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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS BAYAS DE GOJI.

Muestra: “ZUMO DE BAYAS FRESCAS DE GOJI” BIO-ENER S.L. Botella de 0,5 L recibida en julio-2009, para su análisis en Septiembre/Octubre

Referencia interna: 09/321-2009

Responsable: Dra. María Pilar Almajano (CEIB)

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ÍNDICE

OBJETIVO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

ANTIOXIDANTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

IMPORTANCIA DE LAS BAYAS DE GOJI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE,

POLIFENOLES Y FLAVONOIDES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

CAPTURA DE RADICALES POR EL METODO TEAC.

Cuantificación de polifenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu

Cuantificación de flavonoides

Oxigen Radical Absorbance Capacity (ORAC)

CONDICIONES GENERALES DEL ESTUDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

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OBJETIVO

El objetivo de este estudio es estudiar la evolución de la capacidad antioxidante del producto “Zumo de bayas

de Goji” a lo largo de 30 días y en diferentes condiciones de temperatura. Este producto está comercializado

por la empresa BIO-ENER S.L.

Se determina la evolución:

•delacapacidadantioxidanteporelmétodoTEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)

•delacapacidadantioxidanteporelmétodoORAC(Oxigen Radical Absorbance Capacity)

•delospolifenolestotalesporelmétodoFolin-Ciocalteu

•delosflavonoidesporelmétodointerno(refSantaset al. 2008)

ANTIOXIDANTES

Losantioxidantessonmoléculasquetienenlapropiedaddeevitaroprevenirlaoxidaciónconotrasmoléculas.

Seproduceunaoxidación,siemprequeunaespeciecedeelectronesaotra,laespeciequeganaelectrones

sereduce,ylaquepierdeseoxida.Enestasreaccionesdeoxidación,aveces,sepuedenproducirradicales

libres,especiesmuyoxidativasyquepuedenproducirdañosalorganismo.Losantioxidantessonespeciesque

acaban estas reacciones, inhibiendo algún producto intermedio y oxidándose los mismos.

Lascélulas,comopartedesupropiometabolismo,producenradicaleslibresyespeciesreactivasdeloxigeno

(ROS).Estosradicaleslibres,sonbloqueadosporuncomplejosistemaantioxidantedeenzimascomolaca-

talasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y un continuo de antioxidantes no enzimáticos, como las

vitaminasA,EyC,glutatión,ubiquinonaoflavonoides.

Siseproduceundesequilibrioentrelosproxidantesylosantioxidantes,sellegaaunestadodeestrésoxidati-

vo,quepuedeserproducidoporunaexcesivaproducciónderadicaleslibres.

Ladietajuegaunpapelimportanteenlaprevencióndelasenfermedadesrelacionadasconelestrésoxidativo,

fundamentalmenteatravésdelaingestióndecompuestosbioactivosdeorigenvegetal.

Entre ellos, las vitaminas hidrosolubles y liposolubles, carotenoides y una gran variedad de compuestos fe-

nólicos,lacapacidadantioxidanteybeneficiosadeloscualesestánsiendoinvestigadosampliamenteenlos

últimosaños.

Los compuestos fenólicos, constituyen una de las principales clases de metabolitos sencundarios de los ve-

getales,dondetienendiversasfuncionesfisiológicas.Entreotros,intervienenenelcrecimientoyreproducción

de las plantas y en los procesos defensivos, (patógenos, depredadores, incluso radiación ultravioleta). Los

compuestos fenólicos presentan un anillo benzo hidroxilado, como un elemento común en todas sus estructu-

ras moleculares, las cuáles pueden incluir grupos funcionales como esters, metil-esters, glicósidos, etc.

Loscompuestosfenólicoscomprendendesdemoléculassimplescomoloácidosbenzóicoshastapolímeros

complejos como las ligninas. Dentro de cada familia, el número de compuestos fenólicos existentes, serán

másomenosvariado.Porejemplo,seconocenmásde400flavonoidesdiferentes,distribuidosendiversas

subfamilias, Los compuestos fenólicos están presentes en todo el reino vegetal y sus cantidades y tipos varían

en función de la especie, variedad y parte del vegetal considerado (frutas, semillas, brotes hojas....) horas de

exposición solar, grado de maduración, condiciones de cultivo, etc.

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A los alimentos los compuestos fenólicos, se presentan conjugados con azúcares, como la glucosa, galactosa,

arabinosa,ramosa,xilosaolosácidosglucorónicosygalacturónicos.Tambiénpuedenunirseconácidoscar-

boxílicos, ácidos orgánicos, aminoácidos y lípidos.

