Aspetti generaliAspetti generalidelladella
Trasduzione del SegnaleTrasduzione del Segnale
Concetti chiave
SpecificitàAmplificazioneIntegrazione
Interruttori ‘On-Off’Feedback
Gli organismi multicellulari e in particolare i neuroni hanno GROSSI Gli organismi multicellulari e in particolare i neuroni hanno GROSSI problemi di comunicazioneproblemi di comunicazione
??
Hei tu – I tuoi outputs sono
troppo deboli!!!
Oi! Abbiamo bisogno di
inputs!
Avanti N. 7, adesso devi spegnerti!
Per piacere, vuoi smettere di
inviare segnali?
I Problemi del SignallingI Problemi del Signalling
Le cellule in generale, e i neuroni in particolare, sono esposti a una moltitudine di segnali inclusi quelli provenienti da altre cellule (p.es. segnali derivati da lipidi, piccole molecole organiche o peptidi) così come stimoli ambientali (p.es. luce,
calore o variazioni dell’osmolarità)
Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti
Captare segnali di bassa intensità
Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare
Le soluzioniLe soluzioni
Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti
Captare segnali di bassa intensità (ad es. a basse concentrazioni)
Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare
Recettori con un alto grado di specificità
Recettori ad alta affinità accoppiati ad un sistema di amplificazione
Attivazione di vie di signalling disegnate attorno a un limitato numero di processi comuni
Cosa fanno I segnaliCosa fanno I segnali
Le cellule rispondono ai segnali in una varietà di modi
Alterazione del metabolismo p.es. Alterazione del metabolismo del glicogeno in risposta all’insulina
Eccitamento p.es. propagazione dell’impulso nervoso in risposta a neurotrasmettitori
Crescita e Divisione (mitosi) in risposta a fattori di crescita
Morte cellulare programmata causata da specifici fattori di ‘morte’ o dalla rimozione di alcuni fattori essenziali
Espressione genica alterata – p.es. Sintesi di nuove proteine di membrana in risposta ad un incremento dell’attività sinaptica (plasticità sinaptica)
Far attraversare il segnaleFar attraversare il segnale
Molti segnalatori (p.es. neurotrasmettitori) non possono attraversare la membrana ploasmatica. Le cellule risolvono questo problema utilizzando recettori transmembrana. Questi sono proteine posizionate in membrana con il sito attivo per il ligando* sul lato extracellulare e un dominio intracellulare che si accoppia al passo successivo nella catena di trasduzione del segnale
*Ligando – una molecola che si lega ed è riconosciuta da un recettore
Dominio di legame
extracellulare
Dominio intracellulare – si accoppia al passo
successivo (può avere attività enzimatica)
Dominio transmembrana
Membrana plasmatica
esterno
iinterno
Definizione di RecettoreDefinizione di Recettore
Affinchè una proteina possa essere classificata come recettore (e non una semplice proteina di legame) devono essere soddisfatti diversi criteri
Specificità – un recettore deve essere in grado di distinguere tra segnali spesso strettamente correlati
Alta affinità – Le molecole segnalatrici sono spesso presenti a basse concentrazioni – I recettori possono spesso captare concentrazioni tra nM e pM
Saturabilità – una cellula ha un numero finito di recettori, quindi vi è un limite al numero di molecole di ligando che una cellula può legare
Reversibilità – l’associazione ligando-recettore non è covalente – quando la concentrazione del ligando diminuisce il complesso può dissociarsi
Accoppiamento – il recettore trasferisce un segnale dal ligando alla cellula
É quest’ultima caratteristica, più di ogni altra che contraddistingue un recettore da una proteina di legame
Curva di attivazione - Saturazione
(A) Se varia il numero dei recettori presenti si modifica il livello di saturazione della curva
(B) Se varia l’affinità del recettore per il messaggero la curva trasla sull’asse delle concentrazioni senza che si modifichi il livello di saturazione.
k1 k2k3
Risposta sigmoideRisposta iperbolica
sk
sV
dt
dp
m
max
nn
m
nmax
sk
sV
dt
dp
dt
dp
s
dt
dp
s
Una risposta sigmoide denota cooperatività e insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta “n” siti di binding per il ligando “s” (n≡coefficiente di Hill è un numero intero >1)
Risposte iperboliche e sigmoidi
Le risposte sigmoidi sono caratteristiche di molte cascate di signaling, e rappresentano ciò che i biologi chiamano una risposta ultrasensibile ad un input.
Una risposta iperbolica insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta un unico sito di binding per il ligando “s”
Una doppia fosforilazione come causa di ultrasensibiltà
Le cascate di MAP kinasi spesso ricevono inputs da molecole di signaling presenti in membrana in risposta a stimoli extracellulari.
Come mai sono utilizzate tre kinasi invece di una?
raf
Erk1
Mek1
ATP
ADP
ATP
ADP
MAP chinasichinasi
MAP chinasi
Fattore di Crescita
MAP chinasichinasi chinasi
Un importante aspetto del comportamento allo stato stazionario di un sistema di signaling è la forma della curva stimolo-risposta del sistema.
