de maturação dessas células, modulando o metabolismo ósseo (DATTA et al.,
2008; RUCCI, 2008; JIANG et al., 2015).
Nesse contexto, a movimentação dentária é definida como o deslocamento
dentário fisiopatológico advindo da aplicação de uma força, envolvendo a produção de
mediadores inflamatórios que atuam no ligamento periodontal e no osso alveolar. O
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estresse mecânico leva a deformação do ligamento periodontal, originando áreas de
compressão e tração (WISE; KING, 2008). No lado de compressão, o colabamento dos
vasos induz hipóxia e consequente morte celular (GAEGLER; MERTE, 1983). A partir
disso, a matriz extracelular passa a ser composta por fibras colágenas densas, com
ausência de células, denominadas áreas hialinas da matriz extracelular (FRACALOSSI
et al., 2009). Essas áreas liberam fatores quimiotáticos para células gigantes
multinucleadas, que se diferenciam em osteoclastos e tornam a reabsorver o osso
adjacente (VON BÖHL; KUIJPERS-JAGTMAN, 2009). Os eventos inflamatórios são
gerados ao redor das áreas hialinas, uma vez que, os macrófagos, ao fagocitarem essas
áreas, liberam quimiocinas e citocinas que atraem células mesenquimais. Por isso, a
movimentação dentária agrega uma resposta inflamatória asséptica, sem infecção
(KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006). Quando a força é aplicada corretamente, o mínimo
de áreas hialinas é gerado, permitindo a reabsorção óssea frontal. Forças de grande
intensidade, induzem áreas hialinas extensas, o que leva ao atraso do movimento
dentário (FRACALOSSI et al., 2009). No lado de tração, o estiramento do ligamento
periodontal permite a aposição óssea, mediada pelo aumento da angiogênese e de
células osteogênicas como osteoblastos, as quais são induzidas por fatores de
crescimento (FRANCESCHI; XIAO, 2003; BODINE et al., 2007).
Embora o tratamento com ácido zoledrônico não seja recomendado durante a
movimentação dentária, esse trabalho buscou investigar o efeito desse fármaco durante
a remodelação óssea, para a qual o modelo de movimentação dentária induzida (MDI)
em ratos representa uma ferramenta para o estudo desse processo. A literatura tem
abordado os efeitos macroscópicos do ácido zoledrônico na quantificação das taxas do
movimento dentário, mas ainda carece de informações sobre as repercussões
farmacológicas a nível de resposta inflamatória e consequente remodelação óssea da
MDI. Por isso, objetivou-se avaliar a modulação de mediadores inflamatórios,
influenciando o metabolismo ósseo, no tratamento com ácido zoledrônico durante a
remodelação óssea.
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2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Remodelação óssea
O osso é um tecido conjuntivo resistente e especializado, constituído por íons
Ca2+ na forma de hidroxiapatita, que se encontra em constante remodelação óssea
(DATTA et al., 2008). O processo de renovação é dependente da atividade de células
como osteoclastos, que reabsorvem a matriz óssea, osteoblastos, que exercem funções
osteogênicas, e osteócitos, células provenientes de osteoblastos, que constituem a
matriz óssea e exercem funções mecanossensoriais (RUCCI, 2008). Essas células
atuam de forma sincronizada para que a reabsorção seja seguida de neoformação
óssea, preservando a matriz tecidual (RAGGAT; PARTRIDGE, 2010).
Os osteoclastos são derivados de células estaminais hematopoiéticas e seu
desenvolvimento envolve a interação do fator estimulador de colônias de macrófagos
(M-CSF) e do seu receptor C-fms, o qual é encontrado na superfície de tais células
progenitoras (REDLICH; SMOLLEN, 2012). Na osteoclastogênese o recrutamento de
células originadas da linhagem de macrógafos se fundem para formar células
multinucleadas com bordas em escova, os osteoclastos (UDAGAWA et al., 1990;
WALKER, 1975), os quais expressam fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) em
sua superfície (TEITELBAUM; ROSS, 2003). Nesse processo de diferenciação, diversos
mediadores inflamatórios, tais como as prostaglandinas E (PGE2) (BEZERRA et al.,
2000), citocinas como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), a interleucina (IL)-1β
(LIMA et al., 2004) e a IL-17, metaloproteinases de matriz óssea, e óxido nítrico (LEITAO
et al., 2005) exercem um papel crucial na destruição óssea osteoclástica (GUIMARÃES
et al., 2016). Tais mediadores estimulam o aumento de citocinas como o ligante do
receptor ativador do fator nuclear-κB (RANKL), expresso em células estromais como
linfócitos T e B, fibroblastos e osteoblastos, e do M-CSF (WIKTOR-JEDRZEJCZAK et
al., 1990; YASUDA et al., 1998; HOWARD; ZWILLING, 1998; QUINN et al., 2000;
MANABE et al., 2001). O M-CSF atua na proliferação de pré-osteoclastos, ao passo que
o RANKL ativa o receptor ativador do fator nuclear κB (RANK), induzindo a diferenciação
e a ativação de osteoclastos (YASUDA et al., 1998). Após a ligação entre RANK e
RANKL, o fator nuclear-κB (NF-κB) e a proteína ativadora-1 (AP-1), encontrados no
citoplasma sob condições normais, migram para o núcleo e regulam a transcrição gênica
(BOYLE, SIMONET, LACEY; 2003). O NF-κB e a AP-1 ativam o fator nuclear de células
T ativadas-1 (NAFTc-1), uma molécula chave para a diferenciação osteoclástica que age
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nesse processo por intermédio de vias como a do receptor associado ao TNF-6 (TRAF-
6), c-Jun e proteína MAPK p38 (IKEDA et al., 2004; GOHDA et al., 2005; ZHAO et al.,
2007), promovendo oscilação intracelular dos níveis de Ca2+, e induzindo a
osteoclastogênese (YANG, LI; 2007) (Figura 1).
Figura 1 – Vias de indução da transcrição gênica de fatores que estimulam a osteoclastogênese. A interação RANK-RANKL na presença de M-CSF na membrana de pré-osteoclastos promove a ativação de NF-κB e AP-1, com consequente migração para o núcleo. Ambos regulam a ativação de NAFTc-1, que estimula a osteoclastogênese via TRAF6, C-Jun e MAPK p38. Baseado em DATTA et al., 2008; RUCCI et al., 2008; RAGGAT; PARTRIDGE, 2012.
Para interagir com o osso, os osteoclastos maduros expressam αVβ3
integrina, um receptor que interage com proteínas da matriz óssea como a osteopontina
e a sialoproteína óssea (DAVIES et al., 1989). A ocupação do sítio da αVβ3 integrina,
além de promover a oscilação dos níveis de Ca2+, promove a fosforilação de tirosina e a
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), ativando o osteoclasto para promover
reabsorção óssea (SHANKAR et al., 1993; DATTA et al., 1995; NAKAMURA et al.,
1998). As mudanças que ocorrem no citoesqueleto para formar a borda em escova são
mediadas pela GTPases (CHELLAIAH et al., 2000) (Figura 2).
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Figura 2 – Ligação do osteoclasto maduro à matriz óssea. A ligação do osteoclasto ao osso ocorre pela expressão de αVβ3 integrina, que induz oscilação dos níveis de cálcio e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Assim, a célula passa a reabsorver o tecido pela presença da borda em escova formada pelas GTPases. Baseado em DATTA et al., 2008.
De maneira coordenada, os osteoblastos são as células importantes durante
a neoformação óssea, cuja diferenciação também é estimulada por diversos fatores, em
diferentes estágios. Os osteoblastos se desenvolvem a partir de células progenitoras
mesodérmicas que, quando completamente diferenciadas, produzem a matriz óssea. O
fator estimulador de osteoblastos (OSF-1) atua na quimiotaxia de pré-osteoblastos e na
maturação de osteoblastos imaturos (YANG et al., 2001). Todavia, o anabolismo ósseo
depende, principalmente, da expressão do fator de transcrição relacionado a RUNT-2, o
RUNX2, cuja ativação resulta em diferenciação de pré-osteoblastos em osteoblastos
maduros, bem como a sobrevivência dessas células (GAUR et al., 2005).
O RUNX2 pode ser induzido pela via Wnt/β-Catenina, pelo fator transformador
do crescimento-β (TGF-β) e pelas proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) (DATTA et
al., 2008). O hormônio da paratireoide (PTH), os fatores de crescimento fibroblástico
(FGF) e insulínico (IGF), e as BMPs também levam à expressão de RUNX2, via indução
de SMADs e MAPKs (FRANCESCHI; XIAO, 2003; BODINE et al., 2007).
A via Wnt/β-Catenina exerce um papel importante na ativação osteoblástica
(BODINE; KOMM, 2006). As proteínas Wnt são glicoproteínas secretadas por células da
medula óssea e hematopoiéticas (YAMANE et al., 2001). Elas se ligam a um complexo
de receptores composto pelos receptores de lipoproteínas de baixa densidade 5 e 6 e
um receptor Frizzled (VAN AMERONGEN; NUSSE, 2009). A interação entre as
proteínas Wnt e o complexo de receptores inibe a fosforilação de β-catenina, levando a
um acúmulo da forma não-fosforilada no citoplasma, a qual se transloca para o núcleo, e
modula a transcrição gênica (TAMAI et al., 2000).
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Esta via também leva à superexpressão de Osteoprotegerina (OPG), uma
citocina antiosteoclastogênica produzida por osteoblastos que se liga ao RANKL e
impede sua ligação ao RANK (KAWASAKI et al., 2006). Desta forma, inibe a
osteoclastogênese e induz apoptose de osteoclastos maduros (LACEY et al., 1998).
Esta via pode ser infra-regulada por proteínas como a Dickkopf -1 (DKK1), a qual é
secretada fisiologicamente pela pele e baço (KWACK et al., 2008).
A oncostatina M (OSM) também induz a atividade osteoblástica ao se ligar a
um receptor de citocinas chamado glicoproteína 130 (Gp130), presente na membrana de
osteoblastos, induzindo a ativação da via de sinalização JAK-STAT, o que resulta na
modulação da transcrição gênica (WALKER et al, 2010). Ainda, a expressão
osteoblástica de osteopontina, osteonectina e osteocalcina é importante na produção de
componentes da matriz, a exemplo da hidroxiapatita, contribuindo para a manutenção da
mineralização óssea (MURSHED et al., 2005) (Figura 3).
Figura 3 – Vias de indução da transcrição gênica de fatores que estimulam a osteoblastogênese. A ligação do fator transformador de crescimento (TGF-β), hormônio da paratireoide (PTH), proteína morfogenética óssea (BMP), fator de crescimento fibroblasticos (FGF), fator de crescimento insulínico (IGF) e oncostatina M (OSM) na membrana de pré-osteoblastos e osteoblastos maduros leva à ativação da neoformação óssea via indução de RUNX-2, que modula a transcrição gênica para aumentar sua própria expressão, bem como de osteoprotegerina (OPG), osteocalcina (OCN) e osterix (OSX). Baseado em RAGGAT; PARTRIDGE, 2012.
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Em relação aos osteócitos, estas células também estão incluídas na “Unidade
Básica Multicelular” do esqueleto, juntamente aos osteoblastos e osteoclastos,
demonstrando participar ativamente na remodelação do tecido ósseo (BONEWALD,
JOHNSON, 2008; O’BRIEN; NAKASHIMA; TAKAYANAGI, 2013), apesar de terem sido
considerados inertes durante anos. Osteócitos são osteoblastos terminalmente
diferenciados contidos dentro da matriz óssea mineralizada e são envolvidos na
mecanosensação e transdução deste tecido (BONEWALD, JOHNSON, 2008). A
literatura tem destacado a função de osteócitos no controle da formação e reabsorção
óssea. A identificação da esclerostina, uma proteína restrita a osteócitos e considerada
antagonista da via Wnt/β-Catenina (TEN DIJKE et al., 2008), forneceu a primeira
evidência de que os osteócitos exercem controle direto sobre a formação óssea. Ainda,
estudos genéticos revelaram que os osteócitos são fontes celulares de RANKL e que
reconhecidamente controlam a osteoclastogênese (NAKASHIMA et al., 2011; XIONG;
O’BRIEN, 2012).
Sabe-se que os osteoblastos são os principais reguladores da diferenciação
de osteoclastos, uma vez que as principais citocinas requeridas para esse processo são
expressas por essas células (DATTA et al., 2008), a exemplo de RANKL e M-CSF, que
são marcadores característicos da linhagem osteoblástica, assim como PTH, fosfatase
alcalina e osteocalcina (SIMS; GOOI, 2008; RUCCI, 2008; GOOI et al., 2010). Foi
observado, ainda, em um estudo in vitro, que a osteoclastogênese ocorria somente na
presença de osteoblastos e células estromais (TAKAHASHI et al., 1988).
Durante o processo de reabsorção óssea, os osteoclastos e os osteócitos
liberam TGF-β e IGF-1 que induzem o recrutamento de células mesenquimais pré-
osteoblásticas aos sítios de destruição óssea (MARTIN; SIMS, 2005; TANG et al., 2009).
Osteoclastos também expressam a 1-fosfato de esfingosina, uma proteína de
sinalização osteoblástica, que atua como agente quimiotático para osteoblastos
(PEDERSON et al., 2008). Ainda, essas células também produzem efrina-B2, que ao se
ligar aos receptores EphB4, presentes em osteoblastos, induz o aumento da
diferenciação osteogênica, bem como a inibição da osteoclastogênese pela
infrarregulação de NAFTc-1 (ZHAO et al., 2006). De fato, há uma estreita comunicação
entre osteoblastos e osteoclastos, que interagem para promover remodelação e
manutenção do tecido ósseo (RAGGAT; PARTRIDGE, 2010).
O osso pode sofrer influência significativa do sistema imune, uma vez que na
superfície das células ósseas são expressos muitos receptores para citocinas, células de
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defesa e quimiocinas (DATTA et al., 2008). Quando há algum fator de ativação desse
sistema, a exemplo de doenças como a artrite reumatoide (JI et al., 2002) e periodontite
(YOSHIHARA et al., 2004), e indução de estresses mecânicos como a instalação de
aparelhos ortodônticos (GARLET et al., 2007; 2008), há a produção de mediadores da
inflamação que interagem com clastos e blastos modulando o metabolismo ósseo
(RUCCI, 2008; JIANG et al., 2015). Dessa forma, modelos de movimentação dentária
induzida têm sido utilizados afim de elucidar os mecanismos inerentes à remodelação
óssea.
2.2 Movimentação dentária e inflamação A movimentação dentária é, por definição, o deslocamento de um dente
decorrente de uma força mecânica aplicada ao mesmo, envolvendo diretamente o
ligamento periodontal e o osso alveolar, de tal forma a gerar uma área de compressão
do ligamento contra o osso alveolar e, no lado oposto, uma de tração dos ligamentos
periodontais. As forças mecânicas não induzem apenas a movimentação dentária, mas
também, estimulações biológicas capazes de promover reações teciduais que
determinarão uma nova posição estável e duradoura do dente (FRACALOSSI et al.,
2009), cujo fenômeno é denominado mecanotransdução. Tais estímulos biológicos
envolvem eventos celulares, a partir dos quais ocorrem as proliferação, diferenciação e
apoptose de células do ligamento periodontal nos sítios de compressão e tração,
estimulados pela liberação de mediadores da inflamação como prostaglandinas,
citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, dentre outros (KRISHNAN;
DAVIDOVITCH, 2009; CHIBEBE; SATAROBINAS; PALLOS 2011).
Burstone (1962) dividiu a movimentação dentária em seres humanos em três
fases. A primeira, chamada de fase inicial que perdura até o 5º dia e se caracteriza pelo
movimento do dente no espaço periodontal. A segunda, corresponde à fase de latência
em que há o retardo do movimento dentário, devido à formação de áreas hialinas por
volta do 6º ao 12º dia. Por fim, a fase de pós-latência, que ocorre a partir do 13º dia, na
qual há um aumento das taxas de movimentação dentária por conta da reabsorção das
áreas hialinas por osteoclastos (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006).
Ao ser iniciada, a movimentação do dente através do alvéolo induz a
obliteração dos vasos sanguíneos do ligamento periodontal, diminuindo a quantidade de
vascularização no lado de compressão (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006).
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
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Consequentemente, surgem zonas de necrose focal, que apresentam trombose capilar e
redução do número de células, chamadas de áreas hialinas da matriz extracelular, por
se assemelharem à cartilagem hialina em cortes histológicos (MEIKLE et al., 2006). Os
macrófagos são recrutados e diferenciados em osteoclastos para remoção dessas áreas
e, por conseguinte, acabam por reabsorver o osso circunjacente e favorecer o
deslocamento do dente (VON BÖHL; KUIJPERS-JAGTMAN, 2009).
