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PCR em Tempo Real
Dr Robson Francisco Carvalho
Departamento de
Morfologia
PCR em Tempo Real
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
* Pobre precisão
* Baixa sensitividade
* Curta extensão dinâmica (< 2 logs)
* Baixa resolução
* Não automatizado
O que há de errado com os géis de agarose?
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
* Resultados não são expressos em números
* Colorações não são muito quantitativas
* Pós-processamento do produto da PCR
* Contaminação (brometo)
* Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento
O que há de errado com os géis de agarose?
PCR em tempo real
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Starting
Template
PCR
Round 1
PCR
Round 2
2X
Template
4XTemplate
30-40 ciclos
Cycle
Fluorescence
Análise Real-time
Constante detecção e
monitoramento dos
produtos de amplificação
durante toda corrida
(emissão de fluorescência)
PCR tradicional
Deteção do produto
no gel de agarose
PCR em Tempo Real
PCR tradicional x PCR tempo real:
PCR em tempo real
Sistemas de detecção
PCR em tempo real:
→ Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
Vantagens do PCR em tempo real:
→ Não é influenciado por amplificação não-específica (sondas)
→ Amplificação pode ser monitorada em tempo real
→ Ciclos mais rápidos
→ Detecção de alteração menor que 2x
Gel de agarose
5x
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Vantagens do PCR em tempo real:
→ Maior extensão dinâmica (de até 1010 x)
→ Requer 1000x menos DNA que demais ensaios
(3 picogramas = 1 genoma)
→ confirmação da amplificação específica (análise da curva de melting)
→ MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e REPRODUZÍVEL
→ Não é muito mais caro que a PCR convencional
(exceção: preço do equipamento)
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
FASES DA PCR:
→ Exponencial: Dobro do produto é acumulado em cada ciclo (eficiência da reação
~100%). Reação específica e precisa.
→ Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reação)
→ Platô: Detecção por gel para os métodos tradicionais. Produtos não são mais
produzidos e começam ser degradados
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
FASES DA PCR:
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
Desvantagens do PCR em tempo real:
→ Não é ideal para multiplex
→ Utilização requer alta habilidade técnica e suporte
→ Alto custo do equipamento
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Sistema Tempo Real:
→ Sistema óptico
→ Termociclador
→ Hardware
→ Software
PCR em tempo real
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FQ
…...…...T
1. Polimerase encontra o primer.
2. Laser excita a sonda fluorescente
do primer.
3. Florescência é absorvida
pela molécula inibidora Q.
4. Detector registra “no reaction”.
PCR em Tempo Real
FQ
…...T
….
5. Primer estendido pela Polimerase.
PCR em Tempo Real
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FQ
…...…...T
…...….
6. Extensão continua até a polimerase encontrar a molécula fluorescente.
7. polimerase quebra o primer marcado. A sonda fluorescente e a molécula inibidora são liberadas.
PCR em Tempo Real
FQ
…...
T
…...…...…..
.…
Q
QF
F8. O PCR continua, os primers marcados são degradados e moléculas fluorescentes “livres”são acumuladas.
9. O detector grava a fluorescência como medida do progresso de amplificação.
PCR em Tempo Real
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PCR em Tempo Real
- SNPs
- Patógenos
- Carga viral
- Expressão gênica
- Transgênicos
Endpoint Tempo Real
Análise
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Análise
Endpoint Tempo Real
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
Montagem da reação:
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ Baseline: fluorescência do amplicon = fluorescência do meio
(ruído liberado pela reação-background)
- ciclo da PCR com poucas mudanças no sinal de fluorescência
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Terminologia:
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ Rn: sinal do alvo normalizado pelo sinal da referência passiva (ex. ROX)
ROX: fluorescência presente no meio (correção do volume)
Normalização: fluorescência total- fluorescência ROX
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ ∆∆∆∆Rn: magnitude do sinal gerado pela PCR (Rn – Baseline)
- Normalização do “reporter” pelo background
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ Threshold: nível de ∆Rn (determinado automaticamente ou
manualmente), utilizado para a determinação do CT
→ Acima do Baseline e dentro da fase exponencial da curva
PCR em tempo real
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Terminologia:
PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Terminologia:
PCR em tempo real
Diluição de uma
mesma amostrathreshold
CT
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Terminologia:
CT: cycle threshold: ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (threshold)
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