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Diagnostico da leishmaniose visceral humana
José Angelo Lauletta LindosoInstituto de Infectologia Emílio Ribas-SES-SP
Laboratório de Soroepidemiologia-LIM38 HC-FMUSP
Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo
10 SEMINÁRIO REGIONAL SOBRE LEISHMANIOSE VISCERAL
FLORIANÓPOLIS-SC
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90% dos casos: Brasil, Etiopia, Nepal, Índia, Sudão e Bangladesh
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Urbanização da LV no Brasil
Harhay et al. Trends in
Parasitology 2011
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Distribuição de municípios do Estado de São Paulo segundo classificação epidemiológica para leishmaniose visceral americana. Dezembro/2012.
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Classificação dos municípios quanto a área de transmissão de
LVA, ESP, 2010 a 2012
Sem transmissãoEsporádicaModeradaIntensa
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Situação geográfica, magnitude e transcendência
Mundo Américas Brasil
76 países com casos registrados 11 países com casos registrados 5 Regiões e 21 Unidades Federadas com casos registrados
Países prioritários: Índia, Bangladesh, Sudão,Sul de Sudão, Brasil e Etiópia
Países prioritários: Brasil, Paraguai, Argentina e Colômbia
Casos esporádicos: Nicarágua, Venezuela, Honduras, Costa Rica, Bolívia
Regiões prioritárias: Nordeste, Norte e Sudeste
Média casos/ano: 0,2 a 0,4 milhões
Média de casos registrados ao ano: 3.500
Estimativa de casos: 4.500-6.800 casos/ano (Alvar, 2012)
Média de casos registrados ao ano: 3.383
Estimativa de casos: 4200-6300 casos/ano (Alvar, 2012)
20.000 a 40.000 mortes/ano Letalidade: 7% Letalidade: 6,9%
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AgenteEtiológico
DOENÇA MULTIFATORIAL
Vetor Reservatório Hospedeirosusceptível
Alterações Geográficas
físicos
Fatores
humanos ou sociais biológicos
Leishmaniose Visceral
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Interação
Parasito IntracelularResposta imunológica celular e
humoral do hospedeiro
Espectro clínico da doença
Imunopatogenia das Leishmanioses
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FATORES DETERMINANTES DA INFECÇÃO
PARASITA
TAMANHO DO INÓCULO
FASE DE METACICLOGÊNESE
Fase de Metaciclogênese (crescimento lento)
0 5 dias
METACICLOGÊNESE
Maturação
Expressão de moléculas na sua superfície LPG
GP63VETOR
SUBSTÂNCIAS NA SALIVA
MAXADILANHOSPEDEIRO
FATOR GENÉTICO
FATORES IMUNES R. Inata
R. Adquirida
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Leishmaniose
Vetor
MacrófagoDiferenciação
Progressão
da doença
Promastigotas.........Amastigotas
Órgãos
Pele
Hospedeiro
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Infecção
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PMN
Eo
complemento
oxLDL
Mf
CD8+
IFNg
IFNg
CD4+ TH1
TNFaIL-2
IL-12 NK
IFNg
IL-10
CD4+ TH2
IL-4IL-3
GM-CSFTGFb
IGF-IInespecífica
Específica
IL-10TNFa
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Aspectos imunopatogênicos da leishmaniose visceral
Órgãos alvo
Neutrófilos
Monócitos
Hemácias Plaquetas
Alterações laboratoriais:
Anemia PlaquetopeniaNeutropenia Linfopenia
Linfonodos
Medula óssea
Fígado
Baço
Comprometimento da medula óssea edesvio na produção de outros tipos celulares
Infecção de células do sistema reticulo endotelial
Diminuição na produção dos progenitores dos
linfócitos T
Triade clássicaFebre
EmagrecimentoHepatoesplenomegalia
1 2
3
4
56
7
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Comprometimento do sistema imune
Imunossupressão específica a antígenos de
Leishmania
Síndrome inflamatória sistêmica
Deficiência da imunidade efetora
Reversíveis após otratamento
Ativação imune sistêmica
Teste de Montenegro negativo
Diminuição de linfócitos T
Ativação policlonal células B
Hipergamaglobulinemia
Ativação policlonal células T
Elevados níveis de citocinas inflamatórias
1 2
3
4
5
6
77
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Leishmaniose Visceral
Assintomática Oligossintomática Clássica
Sorologia
Teste de Montenegro
Hepatoesplenomegalia
+ ++ ++++
+ + ou - -
Ausente Discreta Volumosa
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(Badaró et al, 1986)
FORMAS CLÍNICAS DA LEISHMANIOSE VISCERAL
Clássica: 5 a 10% dos
infectados por L.chagasi
Subclínica ou Oligossintomática:
sintomatologia leve. Facilmente
confundidas com processos
infecciosos de diversas
etiologias. Progressão para a
cura ou para a LV clássica.