Un enzima che mostra sensibilità iperbolica richiede un incremento dello stimolo di input di 81 volte per essere portato dal 10% al 90% di attivazione massima.
Al contrario, alcuni enzimi e sistemi di signaling mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi, che spesso sono ben approssimate dall’equazione di Hill:
y = xnH/(EC50 + xnH)
Un esempio molto comune di sistemi che mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi è rappresentato dagli enzimi cooperativi.
Un sistema ultrasensibile richiede un incremento inferiore ad 81 volte nello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di massima attivazione
% d
i S
-P a
llo
sta
to-s
tazi
on
ario
[kinasi] in multipli di EC50
La cascata delle MAP kinasi esibisce una risposta marcatamente ultrasensibile
La risposta è marcatamente ripida; mentre un enzima con risposta iperbolica richiede un incremento di 81 volte dello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di attivazione massima, Erk2 (una MAPK) richiede un aumento di circa 2.5 volte
Pertanto, c’è qualcosa nel meccanismo a cascata che genera una risposta ad interruttore partendo da stimoli graduali.
Att
ivit
à d
i E
rk2
allo
sta
to-s
tazi
on
ario
[Mos] (nM)
Erk2=MAPKMos=MAPKKK
a) La MAPKK fosforilata si dissocia dalla MAPKKK
b) La seconda fosforilazione richiede una seconda collisione
allora la velocità di conversione della MAPKK fosforilata a doppiamente fosforilata aumenterà con il quadrato della concentrazione dello stimolo
La reazione del secondo ordine si traduce in una curva stimolo-risposta ultrasensibile con un coefficiente di Hill di 2.
Recenti studi indicano che la MAPK è fosforilata mediante un meccanismo a doppia collisione.
PMAPKKPMAPKKMAPKKK
PPMAPKKPMAPKK-PMAPKKK
La doppia fosforilazione avviene mediante una doppia collisione
L’attivazione delle MAPK dipende dalla fosforilazione di due siti nella MAPK. Anche la completa attivazione di MAPKK richiede la fosforilazione di due siti.
Qui si assume che le MAPKKK sono attivate e inattivate da enzimi denominati El e E2. MAPKKK* rappresenta la MAPKKK attivata. MAPKK-P e MAPKK-PP rappresentano MAPKK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. MAPK-P e MAPK-PP rappresentano MAPK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. P'ase rappresenta una fosfatasi.
Schema di una cascata di MAPK
Vero ordine zero per v=Vmax
Vero
prim
o or
dine
a) v in funzione di [S], per un ampio range di [S]
b) v in funzione di [S], per un ridotto range di [S] dove [S] << Km (~cinetica del 1° ordine)
c) v in funzione di [S], per un range di [S] dove [S] > Km (~cinetica di ordine zero)
Per semplicità si è plottato [S’], dove [S’]=[S]/Km
][][max SkSK
Vv
m
maxVv
Cinetiche di ordine 1 e zero
Vel
oci
tà d
i re
azi
on
e
S-P come % di S + S-P totale
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 20% 40% 60% 80% 100%
[kinasi]1
2
3
Derivazione grafica delle curve stimolo-rispostaSensibilità iperbolica
Un semplice sistema di fosforilazione-defosforilazione: un substrato S è fosforilato da una kinasi per ottenere S-P, che può essere defosforilato da una fosfatasi per riottenere S.
kinasi
fosfatasi
Si assume che la kinasi e la fosfatasi siano lontani dalla saturazione.
Allora la velocità della reazione verso destra (linea continua) diminuirà e quella verso sinistra (linea tratteggiata) aumenterà, entrambe linearmente (reazione del primo ordine) all’aumentare della percentuale di substrato fosforilato
Nel punto di intersezione delle linee tratteggiata e continua il sistema è allo stato stazionario.
Raddoppiando la concentrazione della kinasi: la pendenza della linea della reazione verso
destra raddoppia: ][kinasikv
Derivazione grafica delle curve stimolo-rispostaSensibilità iperbolica
[kinasi]
Vel
oci
tà d
i re
azi
on
e
S-P come % di S + S-P totale
kinasi
fosfatasi Raddoppiando la concentrazione della kinasi la pendenza della linea della reazione verso destra raddoppia.
Adesso la velocità della reazione verso destra sarà superiore a quella della reazione inversa, e il livello di S-P aumenterà.
Però, aumentando S-P la velocità della reazione verso destra decadrà e la velocità della reazione inverse aumenterà.
Verrà eventualmente raggiunto un nuovo stato stazionario, con il punto di intersezione e la percentuale di S-P allo stato stazionario spostati a destra.
Derivazione grafica delle curve stimolo-rispostaSensibilità iperbolica
Plottando i livelli di S-P allo stato stazionario del precedente grafico in funzione della [kinasi] si ottiene una curva stimolo-risposta iperbolica
Il sistema è massimamente sensibile (la curva stimolo-risposta ha la massima pendenza) a bassi livelli di stimolo, e diventa progressivamente meno sensibile all’aumentare dello stimolo.