A hipóxia instalada no sítio de compressão leva ao desenvolvimento de um
processo inflamatório agudo, no qual há a liberação de fatores como a histamina, a
bradicinina, a substância P e o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), os
quais facilitam o extravasamento de plasma dos capilares (WISE; KING, 2008). Com a
perda de líquido, os leucócitos se concentram no lúmen do vaso, e dada a evolução do
processo, se aderem ao longo do endotélio e transmigram para o meio extracelular,
sendo recrutados para o lado de compressão por meio de estímulos de citocinas e
quimiocinas (ANDRADE; TADDEI; SOUSA, 2012) (Figura 4). Em conjunto com as
alterações vasculares e celulares, a compressão do ligamento periodontal também induz
a produção de mediadores da inflamação. Esses mediadores atuam no processo
inflamatório agudo induzindo quimiotaxia de leucócitos como neutrófilos, linfócitos e
monócitos para o local da inflamação por meio da expressão de moléculas de adesão
como VCAM-1 e ICAM-1 (KINDLE et al., 2006), bem como desempenhando um papel
relevante na remodelação óssea induzida pela movimentação ortodôntica, agindo de
forma direta e indireta na atividade das células ósseas (KRISHNAN, DAVIDOVITCH,
2006; 2009; MEIKLE, 2006; JIANG et al., 2015). Dentre eles, destacam-se a PGE2 e as
citocinas pró-inflamatórias, o TNF-α e as IL-1β, -6 e -8 e -17, bem como o fator
estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF). Esses mediadores
químicos ativam os osteoclastos a promover reabsorção óssea (KUWABARA et al.,
2001; YAGO et al., 2007; CHAE et al., 2011; JIANG et al., 2015) (Figura 4).
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Figura 4 – Resposta inflamatória após aplicação de uma força. A hipóxia estimula a liberação mediadores da inflamação que facilitam a saída de leucócitos dos vasos e a quimiotaxia para o local da inflamação. PG: prostaglandina; SP: substância P; VEGF: fator de crescimento de endotélio vascular; TNF: fator de necrose tumoral; IL: interleucina. Adaptado de Andrade; Taddei; Sousa, 2012.
Em contrapartida, as citocinas anti-inflamatórias como IL-4, -10, -18, e os
fatores TGF-β, FGF e IGF exercerem efeitos estimulatórios sobre osteoblastos,
favorecendo a neoformação óssea (HORWOOD et al., 1998; TEIXEIRA et al., 2010;
CHENG et al., 2011).
As prostaglandinas (PGs) atuam principalmente nos eventos vasculares da
inflamação, mas sabe-se que também são potentes reguladores da osteoclastogênese
(SHIMIZU et al., 1992). Estudos revelam uma correlação positiva entre a dor após
instalação de elásticos separadores e os níveis de PGE2 no fluido crevicular gengival
(FCG) de pacientes, uma vez que o pico de deste mediador no FCG se deu por volta de
1 hora após o estímulo, sendo concomitante ao aumento dos escores da Escala Visual
Analógica (GIANNOPOULOU; DUDIC; KILIARIDIS, 2006). Também foi observado um
aumento na produção PGE2, bem como a consequente ativação de osteoclastos nos
sítios de reabsorção óssea alveolar na presença de periodontite (RASMUSSEN;
HANSTROM; LERNER; 2000). Além disso, a incubação de monócitos de sangue
periférico com 10-7 M de PGE2 aumentou a expressão de RANKL após 48 horas
(KANZAKI et al., 2002).
TNF-α, IL-1β e IL-6 são citocinas envolvidas na resposta inflamatória inicial.
No contexto do movimento dentário, tais citocinas têm influência importante na
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remodelação óssea, uma vez que atuam ativamente na maturação osteoclástica
(REDLICH; SMOLEN, 2012).
Particularmente, o TNF-α promove a osteoclastogênese mediante a sua
ligação ao receptor p55 presente na membrana de pré-osteoclastos, induzindo a
diferenciação dessas células em osteoclastos maduros. Também promove a
suprarregulação de RANKL, M-CSF e quimiocinas em osteoblastos (LAM et al., 2000;
TEITELBAUM; ROSS, 2003; YANO et al., 2005). Além de induzir a osteoclastogênese, o
TNF-α exerce uma ação inibitória na neoformação óssea, pois estimula a apoptose de
osteócitos, células que promovem a manutenção da matriz óssea por regularem a
atividade de osteoblastos (AHUJA et al., 2003; RUCCI, 2008).
Da mesma forma, a IL-1β também é um mediador chave envolvido na
osteoclastogênese, que é expresso em níveis elevados no lado de compressão durante
o movimento dentário (GARLET et al., 2007; NAKAO et al., 2007; REN et al., 2007). A
diferenciação de osteoclastos mediada por IL-1β ocorre tanto pela indução de fusão,
ativação e sobrevivência de células reabsortivas (BASARAN et al., 2006), como pelo
aumento da produção de RANKL por osteoblastos e células estromais durante as fases
iniciais da movimentação ortodôntica (LE GALL, SASTRE, 2010). Outros estudos
também constataram que a IL-1β induz a suprarregulação de PGE2, M-CSF e
quimiocinas e a infrarregulação da expressão de osteoprotegerina (OPG), em
osteoblastos (TANABE et al., 2005; BLETSA; BERGGREEN; BRUDVIK, 2006).
A IL-6, induzida por TNF-α e IL-1β, estimula a reabsorção óssea por um
mecanismo distinto, que consiste em intensificar o acoplamento entre osteoclastos e
osteoblastos (STEEVE et al., 2004). Foi observado que esta citocina estimula a
osteoclastogênese na presença de osteoblastos, mas não em culturas de osteoclastos,
apenas (HATTERSLEY et al., 1988). Receptores para a IL-6, como o Gp130, presentes
em osteoblastos, são necessários para que haja osteoclastogênese (UDAGAWA et al.,
1995). Seu efeito se dá pela estimulação da expressão de RANKL nessas células,
intensificando a interação RANK-RANKL (PALMQVIST et al., 2002). Além disso, a IL-6
regula a ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal por TNF-α e IL-1, induzindo o
aumento da liberação de cortisol que também promove reabsorção óssea (VAN GOOL
et al., 1990; CHROUSOS, 1995).
Por outro lado, a IL-4, a IL-10 e o TGF-β desempenham papel inibitório
desses processos, controlando a reabsorção e favorecendo a neoformação ósseas.
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Estes são expressos no ligamento periodontal durante a movimentação dentária e
inibem a osteoclastogênese por estimular a expressão de OPG em osteoblastos
(HORWOOD et al., 1998; TEIXEIRA et al., 2010). Além disso, a IL-4 diminui a expressão
de RANKL via inibição de STAT 6. A IL-10 inibe a produção de TNF-α, IL-1β e IL-6,
tendo sua expressão superior no lado de tração em comparação ao de compressão
(PALMQVIST et al., 2006; GARLET et al., 2007). Um estudo in vitro constatou que TGF-
β induz a suprarregulação de osteoblastos e de OPG durante a tração de células do
ligamento periodontal e, semelhante à IL-10, esta citocina inibe a expressão de IL-6
(KANZAKI et al., 2006).
Mesmo sendo considerada uma citocina importante na ativação de
macrófagos, IFN-γ possui uma ação inibitória da osteoclastogênese em conjunto com os
receptores tipo-Toll (toll-like receptors ou TLRs), inibindo a expressão de RANKL e do
gene que codifica o receptor do fator estimulador de colônias (c-Fms) (JI et al., 2009).
Também foi encontrada em níveis aumentados no lado de tração após indução do
movimento dentário em humanos (GRANT et al., 2013).
O sistema de quimiocinas também exerce função importante na remodelação
óssea. Quimiocinas, como CCL2, 3 e 5, CXCL8 (IL-8) e CXCL12, promovem a
diferenciação de pré-osteoclastos pela indução de RANKL (YU et al., 2004) e induzem a
quimiotaxia e sobrevivência de osteoclastos maduros (OKAMATSU et al., 2004;
WATANABE et al., 2004). RANKL induz a produção de CCL2, 3 e 5 por osteoclastos,
sugerindo uma sinalização autócrina e parácrina da osteoclastogênese e um aumento
da reabsorção óssea (YU et al., 2004; BINDER et al., 2009).
CCL5 e CXCL12 também exercem influência na atividade de osteoblastos
(ANDRADE; TADDEI; SOUSA, 2012). Estudos observaram que a ligação dessas
quimiocinas aos osteoblastos induz o recrutamento e inibição da apoptose dessas
células, como também induzem a expressão de colágeno tipo-I em suas superfícies
(YANO et al., 2005; ANDRADE et al., 2009).
A comunicação entre osteoclastos e osteoblastos por intermédio do sistema
RANK/RANKL/OPG pode ser mediada pela ação das quimiocinas (BOYCE, XING,
2008), as quais são induzidas por IL-1β e TNF-α, contribuindo para a osteoclastogênese
e exacerbando a reabsorção óssea (YU et al., 2004; YANO et al., 2005; SCHALL,
PROUDFOOT, 2011).
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Figura 5 – Desenhos esquemáticos dos processos de reabsorção óssea alveolar no lado de compressão (A) e neoformação óssea alveolar no lado de tração (B). No lado de compressão, a reabsorção óssea é regulada pela via RANK/RANKL/OPG, podendo, também, ser estimulada por mediadores pró-inflamatórios como TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e PGE2 e quimiocinas. No lado de tração ocorrem proliferação de osteoblastos e síntese de colágeno, em que participam quimiocinas, citocinas e fatores de crescimento. Adaptado de Andrade; Taddei; Sousa 2012.
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2.3 Estudos da movimentação dentária induzida (MDI) Os modelos de movimentação dentária induzida (MDI) em animais constituem
boas estratégias para o estudo da remodelação óssea, uma vez que mimetizam as
principais características clínicas, como o movimento propriamente do dente em direção
à força aplicada e a produção de biomarcadores inflamatórios e ósseos (REN et al.,
2004).
Um modelo que vem sendo bastante utilizado consiste na instalação e
ativação de dispositivos ortodônticos, no qual o movimento dentário induz a liberação de
mediadores químicos da inflamação em poucos dias após a aplicação de força (XIE;
KUIJPERS-JAGTMAN; MALTHA et al., 2011; BOAS NOGUEIRA et al., 2013; YAN et al.,
2015).
À semelhança do que se observa em humanos, em que um conjunto de
eventos biológicos estão bem estabelecidos, em modelos animais, a hipóxia gerada pela
compressão do ligamento periodontal da raiz sob movimentação resulta em trombose
capilar e apoptose celular, formando as chamadas áreas hialinas da matriz extracelular,
que apresentam poucas células. Os eventos vasculares iniciais conduzem, rapidamente,
à mobilidade celular para a área afetada, sendo os neutrófilos importantes componentes
que atuam pela liberação de enzimas lisossomais, sinalizando e atraindo novas células
para o local. Tais eventos favorecem a ação de diversos mediadores químicos
plasmáticos e celulares (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006; FRACALOSSI et al., 2009;
ANDRADE et al., 2012; YUCEL-LINDBERG; BAGE et al., 2013).
Um estudo observou o aumento de prostaglandina E2 em apenas 24 h após a
indução do movimento dentário em gatos (SAITO et al., 1991), o que sugere a
participação desse mediador nos eventos iniciais da inflamação consequente do
estresse mecânico, favorecendo a formação de osteoclastos, uma vez que estimula a
enzima adenilato-ciclase e a adenosina monofosfato cílica (AMPc) intracelular em
osteoblastos (SUZAWA et al., 1999).
Xie, Kuijpers-Jagtman e Maltha (2011) constataram um aumento da marcação
para macrófagos, nos 3º e 5º dias da ativação, de uma mola de níquel-titânio em ratos.
Outro estudo, também em ratos, revelou o aumento de IL-8, importante agente
quimiotáxico para neutrófilos em 5 dias de MDI (YANG et al., 2013). Vandevska-
Radunovic et al. (1997) constataram o aumento da marcação de neutrófilos na 24ª hora
e aos 3 dias do início da MDI em ratos, o que foi confirmado na imunohistoquímica para
células CD43+. Os achados, em conjunto, sugerem que a ativação de um dispositivo
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ortodôntico em animais induz um aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias
advindas da ação de macrófagos e neutrófilos ativados.
Estudos observaram, ainda, o aumento da produção de citocinas como TNF-α
e IL-1β em até 7 dias de MDI em roedores, coincidente com maiores taxas do
deslocamento dentário (SAITO et al., 1991; HAZAN-MOLINA et al., 2013; ALIKHANI et
al., 2015; YAN et al., 2015). Quando do tratamento com o Basiliximab, bloqueador de
linfócitos T, ou com o Etanercepte, anticorpo para TNF-α, houve um decréscimo na
movimentação dentária em camundongos, evidenciando que TNF-α participa ativamente
da remodelação óssea da MDI nesses animais. Além disso, também foi verificado um
aumento de IL-6 no 5º dia da instalação da mola, o que possibilita a sugestão da
correlação entre TNF-α, IL-1β e IL-6, citocinas que agem em conjunto na ativação da
reabsorção óssea (YANG et al., 2013; YAN et al., 2015).
Sabe-se que TNF-α, IL-1β e IL-6 induzem diferenciação de osteoclastos pelo
aumento da expressão de mediadores como RANKL e M-CSF (PALMQVIST et al., 2002;
TANABE et al., 2005; YANO et al., 2005). Deveras, a literatura relata a presença de
RANKL, de c-fms e de M-CSF em 3 e 10 dias do início da movimentação em roedores,
evidenciando que o aumento da expressão desses mediadores é consequência dos
níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias, contribuindo, assim para a
osteoclastogênese (KAKU et al., 2008; XIE; KUIJPERS-JAGTMAN; MALTHA et al.,
2008; FRANZEN et al., 2014; ALIKHANI et al., 2015). Estudos mostram, ainda, a
presença de osteoclastos, pelo aumento da marcação para TRAP e Catepsina K em até
10 dias de MDI em roedores (XIE; KUIJPERS-JAGTMAN; MALTHA et al., 2011; HAZAN-
MOLINA et al., 2013; FRANZEN et al., 2014; ALIKHANI et al., 2015; YAN et al., 2015).
Além disso, constatou-se que a interação RANK-RANKL pode ocorrer logo após a
aplicação de força, uma vez que foi relatado o aumento da subunidade p65 do NF-κB,
em 3 e 24 horas de MDI em ratos (ZUO et al., 2007).
Um aumento da expressão do fator de crescimento do endotélio vascular
(VEGF) no lado de tração foi relatado em dois estudos em camundongos aos 10 dias de
MDI, o que confirma os achados histológicos que relataram um aumento da
microcirculação do ligamento periodontal nessa região (SANDSTEDT, 1904;
OPPENHEIN, 1911; SHWARZ,1932; KOHNO et al., 2003; KAKU et al., 2008). Além
disso, mediadores anti-inflamatórios também modulam a reabsorção óssea da MDI,
tanto pelo aumento fisiológico, como pela administração local de citocinas, que induzem
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a neoformação óssea também foi observada durante a MDI em animais (WANG; ZHU;
LIANG, 2000; LOW et al., 2005; BROOKS et al., 2009; KOHARA et al., 2012; HAKAMI et
al., 2015).
O tratamento local diário com 1,5 µg/kg de IL-4 em camundongos submetidos
à MDI por 12 dias reduziu a taxa de movimentação, o que sugere um desequilíbrio na
remodelação óssea devido o estímulo da neoformação óssea. Ademais, houve
diminuição da marcação para TRAP, mostrando que a IL-4 também interfere na
atividade de osteoclastos (HAKAMI et al., 2015). Da mesma forma, camundongos
tratados localmente com 1,5 µg/20µl de IFN-γ também demonstraram taxas de
movimentação e marcação para TRAP reduzidas no mesmo período (KOHARA et al.,
2012). Ainda, a presença de TGF-β também foi verificada após por Wang, Zhu, Liang
(2000) em ambos os lados, sendo superior no lado de tração em 5 e 10 dias de MDI em
ratos. Outros achados também revelam o aumento da marcação para RUNX2 e OPG
aos 1º e 14º dias de MDI em ratos, respectivamente (LOW et al., 2005; BROOKS et al.,
2009).
Quanto às fases da movimentação dentária em humanos, a MDI em animais
também segue essa mesma divisão. Observou-se que a fase inicial da MDI em ratos
ocorre a partir da 6ª hora até o 4ª dia. A fase de latência perdura até o 7⁰ dia. A fase de
pós-latência se dá a partir do 8⁰ dia, em que há um aumento gradual das taxas de MDI,
as quais atingem o pico de movimentação no 11⁰ dia (ARAÚJO, 2015). Além de todas
essas semelhanças, a cavidade oral de humanos e murinos também é similar, uma vez
que ambas são constituídas por epitélio gengival, sulcular e juncional, fibras colágenas,
cementos celular e acelular e osso alveolar. A principal diferença é que o epitélio
gengival do roedor é queratinizado, diferentemente da do humano que não apresenta
queratina (LISTGARTEN, 1975).