Assintomática: infectados
sem evidência clínica.
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AI: asymptomatic infection=LST+/++++ and IFAT−
SRI: subclinical resistant infection= LST+/++ and IFAT+/++
III: indeterminate initial infection=LST−and IFAT+/++
SI: symptomatic infection=LST− and IFAT+++/++++
SOI: subclinical oligosymptomatic infection=LST− and IFAT+++/++++
Crescente et al, AJTMH, 103, 2009
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Perfil Clínico de LV
Silveira et al
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SINAIS E SINTOMAS
SINAIS E SINTOMAS FREQUENCIA
FEBRE 98-100%
ESPLENOMEGALIA 98-100%
HEPATOMEGALIA 90-100%
LINFOADENOPATIA 30-50%
DIARRÉIA 15-35%
PALIDEZ 35-70%
ADINAMIA 80-100%
EPISTAXES 15-30%
PETÉQUIAS 20%
ICTERÍCIA 5%
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Diagnóstico Laboratorial
• Exames Inespecíficos:• Hemograma
• Leucopenia
• Anemia
• Plaquetopenia
• Eletroforese de proteínas• Hipergamaglobulinemia
• Inversão da relação albumina/proteína
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Diagnóstico Laboratorial
• Sorológico:• Elisa• IFI• Western blot
• Parasitológico• Pesquisa direta• Cultura: Meio NNN• Inoculação em hamster
• Molecular• PCR
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Diagnóstico da Leishmaniose Visceral
• Critérios clínicos• Manifestações clínicas
• Laboratoriais• Sorologia
• IFI e ELISA
• Pesquisa e cultura
• Testes imunocromatográficos• rK 39
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Diagnóstico de laboratório
Exames específicos
• Métodos diagnósticos disponíveis :
- Métodos diretos: Exame parasitológico, cultura e PCR
- Métodos indiretos: Teste Imunocromatográfico (Teste rápido), Imunofluorescência indireta (IFI) e ELISA
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Diagnóstico de laboratório
Métodos diretos
Permitem a visualização do parasito na amostra obtida do paciente e incluem:
• A visualização de amastigotas no esfregaço de material obtido a partir de punção aspirativa.
• A visualização de promastigotas em cultivos de material obtido na punção aspirativa
• A detecção de material genético (ADN o ARN) do parasito por meio de técnicas como a
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR).
Foto: Costa, JML, CPq GM-Fiocruz, Brasil
Foto: Costa, JML, CPq GM-Fiocruz, Brasil
Foto: Braz, LM, IMT-USP-SP, Brasil
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Técnica: Punção aspirativa
• Procedimento invasivo
• Necessita de instalações adequadas e apoio para a realização de possíveis transfusão e
cirurgia, se houver complicações relacionadas ao procedimento;
• Requer habilidade e conhecimento técnico específico do médico
• Sensibilidade variável, quando utilizado o exame parasitológico direto:
• aspirado de baço: 93% a 99%
• aspirado de medula óssea: 53% a 86%
• aspirado de gânglio linfático: 53% a 65%
ATENÇÃO: A cultura de Leishmania aumenta a sensibilidade do diagnóstico direto
Métodos diretos
http://youtu.be/XwaiUBudFj4
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Métodos diretos
• A sensibilidade dos métodos diretos é variável e depende:
• da experiência do analista e o tempo utilizado para a leitura da lâmina
•da técnica utilizada para punção aspirativa e processamento da amostra
•da condição imunológica do paciente
• Tempo de resultado do diagnóstico
• A realização do exame parasitológico direto é rápido e de amplo uso
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DEMONSTRAÇÃO DO PARASITO ATRAVÉS DE EXAME DIRETO DE AMOSTRAS DE MEDULA ÓSSEA.