% d
i S
-P a
llo
sta
to-s
tazi
on
ario
[kinasi] in multipli di EC50
Derivazione grafica delle curve stimolo-rispostaUltrasensibilità a steps multipli
kinasi
fosfatasi
La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea continua), con nH=2. La curva sigmoide ha maggiore pendenza di quella iperbolica (linea tratteggiata) per stimoli intorno alla EC50, ma è meno ripida per stimoli molto piccoli e molto grandi.
[kinasi]
Vel
oci
tà d
i re
azi
on
e
S-P come % di S + S-P totale
% d
i S
-P a
llo
sta
to-s
tazi
on
ario
[kinasi] in multipli di EC50In una reazione di doppia fosforilazione a due steps la velocità della reazione verso destra aumenta con il quadrato dell’ammontare di kinasi presente.
La pendenza della linea della reazione verso destra varia con il quadrato della concentrazione della kinasi presente
2][kinasikv
Ultrasensibilità con cinetica di ordine zero
L’ultrasensibilità può anche insorgere quando la kinasi e la fosfatasi operano vicino alla saturazione. In effetti le MAPK sono fisiologicamente presenti a concentrazioni sufficientemente elevate da saturare parzialmente le MAPKK.
Se la kinasi e la fosfatasi sono parzialmente saturati, le loro velocità non variano linearmente all’aumentare di S-P: le rette sono sostituite con curve iperboliche.
La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea continua), con nH=2.5. La curva iperbolica è rappresentata dalla linea tratteggiata.
[kinasi]
Vel
oci
tà d
i re
azi
on
e
S-P come % di S + S-P totale
% d
i S
-P a
llo
sta
to-s
tazi
on
ario
[kinasi] in multipli di EC50
Interruttori di accensione e spegnimentoInterruttori di accensione e spegnimento
La maggior parte dei segnali è transitoria e pure la risposta dovrebbe essere transitoria. Se si accende un segnale, c’è anche bisogno di una via per spegnerlo. Per esempio, il mancato spegnimento di un segnale che fa aumentare la [Ca2+] nel citosol è una delle cause che induce la morte cellulare.
Pertanto, ciò che andiamo cercando sono dei sistemi biochimici in grado di passare rapidamente tra due stati: acceso (on) e spento (off).
In molti sistemi di signalling accensione e spegnimento sono operati da proteine G e/o da proteine di fosforilazione
Interruttori On-Off –Proteine G eterotrimericheInterruttori On-Off –Proteine G eterotrimeriche
Il ciclo di base di legame del GTP/GDP nele proteine G eterotrimeriche. è lo stesso di quello delle proteine G monomeriche.
GDP
GTP
Pi
GTP
GDPGDP
ATTIVA
INATTIVA
Scambio del GDP legato col GTP
La subunità attiva può interagire con lo step successivo della catena di ì signalling e
attivarlo
La subunità si dissocia da
Attività GTPasica della
subunitàGTP GDP+Pi
La subunità si riassocia a
Interruttori On-Off – Proteine G monomeriche Interruttori On-Off – Proteine G monomeriche
Ras (p21ras) è un buon esempio per questo tipo di switch. Ras è una piccola (21 kDa) proteina monomerica che lega il GTP o il GDP e ha un’attività GTPasica intrinseca
p21ras GDP p21rasGTP
p21ras
p21ras GDP
On
Off
GTP
Pi
GDP
ATTIVAINATTIVA
Il fattore di scambio del nucleotide
guanidinico (GEF) interagisce con ras
Ciò causa lo scambio del GDP legato con il GTP
L’attività GTPasica intrinseca idrolizza il
GTP a GDP e Pi
Ras GTPasi stimolata dall’associazione con la GTPase-activating
protein (GAP)
ras attivata interagisce con il componente
successivo della catena di signalling e lo attiva
Attivatori di ras
G-protein Exchange Factors (GEF)
•SOS (Son of Sevenless) - Un GEF importante nella regolazione della via della crescita cellulare MAPK/ERK.
•eIF-2b (Eukaryotic Initiation Factor 2) è richiesto per dare inizio alla sintesi proteica.
•Ras-GRF1.
•Recettori per fattori di crescita.
rasrafras
GTP
Risposta
Cascata delle MAP chinasi
L’attivazione di ras da parte della CaMKII attiva la via delle MAP chinasi
CaMKII
Interruttori On-Off – Proteine di Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazione/defosforilazionefosforilazione/defosforilazione
Protein Kinasi – trasferiscono un fosfato dall’ATP ad amino acidi specifici
C
C C O
O
H
NH Serina
C
C C O
O
NH
OP
O-
O-
O-fosfoserina
KinasiATP
ADP
Protein Fosfatasi – rimuovono un fosfato da specifici amino acidi
C
C C O
O
H
NH Serina
C
C C O
O
NH
OP
O-
O-
Fosfatasi
Pi
Fosforilazione Defosforilazione
O-fosfoserina
Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazioneInterruttori On-Off – Proteine di fosforilazione
Kinasi e Fosfatasi fosforilano/defosforilano specifici amino acidi
Amino Acido Kinasi Fosfatasi
Ser & Thr Protein kinasi C
MAP kinasi
PP1
PP2A
Tyr Recettore per l’EGF pp60c-src
CD45
Thr & Tyr(Doppia specificità)
MAP kinasi kinasi AtDsPTP1
Meccanismi di Trasferimento dell’Informazione
Un cambiamento nello stato di attività di un componente a monte porta ad un cambiamento dell’attività di un componente a valle.
