MÉTODOS DE CULTIVO E
QUANTIFICAÇÃO DO
CRESCIMENTO MICROBIANO
METABOLISMO: • catabolismo: liberação de energia • anabolismo: requerimento de energia
macronutrientes incluem: C, N, P, S, K, Ca, Mg, Fe micronutrientes incluem: elementos traço, fatores de crescimento
REQUERIMENTOS DE ENERGIA POR MICRORGANISMOS
componentes celulares: parede, membrana, ...
síntese de enzimas, ác. nucléicos, polissacarídeos, fosfolipídeos
reparos e manutenção da célula
crescimento e multiplicação
acumulação de nutrientes e excreção de produtos indesejáveis
motilidade
OPÇÕES METABÓLICAS PARA OBTENÇÃO DE ENERGIA
(Madigan et al., Fig. 2.8)
Autotróficos: fixam carbono do CO2
• A maioria dos fototróficos são autotróficos: fotoautotróficos
• Produção primária – uso de uma fonte de energia química ou luz para produzir nova matéria orgânica a partir do CO2
Heteretróficos: obtêm carbono de compostos carbonados orgânicos pré-existentes.
Os procariontes podem ser: quimioautotróficos, quimioheterotróficos, fotoautotróficos e fotoheterotróficos.
Os eucariontes podem ser: fotoautotróficos e quimioheterotróficos.
Fontes de carbono:
MEIO DE CULTURA MEIO DE CULTURA: material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos in vitro. CULTURA: microrganismos que crescem e se multiplicam no meio de cultura. INOCULAÇÃO contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de um determinado número de microrganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação. TÉCNICAS DE SEMEADURA maneiras como a inoculação das bactérias é realizada em diferentes meios
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA
Quanto a composição
Quanto ao estado físico
Quanto a finalidade e características
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto a composição
NATURAIS São aqueles encontrados na natureza, de origem vegetal
(p.ex.: pedaço de batata, de abóbora) ou animal (p.ex.: gema de ovo, pedaço de carne)
ARTIFICIAIS São aqueles fabricados em laboratório, constituído de
substâncias químicas. Podem ser DEFINIDOS ou INDEFINIDOS (complexos)
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto ao Estado Físico
LÍQUIDO Desprovidos de ágar caldo
SÓLIDO Contem de 1,5% a 2,5% de ágar
SEMI-SÓLIDO Contem até 1,0% de ágar
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto à finalidade e
características Simples
Só possui os nutrientes básicos para o crescimento das bactérias em geral.
Enriquecido ou Diferencial
Além dos nutrientes básicos possui elementos nutritivos a mais, como fatores promotores de crescimento (sangue...), mas não é específico.
De enriquecimento ou Seletivo
É suplementado com nutrientes específicos para o microrganismo que se deseja pesquisar. Além disso, possui nutrientes agentes inibidores de determinados microganismos, mas não permite o isolamento da bactéria, pois é um meio líquido.
Por exemplo: aminoácidos (lisina à Salmonella)
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto à finalidade e características
Seletivo
Possui agentes inibidores de determinados microrganismos. Permite a identificação e isolamento da bactéria, pois é um meio sólido (permite a visualização de UFCs).
Por exemplo: Agar EMB à inibe Gram+
Diferencial
Permite a diferenciação de diferentes microrganismos.
Por exemplo: a diferenciação de bactérias fermentadoras e não fermentadoras da lactose no Agar EMB.
Indicadores
Possuem agentes que indicam determinadas reações no meio, para a determinação do metabolismo das bactérias.
Por exemplo: ferro no meio à pode indicar a produção de H2S pelo enegrecimento do meio (sulfeto ferroso)
*** geralmente o agente é um indicador de pH
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto à finalidade e características
Quanto à finalidade de estoque
Meios onde são estocadas culturas puras para posterior utilização.
Geralmente são meios semisólidos
Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAAe57YAG/tipos-meios-cultura-microbiologia
COMPOSIÇÃO g/L: · Caseína Ácida Hidrolisada: 0.50 · Extrato de Levedura: 0.50 · Protease Peptona: 0.50 · Dextrose: 0.50 · Amido Solúvel: 0.50 · Fosfato Dipotássico: 0.30 · Sulfato de Magnésio: 0.024 · Piruvato de Sódio: 0.30 pH FINAL: · 7.2 ± 0.2 APARÊNCIA DO PÓ: · Cor amarelo, homogêneo e pó livre circulante. COLORAÇÃO: · Cor amarelo. TRANSPARÊNCIA: · Solução clara.
