Download - Aulas práticas microbiologia
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Material e Técnicas Básicas Utilizadas no Laboratório de Microbiologia
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Normas de segurança• Uso de jaleco; • Desinfecção das mãos com solução germicida, água e sabão, após
contato com material microbiológico;
• Gestos bruscos;
• Contato de áreas desprotegidas com material infeccioso deve ser comunicado ao professor;
• Instrumental usado não deve ser desprezado sobre a bancada;
• Verificar posição da entrada de ar do bico de Bunsen;
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Normas de segurança• Para abrir ou fechar tubos com material microbiológico, ou meio
de cultura a ser inoculado, segure-o com a mão esquerda, remova a
tampa com a direita retendo-a com o dedo mínimo;
• Ao terminar de usar o microscópio, desligá-lo;
• Lâminas utilizadas devem ser descartadas na travessa de vidro
sobre a bancada;
• Não abrir os meios de cultura que estiverem sobre a bancada sem
autorização do professor, para se evitar contaminações.
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Cultura pura
Crescimento, em meio de cultivo adequado, de um conjunto de células idênticas, correspondentes a mesma espécie
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Esterilização – eliminação de toda e qualquer forma de vida presente em determinado material ou ambiente.
Assepsia – uso de manobras assépticas, que são técnicas que impedem a entrada de micro-organismos onde não são desejados.
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Prática 1Objetivos:
Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em microbiologia;
Definir cultura pura, esterilização e asspsia;
Descrever as principais técnicas de manobras assépticas,
Desenvolver habilidade de manipular tubos com meios estéries, bem como transferir micro-organismos de meio sólido para meio sólido e para meio líquido;
Conscientizar-se da presença de micro-organismos no ambiente.
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Execução1ª: Apresentação do material de laboratório: mostrar a vidraria principal (tubos, pipetas Pasteur, placas, etc)
2ª: Treinar manobras assépticas:
1 – Distribuição, de um tubo para o outro, caldo simples estéril, usando pipeta (2,0ml). Repetir quando a técnica não se mostrar adequada.
2 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida em tubo de agar inclinado contendo meio de agar simples, para outro meio idêntico, com auxílio de alça de inoculação.
3 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida em tubo de agar inclinado para meio líquido de caldo simples. Incubar os tubos no escuro por, no mínimo 48 horas.
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3ª: Verificar a presença de micro-organismos no ambiente:
1 – Verter o meio de agar simples fundido em placa e esperar solodificar.
2 – Expor uma das placas durante 15 minutos ao ar.
3 – Com uma 2ª placa, realizar uma das seguintes opções:
1) Friccionar um swab na bancada e em seguida espqlhar o mesmo na superfície do agar;
2) Friccionar alguns fios de cabelo sobre o agar;
3) Tocar suavemente a superfície dos dedos na superfície do agar;
4) Soprar, tossir ou esperrar sobre a superfície do agar. Incubar as placas a temperatura ambiente por cerca de uma semana.
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Interpretação dos resultados
2ª: Manobras assépticas
a) Leitura dos tubos de caldo simples estéreis, submetidos a transferência em condições assépticas: a observação de turvação no meio de cultura indica a presença de crescimento bacteriano, e portanto, manobra asséptica inadequada.
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Interpretação dos resultados
b) Leitura dos tubos de agar simples inclinado, inoculado com Serratia sp: a presença de crescimento vermelho-alaranjado indica Serratia sp; a presença de outro tipo de crescimento que não apresente a referida cor indica contaminação, e portanto, manobra asséptica inadequada.
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c) Leitura dos tubos de caldo simples inoculados com Serratia sp: a observação de turvação no meio de cultura indica crescimento da Serratia sp, mas não permite verificar se houve ou não contaminação
Interpretação dos resultados
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3ª: Presença de micro-organismos no ambiente
Observar a presença de diferentes colônias na superfície das placas; observar os diferentes tipos de bactérias e fungos; preparar lâminas e observa-las ao microscópia. Distinguir os diferentes tipos microbianos.
Interpretação dos resultados
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Morfologia Colonial
• Pigmentação
Interpretação dos resultados
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Métodos Físicos e Agentes Químicos no Controle do Crescimento Microbiano:
Esterilização, Desinfecção e Antissepsia
O crescimento dos micro-organismo pode ser controlado através de métodos físicos e químicos.