• Il cambiamento può essere attivante o inibente. Esso è interazione-specifico. (p.es. La fosforilazione del target può aumentarne o diminuirne l’attività)
Secondi MessaggeriSecondi Messaggeri
Tipicamente composti a basso peso molecolare prodotti all’interno della cellula da un enzima stimolato dal legame di un ligando a un recettore
Adenilato Ciclasi
GTP
ATPAMP ciclico
2Pi
Attiva la Protein Kinasi A
Attivata dalla subunità
di Gs
Fosfolipasi C
PIP2
PLC
IP3
DAG
Attivata da recettori legati a Gq
Attiva la Protein Kinasi C
Induce un aumento del Ca2+
citosolico
Membranaplasmatica
PIP2 – fosfatidilinositolo difosfatoIP3 – inositolo trifosfatoDAG - diacilglicerolo
In entrambi questi sistemi il legame di un singolo ligando ad un recettore produrrà un gran numero di molecole di secondo
messaggero
- AMPLIFICAZIONEAMPLIFICAZIONE - un ruolo chiave per i secondi messaggeri
Amplificazione
1 recettore attiva più proteine G
Ciascun enzima X produce molti
secondi messaggeri,
ciascun messaggero attiva
1 enzima Y
AMPLIFICAZIONE
AMPLIFICAZIONE
AMPLIFICAZIONE
AMPLIFICAZIONE
AMPc
Kinasi A
Enzima Z
Prodotti dell’enzima Z
proteina recettoreuna molecola
di ligando
subunità di Gs
Adenilato ciclasi attivata
Ciascuna kinasi A può fosforilare e attivare
molte copie di enzima Z
Ciascuna copia di enzima Z produce molte
molecole di prodotto
1recettore-ligando
500 Proteine G
500enzimi
105
2ndi messaggeri
250canali ionici
105-107
ioni
Una molecola di rodopsina assorbe un fotone
Sono attivate 500 molecole di trasducina
Sono attivate 500 molecole di fosfodiesterasi
Sono idrolizzate 105 molecole di GMPc
250 canali del Na vengono chiusi
Viene prevenuto l’ingresso nella cellula di 106-107 ioni Na per secondo per circa un secondo
La membrana dei bastoncelli è iperpolarizzata di 1 mV
Calcio – il messaggero universaleCalcio – il messaggero universale
Il Ca2+ è mantenuto ad una concentrazione estremamente bassa nel citosol (a causa della sua tossicità), tuttavia la concentrazione del Ca2+ è alta fuori dalla cellula e all’interno di alcuni organelli
L’apertura rapida e transitoria di canali permette al Ca2+ di fluire nel citosol seguendo il suo gradiente di concentrazione e costituisce la base di un sistema di signalling ubiquitario
PLCDAG
PKC
Calcio – il messaggero universaleCalcio – il messaggero universale
kinasi
L’IP3 si lega al recettore per l’IP3 sul reticolo
endoplasmatico e apre un canale del Ca2+ (che fa
parte del recettore)
L’attivazione della PLC porta alla formazione di IP3 solubile in
acqua
Il Ca2+ rilasciato dal RE si lega alle Calmoduline
permettendole di interagire con altre proteine e attivarle
La Calmodulina può attivare pompe del Ca2+ del reticolo endoplasmatico abbassando la [Ca2+] citosolico
La Calmodulina può attivare pompe del Ca2+
sulla membrana plasmatica abbassando la
[Ca2+] citosolico
La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine, p.es. kinasi calmodulina-dipendenti
Vie o Networks Generalmente le vie coinvolgono una serie di reazioni a cascata che portano ad un flusso lineare dell’informazione
Esempi di vie
1) Vie delle Proteine G2) Via di Ras–MAPK
I networks (reti) sorgono da interazioni in cui un componente di una via regola l’attività di una seconda via
La via Gq-PLC-
rasrafras
GTP
Risposta
Cascata delle MAP chinasi
L’attivazione di ras da parte della CaMKII attiva la via delle MAP chinasi
Chinasi a cascataChinasi a cascata
CaMKIIIl Ca2+ si lega alle
calmoduline
La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine, p.es la kinasi II
calmodulina-dipendenti
Meccanismi a feedback, feedforward e cross-talk
A volte, molecole non direttamente coinvolte in una reazione enzimatica possono interagire allostericamente con l’enzima stesso alterando la conformazione dell’enzima e quindi la sua velocità di reazione.
Quando sono gli stessi substrato o prodotto dell’enzima ad interagire allostericamente con esso, essi possono mediare interazioni a feedback o a feedforward con la via metabolica in cui è coinvolto l’enzima, oppure mediare un cross-talk tra vie metaboliche parallele.
(A) Feedback negativo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z inibisce l’enzima E1 che catalizza la reazione XY.
(B) Feedback positivo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z stimolsa l’enzima E1 che catalizza la reazione XY.