Culture Media
defined: made from purified chemicals
e.g., glucose-mineral salts broth
complex (undefined): exact chemical composition not known
e.g., YE (yeast extract) agar
• agar – polysaccharide derived from algae
• forms a gel at temperatures of interest, including 37ºC
• not many microorganisms can degrade it
• widely used as solidifying agent in microbial media
(Madigan et al.)
aseptic transfer: inoculating loop
microbial culture
(Madigan et al., Fig. 5.3)
liquid solid
(Madigan et al., Fig. 5.4)
streak plate: confluent growth
single isolated colonies
(Madigan et al., Fig. 5.4)
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: - CONTAGEM EM PLACAS - FILTRAÇÃO - MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL - CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: - TURBIDIMETRIA - ATIVIDADE METABÓLICA - PESO SECO
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: (1) CONTAGEM EM PLACAS - técnica mais utilizada na determinação do tamanho da população bacteriana; VANTAGEM: qualificação de células viáveis DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colônias)
Cálculo:
nº de colônias na placa x índice de diluição da amostra = nº de bactérias/mL
-DILUIÇÃO SERIADA
-MÉTODO DE ESPALHAMENTO EM PLACA
Contagem em placas e diluição seriada
Adaptado de Madigan et al. (2003).
• only those cells that are viable and able to grow and form colonies under the provided
conditions are counted
• results reported as colony forming units/mL (CFU/mL)
viable count:
(Madigan et al., Fig. 6.9)
Contador de Colônias
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(2) FILTRAÇÃO
- < nº de bactérias = pode ser utilizado o método de filtração para a sua
contagem.
- concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana de
filtro de poros muito pequenos após a passagem de um volume de 100
mL de água.
- filtro posteriormente transferido para uma placa de petri contendo
meio sólido.
CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO
Células bacterianas na superfície da membrana (poros)
A membrana filtrante foi colocada sobre o
meio de cultura e a placa foi incubada. ↓
↓
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
- utilizado para microrganismos que não crescem bem em meio sólido.
A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL)
B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL)
c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL)
d) contagem do nº de tubos positivos
e) estimativa do nº de células/mL de bactérias
10 mL de inóculo
1 mL de inóculo
0,1 mL de inóculo
6 tubos positivos (com
crescimento bacteriano)
3 tubos positivos
1 tubos positivos
Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
6
3
1
Método do número mais provável (NMP)
Tabela de combinações (NMP)
6-3-1
Índice de NMP/100 mL = 110
Inferior = 40
Superior = 300
Confiabilidade de 95%
MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL PARA ESTIMATIVA DE CRESCIMENTO
CONTAGEM EM PLACA E DILUIÇÕES SERIADAS
POUR-PLATE ESPALHAMENTO EM PLACA
METODOLOGIA
UTILIZADA PARA A
CONTAGEM DE COLÔNIAS
EM PLACA
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
- um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma
área definida da lâmina de microscópio.
- a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.
- utilizam câmaras de contagem
DESVANTAGENS: - não separa células mortas e vivas
- pode haver erros de contagem
- difícil contagem para bactérias móveis
Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.
Adaptado de Madigan et al. (2003)
Petroff-Hauser counting
chamber
• requires at least 106 cells/mL
• counts all cells (a total count)
• without special stains, cannot distinguish between live and dead cells
direct microscopic count:
(Madigan et al., Fig. 6.9)
CÂMARA DE NEUBAUER ou
HEMACITÔMETRO
CÂMARA DE NEUBAUER ou
HEMACITÔMETRO
CÂMARA DE NEUBAUER
Ao microscópio – aumento de 100X
Ao microscópio – aumento de 400X
CONTAGEM DIRETA
AO MICROSCÓPIO
Coloração com azul de metileno para evidenciar células viáveis de leveduras – células
azuis estão mortas; células sem coloração são células vivas
Câmara de Mac Master
Câmara de Sedgwick-Rafter reticulada
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
(1) TURBIDIMETRIA
- monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez
- espectrofotômetro (660 nm)
(2) ATIVIDADE METABÓLICA
- quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é diretamente
proporcional ao número de células bacterianas.
Fonte
de luz
Filtro Amostra
contendo
células
microbianas
Detector
sensível
á luz
Leitura dos
resultados
em absorbância
ou transmitância
no
espectrofotômetro
DETERMINAÇÃO DE CRESCIMENTO MICROBIANO PORTURBIDIMETRIA
A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº.
de bactérias.
Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida
Figura 11. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
(3) PESO SECO
- principalmente para fungos filamentosos
a) fungo é removido do meio por filtração
b) seco em dessecador
c) posterior pesagem.