Enlaactualidad,estegrupodecompuestosdeorigenvegetal,presentanungraninterésnutricional,porsu

contribución, al mantenimiento de la salud humana. De hecho, desde 1.990, diversas organizaciones interna-

cionales, en el ámbito de la nutrición, recomiendan un consumo diario como mínimo de cinco raciones de fruta

o verdura, para asegurar una adecuada ingesta de antioxidantes y prevenir enfermedades relacionadas con el

estrésoxidativo.

Laactividadantioxidantedeloscompuestosfenólicos,vienedeterminadaporsuestructuraquímica,porloque

existen grandes diferencias en la efectividad en los antioxidantes entre los diferentes grupos de compuestos.

Los compuestos fenólicos pueden actuar, como donantes de hidrógeno o electrones a las reacciones de termi-

nación,querompenelciclodegeneracióndenuevosradicaleslibres,anticipandolasreaccionesdetermina-

ciónactuandocomounantirradicalarios.Elradicalfenoxilgeneradoesmenosreactivo,yaqueseestabilizapor

resonancia con los electrones π del anillo aromático.

La alimentación aporta sustancias necesarias para el metabolismo humano, pero es justamente este mecanis-

moelque,almismotiempo,produceespeciessecundariascomoradicaleslibres,muyreactivosyoxidantes,

con efectos negativos para la salud.

Los seres vivos, tienen un complejo sistema, para hacer frente a esta oxidación, y en especial, los vegetales,

por estar expuestos a la radiación solar. Ciertas sustancias, llamadas antioxidantes, desde vitaminas hasta

polifenoles,bloqueanlaaccióndeestosradicaleslibres.

Importancia de las bayas de Goji.

Durantelosúltimosaños,lasBayasdeGoji,hanestadoconsideradascomounodelosalimentos,conmayor

capacidadantioxidante,quelashahechoespecialmentepopulares.

Las bayas de Goji, (o cerezas de Goji) son el fruto de un arbusto llamado Lycium barbarum L. de la familia de

las Solánaceas. Esta planta es bien conocida en la medicina tradicional china.

Hoyendíaestámuyusadacomoalimentofuncional,conunalargavariedaddeefectosbeneficiariosparala

salud.Porejemplo,reduccióndelaglucosasanguínea,efectosanti-envejecimiento,beneficiosinmunológicos,

efectos anticancerígenos, incluso anti-fatiga (Harunubu et al.2009).

ElprimerarchivochinoquedocumentaelusodelLycium barbarumL.,tieneaproximadamente2.300años.

Los frutos de la planta pueden ser utilizados, para producir diferentes tipos de productos saludables, como

fórmulas, y zumos medicinales. Algunos constituyentes del Lycium barbarum L,hansidoestudiadosquímica-

mente, especialmente los polisacáridos glicoconjugados, presentes en las bayas. El objeto de este estudio es

“Zumo de bayas frescas de Goji” obtenido directamente de las bayas y sin adición de otros componentes.

Algunosestudioshancuantificadolacapacidaddediversasfrutas,comolaguayaba,lapapaya,labanana,la

carambola,lamanzanadeJamaica,olanaranja.LaGuayaba,(138mgequivalentedeácidogálico/100gde

frutaentera)eslaquemáscapacidadantioxidantemuestra,seguidaporlacarambola(131mg/100),lanaranja

(75 mg/100), el mango (54 mg/100), la banana (51 mg/100), la manzana de Jamaica (35 mg/100), y la papaya

28mg/100),todosellosmedidosconmgequivalentedeácidogálico/100grfrutaentera(Limetal.2007)

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Cuantificación de la actividad antioxidante, polifenoles y flavonoides

Existendiversosmétodosdemedirlaactividadantioxidantetotal.Algunosdeéstosmétodos,sepuedenbasar

en diversos procedimientos, como es la captación de radicales libres, generados o bien la medición de los po-

lifenolestotales,contenidosenlamuestra,porelmétododeFolin-Ciocalteau.

Captura de radicales por el método TEAC

ElmétodoTEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity),esunmétodoquesirveparacuantificarlacapaci-

dadantirradicalariadeloscompuestosantioxidantes,esdecir,sirveparacuantificarlacapturadelosradicales

libres.