Acerca da indução da movimentação dentária, a literatura relata a inserção de
elásticos entre molares (WALDO; ROTHBLATT, 1954), fixação de molas helicoidais de
fabricação manual (ALTAN et al., 2012), e instalação de molas fechadas de níquel-titânio
ancoradas por mini-implantes (KAIPATUR et al., 2013) ou fixadas por fio de amarrilho
(HELLER; NANDA). Estas últimas têm sido bastante utilizadas, uma vez que são de fácil
manuseio e proporcionam distribuição contínua e controlada da força (REN; MALTHA;
KUJIPERS-JAGTMAN, 2004).
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K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
CDD 615.1
A utilização de ratos é vantajosa para o estudo do movimento dentário, pois
estes apresentam baixo custo de manutenção, favorecem um número maior da amostra
em estudo, além da possibilidade de conservação do dispositivo ortodôntico por período
mais prolongado. Adicionalmente, o preparo para análises histológicas é relativamente
fácil, e a maioria de anticorpos necessários para as técnicas de biologias molecular e
celular estão disponíveis para estes animais (REN; MALTHA; KUJIPERS-JAGTMAN,
2004). Além de ratos, a movimentação dentária também foi induzida em cachorros
(TENG; LIOU, 2014) e gatos (SAITO et al., 1991).
Diante de todas essas observações, considera-se que a movimentação
dentária induzida por aparato ortodôntico em ratos agrega uma série de eventos
biológicos que levam à remodelação óssea e ao aumento da taxa de movimentação
dentária, também observadas clinicamente.
Observa-se, de fato que a movimentação dentária induzida agrega
fenômenos biológicos que culminam em remodelação óssea (WISE; KING, 2008). Nesse
contexto, a utilização de fármacos anti-inflamatórios ou antirreabsortivos, como os
bisfosfonatos, podem repercutir negativamente neste processo (KRASNY et al., 2013;
KRISHNAN; PANDIAN; KUMAR, 2015)
2.4 Bisfosfonatos
Os bisfosfonatos (BFs) são análogos não-biodegradáveis do pirofosfato com
intensa afinidade por cristais de hidroxiapatita e constituem a principal classe de
fármacos utilizados no tratamento de desordens metabólicas ósseas, dentre elas a
osteoporose, uma condição caracterizada pelo aumento da taxa de reabsorção óssea
(JUNG et al., 1973).
A estabilidade desses fármacos se deve à ligação de um átomo de carbono
com dois átomos de fosfato (P−C−P), o que confere ao composto, resistência à
metabolização e hidrólise enzimática por pirofosfatases (ROGERS et al., 1994; FLEISH
et al., 2002). As ligações adicionais do carbono central podem interagir com diversos
grupamentos, dentre eles, destacam-se os átomos de carbono, oxigênio e nitrogênio.
Essas cadeias laterais ligadas ao carbono podem ser definidas como ligantes R1 e R2
(ROGERS et al., 1994).
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Figura 6 – Estrutura química dos bisfosfonatos, destacando-se a ligação P-C-P. Os ligantes R1 e R2 podem variar de acordo com cada tipo de fármaco. Baseado em RUSSEL et al., 2008.
Quando uma dessas cadeias laterais é um grupamento hidroxila (-OH) ou
uma amina primária (NH2) ocorre a formação de um complexo tridentado que se liga de
forma mais eficaz ao cálcio, aumentando a afinidade a este mineral (JUNG et al., 1973).
Primariamente, os BFs são pouco absorvidos quando ingeridos por via oral o
que se atribui à baixa lipossolubilidade desses fármacos, o que interfere no seu
transporte transcelular por entre as barreiras epiteliais. O transporte de BFs ocorre,
principalmente, pela circulação sanguínea, após atravessarem as junções entre células
do epitélio (BOULENC et al., 1993; LIN et al., 1996). A elevada afinidade pela matriz
mineral óssea favorece a rápida depuração plasmática dos BFs (LIN et al., 1996). Os
mesmos são metabolicamente estáveis, portanto, são excretados pela urina na sua
forma inalterada (LIN et al., 1996).
Esses fármacos são adsorvidos em sítios de intensa remodelação óssea
(CHEONG, 2014) onde exercem seu efeito farmacológico (GREEN, 2004), dependente
da internalização em osteoclastos. Tal internalização causa inibição da reabsorção
óssea por induzir a apoptose dos osteoclastos (FLANAGAM; CHAMBERS, 1990). Além
de influenciar a funcionalidade de osteoclastos, os BFs promovem efeitos diretos na
matriz óssea decorrentes da sua interação com os cristais de hidroxiapatita, inibindo a
precipitação do fosfato de cálcio plasmático, a agregação e a dissolução desses cristais
(FLEISH et al., 1969).
Devido à avidez para se ligar ao osso, os BFs são úteis como agentes
marcadores de metástases ósseas e locais de fraturas (RUSSEL et al., 2008). A partir da
década de 1970, estes fármacos começaram a ser amplamente empregados no
tratamento na terapia oncológica, permanecendo até os dias atuais como ferramenta na
prevenção de complicações esqueléticas decorrentes de mieloma múltiplo (JI et al.,
2014) e de metástases ósseas do câncer de mama (SUMI et al., 2014). Também são
utilizados no tratamento da osteoporose pós-menopausa, reduzindo os marcadores do
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metabolismo ósseo e o risco de fraturas óssea e aumentando a densidade mineral
óssea (LIBERMAN et al., 1995; REGINSTER et al., 2000).
Por conta da adsorção dos BFs em superfícies minerais ósseas, o contato
com as células osteoclásticas é facilitado. Além disso, a queda do pH característica de
áreas de reabsorção óssea facilita a dissociação entre esses fármacos e a hidroxiapatita
e, consequentemente, os BFs são fagocitados pelos osteoclastos (SATO et al., 1991).
No meio intracelular localizam-se em vesículas endocíticas, as quais devem ser
acidificadas para permitir a saída dos BFs para o citoplasma (THOMPSON et al., 2006) e
exercer seus efeitos que culminam em apoptose dos osteoclastos.
Os BFs se dividem em duas classes farmacológicas. Na primeira, estão
aqueles que não contém nitrogênio em sua fórmula molecular, sendo então chamados
de bisfosfonatos não-nitrogenados. A segunda classe, agrega os bisfosfonatos mais
atuais, os quais apresentam o átomo de nitrogênio em sua composição, sendo
classificados como bisfosfonatos nitrogenados (N-BFs) (GREEN 2004, RUSSEL et al.,
2008) (Figura 7).
Figura 7 – Fórmulas moleculares de um bisfosfonato não-nitrogenado, como exemplo, o Clodronato, e de bisfosfonatos nitrogenados, como o Alendronato de Sódio e Ácido Zoledrônico. Arquivo da autora.
Os BFs não-nitrogenados, como o clodronato, o etidronato e o tiludronato,
exercem seu mecanismo de ação mediante a produção de análogos não-hidrolizáveis do
ATP (ROGERS et al., 1994). Lehenkari et al. (2002), em um estudo in vitro utilizando
mitocôndrias de ratos Sprague-Dawley, observaram que o metabólito adenosina-5'-beta-
gamma-diclorometileno-trifosfato (AppCCl2p), originado pelo clodronato, administrado na
concentração de 5x10-4 M, diminuiu do consumo de oxigênio nessas organelas, por inibir
a estimulação de adenosina difosfato (ADP) e a atividade da translocase do nucleotídeo
adenina para formar adenosina trifosfato (ATP). No mesmo estudo, foi realizado outro
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ensaio in vitro com osteoclastos humanos onde foi constatado que o AppCCl2p provocou
a apoptose de 80% dessas células por induzir a perda do potencial de membrana
mitocondrial, caracterizado pela ineficiência em transcolar um átomo de fósforo ao ADP
para formar ATP.
Os N-BFs, como o alendronato, o pamidronato, o ibandronato, o risedronato e
o ácido zoledrônico interferem na atividade e na sobrevivência de osteoclastos, porém
por um mecanismo de ação distinto ao dos BFs não nitrogenados. Seu local de ação
corresponde à via do mevalonato, conhecida pela importância da biossíntese de
colesterol e outros esteróis (RUSSEL et al., 2008). Os N-BFs interferem na cascata
desta via, bloqueando a atividade da farnesil difosfato sintetase (FPPS) (FISHER et al.,
1999)
Esse bloqueio leva à inibição da formação de isopentenil pirofosfato (IPP) em
farnesil pirofosfato (FPP), substrato necessário para a formação de geranil-geranil
pirofosfato (GGPP), via geranil-geranil pirofosfato sintetase (GGPS). Tanto o FPP quanto
o GGPP são necessários para a prenilação das GTPases, como Ras, Rab, Rho e Rac,
as quais são fundamentais para a função e sobrevivência de osteoclastos (LUCKMAN et
al., 1998; ROGERS, 2003). Devido ao acúmulo de GTPases não preniladas em
consequência da interferência na sinalização dessas proteínas, o citoesqueleto perde a
sua conformação, e o transporte vesicular fica comprometido, resultando na
desorganização e achatamento dos prolongamentos celulares. Desta forma, a célula
perde a capacidade reabsortiva óssea, sendo induzida à apoptose (ROELOFS et al.,
2006). Também foi demonstrado que o acúmulo de IPP induzido por N-BFs resulta na
sua ligação ao AMPc para formar um análogo ao ATP intracelular, o Apppi (éster do
ácido trifosfórico 1-adenosina-5-3-[3-metilbut-3-enil]). Esta molécula induz de forma
direta a apoptose de osteoclastos, semelhante ao AppCC12p (MONKKONEN et al.,
2006; ARKKO et al., 2014) (Figura 8)
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Figura 8 – Mecanismo de ação dos N-BFs. Esses fármacos interferem na via do mevalonato levando à desorganização do citoesqueleto e indução direta e indireta da apoptose de osteoclastos. Baseado em Rogers, 2003; Roelofs et al., 2006; Russel et al., 2008.
Clinicamente, o tratamento com N-BFs é bem tolerado desde que a dosagem
correta seja respeitada (OROZCO; MAALOUF, 2012). Contudo, a elevada afinidade pelo
osso mineral promove incorporação duradoura à matriz óssea, mesmo após anos do uso
cessado (WATTS; DIAB, 2010). O tratamento e a ligação à matriz óssea prolongados
culminam em decréscimo da qualidade óssea, quando comparada a um tecido ósseo
fisiológico (ALLEN; BURR, 2008). Por fim, a baixa qualidade óssea é responsável pelo
aumento da incidência de fraturas atípicas de fêmur em pacientes sob tratamento da
osteoporose pós-menopausa (DONNELLY et al., 2012) e de metástases ósseas
resultantes do câncer de mama (WON et al., 2014).
O uso de N-BFs por um período prolongado também apresenta repercussões
importantes na cavidade oral, em que se destaca a osteonecrose dos maxilares, uma
condição restrita ao osso alveolar, caracterizada pela exposição de tecido ósseo
decorrente da incapacidade de cicatrização do epitélio após intervenções orais (AMLER;
JOHSON; STAM, 1960; KOHSLA et al., 2007).
A osteonecrose dos maxilares foi definida pela Sociedade Americana de
Pesquisa Óssea e Mineral como a exposição óssea no complexo maxilo-facial que não
cicatriza em 8 semanas após sua identificação, acometendo pacientes que recebem ou
receberam terapia com N-BFs sem, no entanto, terem passado por radioterapia
(KOHSLA et al., 2007).
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A patogênese da osteonecrose dos maxilares induzida por bisfosfonatos
(ONMB) possui caráter multifatorial, envolvendo os efeitos ósseos dos BFs como
supressão da remodelação óssea, depleção de osteoclastos e redução da angiogênese
associadas à invasão tecidual por micro-organismos periodontopatógenos e traumas
orais (EID; ATLAS, 2014). Pode-se estabelecer, também, uma relação entre a ocorrência
de ONMB e a utilização de N-BFs por via intravenosa, uma vez que esses fármacos têm
sua ação potencializada pela maior afinidade à hidroxiapatita (OROZCO; MAALOUF,
2012).
A ocorrência aumentada de osteonecrose nos maxilares se deve à alta taxa
de remodelação óssea sofrida pelos ossos da face em comparação aos demais do
corpo, o que propicia a rápida adsorção dos N-BFs nessas regiões. Por isso, os efeitos
negativos desse tratamento são vistos, primeiramente, nos maxilares (WALTER et al.,
2014).
A combinação entre a supressão da remodelação óssea e seus efeitos
antiangiogênicos com intervenções cirúrgicas dentoalveolares interfere na reconstituição
óssea, promovendo a exposição deste tecido (ESTILO et al.; 2008; ALLEN et al., 2009).
Os sintomas mais comuns incluem dor, edema, parestesia local, supuração e úlceras na
mucosa inserida (OROZCO; MAALOUF, 2012), que se seguem à necrose propriamente
dita.
A ONMB pode ser evitada ou pelo menos minimizada com o correto
aconselhamento do paciente a solicitar uma avaliação dentária antes do início do
tratamento, realizando as intervenções necessárias (RIZZOLI et al., 2008). O tratamento
inclui o uso de enxaguatórios bucais como o digluconato de clorexidina a 0,12%, terapia
antimicrobiana sistêmica e controle da dor (KOHSLA et al., 2007).
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2.5 Ácido Zoledrônico O ácido zoledrônico (ZOL) pertence à terceira geração de N-BFs (BLACK et
al., 2007; LAMBRIDOUNAK et al., 2008; REID et al., 2002; KHAJURIA; RAZDAN;
MAHAPATRA, 2011). Sua estrutura molecular apresenta dois átomos de nitrogênio
ligados a um anel heterocíclico, aumentando sua afinidade pela matriz óssea (RUSSEL
et al., 2008) (Figura 9).
Figura 9 – Estrutura química do ácido zoledrônico. Bisfosfonato nitrogenado pertencente à terceira geração, apresentando os átomos de nitrogênios ligados à uma cadeia cíclica. Adaptado de LI; DAVIS, 2003.
Seu efeito farmacológico consiste na inibição potente da reabsorção óssea
osteoclástica (GREEN et al., 2004), sendo indicado para o tratamento de doenças que
afetam o metabolismo ósseo, como a hipercalcemia maligna (LOKADASAN et al., 2015),
mieloma múltiplo (KYLE et al., 2007) e metástases ósseas (BROOM et al., 2014). Nestas
últimas, o ZOL age inibindo a anidrase carbônica e impedindo a multiplicação das
células tumorais e consequente invasão tecidual, mantendo o equilíbrio do pH (TAURO
et al., 2014). Tem sido demonstrado que o ZOL é bem tolerado e após sua
administração intravenosa (IV) apresenta boa distribuição aos diversos sítios calcificados
(LIN; DAVIES, 2003; MATHEW; BRUFSKY; 2014). Nancollas et al. (2006) observaram
que os diferentes tipos de BFs apresentam diferenças na cinética de ligação à
hidroxiapatita, tendo o ZOL, a maior afinidade por esta molécula, de maneira dose-
dependente (WEISS et al., 2008). Em modelos animais de roedores, Weiss et al. (2008) utilizaram ZOL marcado
com Carbono 14 e observaram que, após a administração intravenosa (IV) de 150 µg/kg
desse fármaco, a concentração plasmática máxima foi atingida em 5 minutos,
declinando rapidamente em 4 horas. Nesse período, foi constatado o aumento da
interação com tecidos calcificados, a qual se manteve até 24 horas. A excreção máxima
do ZOL ocorreu em 24 horas, principalmente pelos rins (WEISS et al., 2008).
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Quanto ao seu mecanismo de ação, o ZOL tem sido considerado o N-BF com
maior potência em inibir a síntese de FPPS e induzir a produção de Apppi (DUNFOR et
al., 2001). Essa característica justifica sua grande afinidade pela matriz óssea, bem
como sua maior capacidade de retenção neste tecido por um longo período de tempo,
otimizando sua ação antirreabsortiva (GREEN et al., 2004). Além disso, o ZOL, ensaiado
in vitro com osteoclastos de coelhos e humanos, mostrou-se um potente inibidor da
atividade da FPP, promovendo o aumento da ativação de caspases-3-like, cuja atividade
está relacionada à apoptose de osteoclastos (BENFORD et al., 2001). Foi sugerido que
a suprarregulação da caspase-3 poderia ser consequência da falta de GTPases
preniladas (BENFORD et al., 2001).
Sabe-se que as caspases desempenham um papel importante na maturação
de citocinas pró-inflamatórias (WANG; LENARDO, 2000). Diante disso, estudos
abordaram o papel do ZOL na produção de citocinas, as quais participam da
osteoclastogênese via eixo RANK/RANKL/OPG (BOYCE; XING, 2008). Kimachi et al.