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Solução fisiológica (salina), estéril e
gentamicina
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Inoculação em animais
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Diagnóstico molecular
• Gênero específico• kDNA
• Espécie específico• mannose phosphate isomerase gene (MPI)
• Distingue braziliensis, peruviana e guyanensis
• cysteine proteinase B: PCR-RFLP• brazisliensis e não braziliensis
• Gp 63: PCR-RFLP
• G6PD
• Hsp 70: PCR-RFLP
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• Tempo de resultado do diagnóstico:
• o PCR é rápido, com elevada sensibilidade e de acordo com os iniciadores usados, apresenta também elevada especificidade. É mais oneroso e requer uma estrutura laboratorial mais complexa.
• o cultivo requer pelo menos 30 dias para obter o resultado
Métodos diretos
Foto: Kanashiro, EY. eMartins, T. IMT-USP-SP
Foto: Martins, T. IMT-USP-SP
Foto: Braz, LM. IMT-USP-SP
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Métodos indiretos
• Se baseiam na detecção de anticorpos específicos contra Leishmania.• As técnicas disponíveis são:
• imunocromatografia - teste rápido – rK 39• imunofluorescência indireta (IFI) valores ≥ 1:80• ELISA (EIE)
• Imunocromatografia (teste rápido):
• detecta anticorpos contra o antígeno rK39• é fácil de realizar, rápido e econômico• recomendado para diagnóstico precoce devendo estar disponível em todos os níveis de atenção• sensibilidade: 84,7% (79,7 – 88,7%) e 92,0% (87,8 – 94,8%)
• especificidade: 96,8% (93,9 – 98,4%) e 95,6% (92,2 – 97,5%)•O teste rápido está validado para uso em soro.
http://youtu.be/g1mIDwiYX4w
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DIRECT AGGLUTINATION TEST (DAT)
• KIT Biomedical Research, Amsterdam, The Netherlands
• Promastigotas de L. donovani
• Leishmania donovani, L. infantum or L. chagasi
• Não requer equipamento e treinamento
• Alta sensibilidade e especificidade
• Placas 96 poços fundo em V
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TESTE RÁPIDO PARA LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA
(Kalazar Detect Rapid Teste – InBios)
APRESENTAÇÃO:
50 TESTES E DOIS TAMPÕES OU
25 TESTES E UM TAMPÃO
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20 µl soro
2 a 3 gotas de tampão (Chase Buffer)
Linha controle Linha controleLinha teste (+)
TESTE NEGATIVO TESTE POSITIVO
TESTE RÁPIDO PARA LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA
(Kalazar Detect Rapid Teste – InBios)
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Imunocromatografia (teste rápido):
• Interpretação dos resultados de um teste rápido rK39.• Positivo: quando a linha do controle e a linha teste estiverem presentes, o
teste é considerado reagente mesmo quando sua linha for levemente vermelha.
• Negativo: quando apenas a linha do controle estiver presente.• Inválido: quando houver ausência da linha controle
Funed: Representação Esquemática do resultado do teste rápido
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Teste rápido é um teste de diagnóstico fácil de utilização ao lado do paciente.Quando positivo, pela alta especificidade, permite definir o diagnóstico de LV.Porém, pela sua sensibilidade que não é elevada, não permite descartar o diagnóstico de LV.
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Métodos indiretos
• Imunocromatografia (teste rápido):
• O teste rápido está indicado para pacientes com suspeita clinica de leishmaniose visceral, de qualquer idade, proveniente de área endêmica e com os seguintes sinais e sintomas:
• Febre de qualquer duração associada à esplenomegalia• Febre de qualquer duração associada à hepatomegalia• Febre de duração igual ou superior a 14 dias, associada a qualquer citopenia
(anemia, leucopenia, plaquetopenia ou pancitopenia).
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• ELISA
• detecta anticorpos anti-Leishmania
• menor especificidade
• a amostra é feita a partir da coleta de sangue, de onde se separa o soro e o plasma, que
podem ser usados para detecção dos anticorpos
• procedimento realizado em laboratório e processamento feito em espectrofotômetro a
492 nm.