ElmétodoTEAC,segeneraunradicallibrepositivo,estable,llamadoABTS(Acido2,2-azinobis-(3-etilbenzo-

tioazolín-6-sulfónico)medianteunareacciónentreésteyelpersulfatodepotasio.

Aéste,seleañadeelantioxidantequequeremosestudiar,ycomprobamosladisminucióndelaabsorvenciade

lamuestra,yaqueelABTSposeeungrupocromóforoqueobservalaluza734nm.

Cuantificación de polifenoles totales por el método del Folin-Ciocalteu

ElensayoFolin-Ciocalteu,haestadoutilizadodurantemuchosaños,comomedidadelcontenidoencompues-

tosfenólicostotalesenproductosnaturales.Aúnasí,elmecanismobásicoesunareacciónredox,porloque

sepuedeconsiderar,comootrométododemedidadelaactividadantioxidantetotal.Elmétodoqueseutiliza

actualmente,esunamodificación,efectuadaporSingletonyRossi(1965)deunmétodoqueseutilizaba,para

ladeterminacióndelatirosina,queestababasadoenlaoxidacióndelosfenoles,porunreactivodemolibdeno

y wolframio.

La mejora introducida por Singleton y Rossi, fue el uso de un heteropolianio fosfórico de molibdeno y tungsteno

queoxidalosfenolesconmayorespecificidad,

(3H2O-P2O5-13WO3-5MoO3-10H2O y 3H2O-P2O5-14WO3-4MoO3-10H2O)

Laoxidacióndelosfenoles,presentesenlamuestra,causalaaparicióndeunacoloraciónazuladaquepre-

sentaunmáximodeabsorcióna765nm,yquesecuantificaporespectrofotometríaenbaseaunarectapatrón

deácidogálico.Setratadeunmétodoprecisoysensible,peroque,aúnasí,padecenumerosasvariaciones,

cuando es aplicado por diferentes grupos de investigación, fundamentalmente en lo relativo a los volúmenes

utilizadosdelamuestra,concentracióndereactivosytiempoytemperaturadeincubación.Tambiénseprodu-

cennumerosasvariaciones,enelmododeexpresarlosresultados,demaneraqueelpatrónrecomendadode

ácido gálico, ha sido sustituido, en ocasiones por otros. El ensayo de los fenoles totales, se utiliza con frecuen-

cia en el estudio de las propiedades antioxidantes de alimentos vegetales, como zumos de fruta, al tratarse

deunparámetroquegeneralmente,muestraunaestrechacorrelaciónconlosdiferentesmétodosdemedirla

actividad antioxidante.

Así, cuando se evalúan, las propiedades antioxidantes de estos alimentos, el análisis de fenoles, proporciona

información valiosa a la hora de seleccionar, variedades con mayor potencial antioxidante.

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Cuantificación de flavonoides

SerealizaporunmétodointernodescritoenSantaset al.Medianteseparaciónyposteriorcuantificaciónpor

espectrofotometría UV-Vis.

Oxigen Radical Absorbance Capacity (ORAC)*

ElmétodoORACseaplicacon frecuenciaparaasegurar lacapacidadantioxidanteenmuestrasbiológicas

yalimentos.Sebasaenlainhibicióndelradicalperoxiloxidativoinducidoporcomposicióntérmicadecom-

puestos azo como el 2,2`-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Así, el ensayo ORAC combina

tiempoydisminucióndelainhibición,adiferenciadelmétodoTEACqueúnicamenteevalúaladisminuciónen

la inhibición.

Inicialmente,elmétodoORACse realizabaconB-phycoercythrin (B-PE)comocompuestofluorescente, ya

queposeediferenteslongitudesdeondadeexcitaciónyemisión,elevadocampodefluorescencia,sensibili-

dad a las especies reactivas de oxigeno (ROS) y solubilidad en agua. Aún así, la B-PE presenta una serie de

inconvenientes:bajapurezadelreactivo(aproximadamentedel30%)queprovocamuchasvariacionesenlos

resultadossiseutilizanreactivosprocedentesdediferenteslotes,noesfotoestableporloquetranscurrido

un cierto tiempo, pierde totalmente la coloración e interacciona con los polifenoles. Estos inconvenientes han

provocadoqueapartirdelaño2001estemétodosehayaadaptadoparaserutilizadoconfluorescencia(FL)

(3´6´-dihydroxy-spiro(isobenxofuran-1(3H),9´(9H)-xanthen)-3-one)comocompuestofluorescente.