(2011) realizaram ensaios in vitro com duas linhagens de células macrofágicas murinas:
RAW264.7 e células da medula óssea. As primeiras células foram cultivadas com
RANKL (100 ng/ml) e TNF-α (50 ng/ml), com ou sem ZOL (0,5 µM). Após 3 dias,
observou-se que a adição de ZOL às culturas preveniu a produção de RANK induzida
por TNF-α e RANKL. Em ensaios de Western Blotting, o ZOL inibiu a ativação do NF-κB
promovida por TNF-α. Corroborando esses achados, demonstraram que o TNF-α
aumenta a atividade transcricional do NF-κB em seus ensaios de luciferase. No entanto,
o tratamento com ZOL diminuiu significantemente tal atividade de transcrição. Nas
culturas de células da medula óssea, foram adicionados TNF-α (50 ng/ml), RANKL (100
ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) e ZOL (10 ou 30 µM). Verificou-se que o ZOL inibiu a
maturação de osteoclastos induzida por TNF-α e/ou RANKL, mesmo com adição de M-
CSF. Mercatali et al. (2013) analisaram os efeitos do ZOL ao longo do tempo em
pacientes sob tratamento quimioterápico do câncer de mama, próstata e pulmão. No
período de 9 a 12 meses de quimioterapia foi observado uma diminuição não significante
de RANKL, seguida de aumento de OPG (p>0,05), resultando, contudo, em diminuição
significante da razão RANKL/OPG em relação aos níveis basais. Quanto aos níveis
séricos do telopeptídeo N-terminal (NTX), um marcador da presença de reabsorção
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óssea, foi verificada a diminuição significante nos tempos de 3 a 4 meses e 6 a 8 meses,
em relação aos valores basais. Ohba et al. (2014a) realizaram um estudo in vitro de reabsorção óssea,
utilizando células da linhagem de células de osteosarcoma agressivo (K7M3), que
produzem um fator solúvel indutor da osteoclastogênese. A citometria de fluxo e a
reação de transcriptase reversa seguida de reação em cadeia de polimerase (RT-PCR)
mostraram que o ZOL foi responsável por diminuir a produção de RANKL nas culturas
dessas células. Também foi observado que a adição de ZOL inibiu a diferenciação
osteoclástica induzida pelas células K7M3, ao diminuir a marcação para TRAP. Quanto
à OPG, a reação em cadeia de polimerase em tempo real (qPCR) demonstrou que, nas
culturas tratadas, sua expressão aumentou. De fato, foi constatado um decréscimo na
razão RANKL/OPG (OHBA et al, 2014a). Sabe-se que uma variedade de tumores sólidos superexpressam VEGF-A e
os receptores VEGFR. Especialmente uma linhagem de células de osteosarcoma
agressivo, células K7M3, expressam altos níveis de VEGF-A e induzem resposta
neoangiogênica, favorecendo o crescimento tumoral rápido. Tem sido demonstrado que
N-BFs, como o ZOL e ALD, diminuíram a expressão de VEGFR2 em uma linhagem de
células endoteliais (bEnd.3) e inibe a proliferação e a proliferação e migração de células
endoteliais. Adicionalmente, o ZOL diminui a expressão de VEGF-A e VEGFR1 em
estudos com células de osteossarcoma agressivo (K7M3) in vitro e in vivo (OHBA et al.,
2014b). O ZOL, não obstante suas atividades antirreabsortivas via inibição e apoptose
de osteoclastos, parece modular a resposta imune inata por osteoblastos e macrófagos
estimulados por patógenos (CARAGLIA et al., 2006). Assim, considerando que os
osteoblastos possuem papel relevante na patogênese da doença osteoarticular induzida
por várias bactérias. Rizzo et al. (2014), em células humanas de osteosarcoma (SaOS-2)
com propriedades osteoblásticas, mostraram que o ZOL exerce efeito imunomodulador
da secreção de citocinas e nos efeitos citotóxicos da C. pneumoniae sobre as células
SaOS-2 durante 24, 48 e 72 horas. Ademais, esse fármaco inibiu o crescimento
bacteriano e, quando utilizado como pré-tratamento, induz um aumento dos níveis de
TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-12 em culturas colonizadas com C. Pneumonia.
Alguns estudos já investigaram as repercussões estruturais ósseas
consequentes do tratamento com ZOL durante a MDI. Sirisoontorn et al. (2012)
avaliaram o efeito da administração intraperitoneal de ZOL na dose de 1,6 µg/kg em
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ratas ovariectomizadas. O tratamento se iniciou duas semanas após a ovariectomia,
durando 6 semanas no total. As aplicações eram feitas semanalmente. Os dispositivos
ortodônticos foram instalados duas semanas após o início do tratamento com ZOL. Foi
relatado uma diminuição do deslocamento dentário após 28 dias. Além disso foi
constatado que o ZOL preveniu as reabsorções radiculares.
Os efeitos do ZOL na produção de mediadores inflamatórios e de marcadores
ósseos são notáveis. Entretanto, no contexto da remodelação óssea consequente à
MDI, são escassos os estudos que investigam a sua repercussão tanto na reabsorção
como na formação óssea. Diante disso, pareceu coerente averiguar os impactos do uso
do ZOL durante a MDI, correlacionando as alterações nos níveis de mediadores pró-
inflamatórios e a presença de biomarcadores do metabolismo ósseo com o seu efeito
farmacológico.
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
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3 JUSTIFICATIVA
Os bisfosfonatos nitrogenados são a classe de fármacos mais utilizada para
tratamento de desordens metabólicas ósseas, a exemplo da osteoporose, da doença de
Paget e das metástases ósseas advindas de tumores sólidos e mieloma múltiplo. Seu
uso estendido promove efeitos adversos relevantes na cavidade oral, como a
osteonecrose dos maxilares, uma condição que impede a cicatrização epitelial
promovendo exposição óssea. Esta condição depende, também, da via de
administração, tendo os fármacos endovenosos, como o ácido zoledrônico, maior
associação à esta doença.
O ácido zoledrônico (ZOL), um bisfosfonato nitrogenado, é considerado como
um potente inibidor da reabsorção óssea. Não obstante suas atividades antirreabsortivas
via inibição e apoptose de osteoclastos, o ZOL demonstrou potencial modulador a
resposta imune inata de osteoblastos e macrófagos quando estimulados por patógenos.
A movimentação dentária induzida (MDI) por dispositivo ortodôntico é
caracterizada por apresentar fenômenos de reabsorção e neoformação ósseas, devidos
a alterações vasculares e celulares, bem como à participação de mediadores
inflamatórios. Nesse contexto, fármacos antirreabsortivos podem interferir na MDI ao
promover um desequilíbrio da remodelação óssea.
A literatura, contudo, não tem abordado as repercussões do tratamento com o
ZOL na resposta inflamatória necessária à remodelação óssea alveolar durante a MDI.
Este trabalho objetiva avaliar a participação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α
e IL-1β, na modulação do eixo RANKL-OPG quando do tratamento com ZOL durante a
remodelação óssea da MDI.
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4 OBJETIVOS 4.1 Geral
O objetivo geral do presente estudo foi avaliar o efeito do ácido zoledrônico
(ZOL) na resposta inflamatória e na remodelação óssea alveolar durante a
movimentação dentária induzida em ratos.
4.2 Específicos
• Analisar os efeitos do ZOL na resposta inflamatória e na remodelação óssea
alveolar, por meio de: o Quantificação dos espaços entre os primeiros molares superiores e
incisicos centrais superiores de hemiarcadadas controles e submetidas à
MDI e contralaterais não submetidas; o Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal nos lados de
compressão e tração e áreas hialinas; o Histologia da raiz distovestibular e do osso alveolar circunjacente para
avaliação de reabsorções radiculares e ósseas; o Análise da infiltração neutrofílica por meoo da dosagem da atividade da
mieloperoxidase (MPO) gengival;
o Dosagens dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β por ELISA;
o Marcação imunohistoquímica para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP; o Avaliação do anabolismo ósseo pela dosagem sérica de Fosfatase Alcalina
Óssea • Verificar a repercussão sistêmica do ZOL mediante:
o Leucograma; o Análise da variação de massa corpórea.
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5 METODOLOGIA 5.1 Seleção de animais
Foram utilizados 72 ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, com massa
corpórea entre 180 e 220 gramas provenientes do Biotério Central do Campus do Pici da
Universidade Federal do Ceará – UFC e transferidos para o Biotério Setorial do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia (FaMed, UFC-Fortaleza). Estes animais
foram mantidos em gaiolas apropriadas, em número de 4 animais em cada uma delas.
Os ratos receberam ração comercial balanceada própria e água à vontade, e
permaneceram nas mesmas condições ambientais durante os experimentos. As coletas
de sangue foram utilizadas para obtenção de valores basais bioquímicos e de
leucograma.
5.2 Fármacos, reagentes e anticorpos Como abordagem farmacológica, foi utilizado medicamento genérico,
apresentado em frasco-ampola de 5 ml de solução injetável, contendo 4,264 mg de
ácido zoledrônico, equivalente a 4 mg de ácido zoledrônico, produzido pelo laboratório
Eurofarma (São Paulo-SP, Brasil). Antes da administração intravenosa (i.v.), o fármaco
foi adequado à temperatura ambiente e diluído em água destilada (H2Od).
Para a anestesia dos animais foi utilizada a combinação de cloridrato
quetamina (Cetamin, Syntec®, Hortolândia-SP, Brasil) com cloridrato de xilazina (Xilazin,
Syntec®, Hortolândia-SP, Brasil), em proporções de 90 mg/kg e 10 mg/kg,
respectivamente, administrada intramuscularmente (i.m.).
O brometo de hexadeciltrimetilamônio (H-TAB), a albumina sérica bovina
(BSA), a tetrametilbenzidina (TMB), o Tween TW20 e a Carragenina lâmbda tipo IV
foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis-MO, USA).
Para as dosagens de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-
1β) por ELISA, foram utilizados anticorpos anti-TNF-α e anti-IL-1β da R&D Systems
(Minneapolis-MS, EUA) [Anticorpos de captura: diluição em tampão fosfato-salino (PBS)
10% (1:1000); Anticorpos de detecção: diluídos em BSA 1% (1:1000)].
As marcações imunohistoquímicas foram feitas utilizando-se os anticorpos
primários policlonais de cabra TNF-α, fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP),
ligante do receptor ativador do fator nuclear-κB (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) com
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o respectivo secundário anti-cabra e sistema ABC, todos fornecidos pela Santa Cruz
(Dallas-TX, EUA) e diluídos no diluente de anticorpo com redução de background da
Dako (Barueri-SP, Brasil). O sistema de coloração para imunohistoquímica, cromógeno
3,3’diaminobenzidine DAB/peróxido foi adquirido da Dako (Carpinteria-CA, EUA).
A quantificação dos níveis séricos da enzimas fosfastase foi utilizado o kit
do fabricante LABTEST® (Labtest®, Lagoa Santa-MG, Brasil). O kit de coloração utilizado
para realização do leucograma dos animais foi obtido da Instant Prov Stain
Set® (Newprov Produtos para Laboratório, Pinhais-PR, Brasil).
O formol, o álcool etílico absoluto, o EDTA e a solução pronta de hematoxilina
de Harris utilizados nas diferentes análises foram obtidos da Dinâmica (Dinâmina,
Diadema-SP, Brasil).
5.3 Protocolo Experimental 5.3.1 Modelo de Movimentação Dentária Induzida (MDI)
Foi utilizado o modelo de movimentação dentária induzida (MDI) por
dispositivo ortodôntico descrito anteriormente por Heller e Nanda (1979), adaptado pelo
nosso laboratório por Dutra (2010) e Araújo (2015). Este modelo consistiu na utilização
de molas fechadas de níquel-titânio (Morelli®-ref. 35.20.064; Sorocaba-SP) fixadas aos
primeiros molares superiores esquerdos e incisivos centrais superiores por meio de fio
de amarrilho de aço inox de 0,008 polegadas (Morelli® - ref. 55.01.210; Sorocaba-SP) e
ativadas com uma força de 50 gf mensurada por tensiômetro (Morelli®, ref: 75.02.009,
Sorocaba-SP, Brasil) (KARRAS et al., 2009; KAIPATUR et al., 2013). Para fixação
adicional dos amarrilhos, criou-se um sulco na região cervical dos incisivos superiores
com um disco de lixa acoplado à uma microrretífica sob irrigação com soro fisiológico, e
preenchido com resina fotopolimerizável (Fill Magic, Vigodent®, Rio de Janeiro-RJ,
Brasil). Nenhuma ativação adicional foi feita ao longo do período experimental, no
entanto, os animais foram monitorados diariamente quanto à presença ou não deste.
Demonstrou-se que o modelo de MDI causa movimentação dos dentes a
partir do dia 1º dia, progredindo até o 4º dia. Do 4º ao 7º dia não é observado
deslocamento importante. Porém, a partir do 7º dia, a movimentação volta a ocorrer,
atingindo o pico no 11º dia da instalação da mola e, a partir de então, formando um platô
até o 21º dia (ARAÚJO; 2015). Microscopicamente, as raízes retornam a uma posição
mais centralizada no ligamento periodontal e apresentam maiores reabsorções,
caracterizando, assim, a remodelação óssea.
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Devido ao pico de movimentação dentária e a presença de remodelação
óssea ocorrer no 11º dia, este foi escolhido para eutanásia e análise dos materiais
coletados. Os animais foram eutanasiados após o referido período com overdose
anestésica da combinação de cloridratos de quetamina e xilazina.
Figura 10 – Representação esquemática do modelo de MDI por mola fechada Ni-Ti e administração de ZOL. No dia 0 foram registrados os valores basais de massa corpórea, leucograma e fosfatase alcalina óssea. A seguir, os animais, previamente anestesiados, receberam ZOL ou H2Od, tomaram-se os registros das medidas dos espaços interdentários e instalou-se a mola fechada de níquel-titânio ativada com 50 gf. No 7⁰ dia, repetiram-se as administrações de ZOL. Ao 11⁰ dia, foram refeitas as coletas de amostras sanguíneas e as medidas interdentais. As gengivas submetidas à MDI e contralaterais controles foram retiradas para dosagem da atividade de MPO e dos níveis e citocinas por ELISA. Seguiu-se a eutanásia e foram as maxilas para os ensaios de microscopia. LC: lado de compressão; LT: lado de tração; RRs: reabsorções radiculares; ROs: reabsorções ósseas.
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Figura 11 - Fotografia ilustrativa do modelo de movimentação dentária induzida. Posicionamento da mola fechada com fixação no primeiro molar superior esquerdo (1º MS) e incisivos superiores (ICS). A mola Ni-Ti é fixada com o fio de amarrilho e a resina na face vestibular dos incisivos superiores (Fonte: Laboratório de Osteofarmacologia). 5.3.2 Grupos Experimentais A. Grupo não tratado
Esses grupos foram constituídos por 8 ratos cada submetidos à MDI. Os
animais receberam água destilada (H2Od 1 ml/kg, i.v.) 5 minutos antes da instalação do
aparelho e após este, no 7º dia.
B. Grupos Ácido Zoledrônico (ZOL) Três grupos foram constituídos por 8 animais cada, os quais receberam ácido
zoledrônico dissolvido em água destilada nas doses de 50, 100 e 200 µg/kg-i.v.,
respectivamente. A primeira administração ocorreu 5 minutos antes da instalação do
aparelho, para que a mola fosse ativada concomitantemente ao pico plasmático desse
fármaco em ratos (WEISS et al., 2008). A segunda administração se deu após sete dias.
Os animais continuaram em observação até o 11º dia, quando, então, foram
eutanasiados.
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C. Grupos Controle Este grupo foi constituído por 8 animais não submetidos à instalação da mola,
nem abordagens farmacológicas, quando das análises macroscópicas e de variação da
massa corpórea.
Nos ensaios de histomorfometria, histologia, imunohistoquímica, dosagem da
atividade da mieloperoxidase e dos níveis de TNF-α e IL-1β por ELISA, foram utilizadas
as hemiarcadas contralaterais controles.
Ensaios Grupos
Macroscopia, microscopia e dosagens gengivais de MPO e TNF-α
Dosagem de IL-β
Controle 8 - NT 8 8
ZOL 50 µg 8 8 ZOL 100 µg 8 8 ZOL 200 µg 8 8
Quantidade de animais/ensaio 40 32
Total 72
5.4 Quantificação dos espaços interdentais Concomitantemente à mesialização dos molares desafiados ocorre a
palatinização dos incisivos. Dessa forma, as medidas obtidas entre molares e incisivos
do lado esquerdo foram subtraídas das medidas das hemiarcadas contralaterais, as
quais apresentaram apenas a palatinização dos incisivos, enquanto os molares
permaneceram imóveis na hemiarcada. Então, no 11º dia, imediatamente antes da
eutanásia dos animais, foram tomadas as medidas dos espaços entre os primeiros
molares superiores esquerdos e incisivos superiores das hemiarcadas submetidas à MDI
(MDI11) e das contralaterais controles (N11) de cada animal, utilizando paquímetro digital.