Meccanismi a feedback
In una interazione a feedback, il prodotto di una reazione enzimatica influenza l’attività di un altro enzima che lo precede nella via metabolica.
Feedforward in uno schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. X stimola l’enzima E2 che catalizza la reazione YZ.
Meccanismi a feedforward
In una interazione a feedforward, il prodotto di una reazione enzimatica influenza l’attività di un altro enzima che lo segue nella via metabolica.
Reti di signaling e comunicazione incrociata (cross-talk)
Una ipotetica rete di signaling. La rete consiste in sei recettori e tre protein kinasi citosoliche. Ciascun recettore attiva (frecce verdi) o inibisce (linea nera) la kinasi 1 o la 2 o entrambe con un meccanismo non specificato. Poichè i segnali convergono sulla kinasi 3 (la kinasi di output), questa rete si attiverà massimalmente solo quando saranno presenti combinazioni specifiche di stimoli extracellulari.
molecole della matrice fattori di crescita
kinasi 1 kinasi 2
kinasi 3
Nel cross-talk il metabolita di una via influenza l’attività dell’enzima di un’altra via.
Segnali multipli – ‘Crosstalk’ di recettoriSegnali multipli – ‘Crosstalk’ di recettori
Immaginate che una cellula riceva due segnali. Il segnale A inibisce la proliferazione, mentre il segnale B stimola la proliferazione…
A B
chinasiIl segnale A attiva una chinasi…
…che fosforila e inattiva il recettore per il segnale B -
risultato – nessuna proliferazione
Se il ‘crosstalk’ lavora solo in una direzione (ad es. da A a B) allora il segnale A sarà dominanteSe il ‘crosstalk’ lavora in entrambe le direzioni, ciò che accadrà dipenderà da diversi fattori p.es.
Timing della percezione del segnaleDensità relativa dei recettori
Ampiezza relativa del segnale
-
Un crosstalk tra vie del signaling neuronale può influenzare cambiamenti sinaptici indotti da stimoli
B (basale) stabile
T (soglia) metastabile
A (attivo) stabile
MAPK vs PKC
PKC vs MAPK
• Il punto A rappresenta uno stato di attività alta sia per la PKC che per la MAPK, mentre il punto B rappresenta uno stato di bassa attività.
• Entrambi i punti rappresentano livelli diversi di stati stazionari. Un sistema dI questo tipo è definito bistabile.
• Il punto di biforcazione T è importante perché definisce la soglia di biforcazione.• Con A viene innescato un loop a feedback positivo che diventa indipendente
dall’attivazione del recettore.
In particolare, la capacità della PKC di regolare la MAPK e della MAPK di regolare la PKC porta ad una interazione tra le due vie (feedback pos.)
• Quasi tutte le isoforme di adenilato ciclasi (AC) sono regolate dalla via della PLC.
• L’AC è intimamente associata a siti di ingresso del Ca2+ nella cellula.
• Oscillazioni nei livelli di AMPc intracellulare insorgono a causa di una inibizione a feedback dell’AC Ca2+-dipendente.
• Quindi il signalling dell’AMPc si interseca con il Ca2+ intracellulare ed estende le sue modalità di regolazione.
Feedback negativo ed oscillazioni
Feedback negativo ed oscillazioniIl modello mette in relazione i livelli di AMPc e l’ingresso di Ca2+. L’AMPc attiva canali del Ca2+ (Y). L’ingresso di Ca2+ aumenta. Il Ca2+ intracellulare inibisce l’adenilato ciclasi (AC). L’effetto complessivo è un loop a feedback negativo in cui l’AMPc inibisce la sua stessa produzione.
Oscillazioni nell’AMPc e nel Ca2+ sono sostenute dal loop a feedback negativo.
cAMPAMP)PDE(b
)AC(a
intf
eext CaCa
22
Od
c
C YY
*ACACg
h
Feedback positivo
Problema: come può essere immagazzinata informazione, ad es. nel sistema nervoso, partendo da molecole instabili?
Consideriamo ad es. il processo di fosforilazione come un meccanismo diimmagazzinamento di informazione.
• La fosforilazione è un meccanismo comune per attivare/disattivare enzimi.
• Supponiamo che un bit di informazione sia stato immagazzinato in un neurone in seguito alla fosforilazione di un enzima chiave attivandolo.
• In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe durare a lungo.
In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe durare a lungo.
Difficoltà: In realtà, l’emivita della proteina fosforilata è limitata e quindi anche lo stato “on” dell’enzima.
Quesito centraleÈ possibile costruire interruttori molecolari stabili?
Secondo questo articolo è possibile costruire interruttori molecolari in grado di immagazzinare informazione indefinitamente, utilizzando reazioni enzimatiche ben note e in maniera estremamente semplice.
Reazioni in un interruttore bistabile.
• L’interruttore è costituito da due proteine: la kinasi-1, che può esistere in uno stato inattivo (K1) o in uno stato attivo (K*
1p), e una fosfatasi.
• La transizione tra gli stati inattivo e attivo è dovuta a una reazione di fosforilazione.• La fosforilazione può essere catalizzata dalla kinasi-1 attiva (feedback positivo) • o dalla kinasi-2 attivata durante una stimolazione neuronale.