Elmecanismodelareacciónsebasaenlatransferenciadeunátomodehidrogeno(HidrogenAtomTransfer,

HAT)delantioxidantealradicallibre.Poresto,seutilizaelradicaliniciador,elAAPH,paragenerarelradical

peroxil ROO· Un mol de AAPH, pierde un mol de nitrógeno, para generar dos mols de radical AAPH en un ratio

constante. En una solución saturada de aire, el radical AAPH reacciona rápidamente con el oxígeno para dar

unradicalperoxilmásestable,ROO·.LapérdidadefluorescenciadelaFLeselindicadordelaextensiónde

la oxidación con el radical peroxil. En presencia de un antioxidante, RRO· capta, preferiblemente, un átomo de

hidrógenodelantioxidanteestable(ArO·).Comoconsecuencia,ladisminucióndelafluorescenciadelaFLpor

accióndelradicalperoxilesdisminuidaoinhibida.Lasreaccionesquetienenlugarson:

DondeA-HrepresentaalradicaliniciadorAAPH,FL-Heselcompuestofluorescente(FL)yArOHeselantioxi-

dante.

Laproteccióndelantioxidantesemideapartirdeláreadefluorescenciabajolacurva(AUC)delamuestraen

comparación con la AUC del blanco, donde el antioxidante no está presente. La AUC se calcula mediante la

siguiente expresión:

*Seexplicaconmásprofundidaddebidoaqueeselmásutilizadoyalavezmásdesconocidoprocidimentalmente.

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Donde:

I: número de ciclos.

F:unidadesdefluorescencia

CT:tiempodecadacicloenminutos.Enestecaso,CTesiguala2

Lafigura1muestraunejemplodelasAUCdelblancoydelospatrones,Trolox20mM,40mM,100mM,200

mM y 300 mM (concentraciones iniciales en muestra)

Figura 1. AUC de blancos y patrones de Trolox.

El área limpia bajo la curva (AUC límpia) se encuentra por diferencia entre el AUC de la muestra y el AUC del

blanco.EstaAUClimpia(y)serepresentadelantedelaconcentracióndeTroloxcomopatrón(X)obteniendola

rectaderegresiónlineal,apartirdeaquí,secalculanlosmolesequivalentesdeTroloxporlitrodemuestra.Se

haderemarcarqueestecalibradoconTrolox,sehaderealizarcadavez.

Alafigura2,seindicaunejemplodelarectadecalibradoobtenidaporunensayodelmétodoORAC.

Figura 2. Calibrado del método ORAC para un ensayo determinado

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Condiciones generales del estudio

La muestra se conservó con refrigeración (t=4ºC ± 2º C) y con la botella cerrada hasta el momento del inicio

del proceso.

Condiciones climáticas.

Sereproducieronlascondicionesquesepuedenllevaracaboencasa.Seconsideródossituaciones,(cada

una en una botella). La cantidad necesaria para el análisis se extraerá periódicamente de ellas, en condiciones

higiénicas.

Unadelasbotellassemantuvoalatemperaturade20ºC(enunclimatizador)durantetodoeltiempoqueduró

el experimento. La otra se conservó a temperatura ambiente, es decir sobre una mesa protegida de la luz. Am-

bas se dejaron desde el 16 de septiembre, durante 30 días. La evolución de la temperatura ambiente da una

media de 25,4ºC.

Debido a la evolución del experimento (posible contaminación a temperatura no refrigerada), a partir del 1 de

Octubre, se inician los estudios a temperatura de refrigeración (4ºC), con otra botella.

La desviación máxima de las condiciones reales de las cámaras respecto las condiciones establecidas es de

±2ºC. Se registró diariamente las condiciones de temperatura.

Duración del estudio.

Todoslosestudiossedieronatérminoduranteunperiodode30días.

Control del producto.

Elproductofuéanalizadoaliniciodelestudioyalolargodeladuracióndeéste,mediantecontrolesperiódicos

cada 5 días.

En cada control, se realizaron tres determinaciones por cada una de las pruebas y cada una de las tempera-

turas.

Toma de muestras

Cada 5 días y a la misma hora, se homogeneiza la muestra de la botella (por agitación manual) y se cogen 10

mL. No se pudo utilizar directamente el producto. Del zumo se separa la partículas en suspensión, mediante

centrifugación a 1200 rpm durante 10 minutos y se coge el sobrenedante, utilizando esta como muestra*

Lametodologíautilizadaenlosanálisiscorrespondealosmétodosdeprocedimientonormalizadosdetrabajo

validados,basadosendesarrollosinternos.Losensayossellevaronatérminoconloscontrolesylasgarantías

establecidas en nuestro sistema de gestión basado en la norma ISO-17025.