Os valores encontrados nas hemiarcadas no dia da eutanásia foram subtraídos
daqueles encontrados no dia 0, MDI0 e N0, respectivamente. Por fim, a subtração entre essas diferenças foi calculada em percentual, em função do valor basal N0, a seguir:
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5.5 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea (FAO) Antes da instalação da mola (dia zero), bem como na ocasião da eutanásia
(dia 11), foram coletados 1 ml sangue do plexo orbital dos animais sob anestesia. Em
seguida, para a reposição dos fluidos, 2 ml de solução salina de NaCl a 0,9% foram
administrados por via intraperitoneal no dia zero. Os tubos de sangue foram
centrifugados (1800 g) por 10 minutos e o soro foi coletado e armazenado para
avaliação indireta da atividade osteoblástica, por meio da dosagem de fosfatase alcalina
óssea FAO. A quantificação seguiu a metodologia da inativação térmica de amostras
(MOSS; WHITBY, 1975), conforme instruções do fabricante (Labtest®, Lagoa Santa-MG,
Brasilpara a dosagem de FAT, a seguir:
Após a identificação dos tubos de ensaio em Branco, Amostra e Padrão,
adicionou-se em todos os tubos a quantidade de 250 µl do tampão e 25 µl de substrato.
Posteriormente, adicionou-se 25 µl da amostra nos tubos assim identificados e 25 µl de
padrão no tudo assim identificado inicialmente. Após a homogeneização, todos os tubos
foram submetidos ao aquecimento indireto a 37 ºC por 10 minutos. Em seguida adiciona-
se 1 ml do reagente de cor em todos os tubos para que sejam efetuadas as leituras
espectrofotométricas em 590 nm. A fosfatase alcalina óssea é determinada pela
dosagem da fosfatase alcalina total (constituída pelas isoformas hepática, entérica e
óssea) subtraída da dosagem realizada com a amostra aquecida a 56 ºC por 10 minutos,
seguindo a mesma sequência descrita acima. Os níveis séricos de fosfatase foram
expressos em unidades por litro (U/l).
5.6 Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal
Após os registros dos espaços interdentais, as hemiarcadas foram
removidas e fixadas em formol a 10% tamponado por 48 horas. Em seguida, foram
desmineralizadas em EDTA a 10% durante 30 dias, aproximadamente. Posteriormente,
foram lavadas em água corrente por 1 hora, e processadas para a inclusão das maxilas
em parafina. Os cortes obtidos com espessura de 4 µm em lâminas apropriadas foram
corados com hematoxilina e eosina.
Para esta análise, consideraram-se os cortes transversais da raiz
distovestibular (DV) do primeiro molar superior esquerdo, por apresentar menos
variabilidade de morfometria e de posição na hemiarcada (Figura 11).
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Figura 12 – Fotomicrografia das raízes do primeiro molar superior esquerdo do rato. Corte transversal do primeiro molar superior esquerdo do animal. Em destaque, as raízes mesial (M), intermediária (INT), mesiolingual (ML), distolingual (DL) e distovestibular (DV), sendo esta utilizada na histomorfometria.
As imagens digitalizadas das lâminas foram obtidas por meio de microscópio
ótico (Nikon Eclipse-Ci, Tóquio, Japão). Nas fotomicrografias foram identificadas as
estruturas dentárias como osso alveolar, ligamento periodontal, cemento, dentina e
polpa dentária (Figuras 13A e 13B). Histomorfometricamente, foram quantificadas (%) as
áreas de compressão, tração e hialinas do ligamento periodontal utilizando-se o software
NIS Elements Documentation®. Para isso, foi traçada uma linha correspondente ao
limite externo do ligamento periodontal, em contato com trabeculado ósseo (Figura 13C).
Posteriormente, traçou-se outra linha coincidente ao limite interno do ligamento
periodontal, em contato com o cemento (Figura 13D). A área total do ligamento
periodontal foi obtida pela diferença entre essas medidas. Após isso, foram delineadas
as áreas de compressão e tração, delimitadas por um ângulo de 120⁰, no ligamento
periodontal e somadas entre si, respectivamente (Figuras 13E e 13F). As respectivas
áreas, de compressão ou tração, foram expressas em percentual em relação à área total
do ligamento periodontal, a seguir:
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As áreas hialinas, quando presentes ao longo do ligamento periodontal,
também foram calculadas. Para tanto, estas foram contornadas e somadas suas áreas
entre si (Figura 14). Por fim, o total de área hialina foi expresso em percentual em
relação à área total do ligamento periodontal, a seguir:
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Figura 13 – Fotomicrografias ilustrando os delineamentos para quantificação das áreas de compressão e tração do ligamento periodontal. Para a histomorfometria foram utilizadas as raízes DV a partir dos cortes transversais do primeiro molar superior esquerdo do animal. A e B. Fotomicrografias demonstrando as estruturas correspondentes do periodonto (oa: osso alveolar; lp: ligamento periodontal; c: cemento; d: dentina; p: polpa dentária); C. Linha azul demarcando contorno externo do ligamento periodontal, em contato com o trabeculado ósseo; D. Linha vermelha delimitando a área mais externa do cemento; E. Linha laranja delimitando a área do ligamento periodontal no lado de compressão compreendida pelo ângulo de 120⁰; F. Linha verde delimitando a área do ligamento periodontal no lado de tração compreendida pelo ângulo de 120⁰. Setas pretas indicam lado de compressão e setas brancas, lado de tração.
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Figura 14 – Fotomicrografia com delineamento para a quantificação das áreas hialinas do ligamento periodontal. Delimitação em azul das áreas hialinas presentes no ligamento periodontal. A seta preta indica o lado de compressão e a branca, lado de tração. 5.7 Histologia de reabsorções radiculares e ósseas alveolares
Para esta análise, foram consideradas as mesmas fotomicrografias da raiz
distovestibular (DV) do primeiro molar superior esquerdo, utilizadas para a análise
histomorfométrica.
Foram inseridos círculos englobando as raízes, cujos raios partiam do centro
da polpa. Demarcou-se, então, uma linha que coincidia com o longo eixo das raízes
dividindo o círculo em duas metades, correspondentes a dois ângulos de 180º. O lado
correspondente à área de compressão, foi dividido em três partes com ângulos de 60º
cada, como ilustrado na figura 15.
A partir dessa divisão em ângulos de 60º, foram estabelecidos escores de 0 a
3 para mensurar o grau das reabsorções radiculares (RR) e ósseas (RO), de acordo com
a abrangência de cada sextante, como mostrados no quadro 1.
Quadro 1 – Escores referentes à extensão de reabsorções radiculares (RR) e ósseas (RO) nos lados de compressão.
Escores Grau de extensão de reabsorções
0 RR/RO ausentes 1 RR/RO abrange 60º da área delimitada 2 RR/RO abrange 120º da área delimitada 3 RR/RO abrange 180º da área delimitada
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K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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Figura 15 – Fotomicrografia com delineamento para as análises histológicas de reabsorções radiculares e ósseas. Delimitação da raiz com um círculo cujo raio parte do centro da polpa. A linha que divide o círculo em duas metades coincide com o longo eixo da raiz, dividindo o círculo em duas partes com ângulos de 180º. A metade correspondente ao lado de compressão está dividida em três partes, com 60º cada.
5.8 Dosagem da atividade da mieloperoxidase (MPO) gengival No intuito de quantificar a presença de neutrófilos na gengiva subjacente à
área submetida à MDI, a atividade da mieloperoxidase gengival foi avaliada, uma vez
que tal enzima se encontra presente em abundância nos grânulos azurófilos de
neutrófilos. O ensaio foi realizado conforme protocolo descrito anteriormente por
Bradley, Christensen, Rothstein (1982), adaptado por Lima et al. (2005).
No 11⁰ dia, os tecidos gengivais de 8 animais de cada grupo, bem como o da
hemiarcada contralateral do grupo controle, foram removidos e armazenados em freezer
-80 ⁰C. Posteriormente, foram homogeneizados e processados para análise da atividade
da mieloperoxidase em leitor de placas. Assim, o tecido gengival foi pesado e triturado
em solução contendo NaCl (100 mM), EDTA (15 mM) e NaPO4 (20 mM) e o homogenato
foi centrifugado a 4 ºC por 15 minutos (3000 g). O pellet foi, então, imergido em solução
hipotônica com 900 µl de NaCl a 0,2%; 900 µl de NaCl a 1,6%; 900 µl de glicose a 5%, e
novamente centrifugado (3000 g) a 4 ºC por 15 minutos. O pellet final foi ressuspendido
em solução de NaPO4 a 50 mM e hexadecil-trimetil-brometo de amônio (H-TAB), e
homogeneizado (10000 g) a 4oC por 15 min. O sobrenadante foi usado para o ensaio em
adição ao tetrametilbenzidina (1,6 mM) e H2O2 (0,5 mM). A reação enzimática foi
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interrompida com 50 µl de H2SO4 (1M). A atividade de MPO foi determinada em
absorbância de 450 nm.
Os valores foram expressos em atividade de MPO por miligrama de gengiva
comparada à curva padrão construída utilizando neutrófilos peritoneais de ratos. Para
alcançar este objetivo, a migração de neutrófilos foi induzida por injeção intraperitoneal
de carragenina lambda tipo IV em ratos (300 µg/cavidade peritoneal) (CUNHA et al.,
1989). Uma curva padrão relativa de neutrófilos (>90% de pureza) e os números de
absorbância foram obtidos por processamento de neutrófilos purificados, como descrito
acima, e o ensaio da atividade de MPO foi realizado.
5.9 Dosagens dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β
Os primeiros sobrenadantes obtidos por ocasião dos ensaios da MPO foram
utilizados para quantificar os níveis de TNF-α e IL-1β por ELISA. Inicialmente, placas de
96 poços foram incubadas overnight a 4 °C com anticorpos anti-TNF-α ou anti-IL-1β
diluídos em PBS na concentração de 1:1000 (R&D Systems). Após a sensibilização das
placas, estas foram lavadas três vezes com solução tampão PBS/Tween-20 (0,05% R&D
Systems). Após isso, as amostras foram adicionadas em poços únicos cada e a curva
padrão foi realizada por meio de diluições seriadas em 11 poços seguidas de incubação
overnight a 4 ºC. As placas foram lavadas novamente e incubadas com anticorpo
monoclonal biotinilado anti-TNF-α ou anti-IL-1β (R&D Systems) diluídos em BSA a 1%
na concentração de 1:1000. Após o período de incubação à temperatura ambiente por 2
h, repetiram-se as lavagens das placas e foram adicionados 100 µL do complexo HRP-
estreptavidina 1000 (R&D Systems) diluído 1:5000. Decorridos 20 minutos, 50 µL do
reagente de cor o-fenilenodiamina (OPD, R&D Systems) foram adicionados e as placas
foram incubadas na ausência de luz a 37 ºC por 20 min. A reação enzimática foi
interrompida com 100 µl de stop solution (2 NH2SO4) e a densidade óptica foi mensurada
a 450 nm em espectrofotômetro. As concentrações das citocinas contidas nas amostras
foram calculadas a partir da curva padrão, sendo as concentrações iniciais de 4000
pg/ml. Os resultados foram expressos em picograma de citocinas (CUNHA et al., 1993).
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5.10 Análise imunohistoquímica para detecção de TNF-α, RANKL, OPG e TRAP
A partir dos blocos de parafina utilizados para a histologia foram obtidos
cortes (4 µm) em lâminas de poli L-lisina (Probe on Plus®) adequadas para a técnica de
imunohistoquímica. Os cortes foram desparafinizados em estuda a 60 ⁰C e hidratados
em temperatura ambiente por meio de imersões conseguintes em xilol, álcool 95% e
água destilada em referido período de tempo para cada solução. Em seguida, foram
imersos em solução tamponada 0,1 M (Tampão de citrato; pH 6,0) sob aquecimento a
65 ⁰C, por 30 minutos. Após o resfriamento em temperatura ambiente por 20 minutos, os
cortes foram incubados em peróxido de hidrogênio a 3%, para bloqueio da peroxidase
endógena, intercaladas com solução tamponada de fosfato (PBS). A fim de se bloquear
ligações proteicas inespecíficas, o BSA a 5% foi utilizado para o bloqueio de proteínas.
A incubação com anticorpos primários anti-RANKL (1:100), anti-OPG
(1:100), anti-TRAP (1:100) e anti-TNF-α (1:100) foi feita durante a noite (overnight) a 4
⁰C. Seguidamente, realizaram-se novas lavagens e posterior incubação com anticorpo
secundário biotilinado anti-IgG anti-RANKL (1:100), anti-OPG (1:300), anti-TRAP (1:300)
e anti-TNF-α (1:300) durante 30 minutos, à temperatura de 22 a 25 ⁰C. Nesse período, o
complexo ABC foi preparado conforme instrução do fabricante (Vectastain ®). Após nova
lavagem com PBS, a reação foi visualizada pela adição do cromógeno
3,3’diaminobenzidina DAB/peróxido, por 2 minutos, em temperatura ambiente. A reação
foi interrompida com água destilada e as lâminas foram contracoradas por hematoxilina
de Harry durante 5 minutos, em temperatura ambiente. Os controles negativos foram
processados simultaneamente conforme protocolo descrito acima. No entanto, o
primeiro anticorpo foi substituído por PBS-BSA 5 %. Nenhum dos controles negativos
mostrou imunorreatividade para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP. (Apêndice A). Por fim,
foram realizadas desidratação seriada em concentrações de álcoois, clareamento em
xilol e, finalmente, as respectivas montagens das lâminas e lamínulas.
As contagens de células positivas para os marcadores utilizados foram
realizadas em microscópio ótico (Nikon Eclipse-Ci, Tóquio, Japão) por um examinador
cego quanto aos tratamentos empregados. Foram selecionados para as contagens, dois
campos microscópicos com aumento de 400x, correspondentes aos lados de
compressão e de tração do ligamento, respectivamente. Consideraram-se marcações
positivas àquelas que apresentavam coloração marrom. Para TRAP, foram contadas,
somente, marcações marrons em células multinucleadas.
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5.11 Análise do Leucograma Os leucogramas foram avaliados antes da instalação da mola (dia 0) e no
momento da eutanásia (dia 11), a partir do plexo venoso caudal. Foram coletados 20 µl
de sangue e diluídos em 380 µl de líquido de Turk, para a realização da contagem do
número total de leucócitos, utilizando câmara de Neubauer. Adicionalmente, uma gota
de sangue foi colhida para a confecção de esfregaço corado pelo método HE para as
contagens diferenciais de neutrófilos, linfócitos e monócitos.
5.12 Análise da variação de massa corpórea Os animais tiveram suas massas corporais medidas antes da instalação do
aparato ortodôntico e, após este, diariamente, durante 11 dias. Os valores encontrados
foram expressos como a variação de massa corpórea (g) em relação à massa inicial.
5.13 Aspectos éticos Todos os protocolos abordados foram previamente submetidos e aprovados
pelo Comissão de Ética para Uso de Animais da Universidade Federal do Ceará, sob
número 28/15 (Anexo A). Os pesquisadores envolvidos se esforçaram em reduzir ao
mínimo o número de animais utilizados, bem como o sofrimento dos mesmos de acordo
com as orientações previstas na Lei Arouca 11.794/2008 e suas resoluções normativas.
5.14 Análise estatística
A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilke. Os dados
paramétricos como os resultados da quantificação da MDI, das análises
histomorfometrica e imunohistoquímica, dosagens em tecidos gengivais, dosagem de
fosfatase alcalina óssea, leucograma e variação de massa corpórea foram expressos
como média±erro padrão da média (epm) e as comparações entre os grupos foram
realizadas pela Análise de Variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparações
múltiplas de Bonferroni. Os dados não paramétricos, como os da análise histológica por
escores, foram expressos em mediana, seguida de seus valores extremos. As
comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste de Kruskall-Wallis, seguido
pelo pós-teste de Dunn. Em todas as situações foi adotado o nível de significância de
P<0,05. O software utilizado para todas as análises foi o GraphPad Prism® versão 6.0
para Mac OS X (La Jolla-CA, EUA), com licença devidamente autorizada.
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6. RESULTADOS 6.1. Quantificação dos espaços interdentais
A MDI foi avaliada diretamente na maxila, considerando os espaços entre a
distal do incisivo e a mesial do primeiro molar superiores de hemiarcadas controles (não
submetidas à MDI) e submetidas à intalação e ativação da mola de animais que
receberam apenas H2Od (não tratados) ou tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg).
A figura 16 mostra que a instalação e a ativação da mola de Ni-Ti entre os
primeiro molar superior esquerdo e incisivos superiores nos animais do grupo não
tratado resultou em um aumento de 87,2% do movimento dentário quando comparado
às hemiarcadas contralaterais controles, as quais não foram submetidas à MDI
(Controle= 1±0,3; NT= 7,8±0,5). Observou-se que o ZOL, nas três doses utilizadas,
reduziu de forma significante (p<0,05) e dose-dependente a MDI após 11 dias, quando
comparada a MDI em animais não tratados (ZOL 50= 2,6±0,2; ZOL 100= 1,4±0,1; ZOL
200= 0,7±0) em 76,5%, 94,1% e 104,4%, respectivamente, comparadas ao grupo não
tratado (NT= 7,8±0,5).