Interruttori molecolari bistabili
In assenza di attività della Kinasi-2, l’interruttore è descritto da quattro equazioni:
Eq. 1 stabilisce che la derivata prima della concentrazione della Kinasi-1 attiva dK*1p/dt, è la differenza tra le velocità di reazione della kinasi e della fosfatasi.
Eq. 2 è la legge di conservazione per la kinasi-1, dove T è la somma della kinasi-1 attiva e inattiva.
Eq. 3 descrive le reazioni della Eq. 1 in termini di cinetiche di Michaelis-Menten, dove Km1 e Km2 sono le costanti di Michaelis per la kinasi-1 e la fosfatasi, rispettivamente; C1 e C2 sono i numeri di turnover della kinasi-1 e della fosfatasi, rispettivamente, e P è la concentrazione della fosfatasi.
Eq. 4 è ottenuta sostituendo l’eq.2 nella 3.
• In assenza di kinasi-1 fosforilata, la velocità di reazione della fosfatasi è zero.
• All’aumentare di K*1p, la velocità di reazione della fosfatasi aumenta fino alla saturazione.
• La velocità della reazione della kinasi-1 aumenta all’aumentare di K*1p, ma la velocità decresce nuovamente per concentrazioni elevate di K*1p perchè vi è poca proteina non fosforilata da fosforilare.
Ve
loci
tà (
mo
li/l·
10-8/s
)
Fosfatasi
Kinasi
Le velocità di reazione della kinasi-1 e della fosfatasi dipendono dalla frazione di kinasi-1 attiva
Velocità (M/s) delle reazioni della kinasi-1 (termine di sinistra nell’Eq. 4) e della fosfatasi (termine di destra nell’Eq. 4) in funzione della frazione dei kinasi-1 attiva (K*
1p/T).
Grafico della derivata di K*1p (Eq. 4) rispetto al tempo in funzione di K*1p/T.
La derivata prima rispetto al tempo della concentrazione di kinasi-1 attiva (dK*pl/dt) è la differenza tra le velocità delle reazioni della kinasi e della fosfatasi.Allo stato stazionario (equilibrio) sara:
Affinchè uno stato sia stabile, deve essere dK*1p/dt = 0 e d2K*1p/dt2 deve essere negativa. Questa seconda condizione è richiesta affinchè una piccola deviazione da uno stato stabile sia seguita da un ritorno spontaneo a quello stato.
In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati in due punti: K*1p/T = 0 e K*1p/T 0.74, mentre K*1p/T 0.22 rappresenta uno stato instabile.
Stati stabili
stato instabileK*1p/T0.22
I punti in corrispondenza di K*1p/T = 0 e di K*1p /T 0.74 rappresentano gli stati stabili.Ad esempio:• se K*1p /T > 0 ma < 0.22, dK*1p/dt è negativa e K*1p ritornerà velocemente a zero;• se K*1p/T > 0.22 ma < 0.74, dK*1p/dt è positiva e K*1p/T aumenterà a 0.74,• se K*1p/T diventa > 0.74, dK*1p/dt è negativa e K*1p/T scenderà verso 0.74.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-5
0
5
dK1p
/dt
& d
2 K1p
/dt2
[K1p
]/[T]
dK*1p/dt
d2K*1p/dt2
Affinchè un punto di equilibrio sia stabile, deve essere:
dK*1p/dt = 0 e
d2K*1p/dt2 <0
In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati nei due punti: K*1p/T = 0 e K*1p/T 0.74, mentre K*1p/T 0.22 rappresenta un punto di equilibrio instabile
0.22 0.74
Tempo (s)
[K1
p*]
/T
0.74
0.22
0
Le curve convergono verso i due punti stabili K*1p/T = 0 e K*1p/T = 0.74 a seconda che la concentrazione iniziale (normalizzata) di K*1p sia rispettivamente minore o maggiore di 0.22, che rappresenta il punto di equilibrio instabile.
stato stabile (fosforil.)
stato stabile (defosforil.)
stato instabile
Soluzioni dell’equazione differenziale:
per diverse concentrazioni iniziali di K1p*
Effetto della stimolazione sull’interruttoreStimoli di diversa ampiezza attivano la kinasi-2 in modo graduale.
L’interruttore può essere acceso permanentemente da uno stimolo esterno
Kinasi
Fosfatasi
Stimolo
Funzione neuronale
K*1p/T
K*2 (nM)
Tempo
L’attivazione risultante della kinasi-1 è anch’essa graduale finchè la sua attivazione diviene rigenerativa. Da quel momento, l’attività della kinasi-1 rimane alta anche quando lo stimolo verrà rimosso.
Meccanismo molecolare del potenziamento a lungo termine
Spina
Ramo di un dendrite
Assone
Terminalepresinaptico
TerminalepostsinapticoSinapsi
PSD
La “densità postsinaptica o “postsynaptic density” (PSD) è una zona specializzata densa di proteine attaccate al lato citosolico della membrana postsinaptica.
• La PSD, caratteristica delle sinapsi eccitatorie del SNC, consiste di recettori ionotropici, proteine di sostegno e del citoscheletro, e molecole di signaling.