Eliminação total ou parcial
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Esterilização – Eliminação total dos micro-organismos presentes em determinado material ou ambiente.
Desinfecção – Inativação ou redução do número de micro-organismos presentes em material inanimado. A desinfecção não implica na eliminação de todos os micro-organismos viáveis, porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies ou local de trabalho. Assim, a desinfecção tem como objetivo eliminar os micro-organismos.
Antissepsia – Consiste no mesmo conceito de desinfecção, porém está relacionado com substâncias (antissépticos) aplicados em tecido vivo.
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I – Métodos Físicos de Controle do Crescimento de Micro-organismos
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Calor
1 – Calor úmido
Autoclave – utiliza o calor na forma de vapor d’água sob pressão. Destrói formas vegetativas e esporuladas (121ºC/15-30minutos). Usados para meios de cultivo, vidrarias, etc.
Água em ebulição – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Destrói apenas formas vegetativas (100ºC/20minutos
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Tindalização – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Visa destruir formas vegetativas e esporuladas. É também denominado esterilização fracionada ou intermitente (100ºC/20min. Durante 3 dias consecutivos). Usado no preparo de alguns medicamento, vacinas, etc.
Pasteurização – Reduz as populações microbianas sem destruir necessariamente todas as formas vegetativas. Muito utilizado nas indústrias de alimentos (leite, cremes, cerveja, etc). Dois tipos:
- Alta temperatura – usa um tempo curto (15 seg.) a 72ºC
- Baixa temperatura – usa um tempo mais longo (30 seg) a 63ºC
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2 – Calor SecoFornos ou estufas – utiliza o calor seco a 180ºC durante 1 ou 2 horas. Muito usado para vidrarias e para materiais danificáveis pela umidade como os metais ou óleos.
Flambagem – esteriliza agulhas e alças microbiológicas: aquecimento ao rubro
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Incineração – para eliminar animais de laboratório
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Radiações
Ultravioleta – o comprimento de onda mais efetivo para efeitos germicidas é entre 2600-2700A. Muito usado para salas cirúrgicas. O poder de penetração é muito baixo. Atua no DNA formando dímeros de timina.
Raios - empregado para materiais descartáveis e material cirúrgico termolábil. Método caro e perigoso. Uso industrial.
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Filtração
Filtros bacteriológicos – empregados para esterilizar materiais termolábeis como soro, enzimas, etc. São filtros de materiais diversos como ésteres (acetato ou nitrato) de celulose e amianto
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Prática 2Objetivos:
Conceituar os diferentes métodos de esterilização;
Comparar os diferentes métodos físicos de esterilização;
Listar alguns métodos de esterilização pelo calor;
Relacionar as finalidades da desinfecção e antissepsia;
Fazer apreciação dos diferentes agentes antissépticos;
Testar a eficácia da ação do calor e de agentes químicos sobre o crescimento microbiano
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Execução
1ª - Teste da ação do calor sobre as bactérias: será verificada a ação de dois métodos diferentes de controle dos micro-organismos que empregam o calor úmido, autoclave e água em ebulição
Adicionar 1 a 2 gotas de cultura pura de bactérias (Bacillus subtilis ou Escherichia coli) a tubos contendo caldo simples e submetê-los aos seguintes tratamentos:
Tubo 1: controle, sem tratamento
Tubo 2: ferver 5 minutos em banho maria
Tubo 3: ferver 20 minutos em banho maria
Tubo 4: submeter à autoclavação durante 15 minutos.
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Interpretação dos Resultados:
1ª - Ação do calor sobre bactérias. Observar os 4 tubos semeados na aula anterior. A turvação do meio de cultura, ou a presença de uma película na superfície do meio, indica a presença do crescimento bacteriano.
Avaliar a eficiência dos tratamentos comparando o crescimento em relação ao tubo 1 (controle).
Comparar os resultados obtidos com cada uma das duas espécies bacterianas: B. Subtilis e E. coli. As culturas de B. Sutilis, por serem esporuladas, são muito mais resistentes e só são destruídas por autoclavação. Já as formas vegetativas de ambas as culturas são destruídas em banho-maria.