Figura 16 – Movimentação dentária induzida (MDI) durante 11 dias por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. As hemiarcadas foram mensuradas antes e após 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da média da MDI obtida pela diferença entre as medidas encontradas no dia 0 e 11 em animais dos grupos Controle, não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT; ¤p<0,05 em relação ao ZOL 50; §p<0,05 em relação ao ZOL 100 µg/kg. ANOVA; Bonferroni.
6.2 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea (FAO)
A figura 17 demonstra que a MDI por 11 dias não alterou os níveis séricos de
fosfatase alcalina óssea, quando comparada aos valores controle (Controle= 97,2±2,6;
NT= 84,5±5,6; p>0,05).
Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000
2
4
6
8
10
Mov
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)
#
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(µg/kg)
#*
MDI (11 dias)
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As três doses de ZOL administradas durante 11 dias de MDI reduziram
significantemente (p<0,05) os níveis da FAO (ZOL 50= 41,7±5,3; ZOL 100= 47,7±2,2;
ZOL 200= 41,7±1,9), em 67,8%, 62,6% e 67,8%, respectivamente, quando comparados
aos valores dos não tratados (NT= 84,5±5,6).
Figura 17 - Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea em animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Amostras sanguíneas foram coletadas antes (valores controles) e após 11 dias da MDI. Os valores representam a média ± erro padrão da média dos níveis séricos fosfatase alcalina óssea de animais dos grupos controle, não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.
6.3 Análise histomorfométrica A raiz distovestibular do primeiro molar superior esquerdo dos animais foi
avaliada histomorfometricamente. Consideraram-se as áreas do ligamento delimitadas
pelo ângulo de 120⁰ nos lados de compressão (LC) e de tração (LT) do ligamento. Na
figura 18 (A e B) observa-se que 11 dias de MDI não causaram alterações significantes
(p>0,05) nas áreas de compressão (Controle= 24,2±1,5; NT= 23,8±1,6) e tração
(Controle= 31,2±1,58; NT= 31,6±0,8), respectivamente, assim como o tratamento com
ZOL nas três doses utilizadas também não induziu alterações significantes em ambos os
lados avaliados (LC: ZOL 50= 21,9±1,2; ZOL 100= 22,2±1,9; ZOL 200= 23±2); (LT: ZOL
50= 33,7±; ZOL 100= 33,5±2,3; ZOL 200 =32±1,7), em comparação às hemiarcadas dos
animais não tratados (LC: NT=23,8±1,6; LT: NT= 31,6±0,8), respectivamente.
A figura 18C ilustra que 11 dias de MDI induziu significantemente a formação
de áreas hialinas no ligamento periodontal de animais não tratados, quando comparados
ao grupo Controle (Controle= 0,0±0,0; NT= 1,5±0,0). O tratamento com as três doses de
ZOL foi capaz de reduzir significantemente (p<0,05) o surgimento dessas áreas no
Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000
20
40
60
80
100
120
FAO
(U/l)
(µg/kg)MDI (11 dias)
*# *#*#
60
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ligamento periodontal (ZOL 50= 0,7±0,0; ZOL 100= 0,7±0,3; ZOL 200= 0,6±0,0) em
53,3%, 53,3% e 60%, respectivamente, quando comparados ao grupo controle (NT=
1,5±0,0).
6.4 Análise histológica A figura 19A ilustra as estruturas do periodonto correspondentes às
observadas nas fotomicrografias. Na figura 19B observa-se uma raiz distovestibular de
uma hemiarcada controle, não submetida a MDI, com preservação de osso alveolar na
periferia do ligamento periodontal, de cemento e de dentina. As raízes distovestibulares
dos animais não tratados submetidos à MDI por 11 dias, demonstraram intensas áreas
de reabsorções óssea, cementária e dentinária no lado de compressão do ligamento
periodontal. A administração de ZOL, nas doses de 50, 100 e 200 µg/kg, manteve a
integridade das estruturas periodontais (figura 19D, E e F).
A análise histológica mostrou que após 11 dias de MDI, houve um aumento
significante da reabsorção radicular, bem como da reabsorção óssea. O tratamento com
ZOL nas doses de 50, 100 e 200 µg/kg foi capaz de prevenir, de forma significante, as
reabsorções radiculares e ósseas, sendo as doses de 100 e 200 µg/kg, mais eficazes
em reduzir a reabsorção radicular, quando comparadas à dose de 50 µg/kg (Tabela 1).
Tabela 1 – Efeito do ácido zoledrônico sobre as reabsorções radiculares e ósseas após 11 dias de MDI.
N=8/grupo; #p<0,05 comparado ao grupo Controle; *p<0,05 comparado ao grupo NT; ¤p<0,05 em relação ao grupo ZOL 50 µg/kg. ANOVA; Bonferroni.
Grupos Áreas reabsortivas
Controle NT ZOL 50 µg/kg
ZOL 100 µg/kg
ZOL 200 µg/kg
Reabsorção Radicular (escores)
0 (0-0) 2 (2-3)# 1,5 (0-2)* 1 (0-1)*,¤ 0 (0-1)*,¤
Reabsorção Óssea (escores) 0 (0-0) 3 (2-3)# 1,5 (1-2)* 1 (0-2)* 1 (0-2)*
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Figura 18 – Análise histomorfométrica dos sítios de compressão (A) e de tração (B) e áreas hialinas do ligamento periodontal pós 11 dias de MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. As maxilas foram removidas após 11 dias e processadas para método HE. Os valores representam a média ± erro padrão da média da razão entre as áreas de compressão, tração e hialinas, e a área total do ligamento periodontal (%) na raiz distovestibular de animais dos grupos controle, não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.
Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000
10
20
30
40R
azão
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(µg/kg)MDI (11 dias)
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Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000
10
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40
(µg/kg)MDI (11 dias)
B
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amen
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)
Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
#
#
(µg/kg)MDI (11 dias)
*# *#
C
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Figura 19 - Fotomicrografias dos cortes transversais das raízes distovestibulares. (A) Esquema de estruturas do periodonto: osso alveolar (oa), ligamento periodontal (lp), cemento (c), dentina (d) e polpa (p). (B) Raiz de hemiarcada controle. Raízes de hemiarcadas de animais não-tratados submetidos à MDI (C) ou ZOL 50 µg/kg (D), 100 µg/kg (E) e 200 µg/kg (F). Setas pretas indicam lado de compressão e setas brancas, lado de tração.
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6.5 Atividade da mieloperoxidase (MPO) gengival
A figura 20 demonstra que 11 dias de MDI aumentou a atividade da
mieloperoxidase de forma significante (p<0,05) em 200%, quando comparada ao tecido
gengival de hemiarcadas não tratadas (NT=0,9±0,2; NT= 2,7±0,4).
O ZOL nas três doses utilizadas preveniu significantemente (p<0,05) o
aumento da MPO (ZOL 50=0,5±0,12; ZOL 100=0,5±0,15; ZOL 200=0,4±0,16), em
72,2%, 72,2% e 77,8%, respectivamente, em relação ao tecido gengival de animais
controle (NT= 2,3±0,6).
Figura 20 - Atividade da mieloperoxidase no tecido gengival de hemiarcadas controles e submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Os tecidos gengivais subjacentes à área desafiada foram removidos após 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da média da quantificação de MPO (U x 103/mg de tecido) de animais dos grupos Controle, não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.
6.6 Análise dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β
A figura 21 mostra que 11 dias de MDI (NT) aumentaram de forma significante
(p<0,05) os níveis de TNF-α e IL-1β em 621% e 200%, respectivamente, no tecido
gengival, quando comparados às gengivas contralaterais controles (TNF-α:
Controle=0,2±0,0; NT=1,7±0,2; IL-1β: Controle=0,2±0,0; NT=0,6±0,1).
O tratamento com ZOL (200 µg/kg) não preveniu o aumento significante nos
níveis gengivais de ambas as citocinas após 11 dias de MDI (TNF-α: NT=1,7±0,2; ZOL
200= 1,3±0,2; IL-1β: NT= 0,6±0,1; ZOL 200=0,4±0,0)
Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000
1
2
3
4
MPO
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#
*
(µg/kg)MDI (11 dias)
* *
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
CDD 615.1
Figura 21 – Níveis de TNF-α e IL-1β no tecido gengival de hemiarcadas controles e submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Os tecidos gengivais subjacentes à área desafiada foram removidos após 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da média dos níveis de gengivais de TNF-α e IL-1β (pg/mg x 103/mg de tecido) de animais dos grupos Controle, Não tratado (NT) e tratados com ZOL (200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle. ANOVA; Bonferroni. 6.7 Análises imunohistoquímicas
As imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP presentes nos lados
de compressão e de tração, respectivamente, de uma raiz distovestibular, estão
representadas através das figuras, onde constam as contagens de células positivas na
figura 22, e as fotomicrografias das imunomarcações nas figuras 23 e 24. Observou-se
que a raiz de animais controles não submetidos à MDI apresentou um número
importante de marcações positivas para TNF-α nos lados de compressão e tração
(figuras 22A e 23B: Controle=16±2; figuras 22A e 24B: Controle=15,6±1,7). Após 11 dias
de MDI nos animais que não tratados, foi constatado um aumento significante dessas
marcações no lado de compressão (figuras 22A e 23D: NT=27,7±1,4). No lado de
tração, não foram observadas diferenças nessa contagem (figuras 22A e 24D:
NT=18,3±0,9). A maior dose de ZOL reduziu significantemente as marcações nos lados
Controle NT ZOL 2000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
TNF-α
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MDI (11 dias)
#
#
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Controle NT ZOL 2000.0
0.2
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IL-1β
(pg/
mg
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#
(µg/kg)MDI (11 dias)
B
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de compressão (figuras 22A e 23F: ZOL 200=7±1,1) e de tração (figuras 22A e 24F: ZOL
200=6±1,7).
Para RANKL, foi observado que as hemiarcadas de animais controles não
submetidas à MDI apresentaram poucas marcações positivas nos lados de compressão
(figuras 22B e 23H: Controle= 4,7±0,33) e de tração (figuras 22B e 24H: Controle=
04,7±0,9). A MDI durante 11 dias foi responsável por aumentar, de forma significante, as
células RANKL+ em ambos os lados nos animais não tratados (figuras 22B e 23J: NT=
14,3±3,4; figura 22B e 24J: NT= 14,3±0,6). A maior dose do ZOL diminuiu de forma
significante as imunomarcações para RANKL tanto no lado de compressão (figuras 22B
e 23L: ZOL 200= 2,3±0,3) como no de tração (figuras 22B e 24L: ZOL 200= 1,6±0,3).
Para OPG, constatou-se que as hemiarcadas controles apresentaram leve
imunomarcação nos lados de compressão (figuras 22C e 23N: Controle= 4,7±0,9) e
tração (figuras 22C e 24N: Controle= 5±1). Após 11 dias de MDI, foi constatado que não
houve diferença significante no número de marcações no lado de compressão (figuras
22C e 23P: NT= 3±0,6) nos animais não tratados, quando comparado ao controle. No
lado de tração, foi observado um aumento significante de células OPG+ (figuras 22C e
24P: NT= 12,7±1,8) após 11 dias de MDI. O ZOL, na maior dose, preveniu de forma
significante, as marcações positivas no lado de tração (figuras 22C e 24R: ZOL 200=
3,3±0,3) mantendo o número de marcações no lado de compressão (figuras 22C e 23R:
ZOL 200= 2,3±0,3).
A razão RANKL/OPG para os lados de compressão e tração se mostraram
equivalentes nos animais controles não submetidos à MDI como está demonstrado na
figura 22D (compressão: Controle= 1±0,13; tração: Controle= 0,9±0). A MDI por 11 dias
nos animais não tratados, foi responsável pelo aumento significante da razão
RANKL/OPG no lado de compressão (figura 22D: NT= 4,8±0,9), a qual se manteve
estável no lado de tração (figura 22D: NT= 1,3±0,2). A maior dose do ZOL foi
responsável por diminuir, significantemente, a razão RANKL/OPG em ambos os lados do
ligamento periodontal (figura 22D; compressão: ZOL 200= 1±0; tração: ZOL 200=
0,5±0,1).
Por fim, as marcações para TRAP no periodonto de animais controles não
submetidos à MDI, foram observadas em quantidade reduzida nos lados de compressão
(figuras 22E e 23S; Controle= 1±0,13) e tração (figuras 22E e 24S; Controle= 2±0,0). Ao
fim de 11 dias de MDI em animais não tratados, houve um aumento significante do
número de imunomarcações no lado de compressão (figuras 22E e 23V; NT= 20,7±0,9),
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não havendo alterações significantes no lado de tração (figura 22E e 24V; NT= 2,7±1,2).
O ZOL, em sua maior dose, preveniu significantemente o aumento de células TRAP+ no
lado de compressão (figuras 22E e 23Y; ZOL 200= 4±1,7) e não induziu alterações
significantes nesta contagem no lado de tração (figuras 22E e 24Y; ZOL 200= 1,7±0,33).
Figura 22 – Contagens das imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP. Os gráficos representam o número de marcações encontrados nos lados de compressão e tração no ligamento periodontal. Número de marcações TNF-α+ (A), RANKL+ (B), OPG+ (C), razão RANKL/OPG (D) e TRAP+ (E). Os valores representam a média ± erro padrão da média do número de células nos cortes histológicos dos grupos Controle, Não tratado (NT) e ZOL (200 µg/kg). N=3/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni
Controle NT ZOL 2000
10
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30
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(µg/kg)
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(µg/kg)
B
MDI (11 dias)
Controle NT ZOL 2000
5
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15
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N° d
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OPG
+
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*
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(µg/kg)MDI (11 dias)
Controle NT ZOL 2000
2
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RA
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*#
#
*(µg/kg)
D
MDI (11 dias)
Controle NT ZOL 2000
5
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*(µg/kg)
E
MDI (11 dias)
Lado deCompressãoLado de Tração
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6.8 Leucograma
A figura 25 A, B, C e D mostram que 11 dias de MDI não provocaram
aumento significante do número total de leucócitos (Controle=16,9±0,6; NT= 16,7±2,8),
bem como os números de neutrófilos (Controle= 3,9±0,2; NT= 4±0,7), linfócitos
(Controle= 12±0,4; NT= 11,2±2,2) ou monócitos (Controle= 0,6±0,0; NT= 0,4± 0,0),
respectivamente.
As três doses de ZOL administradas durante 11 dias de MDI não induziram
alterações significantes (p>0,05) na contagem de leucócitos totais (NT=16,7±2,8; ZOL
50=15,4±1,7; ZOL 100=15,9±1; ZOL 200=16,4±1,2), bem como no número de neutrófilos
(NT=4±0,7; ZOL 50=3,6±0,5; ZOL 100=4,8±0,4; ZOL 200=4,5±0,4), linfócitos
(NT=11,2±2,2; ZOL 50=11,6±1,5; ZOL 100=11±0,7; ZOL 200=10,7±0,9) e monócitos
(NT= 0,4± 0,0; ZOL 50=0,3±0,0; ZOL 100=0,5±0,0; ZOL 200=0,6±0,0) quando
comparados aos respectivos não tratados.
Figura 25 - Leucograma de animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Amostras sanguíneas foram coletadas antes (valores controles) e após 11 dias da MDI. Os valores representam a média ± erro padrão da média do leucograma de animais dos grupos Controle, Não tratado (NT) e ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; ANOVA; Bonferroni.
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Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000
5
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(µg/kg)MDI (11 dias)
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Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000
5
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MDI (11 dias)
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(µg/kg) Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000
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(µg/kg)
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MDI (11 dias)
70
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6.9 Variação de massa corpórea
A figura 26 mostra a variação de massa corpórea causada pela MDI por 11
dias, quando comparada a de animais controles, não submetidos a MDI. Observou-se
que a MDI induziu significante (p<0,05) a perda de peso nos animais não tratados a
partir do 1º dia (valores basais) e assim mantendo até o 5º dia. A partir do 6º dia, os
animais atingem seus valores basais, ultrapassando-os a partir do 8º até o 11º dia, sem,
contudo, atingir os valores de animais controles.
O tratamento com ZOL, nas três doses utilizadas, não alteraram a perda de
massa corpórea vista durante os 11 dias de MDI (p>0,05).
Figura 26 - Efeito do Ácido Zoledrônico (ZOL) na variação da massa por 11 dias em animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Os animais foram pesados diariamente por 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da variação de massa corpórea, obtidos pela diferença entre os pesos de cada animal e o peso observado no dia 0, de animais dos grupos Controle, Não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
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7. DISCUSSÃO
Nesse estudo, foi escolhido o modelo de movimentação dentária induzida em
animais por ter se mostrado útil para estudar os eventos relacionados à remodelação
óssea, com a vantagem de se observar sítios distintos conforme o predomínio de cada
um dos processos de reabsorção e neoformação ósseas. Além das alterações
vasculares e celulares iniciais, há ainda a participação de vários mediadores, como
citocinas, fatores de crescimento e neurotransmissores, os quais tornam o ambiente
favorável à remodelação óssea, consequentemente, ao deslocamento dentário através
do osso alveolar (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006).