• Tali proteine creano un microdominio di signaling, che traduce inputs presinaptici in risposte postsinaptiche.
• Due sottotipi di recettori glutamatergici, AMPA ed NMDA, mediano la la trasmissione eccitatoria rapida.
Trasmissione Sinaptica
AM
PA
R
AM
PA
R
Po
ten
zial
e d
’azi
on
e
Po
ten
zial
e d
’azi
on
e
Glutamato
Potenziamento
Glutamato
AM
PA
R
AM
PA
R
NM
DA
R
NM
DA
R
Na+ Na+ Ca++
Mg++
NM
DA
R
NM
DA
R
Mg++
I recettori AMPA forniscono la depolarizzazione della membrana postsinaptica, che a sua volta aiuta l’apertura dei recettori NMDA a generare l’ingresso di Ca2+ che innesca cascate di signaling.
Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica
Tempo (min)0 60
Cor
rent
e po
stsi
mna
ptic
a
Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca2+
Bliss & Lomo J Physiol, 1973
Il potenziamento a lungo termine o LTP è una forma sinapsi-specifica di plasticità che potrebbe essere correlata ad alcuni tipi di memoria.
Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica
Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca2+
Tempo (min)0 60
Cor
rent
e po
stsi
mna
ptic
a
con un inibitore della CaMKII non c’è LTP
Lledo et al PNAS 1995, Giese et al Science 1998
*CaMKII a bassa attività: Potenziamento precoce (memoria a breve termine?)
Le CaMKII attivate agiscono su proteine preesistenti in attesa di essere attivate. Ad es., fosforilazione di recettori AMPA risposta postsinaptica più intensa a parità di glutammato liberato
AMPAR
fosforilazione
Processi di rilascio
*CaMKII
NMDAR Ca++
**CaMKII LTP
** CaMKII ad alta attività: Potenziamento tardivo (memoria a lungo termine?)
Premessa
La CaMKII è localizzata nella PSD ed è richiesta per l’induzione di LTP
La protein kinasi II Ca2+/calmodulina-dipendene (CaMKII) localizzata nella PSD è in una posizione ideale per giocare un ruolo chiave nell’LTP, essendo virtualmente in grado di indurre i processi a valle che potenziano la trasmissione sinaptica.
• L’ingresso transiente di Ca2+ attraverso canali NMDA, che avviene durante l’induzione dell’LTP, stimola l’autofosforilazione persistente e l’attivazione della CaMKII.
• L’attivazione persistente della CaMKII suggerisce che essa possa agire come un interruttore bistabile responsabile del rafforzamento tutto-o-nulla delle singole sinapsi.
Obiettivo
Comprendere il meccanismo di accensione della CaMKII e, in particolare, come la CaMKII possa rimanere in uno stato altamente fosforilato nonostante l’attività delle fosfatasi endogene.
La CaMKII è una proteina multimerica in cui l’oloenzima è costituito da 8 a 12 subunità, ciascuna delle quali ha un’attività kinasica.
Ciascuna subunità è fosforilabile e il sito di fosforilazione è rappresentato dalla Thr286.
La defosforilazione della CaMKII avviene per azione specifica della PP1 trattenuta nel PSD da proteine strutturali.
Un oloenzima = 8/12 subunità
Protein Kinasi II Calmodulina-dipendente
CATALiTICAAUTO-INIBITORIA
CaM ASSOCIAZIONEALLE SUBUNITA’
COOHH2N
Un dominio autoinibitorio occupa e blocca il sito catalitico.
La Ca2+/calmodulina rimuove il dominio autoinibitorio dal sito catalitico causando fosforilazione e attivazione.
Gli oloenzimi di CaMKII formano una struttura ad anello. Negli oloenzimi di CaMKII, le subunità si assemblano in due anelli coplanari, ciascuno contenente 4/6 subunità. In queste strutture ad anello si realizza l’autofosforilazione mediante un processo in cui una subunità fosforila quella accanto.
Meccanismi di bistabilitè del sistema CaMKII/PP1 nel PSD
La CaMKII può trovarsi quindi in uno stato attivato (“on”) nel quale la maggior parte delle 8/12 subunità sono fosforilate a livello della Thr286 e in uno stato disattivato (“off”) nel quale esse sono quasi completamente defosforilate.
Come fa un gruppo di molecole CaMKII e PP1 nella PSD ad operare come un interruttore che presenta due diversi stati stabili a concentrazioni basali di Ca2+ intracellulare?
L’operazione di attivazione è basata su tre reazioni che possono avvenire ai livelli basali di Ca2+.
Stato “off” Stato “on”
(1) Se nessun sito Thr286 in un anello è fosforilato, la prima autofosforilazione richiede il legame di due molecole di Ca2+/calmodulina: una per attivare la subunità catalitica della CaMKII, e l’altra per esporre la Thr286 della subunità adiacente che funge da substrato.
v1 = velocità di inizio dell’autofosforilazione per sito (subunità)
k1 = costante di velocità dello step di autofosforilazione elementare
KH1 = [Ca2+]50 per l’attivazione della CaMKII (0.7 μM, Kuret and Schulman, 1984)
[Ca2+]i a riposo (100 nM) << KH1 l’inizio procederà lentamente alla [Ca2+] di riposo.