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Escherichia coli X Bacillus
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II – Metodos Químicos de Controle de Crescimento Microbiano
• Antisséptico – usado em tecidos vivos para inibição do crescimento (álcool iodado)
• Desinfetante – inibe o crescimento de microorganismos (formas vegetativas) em material inanimado (fenol, etanol)
• Antimicrobianos – utilizado para o tratamento de doenças infecciosas (Penicilinas, cloranfenicol)
Toxidade seletiva – atuação sobre microrganismos sem afetar celulas
hospedeiras
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Fenóis e derivados (fenol, cresol) - desnaturação de proteínas
Álcoois (metílico, etílico, propílico) - solvente para lipídios- desnatura e coagula proteínas
Compostos de cloro (hipoclorito de sódio, cloramina, cloro)
- se combina com proteínas- agente ocidante
Tintura de iodo, água sanitária, permanganato de potássio
- agentes oxidantes
Detergentes (lauril sulfato de sódio) - rompe membrana celular- altera permeabilidade celular- diminui tensão superficial
Corantes (cristal violeta) - tem afinidade por ácidos nucleicos
Óxido de etileno (gás esterilizante) - agente alquilante- ativo contra formas vegetativas e esporulados. Usado na preservação de alimento, esterilização de material plástico, equipamentos médicos etc. Desnatura proteínas e danifica DNA e RNA (ação mutagênica)
Agentes
Mecanismo de ação
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2ª - Teste da eficácia da ação de agentes químicos (antissépticos) sobre os micro-organismos. Será demonstrada a ação do álcool, álcool iodado, detergentes, água sanitária, etc. Sobre o crescimento de Serratia sp (técnica do polegar)
1 – Em placa de petri contendo meio de cultura, delimitar 3 regiões, utilizando lápis cera. Marcar as regiões 1, 2 e 3;
2 – Sobre a superfície do meio, comprimir ligeiramente o polegar na região 1, tomando cuidado para não ferir o agar;
3 – Umidece o polegar no papel de filtro embebido com cultura de Serratia e comprimi-lo ligeiramente na região 2;
4 – Lavar o polegar utilizando qualquer um dos agentes antissepticos a sua escolha ( alcool, alcool iodado, detergente ou água santária);
5 – Secar o polegar ao ar e novamente comprimi-lo ligeiramente na região 3;
6 – Anotar o composto utilizado. Identificar a placa. Embrulhar com papel e incubar a temperatura ambiante (25-28ºC) por 24/72h;
Prática 2
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Interpretação dos Resultados:
2ª - Teste da ação dos agente antissépticos. Observar a placa da aula anterior, e verificar o crescimento bacteriano nas quatro regiões. Comparar a eficiência dos diferentes antiossépticos usados pelos colegas.
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Assunto 3: Exame Microscópio de Micro-organismos
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300 nm a 1 m
Bactérias e Arqueas
Fungos Protozoários Algas
10 m a 100 m
Pox vius Herpes vius
27 nm a 300nm 0,2 mm0,2 mm
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Bactérias e Arqueas
Fungos Protozoários Algas
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Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos em um arranjo denominado estafilococos.
Microscopia eletrônica de varredura das células apresentadas acima.
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Pox vius Herpes vius
Varredura
Transmissão
Varredura
Transmissão
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Principais tipos de preparações microscópicas para visualizar micro-organismos
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Colorações
SIMPLESPositivaNegativa
DIFERENCIAL
SEPARAÇÃO DE GRUPOS
Coloração de Gram
Coloração de Ziehl-Neelsen – Alcool-ácido resistente
VISUALIZAÇÃO DE ESTRUTURAS
Esporos
Cápsulas
Flagelo
Tipos de coloração utilizadas em Tipos de coloração utilizadas em microscopia ópticamicroscopia óptica
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POSITIVA – corantes carregados positivamente
(núcleo superfície)
Ex: Giemsa
NEGATIVA – corante acídico (lâmina)
Ex: Nanquim
T. cruzi
Plasmodium falciparum
C. neoformans
COLORAÇÃO SIMPLES
Uso de apenas 1 corantes
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Coloração de Ziehl-Neelsen
Dificulta a penetração de vários corantes –
grande hidrofobicidade
COLORAÇÃO DIFERENCIADA
Uso de apenas 2 corante
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Solução àlcool-ácido
(etanol 95% + HCL concentrado)
5 min, aquecendo
Água destilada
CarbolfucsinaCarbolfucsina
Até o líquisdo
que pararmde
sair colorido
Água destilada
Azul de Metileno
Água destilada
2 min
Papel de filtro e micorscópio óptico
Coloração de Ziehl-Neelsen
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COLORAÇÃO DIFERENCIADA
Uso de apenas 2 corantes
LugolLugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante
primário-iodo para-rosalina)
1 min
Água destilada
Cristal VioletaCristal Violeta(cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de
célula)
1 min
Água destiladaEtanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico
Água destilada
Safranina Safranina (cora o citoplasma de (cora o citoplasma de vermelho)vermelho)
45 seg Água destilada
Papel de filtro e micorscópio óptico
Coloração de Gram
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Gram +Gram +
Gram -Gram -
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Formase
Arranjos(eubactérias)
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Prática 3
Objetivos:
Manusear adequadamente um microscópio ótico;
Conhecer os principais métodos de observação microscópica de
micro-organismos;
Distinguir,morfologicamente, bactérias, leveduras, bolores e
protozoários;
Identificar os principais tipos morfológicos das bactérias;
Discutir a importância do método de Gram na identificação de
micro-organismos;
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Execução:1ª - Observação microscópica de lâminas prontas
a) Esporos de Bacillus megaterium (cultura com mais de 48 horas de crescimento), coradas pelo método de Schaeffer fulton (célula corada de vermelho (safranina) e esporos corados de verde (verde malaquita)
b) Bactérias coradas pelo Gram: B. subtilis, S. aureus (Gram positiva e E. coli (Gram negativa)
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2ª- Preparação de lâminas para observações microscópicas
1) Preparação a fresco de E. coli. Após flambar a alça, colocar uma gota de suspensão bacteriana em uma lâmina, cobrir com lamínula. Adicionar uma pequena gota de óleo de cedro e observar com objetiva de imersão (100x)
2) Preparação a fresco de Sccharomyces cerevisiae. Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento da levedura e suspender em uma gota de solução salina em uma lâmina. Cobrir com lamínula e observar com objetiva de 40x.
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3) Preparação a fresco de Aspergillus versicolor. Cuidadosamente, para não alterar as estruturas fúngicas, retirar com alça flambada uma porção do crescimento do fungo e suspender em uma gota de solução salina, em uma lâmina. Observar entre lâmina e lamínula com objetiva de 40x.
4) Preparação a fresco de Herpetomonas sp. Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento em meio líquido do protozoário e colocar sobre uma lâmina. Cobrir cuidadosamente com uma lamínula. Observar com objetiva de 40x.
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5) Coloração de Gram
Colocar uma gota de salina sobre a lâmina. Com alça flambada retirar uma pequena porção da cultura e colocar na gota de salina, espalhar obtendo um esfregaço. Deixar secar.
Fixar o esfregaço na lâmina, presa ao pregador, passando-a na chama do bico de Bunsen
LugolLugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-
iodo para-rosalina)
1 min
Água destilada
Cristal VioletaCristal Violeta(cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula)
1 min
Água destiladaEtanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico
Água destilada
Safranina Safranina (cora o citoplasma de (cora o citoplasma de vermelho)vermelho)
45 seg Água destilada
Papel de filtro e micorscópio óptico
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3ª- A partir das placas expostas (ar, bancada, dedo, boca, etc) observar diversos tipos de colônias crescidas. Com o auxílio do professor escolher uma colônia de bactéria e outra de fungo, para estudo.
a) Colônia de bactéria: Realizar coloração de Gram.
b) Colônia de fungo: Preparar lâmina a fresco com solução salina.
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Interpretação dos Resultados (Leitura)
1ª – Observação de lâminas prontas:
1) Observação de lâminas de Bacillus megaterium. Distinguir os esporos, corados em verde das células vegetativas, coradas em vermelho. Observar esporos dentro e fora da célula.
2) Observação de lâminas de bactérias coradas ao Gram. Distinguir o tamanho, a forma (coco ou bacilo) e a reação ao Gram, roxas, Gram (+) ou vermelhas, Gram (-). Observar algum arranjo característico.
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Interpretação dos Resultados (Leitura)
2ª – Observação de lâminas preparadas pelo aluno:
1) Observar, na preparação a fresco de E. coli, seu tamanho relativo, sua forma e sua locomoção.
2) Observar S. cerevisiae quanto a forma, tamanho relativo e a presença ou ausência de brotamento.
3) Observar A. versicolor quanto ao tamanho. Identificar o micélio, hifas septadas ou não, e se possível as estruturas que contêm os esporos.
4) Observar Herpetomonas sp quanto ao tamanho e capacidade de locomoção.
