EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Consideraciones iniciales
- Condiciones de limpieza y esterilidad
- Peligrosidad de algunos reactivos usados en la purificación
FasesFases
- Rotura-homogeneización: obtención de un lisado celular- Bacterias: lisozima- Plantas y hongos: rotura mecánica y/o enzimas
específicas (celulasas, quitinasas)- Células animales: detergente
- Rotura mecánica: macerado con nitrógeno líquido, prensa de French, homogeneizador, sonicación.
- Purificación: separación de los ácidos nucléicos del resto de componentes celulares
- Extracción con solventes orgánicos, precipitación de proteínas y otras impurezas
- Concentración: mediante precipitación
- Lavado y resuspensión
Rotura-homogeneización- Prevenir la degradación del ADN
- Evitar rotura física del ADN- Impedir acción de nucleasas: EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético)
- Detergentes: SDS, desestabilizan las membranas celulares
- Proteinasa K: degrada proteínas
- Buffer rotura, composición típica: Tris, EDTA, SDS, CTAB
Purificación
- Extracción con fenol-CIA (1:1) (CIA: cloroformo:alcohol isoamílico 24:1)
- Acetato potásico: elimina proteínasSDS y lípidos, precipitados por centrifugación
Concentración - Precipitación con alcoholes: etanol (2.5:1) o isopropanol (0,7:1), en presencia de cationes monovalentes (Na+, K+, NH4
+)
- Centrifugación en frío
- Lavado con etanol 70%. Secado.
- Resuspensión en TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8)
Purificación mediante columnas- Gel filtración: separación por tamaño
- Columnas de afinidad, intercambiador aniónico
Purificación de ADN plasmídicoPurificación de ADN plasmídico
- Lisis alcalina
- Rotura: tampón con glucosa, lisozima, EDTA- Desnaturalización: tampón con SDS, NaOH- Purificación: acetato potásico en solución ácida
- Boiling- Rotura, hervido, hielo, centrifugación.
- Columnas de afinidad
- Gradiente de cloruro de cesio
Purificación de ADN plasmídicoPurificación de ADN plasmídico
- Gradiente de cloruro de cesio- Utiliza un gradiente de cloruro de cesio y el agente intercalante bromuro de etidio para generar diferencias de densidad entre el ADN superenrrollado plasmídico (ccc) y el ADN lineal cromosómico o plasmídico circular abierto (oc). El superenrrollado acepta menos BrEt y será más denso, apareciendo más abajo tras la centrifugación
Cuantificación de ácidos nucleicosCuantificación de ácidos nucleicos
- Electroforesis
- Marcadores de peso molecular de concentración conocida, comparar la intensidad de la señal tras la tinción con bromuro de etidio. Densitometría
- Espectrofotometría- 260 nm (máxima absorbancia de ácidos nucléicos)- 280 nm (máxima absorbancia de proteínas)
- ADNss: 1.0 OD = 33 µg/µl- oligonucleótidos: 1.0 OD = 20 µg/µl- ADNds: 1.0 OD = 50 µg/µl- ARNss: 1.0 OD = 40 µg/µl
Para ADN puro: A260/A280 = 1.65 – 1.9
Para ARN puro: A260/A280 = 2.0
EXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARN
FasesFases- Material de partida
- Siempre fresco o congelar inmediatamente, preferiblemente en nitrógeno líquido.
- Evitar acción ARNasas: espacio de trabajo limpio, siempre guantes, tratar en autoclave todo el material dos veces o en horno a 260ºC durante 12 h. Todas las soluciones tratadas con DEPC (dietil pirocarbonato) 0.1% (mezclar por agitación durante 2-3 h al menos y luego tratar en autoclave), excepto las que llevan Tris, para éstas usar H2O DEPC ya esterilizada de partida. El DEPC inactiva las RNAsas por carboxietilación de determinados aminoácidos.
- Rotura: similar al caso del ADN, conveniente hacerlo en frío, por ejemplo nitrógeno líquido. Rápidamente añadir buffer de rotura.
- Purificación: Varios sistemas. - Mezclas tipo Trizol (Invitrogene): Isotiocianato de guanidina. Precipita las proteínas y permite una separación de los diferentes componentes celulares: ADN, ARN, proteínas, etc- Extracciones con fenol-cloroformo y precipitación selectiva con LiCl
0.2 M. Siempre quedan trazas de DNA, deben eliminarse con ADNasa libre de ARNasas, sobre todo si se va a realizar RT-PCR
- Columnas RNeasy de Qiagen: ARN de muy buena calidad, algo de contaminación con ADN.
Típico gel de agarosa con ARN de hongos teñido con BrEt
- Las bandas intensas corresponden a los ARN ribosomales (aprox. 80% del total en la célula), aproximadamente 3.4 y 1.7 kb de tamaño
- El ARNm no representa más del 2-5% del total y aparece como un barrido o a veces no es visible
- Almacenamiento
En H2O DEPC a -80ºC durante semanas-meses. A -20ºC es mucho más inestable. También precipitado con etanol/sal a -80ºC
¿ARN total o ARNm?
- Para la mayor parte de usos ARN total puede ser utilizado: Northern, RT-PCR
- ARNm es imprescindible para construcción de bibliotecas de ADNc y para el marcaje de sondas para hibridación de microarreglos.
Purificación de ARNm
- Columnas de oligo(dT)-celulosa
- Retienen el ARNm al tener una cola de poly-A en 3’. Una ronda elimina entre 50-70% ARNr, se pierde entre un 20 y un 50% del total de ARNm. Una segunda ronda elimina hasta 95% de ARNr y es imprescindible para marcaje de cDNA en microarrays.
- Dyna-beads
- Dyna-beads (de Dynal), recubiertas con oligo(dT) pemiten separar eficientemente el ARNm mediante separación magnética
Streptavidina
Biotina
Bolita magnéticaOligo-dT 25 nucleótidos
Molécula de ARNm