C= complesso Ca2+-calmodulina Po=oloenzima non fosforilatoP1=oloenz. fosforil. una volta
Po PoC PoC2 P1C2
(1)
Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v1. dipenderà dalla seconda potenza della [Ca2+/calmodulina], che a sua volta dipende dalla quarta potenza della [Ca2+]:
Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v2, della CaMKII parzialmente fosforilata sarà superiore a v1, in quanto dipenderà solo dalla quarta potenza della [Ca2+]:
(2)
0.E+00
2.E-07
4.E-07
6.E-07
0 0.04 0.08 0.12
[Ca] (microM
velo
cità
di a
uto
fosf
ori
lazi
on
e
v1
v2
(2) Invece, una volta che una o più subunità sono fosforilate, la velocità di fosforilazione della Thr286 diventerà molto più rapida, nonostante la bassa [Ca2+]in, dal momento che è richiesta solo una molecola di Ca2+/calmodulina per esporre la Thr286 della subunità che funge da substrato.
P1 P1C P2
Quindi, il compartimento biochimico di rilievo è il volume della PSD all’interno del quale la concentrazione delle subunità della CaMKII è 100–200 μM.
Se vi è un numero significativamente elevato di subunità fosforilate della CaMKII, la loro concentrazione sarà molto più alta della KM della fosfatasi (1 μM), e vi sarà saturazione della fosfatasi.
(3) I siti della Thr286 della CaMKII vengono defosforilati ad opera esclusivamente della PP1 tenuta nel PSD da proteine di sostegno: il contributo delle altre fosfatasi è minimo in quanto non sono in grado di funzionare nella PSD.
La defosforilazione delle subunità procede secondo lo schema di Michaelis-Menten:
SP = subunità fosforilataS = subunità defosforilataE = fosfatasi
(3)
Pertanto, la velocità di defosforilazione per sito della CaMKII parzialmente fosforilata, v3, sarà:
k2 = costante catalitica della PP1
KM = costante di MM
ep = concentrazione di PP1 attiva*
Pi = concentrazione dell’oloenzima fosforilato i-volte.
Interpretazione intuitiva di come questo sistema chimico può operare da interruttore
• Quando gli oloenzimi CaMKII sono pochissimo fosforilati, la velocità alla quale i siti disponibili diventano autofosforilati è bassa perchè la reazione (1) è lenta.
• Al contrario, la PP1 può rapidamente defosforilare ogni sito fosforilato poichè essa non è saturata (vi sono pochi siti sui quali la PP1 deve intervenire).
• Lo stato “off” è pertanto stabile poichè la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito è bassa rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.
• Questa situazione è ribaltata nello stato “on”.
• In questo caso, la reazione della CaMKII è più veloce (essendo richiesta solo una calmodulina per la reazione (2).
• D’altro canto, l’alta concentrazione di subunità fosforilate satura la fosfatasi, e la velocità alla quale essa può defosforilare le varie subunità è pertanto bassa.
• Lo stato “on” è quindi stabile essendo la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito alta rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.
La simulazione mette in evidenza l’esistenza di un sistema bistabile a [Ca2+]in basali che dipende dalle proprietà della fosfatasi presente nel PSD
Vi sono due livelli stabili (punti neri) di fosforilazione a [Ca2+]in basali (linea verticale). Il sistema è bistabile in un ampio intervallo di [Ca2+]in (area ombreggiata).
Il punto rosso indica la percentuale totale di siti di Thr286 fosforilati dopo che il 20% dell’oloenzima della CaMKII nello stato “on” altamente fosforilato è stato rimpiazzato da oloenzimi non fosforilati. Tale perturbazione non è sufficiente a spingere il sistema nello stato “off”.
Il passaggio del sistema allo stato “off” richiederebbe che la fosforilazione precipitasse al di sotto del livello marcato con il punto giallo (punto di equilibrio instabile).
Allo stato stazionario, il livello di fosforilazione delle Thr286 varia con la concentrazione intracellulare di Ca2+.
NOTA BENE: La CaMKII nella PSD può essere defosforilata solo dalla PP1.
Un aumento della [Ca2+]in aumenta la frequenza di autofosforilazione.
Se la [Ca2+]in è quella basale (bassa), il grado di fosforilazione allo stato stazionario della CaMKII è basso (cerchio nero nel grafico).
Successivamente, un ingresso di Ca2+, causato ad es. da stimolazione elettrica, può muovere transitoriamente la [Ca2+]in verso destra, a valori molto più elevati.
Se la [Ca2+]in rimane per un certo tempo elevata, a destra della regione grigia, l’autofosforilazione farà saltare stabilmente l’attività della CaMKII da un livello basso ad uno alto (cerchio nero nel grafico).
Successivamente, quando la [Ca2+]in ritorna a livelli basali, lo stato della CaMKII si riduce, muovendosi verso sinistra. Ma l’attività della CaMKII permane comunque ad un livello alto, con sostenuta autofosforilazione.
Un aumento della [Ca2+] aumenta la frequenza di autofosforilazione.
FINE