5) Observar as lâminas coradas pelo Gram, como em 2), 1 parte.
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Interpretação dos Resultados (Leitura)
3ª – Observação de colônias desconhecidas de micro-organismos do ambiente:
- Observar ao microscópio as lâminas preparadas pelo próprio aluno. De acordo com as características observadas tais como tamanho, forma, Gram, presença de hifas, etc. Confirmar tratar-se de bactéria, levedura ou fungo.
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Assunto 4: Técnicas de Isolamento e Contagem de Micro-organismos:
Obtenção de Cultura Pura
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Meios de Cultura: Destinam-se ao cultivo artificial dos micro-organismos e portanto devem fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. Normalmente contém uma fonte de C, N e sais minerais, além de fatores de crescimento, para o caso de micro-organismos exigentes.
Meio de enriquecimento: Adequado ao crescimento de micro-organismos heterotrófico mais exigentes em termos nutritivos, tais como os patogênicos. Costuma-se adicionar sangue, soro, extrato de plantas ou animais. Ex.: B.H.I (Brain Heart Infusion), para protozoários.
Meio Seletivo: Adequado ao isolamento de um grupo particular de micro-organismos, através da adição de substâncias químicas que vão inibir certos grupos sem afetar outros, ou, ao contrário, facilitar certos grupos e não outros. Ex.: adição de antibióticos, de fonte de C específicas, como a celulose para celulolíticos
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Meio diferencial: Através da adição de certos reagentes ao meio, após inoculação e incubação, poder-se-á observar uma modificação que permita diferenciar tipos de bactérias. Ex.: meio BEM para diferenciar E. coli, meio de agareur manitol sal para diferenciar Staphylococcus aureus, meio de Teaguer, que diferencia bactérias lactose positivas (escuras) das lactose negativa (claras).
MacConkey – Lactose+ - rosa
EMB – E. coli – verde metálico
Agar manitol sal – S. aureus – amarelo ouro
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Obtenção de culturas puras
Isolamento:
técnica de semeadura por esgotamento, e diluições em placas com meio sólido.
Esgotamento:Consiste em espalhar, com auxílio de alça de
inoculação, suspensão de micro-organismos na superfície do meio de cultivo sólido, em três setores distintos, de modo que a quantidade de material contida na alça seja progressivamente menor.
Passos para o sucesso do esgotamento:
a) realizar o maior número de estrias possíveis;b) não perfurar o meio;c) não voltar com a alça sobre as estrias;d) utilizar pequena quantidade de material
para semear
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Esgotamento
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Técnica de Diluição para obtenção de cultura pura e contagem de colônias
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Prática 4
Objetivos:
Mostrar ao aluno os métodos de obtenção de cultura pura;
Treinar o aluno na execução da técnica de esgotamento;
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Execução: 1ª - Técnica do esgotamento para o isolamento de bactérias (obtenção de cultura em meio sólido)
a) Utilizar a suspensão mista de bactérias (Serratia sp + Micococcus sp) a ser distribuída pelo professor;
b) Flambar a alça e retirar com ela uma pequena gota da suspensão mista de bactérias; semeá-las sobre a superfície de um meio (agar simples) em placas. A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o esquema, na seguinte sequência.
1ª operação: colocar a gota na superfície do meio e passar a alça em zig-zag sem tocar no meio já semeado, cobrindo outro 1/3 da placa;
2ª operação: mudar a direção do estriamento para a 2ª região da placa, com o mesmo cuidade da região 1, cobrindo outro 1/3 da placa
3ª operação: mudar a direção da estriamento para a parte final do meio, sem tocar na superfície já semeada.
c) Embrulhar as placas e incubar na estufa a 37°C por 24 horas.
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Interpretação dos resultados
1) Observar o aparecimento de colônias isoladas nas placas de agar simples semeadas. Notar o aparecimento de dois tipos deferentes de colônias. Observar, cor, forma, tamanho, borda, etc.
2) Retirar com agulha flambada, uma porção de uma colônia escolhida e transferir assepticamente para o tubo de agar simples inclinado, fazendo estrias na superfície do agar. Anotar o nome do aluno e incubar a 37°C por 24 horas.
3) Após este tempo, observar a cultura crescida no tubo de agar inclinado, verificando sua pureza através do aspecto homogêneo. Confirmar a pureza realizando Gram e observar a mesma forma e reação ao Gram de todas as células observadas.