A escolha de ratos Wistar se deu pela facilidade de manuseio dos mesmos e
acesso aos dentes, mas, principalmente, pela reprodutibilidade na obtenção de medidas
para quantificar a MDI (ARAÚJO, 2015). Quanto à força utilizada no estudo, tem sido
demonstrado que intensidades entre 10 e 50 gf induzem maiores taxas de
movimentação, enquanto que forças exorbitantes são prejudiciais ao periodonto
(NAKANO et al., 2014). Nakano et al. (2011) demonstraram que a MDI durante 7 e 10
dias com 50 gf favoreceu maior imunoexpressão de marcadores de reabsorção óssea,
como RANK, RANKL e M-CSF. Adicionalmente, vale ressaltar que resultados do nosso
laboratório também constataram um pico de movimentação dentária aos 11 dias com 50
gf, bem como aumento da imunomarcação para RANKL e TRAP no ligamento
periodontal da raiz distovestibular do primeiro molar superior esquerdo (ARAÚJO, 2015).
Ainda, sabe-se que o curso da movimentação dentária em animais é bastante
semelhante à cronobiologia da movimentação dentária em humanos, e é dividido em
três fases, inicial, latência e pós-latência (BURSTONE, 1962; FRACALOSSI et al., 2009;
CHOI et al., 2010; ARAÚJO, 2015). Dessa forma, a escolha do 11º dia de MDI foi feita
com base no fato de que nesse período observa-se um pico de deslocamento dentário
correspondente à fase de pós-latência da MDI em animais, logo, julgamos coerente
utilizar a força de 50 gf no protocolo experimental em questão, e consideramos que este
modelo de MDI, com força contínua reconhecida, seja útil para melhor compreender os
efeitos de fármacos antirreabsortivos, a exemplo do ácido zoledrônico, evidenciando
seus mecanismos junto à resposta inflamatória esperada na MDI.
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CDD 615.1
A repercussão do ácido zoledrônico no tecido ósseo tem sido abordada na
literatura, tanto para prevenção de metástases ósseas do câncer (JI et al., 2014; SUMI
et al., 2014), como no tratamento da osteoporose pós-menopausa (BOONEN et al.,
2008). Mais recentemente, os efeitos macroscópicos do ácido zoledrônico foram
avaliados na MDI por mola fechada de Ni-Ti, mostrando-se capaz de restringir o
deslocamento dentário (SIRISOONTORN et al., 2012; FERNANDEZ-GONZÁLEZ et al.,
2016). No entanto, os efeitos diretos desse fármaco no recrutamento de neutrófilos
correlacionado à atividade de marcadores ósseos não estão bem elucidados. Desse
modo, este estudo a avaliou o ácido zoledrônico nos eventos celulares e vasculares da
inflamação relacionados à produção de marcadores ósseos durante a remodelação
óssea alveolar da MDI.
Sabe-se que o emprego de fármacos antirreabsortivas, a exemplo do ácido
zoledrônico, tem-se mostrado importante no manejo da quimioterapia para pacientes
com alguns tipos de cânceres, como de próstata, mama e mieloma múltiplo (JI et al.,
2014, SUMI et al., 2014). Entretanto, pouco se sabe acerca de seus efeitos na MDI,
processo este conhecido por induzir remodelação óssea, agregando reabsorção e
neoformação ósseas em sítios distintos, porém, de maneira coordenada (KRISHNAN,
DAVIDOVITCH; 2006).
Para a seleção das diversas doses de ácido zoledrônico foram considerados
os cálculos propostos por Reagan-Shaw; Nihal; Ahmada, em 2008, em que se observou
que a dose absorvida no período de uma semana durante a quimioterapia com 4 mg de
ácido zoledrônico em humanos, correspondia a 100 µg/kg em ratos. Fixou-se essa
dosse como a intermediária e foram escolhidas a menor (metade) e a maior (dobro), 50
µg/kg e 200 µg/kg, respectivamente. Vale salientar que estas doses têm sido avaliadas
em diferentes modelos animais e se mostraram eficazes e seguras (KHAJURIA;
RAZDAN; MAHAPATRA, 2015; SILVA et al., 2015). Nossos resultados mostram que o ácido zoledrônico, nas doses de 50, 100 e
200 µg/kg, diminuiu a MDI no 11º dia. Considerando-se o ácido zoledrônico como o
bisfosfonato de efeito antirreabsortivo mais potente (ZHAO; HU, 2015), a repercussão
negativa na MDI era esperada, devido ao desequilíbrio na remodelação óssea. Estudos
na literatura têm evidenciado que o ácido zoledrônico é capaz de afetar a MDI, porém
em variações diversas do modelo em termos de intensidade de força, tempo de
experimentação e diferenças na posologia e via de administração, porém, mesmo com
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
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diversidades de protocolos, o ácido zoledrônico mostrou-se capaz de reduzir a MDI.
Sirisoontorn et al. (2012), utilizando a dose de 1,6 µg/kg de ácido zoledrônico por via
intraperitoneal, administrada uma vez por semana durante 6 semanas, preveniu a MDI
em ratas ovariectomizadas submetidas a instalação e ativação de uma mola fechada de
Ni-Ti com 25 gf por 28 dias. Ainda, Fernandez-González et al. (2016) administraram
dose única de 16 µg/kg de ácido zoledrônico na mucosa do palato e avaliaram o
deslocamento mesial dos molares por ativação de mola fechada de Ni-Ti com 50 gf nos
dias 7, 14 e 21, por meio de microtomografia. Em todos os períodos experimentais, foi
observado que as taxas de deslocamento dentário nos animais que receberam o ácido
zoledrônico foram menores quando comparadas aos animais do grupo controle.
De fato, a inatividade do citoesqueleto de osteoclastos causada pelos
bisfosfonatos em geral leva à infrarregulação de fatores de crescimento liberados por
osteócitos da matriz, que recrutam osteoblastos para formar um novo osso, culminando
em diminuição da remodelação óssea. O processo de remodelação óssea é
caracterizado pelo acoplamento relativamente harmônico entre osteoclastos e
osteoblastos, e durante a movimentação dentária, qualquer intervenção nessa dinâmica,
resulta em alteração no curso da MDI, explicando os resultados do presente estudo
(RUCCI, 2008; RAGGAT; PARTRIDGE, 2010; JIANG et al., 2015).
Nesse contexto, a MDI pode ser reduzida tanto em decorrência da diminuição
da reabsorção óssea necessária para a movimentação dentária propriamente dita,
conferida por agentes antirreabsortivos ósseos, como também a um aumento no
anabolismo ósseo. De fato, tem sido descrito que, em condições de elevada atividade
anabólica, em detrimento da reabsortiva, como na osteopetrose, o movimento dentário
eruptivo é interrompido pela intensa deposição de minerais na matriz, resultando em
dentes impactados no osso basal e agenesias dentárias (BJORVATN; GILHUUS-MOE;
AARSKOG, 1979; IDA-YONEMOCHI et al., 2002).
Afim de esclarecer se o efeito pelo qual o ácido zoledrônico restringiu o
deslocamento dentário pode ser essencialmente causado pelo aumento do anabolismo
ósseo, considerou-se avaliar os níveis séricos de fosfatase alcalina óssea (FAO), um
marcador da presença de osteoblastos (WHYTE, 1994). O presente estudou mostrou
que os 11 dias de MDI não alteraram os níveis séricos da fosfatase alcalina óssea
(FAO), quando comparada aos valores basais. A fosfatase alcalina é composta de 3
isoformas e, dentre estas, a isoforma óssea é a predominante. Geralmente, níveis
elevados de FAO são encontrados na presença de doenças de afetam o metabolismo
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ósseo, como a metástase ou a doença de Paget (COLEMAN et al., 2008). Neste estudo,
os níveis não alterados de FAO após a MDI indicam que o processo de remodelação
óssea ocorreu em sua normalidade. Nossos achados podem ser corroborados pela
literatura, onde se verificou que o tratamento ortodôntico induzido em beagles com 25 gf
não repercutiu em mudanças significantes nos níveis séricos e em fluido crevicular
gengival da FAO nos períodos de 7, 28, 56 e 83 dias (TENG; LIOU, 2014).
Por outro lado, o tratamento com o ácido zoledrônico diminuiu os níveis
plasmáticos dessa enzima, indicando que este fármaco reduziu os mecanismos de
anabolismo ósseo. A literatura tem abordado por meio de estudos in vitro que utilizaram
células de linhagem de osteosarcoma e precursores de osteoblastos e osteoblastos
maduros, a diminuição da FAO à medida que as concentrações de ácido zoledrônico
aumentavam (VAISMAN; MCCARTHY; CORTIZO, 2005; PATNTIRAPONG et al., 2012).
Ainda, foi observado que a adição de Zn2+ e Mg2+ após o tratamento com ácido
zoledrônico reestabelecia as concentrações de FAO. Visto que as fosfatases são
metaloenzimas que precisam desses íons divalentes como co-fatores (VAN HOOF; DE
BROE, 1994), pode-se sugerir que esse fármaco atue como um agente quelante, devido
aos dois átomos de fosfatos da sua estrutura química (VAISMAN; MCCARTHY,
CORTIZO, 2005). Além disso, pode-se aventar que o ácido zoledrônico interfere tanto na
expressão de FAO em osteoblastos ativos como em seus precursores, podendo, desta
forma, afetar não só a atividade dessas células, mas também sua diferenciação.
Clinicamente, foi relatado que pacientes com câncer de mama e metástase
óssea confirmada sob quimioterapia associada ao ácido zoledrônico, apresentaram
diminuição dos níveis séricos de FAO em intervalos de 3 meses de um período de 18
meses, os quais são restabelecidos quando os pacientes se encontram em wash out
quimioterápico por 6 meses (BARNADAS et al., 2014; PATEL et al., 2014).
O aumento dos níveis desta enzima está diretamente relacionado à presença
de metástases ósseas e à maior progressão desta doença tendo consequência no
aumento da incidência de mortalidade de pacientes com câncer (BARNADAS et al.,
2014; NISHIZAWA et al., 2014). Ao reduzir a FAO sérica, o ácido zoledrônico se mostra
efetivo como adjuvante quimioterápico. Nossos dados, em conjunto com os dados da
literatura indicam que a redução da MDI pelo ácido zoledrônico não se deveu ao
aumento de formação óssea, e sim, pela restrição potente da reabsorção óssea alveolar.
Uma vez que a redução da MDI não foi causada pelo aumento do anabolismo
ósseo, ao passo que o ácido zoledrônico reduziu os níveis séricos de fosfatase alcalina
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óssea, buscou-se investigar a repercussão desse fármaco nos aspectos reabsortivos
deste modelo. A histomorfometria do ligamento periodontal mostrou que os 11 dias de
MDI não mostraram alterações em ambos os lados, possivelmente por se encontrar na
fase em que a remodelação inicial ocorrera anteriormente e, portanto, as raízes
encontram-se centralizadas no alvéolo, bem como o tratamento com ácido zoledrônico
não alterarou essas áreas no ligamento periodontal observadas durante a MDI em
nenhuma das doses utilizadas. De fato, dados do nosso laboratório mostraram que a
MDI causou redução significante da área de ligamento periodontal no lado de
compressão e aumento correspondente na área de tração desde a 6ª h até o 4º dia. A
partir de então, essas áreas retornam às suas dimensões normais, assim seguindo até
os 21 dias. Ao 11º dia de MDI, as áreas do ligamento periodontal nos lados de
compressão e tração não apresentam alterações de extensão uma vez que as raízes
distovestibulares se encontram centralizadas no alvéolo, pois a remodelação inicial
ocorrera (ARAÚJO, 2015).
A constrição de vasos sanguíneos do ligamento periodontal na fase inicial da
MDI leva à formação de áreas de necrose focal caracterizadas pela redução de células,
chamadas áreas hialinas da matriz extracellular. Quando a intensidade da força gera o
mínimo de áreas hialinas, ocorrem, então, as reabsorções ósseas frontais. Na presença
exacerbada dessas áreas devido à maior intensidade de força, ocorre a reabsorção
óssea solapante, em que células distantes do ligamento são recrutadas para reabsorver
as áreas hialinas, acarretando um atraso do movimento dentário devido à distância e a
maior quantidade de osso à ser reabsorvida (FRACALOSSI et al., 2009).
Em quantidades diminuídas, essas áreas favorecem a liberação fatores
quimiotáxicos que recrutam células multinucleadas originárias do osso basal, induzindo
a sua diferenciação em osteoclastos. A partir de então, os macrófagos se deslocam para
a periferia do ligamento periodontal, promovendo a reabsorção do tecido necrótico.
Memo assim, esse processo gera um retardo da movimentação dentária, por isso a
formação de áreas hialinas é característica da fase de latência da MDI (KRISHNAN;
DAVIDOVITCH, 2006; FRACALOSSI et al., 2009; VON BÖHL; KUIJPERS-JAGTMAN,
2009). Vale salientar que nas fases posteriores, de pós-latência, o processo de
hialinização se apresenta de forma bastante discreta (VON BÖHL et al., 2004), tal como
foi observado no presente estudo. De fato, embora significante, observamos que os 11
dias de MDI causaram aumento discreto dessas áreas, considerando todo o ligamento
periodontal. Dados do nosso laboratório mostraram que houve um pico de áreas hialinas
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ao 1º dia de MDI, se estendendo até o 4º dia. A partir do 7º dia, essas áreas se
mostraram discretas, permanecendo assim até o 21º dia (ARAÚJO, 2015). No 11º dia,
quando se sabe ser o dia de pico da MDI, esta ocorre concomitantemente à baixa
quantidade de áreas hialinas presentes em toda a extensão do ligamento periodontal.
Ainda assim, as três doses de ácido zoledrônico utilizadas foram capazes de
reduzir à metade essas áreas hialinas no ligamento, evidenciando sua formação ao
mínimo. Esses achados estão de acordo com outros estudos em que o alendronato de
sódio também restringiu o surgimento de áreas hialinas no ligamento periodontal em
período semelhante, 11 ou 14 dias de MDI (KARRAS et al., 2009; ARAÚJO, 2015). A
formação mínima de área hialina pelo ácido zoledrônico pode estar relacionada com a
redução da MDI, uma vez que essas áreas são importantes no recrutamento de células
que iniciariam a reabsorção óssea.
Buscando avaliar o efeito antirreabsortivo do ácido zoledrônico a nível
histológico, as reabsorções presentes na raiz distovestibular e no osso alveolar
circunjacente foram analisadas. A análise dos escores histológicos mostrou que houve
um aumento intenso de reabsorções radiculares e ósseas após 11 dias de MDI,
corroborando os achados de Fracalossi et al. (2009), que constataram a presença
dessas reabsorções na raiz distovestibular e osso alveolar circunjacente a ela após 9
dias de MDI. O tratamento com ácido zoledrônico nessa pesquisa mostrou ser efetivo
em prevenir as reabsorções radiculares e ósseas, o que confirma a redução da MDI
devido ao efeito antirreabsortivo desse fármaco. Quanto à preservação radicular, nossos
achados estão de acordo com as observações de Sirisoontorn et al. (2012), em que a
administração intraperitoneal por 6 semanas com 1,6 µg/kg de ácido zoledrônico em
ratas ovariectomizadas preveniu as reabsorções radiculares após 28 dias de MDI, com
intensidade de força de 25 gf.
Como mencionado anteriormente, o ácido zoledrônico reduziu a MDI,
possivelmente por inibir a reabsorção óssea. Assim, considerou-se importante avaliar se
esse efeito poderia estar relacionado à modulação dos eventos celulares da inflamação
que ocorrem durante a MDI, uma vez que a participação de mediadores inflamatórios na
atividade osteoclástica já é bem estabelecida (YOSHIHARA et al., 2004; DATTA et al.,
2008; RUCCI, 2008; JIANG et al., 2015). Vale ressaltar que a movimentação dentária
engloba, principalmente, o ligamento periodontal e o osso alveolar, mas, também induz
alterações inflamatórias no tecido mole circunjacente ao dente, que compõe o
periodonto (WISE; KING, 2008).
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Avaliou-se a presença de neutrófilos, células importantes da inflamação
aguda, durante a MDI por meio da dosagem da atividade da mieloperoxidase gengival,
uma enzima presente em abundância nos grânulos azurófilos de neutrófilos. Após 11
dias de MDI, a atividade de mieloperoxidase gengival se mostrou elevada. De fato, a
ativação de um dispositivo ortodôntico favorece uma exacerbação da resposta
inflamatória, caracterizada, principalmente, pela presença de neutrófilos (ARAÚJO,
2015). Ainda, estudos que avaliaram a reabsorção óssea alveolar induzida em ratos no
mesmo período, também demonstraram um aumento da atividade da MPO (DE
ARAÚJO-JÚNIOR et al., 2013; GÓES et al., 2014; GUIMARÃES et al., 2016). Entretanto,
o ácido zoledrônico preveniu, significantemente, o aumento da atividade dessa enzima.