Algunasdelasmuestras,(inicialyfinal)sevalidaronporHPLC.

*Tambiénseextrajolospolifenolesdelprecipitado.Presentaresultadossimilaresalsobrenadado,peronoserecogenenesteinforme.

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Métodos

Determinación de polifenoles totales y de flavonoides.

ElmétododeFolin-Ciocalteusehautilizadoparaladeterminacióndepolifenolestotales,siendoelpatrónyla

referenciaelácidogálico.Losresultadosseexpresan,comoequivalentesenmgdeácidogálicoporLdezumo.

Pararealizarestemétodo,seutilizólasextraccionesrealizadasanteriormente.

ElmétododeFolin-Ciocalteu,sebasaenunareacciónentreelreactivoFolin-Ciocalteuactivadoconunabase,

como carbonato de sodio.

Elmétododeflavonoidescuantificalospolifenolesmásactivoscomoantioxidantes.

ParaquelamuestranosalgadelrangolinealdelaleydeLambert-Beer,nidelrangodelecturadelaparato,se

diluye adecuadamente la muestra.

Los resultados se expresaron mediante una calibración previa realizada con ácido gálico como patrón.

Estudio de la capacidad antirradicalaria.

ElmétodoTEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)esunmétodoquesirveparamedircapacidadanti-

rradicalaria de una muestra.

Secomparalacantidaddeinhibicióndelradical libredelamuestraconladeunpatrón,Trolox,unisómero

hidrosolubledelavitaminaE,apartirdeunarectadecalibrado.Losvaloresobtenidossonsimilares(noequi-

valentes)alacapacidadantioxidantequetendríalavitaminaE,peroconlaventajaque,alserhidrosolubleno

quedaretenidoenelorganismo.

ElmétodoORAC(Oxigen Radical Absorbance Capacity) se aplica para medir la capacidad antioxidante en

muestrasbiológicasyalimentos.Combinatiempoydisminucióndelainhibición,adiferenciadelmétodoTEAC

quesolamenteevalúaladisminuciónenlainhibición.

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Resultados

a) La actividad antioxidante del Goji presenta los siguientes valores:

I) Entre60y75miliequivalentesdeTrolox/Ldemuestraalolargodelmes,medidoporelmétodoORAC

quedeterminatodaslasespeciesreactivasaloxígeno.Enlafigura3serecogelaevolución.

Figura 3: Evolución de antioxidantes totales por ORAC

II) Entre23y30miliequivalentesdeTrolox/Ldemuestraa lo largodeunmes,medidoporelmétodo

TEAC,quedeterminalasespeciesreactivasfrenteradicaleslibres.

Losresultadosserecogenenlafigura4.

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Figura 4: Evolución de los compuestos antirradicales por TEAC.

b) Lospolifenolestotales,determinadosporelmétodoFolin-Ciocalteu,estánentre2y3equivalentesengra-

mosdeácidogálico/Ldemuestra.Lafigura5muestralaevoluciónalolargodeunmes.

Figura 5: Evolución de los compuestos fenólicos.

c)Losflavonoidestotalesseencuentranenelrangode0,2a0,6equivalentesengramosdeácidogálico/Lde

muestra.Enlafigura6serecogelaevolución.

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Figura 6: Evolución de los compuestos flavonoides

CONCLUSIONES:

Por tanto, se puede afirmar que la capacidad antioxidante mostrada por el zumo de Goji, de aproximadamente

unos 240 mg/100 g (medidos con mg equivalentes de ácido gálico, por cada 100 gr de zumo de Goji), presentan

una capacidad antioxidante, casi dos veces superior a la Guayaba o la carambola, unas tres veces superior a

la naranja, seis veces superior al mango y a la banana y unas siete veces superior a la manzana de Jamaica

y la papaya.

Bibliografía

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antioxidant biomarkers in serum of healthy adults, Nutrition Research, Volume 29, Issue 1, January

2009, Pages 19-25.

Y.Y.Lim,T.T.Lim,J.J.Tee,Antioxidantpropertiesofseveraltropicalfruits:Acomparativestudy,Food

Chemistry, Volume 103, Issue 3, 2007, Pages 1003-1008.