A modulação de neutrófilos pelo ácido zoledrônico já foi abordada na literatura por
Williams et al. (2000), em que o mecanismo dos bisfosfonatos, o qual consiste em inibir
a atividade de GTPases, parece interferir no processo de maturação e função
neutrofílica. Em outro estudo em culturas de células, Kuiper et al. (2012) observaram
que o ácido zoledrônico inibiu a quimiotaxia de neutrófilos e a atividade de NADPH
oxidase, uma enzima importante para a atividade fagocitária, bem como a diferenciação
de células hematopoiéticas nessas células de maneira concentração-dependente.
Tem sido relatado que fármacos antirreabsortivos podem afetar o sistema
imune inato, e interferir na liberação de enzimas lisossomais, a exemplo da
metaloproteinase-8, por neutrófilos (TERONEN et al., 1997). Sugere-se que a alta
incidência de osteonecrose dos maxilares por bisfosfonatos também pode estar
relacionada à incapacidade do sistema imune inato, facilitando a instalação da infecção
(KUIPER et al., 2012).
A instalação de mola Ni-Ti induz, além da migração neutrofílica, o aumento da
produção de citocinas, como TNF-α e IL-1β (HAZAN-MOLINA et al., 2013; ALIKHANI et
al., 2015), as quais participam ativamente da osteoclastogênese e indução de
osteoclastos maduros (TEITELBAUM; ROSS, 2003; BASARAN et al., 2006; LE GALL,
SASTRE, 2010) e estão presentes desde os estágios iniciais da MDI (ALIKHANI et al.
2015).
No presente trabalho, foi observado o aumento significante dos níveis de
TNF-α e IL-1β após 11 dias de MDI, quando comparados aos tecidos gengivais
contralaterais, em concordância com outros autores, os quais mostraram que a ativação
de uma mola Ni-Ti é responsável pelo aumento dos níveis de TNF-α e IL-1β após em 7 e
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10 dias, respectivamente (DE OLIVEIRA et al., 2014; YAN et al, 2015). Sabe-se que o
TNF-α induz a produção e secreção de IL-1β por macrófagos, tendo um papel
importante na remodelação óssea (DINARELLO et al., 1986; REDLICH; SMOLEN,
2012). O ácido zoledrônico, após 11 dias de MDI, não preveniu o aumento dos níveis
gengivais de TNF-α e IL-1β. Observou-se, ainda, a participação de TNF-α no modelo da
MDI, comparativamente à IL-1β.
De fato, ensaios in vitro observaram que a incubação de osteoclastos isolados
de humanos saudáveis com ácido zoledrônico foi responsável por promover o aumento
dos níveis de TNF-α e IL-1β (TSENG et al., 2015). Da mesma forma, estudos que
utilizaram células da linhagem de macrófagos murinos e osteosarcomas humanos,
constataram que o pré-tratamento com ácido zoledrônico aumentou a produção de TNF-
α, IL-1β e IL-6 após a incubação com LPS (MURATSU et al., 2013; RIZZO et al., 2014).
Embora o ácido zoledrônico não tenha prevenido o aumento dos níveis de TNF-α após
11 dias de MDI, estes se mantiveram elevados em relação ao controle.
Considerando que o ácido zoledrônico possui rápida depuração plasmática, e
se liga fortemente ao osso, avaliou-se a sua presença neste tecido. A imunohistoquímica
para TNF-α mostrou um aumento das imunomarcações no lado de compressão do
ligamento periodontal da raiz DV dos animais não tratados (NT), estando em
conformidade com os achados na literatura, que mostram a participação de TNF-α na
remodelação óssea da MDI (BOAS NOGUEIRA et al., 2013; ALIKHANI et al., 2015; YAN
et al., 2015). O ácido zoledrônico (200 µg/kg), diferentemente do que foi observado na
gengiva, diminuiu significantemente o número de células positivas para TNF-α nos lados
de compressão e tração do ligamento periodontal. Apesar da literatura não abordar com
especificidade o efeito do ácido zoledrônico na imunohistoquímica para TNF-α durante a
MDI, foi constatado que, na osteonecrose induzida por ácido zoledrônico, há um
aumento das imunomarcações para TNF-α (SILVA et al., 2016). Contudo, a
osteonecrose é uma condição peculiar, caracterizada por necrose propriamente dita,
sequestro ósseo, associada, muitas vezes, à presença de micro-organismos (SILVA et
al,. 2015), o que favoreceu a produção de citocinas pró-inflamatórias.
Citocinas pró-inflamatórias, principalmente TNF-α, promovem reabsorção
óssea por induzir a expressão de RANKL em células estromais como fibrosblastos e
osteoblastos (QUINN et al., 2000; MANABE et al., 2001). (LE GALL; SASTRE, 2010),
além de inibir a neoformação por estimular a apoptose de osteócitos e favorecer a
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infrarregulação de OPG (AHUJA et al., 2003; TANABE et al., 2005). Nesse contexto,
percebe-se que o eixo RANKL-OPG sofre uma influência relevante de mediadores da
inflamação (BOYCE; XING; 2008). Nesse estudo, foi verificado o aumento da
imunomarcação para RANKL no lado de compressão do ligamento periodontal da raiz
DV dos animais não tratados (NT), provavelmente em decorrência do aumento de TNF-
α. No lado de tração, as marcações positivas para RANKL também foram aumentadas.
Sabe-se que o movimento dentário ocorre mediante reabsorção óssea no
lado de compressão e neoformação no lado de tração (SANDSTEDT, 1904;
OPPENHEIN, 1911; SHWARZ, 1932), por isso o aumento da imunomarcação para
RANKL em ambos os lados indica o processo de remodelação óssea induzido pela
aplicação de força, uma vez que no lado de compressão foi constatado o aumento da
osteoclastogênese, e no lado de tração, maior presença de osteoblastos. A maior dose
de ácido zoledrônico diminuiu as imunomarcações para RANKL em ambos os lados,
indicando que houve uma redução da diferenciação osteoclástica no lado de
compressão e, no lado de tração, a diminuição de osteoblastos. Embora a literatura não
apresente estudos que avaliem os efeitos do ácido zoledrônico em imunohistoquímica
para RANKL durante a MDI, protocolos que utilizam ratas ovariectomicadas tem sido
abordados, nos quais o tratamento semanal com 1,5 µg/kg de ácido zoledrônico por 4 e
8 semanas, resultou na diminuição de células RANKL+ em fraturas ósseas na tíbia (LI et
al., 2012).
A OPG é uma citocina antiosteoclastogênica expressa em osteoblastos e
impede a ligação entre RANK e RANKL, inibindo a osteoclastogênese e, por
conseguinte, a reabsorção óssea (LACEY et al.,1998; KAWASAKI et al., 2006). Foi
observado um aumento de células OPG+ no lado de tração no ligamento periodontal da
raiz DV dos animais não tratados (NT), indicando a diminuição da osteoclastogênese
nesta região, o que pode favorecer a neoformação óssea. No lado de compressão, não
foram observadas alterações significantes no número de células imunomarcadas para
OPG, uma vez que neste local, a diferenciação osteoclástica se encontra aumentada
devido a maior presença de TNF-α e RANKL. Esses resultados estão de acordo com
aqueles encontrados por ZHOU et al. (2011), em modelo semelhante de MDI.
A utilização da maior dose de ácido zoledrônico foi responsável por prevenir
as marcações positivas para OPG no lado de tração, possivelmente por um aumento de
Dickkopf-1 (DKK-1), visto que a DKK-1 é uma proteína responsável por regular a via
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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Wnt/β-Catenina, inibindo a transcrição gênica e, consequentemente, a produção de OPG
(BARON; RAWADI, 2007; KWACK et al., 2008). De fato, tem sido demonstrado que o
tratamento anual com 5 mg de ácido zoledrônico em mulheres com osteoporose pós-
menopausa aumentou, de forma significante, os níveis séricos de DKK-1 após 1 mês da
administração, mantendo-se elevados até o 6º mês (GATTI et al., 2014). Esses dados
parecem coerentes com os níveis diminuídos de FAO por ácido zoledrônico.
A razão RANKL/OPG foi empregada, uma vez que esta relaciona a
quantidade desses biomarcadores, indicando a elevação ou redução da reabsorção
óssea. Devido ao aumento a imunomarcação para RANKL no lado de compressão da
raiz DV dos animais não tratados (NT), foi observado que a razão RANKL/OPG se
mostrou elevada nesta região, a qual se confirmou pelo aumento da imunomarcação
para TRAP, mostrando o aumento da atividade osteoclástica e reabsorção óssea. No
lado de tração, tal razão permaneceu inalterada devido ao aumento concomitante da
marcação para OPG, coerente com as baixas imunomarcações para TRAP e
consequente redução da atividade osteoclástica e reabsortiva, o que pode favorecer a
formação óssea nessa área.
Entretanto, no lado de compressão, o ácido zoledrônico preveniu o aumento a
razão entre ambos os biomarcadores e das imunomarcações para TRAP, indicando
menor atividade osteoclástica e reabsortiva neste lado. No lado de tração, o ácido
zoledrônico promoveu uma diminuição significante da razão RANKL/OPG, devido ao
número reduzido de células positivas para RANKL, seguida por imunomarcações para
TRAP reduzidas. De fato, achados da literatura mostram que 12 dias de MDI
promoveram um aumento da imunomarcação para TRAP (TADDEI et al., 2013). Embora
não sejam abordados protocolos que envolvam o efeito do ácido zoledrônico na
marcação para TRAP durante a MDI, estudos mostram que em lesões osteolíticas e
osteosarcomas presentes em tíbias de camundongos, o tratamento semanal com ácido
zoledrônico foi responsável por diminuir a marcação positiva para TRAP após 8 e 5
semanas, respectivamente (LEE et al., 2002; ZHOU et al., 2005).
Confirmando que as doses utilizadas nesse estudo não causaram alterações
sistêmicas importantes, o ácido zoledrônico não alterou o leucograma, não alterando os
neutrófilos, linfócitos ou monócitos. Esses dados podem ser corroborados por aqueles
observados por Silva et al. (2015), os quais não constataram alterações significantes no
número de leucócitos, neutrófilos e linfócitos, após 13 dias do tratamento de ratos Wistar
ccom ácido zoledrônico nas doses de 40 e 200 µg/kg durante 3 semanas. Quanto à
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variação de massa corpórea, visto que houve perda de peso inicial em todos os animais
submetidos à MDI, tratados ou não, é possível inferir que a própria instalação da mola foi
responsável por induzir a perda de massa corpórea. De fato, procedimentos cirúrgicos
orais em animais, como a indução de reabsorção óssea alveolar por ligadura em torno
do segundo molar superior de ratos, também resultam em perda inicial de massa
corpórea inicial (LIMA et al., 2004, GÓES et al., 2012). Uma vez que os animais tratados
com ácido zoledrônico atingiram seu peso inicial no decorrer do período experimental,
não diferindo estatisticamente dos animais não tratados, pode-se dizer que esse
fármaco não induz alterações importantes na variação de massa corpórea.
Em suma, embora o ZOL tenha reduzido significantemente os eventos
anabólicos ósseos nesse estudo, seu efeito predominante na MDI consistiu na
diminuição da resposta inflamatória, com redução da atividade de MPO gengival e
consequente redução da MDI por menor reabsorção óssea osteoclástica via modulação
de TNF-α, RANKL, OPG e TRAP, sem alterações sistêmicas importantes.
Figura 27 – Modelo hipotético do efeito do ZOL na remodelação óssea da MDI. O ZOL resultou em menor MDI sem induzir o anabolismo ósseo ao diminuir os níveis séricos de FAO e as marcações para RANKL e OPG no lado de tração, mas pelo seu efeito anti-inflamatório, ao reduzir a infiltração neutrofílica e potente antirreabsortivo ósseo, inibindo a osteoclastogênese pela redução de TNF-a e RANKL, levando à diminuição da atividade osteoclástica e reabsortiva confirmada pela diminuição de marcação para TRAP e da razão RANKL/OPG no lado de compressão.
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8. CONCLUSÃO
• O ácido zoledrônico reduziu a atividade anabólica óssea na MDI;
• O ácido zoledrônico resultou em menor MDI via redução da resposta
inflamatória e inibição potente da reabsorção óssea;
• Sistemicamente, o ácido zoledrônico não induziu alterações no leucograma
e na massa corporal dos animais.
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
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Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
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APÊNDICES
Apêndice A – Controles negativos para análise imunohistoquímica de TNF-α, RANKL, OPG e TRAP
Controles negativos do lado de compressão (A: TNF-α; B: RANKL; C: OPG; D: TRAP). Controles negativos do lado de tração (E: TNF-α; F: RANKL, G: OPG; H: TRAP).
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Apêndice B – Aparelhos e instrumentos laboratoriais
• Abridor de boca de rato (confeccionado pelo Laboratório de
Osteofarmacologia – UFC, Fortaleza-CE) • Agitador magnético 725a (Fisatom, São Paulo-SP, Brasil)
• Agitador Vortex (Phoenix, Araraquara-SP, Brasil)
• Alcoômetro Gay-Lussac (Incoterm, Porto Alegre-RS, Brasil) • Algodão (Johnson&Johnson, São Paulo-SP, Brasil)
• Alicate ortodôntico de corte de amarrilho (Quinelato®, ref: QO.151.00, Rio
Claro – SP, Brasil) • Balança digital BS3000 (Bioprecisa BS3000, Curitiba-PR, Brasil) • Balança digital modelo F6/1 (Filizola, São Paulo-SP, Brasil)
• Balança eletrônica de precisão (Sartorius BR 210S, Gotinga, Baixa Saxônia,
Alemanha) • Balança eletrônica de precisão FA2104N (Bioprecisa, Curitiba-PR, Brasil) • Banho-maria digital NT (Nova técnica equipamentos, Piracicaba-SP, Brasil)
• Centrífuga 80-2B (Centribio, São Paulo-SP, Brasil)
• Centrífuga Eppendorf 5804R (Eppendorf, Hamburgo-HA, Alemanha) • Destilador modelo 016 (Fabbe-Primar, São Paulo- SP, Brasil)
• Disco de Lixa 4 ½ 100 (3M, Campinas-SP,Brasil)
• Espátula 7 (Golgran, São Caetano do Sul-SP, Brasil) • Espectrofotômetro UV-5100B (Senova, Xangai, China)
• Fio de amarrilho de aço inox de 0,008 polegadas (Morelli®, ref:55.01.208,
Sorocaba-SP,Brasil)
• Fotopolimerizador Led (Ecco®, Campinas-SP, Brasil)
• Freeser -80 ⁰C (Revco Elite Plus, ThermoScientific, San Jose, EUA)
• Gase (Nexcare – 3M, Campinas-SP, Brasil)
• Homogeneizador de amostras – Polytron PT1035 (Kinematica, Lucerna,
Suiça) • Leitor de placas do tipo ELISA modelo ELX 800 (BioTek Instruments,
Winooski-Vermont, EUA) • Máquina de gelo EGE 300M (Everest, Rio de Janeiro-RJ, Brasil) • Microscópio ótico (Nikon Eclipse Ci, Tóquio, Japão)
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1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
CDD 615.1
• Microscópio ótico modelo 175045 (Zeiss, Oberkochen-Baden-Wüttemberg,
Alemanha) • Micro-retífica modelo 300 (Dremel®, São Paulo-SP, Brasil)
• Mola fechada de níquel-titânio (Morelli®, ref: 35.20.064, Sorocaba-
SP,Brasil)
• Pinça clínica (Golgran, São Caetano do Sul-SP, Brasil) • Pipetas automáticas (LABMATE+, Varsóvia, Polônia)
• Porta-agulha Mathieu (Golgran, São, Caetano do Sul-SP, Brasil)
• Regrigerador Biplex 350 (Cônsul, São Paulo-SP, Brasil) • Tensiômetro (Morelli®, ref: 75.02.009, Sorocaba-SP,Brasil)
• Tesoura cirúrgica (Golgran, São Caetano do Sul-SP, Brasil)
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
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K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
CDD 615.1
Apêndice C - Soluções e materiais de consumo
• Água destilada • Corante rápido de hematoxilina e eosina (NewProv®, Pinhais-PR, Brasil)
• Resina Composta Fill Magic (Vigodent®, Rio de Janeiro-RJ, Brasil) • Soro fisiológico 0,9% (NaCl 0,15 M) frasco com 500 ml (ADV, Nova
Odessa-SP, Brasil)
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K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.
1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.
CDD 615.1
ANEXOS Anexo A - Aprovação do estudo pela Comissão de Ética no Uso de Animais – UFC