• a amostra é considerada positiva quando a densidade ótica é igual ou superior a
densidade ótica média dos soros controles negativos mais dois desvios padrões
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Técnicas recomendadas para o diagnóstico de leishmaniose visceral paraáreas endêmicas , segundo nível de sistema de saúde.
Nivel de lo sistema de salud Técnicas de diagnóstico
Centro de Atención Primaria
Serológico: Antígeno rK39, detectado en prueba inmunocromatográfica
Hospital Distrital o Regional
Serológico: Antígeno rK39, detectado en prueba inmunocromatográfica o
prueba de aglutinación directa *
Parasitologico: Microscopía de aspiración en la médula ósea, los ganglios
linfáticos o el bazo **
Hospital de Referencia (Atención
terciaria)
Serología : Antígeno rK39 detectado en prueba inmunocromatográfica,
prueba de aglutinación directa, otro prueba serológica (por
ejemplo, IFAT, ELISA)
Parasitologico: Microscopía de las muestras de crema leucocitaria, médula
ósea, ganglios linfáticos o bazo
Cultivo o PCR
Fuente: WHO TRS 949,2010
(*)Prueba de aglutinación directa se debe utilizar sólo si la adecuada supervisión y control de calidad
(**) Aspiración del bazo debe ser realizado únicamente por personal médico experimentado y si las instalaciones para el tratamiento de las complicaciones hemorrágicas se encuentran disponibles.
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IMPORTANTE
Em decorrência do aumento da coinfecção Leishmania/HIV nos últimos anos, recomenda-se oferecer o teste de HIV a todo paciente com diagnóstico de leishmaniose visceral, tendo em vista que esta pode manifestar-se como doença oportunista em pessoas imunodeprimidas.
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Projeto de pesquisa em andamento
Validação do teste imunocromatográficos rk39 em humanos utilizando sangue total e exsudado de mucosa oral (saliva).
Local LV CS CI
Campo Grande 22 2 1
Bauru 17 0 0Aracaju 27 2 -
São Paulo - - 0
Total 66 4 1
Tabela 2. Frequência de amostras positivas no teste rápido, em
amostras de soro de pacientes de LV e controles, de acordo com o
local de coleta
LV – leishmaniose visceral, CS – controle sadio, CI – controle
infectado
As quatro amostras de controle saudáveis (CS) e uma de
controle infectado (CI) reagiram fracamente (linha tênue).
Local Teste P % IC 95%
Campo GrandeN=26
TR-ST 96,15 81,11-99,32
TR-FO 84,62 66,57-93,85
TR-SO 92,31 75,86-97,86
BauruN=8
TR-ST 100,0 67,56-100,0TR-FO 62,50 30,57-86,32TR-SO 100,0 67,56-100,0
AracajuN=18
TR-ST 83,33 60,78-94,16
TR-FO* 68,75 44,00-85,84
TR-SO 77,78 54,79-91,00
TotalN=52
TR-ST 92,31 81,83-96,97
TR-FO# 76,00 62,59-85,70
TR-SO 88,46 77,03-94,60
Tabela 4. Positividade (%) e intervalos de confiança de 95% de probabilidade (IC 95%)
do teste rápido em amostras soro de pacientes com LV, de acordo com o local de coleta
Local Teste P % IC 95%Campo GrandeN=14
DAT 85,71 57,19-98,22IFI 92,86 66,13-99,82
BauruN=8
DAT 100,00 63,06-100,0IFI 87,50 47,35-99,68
AracajuN=11
DAT 100,00 71,51-100,0IFI 100,00 71,51-100,0
TotalN=33
DAT 93,94 79,77-99,26IFI 93,94 79,77-99,26
Tabela 9. Positividade (%) com intervalos de confiança de 95% de probabilidade (IC
95%) do DAT e IFI em amostras de pacientes com LV
Local Teste P % IC 95%
Campo GrandeN=5
DAT 0,00 0,00-43,45IFI 0,00 0,00-43,45
BauruN=2
DAT 0,00 0,00-65,76IFI 0,00 0,00-65,76
AracajuN=6
DAT 0,00 0,00-39,03
IFI 50,00 18,76-81,24
TotalN=13
DAT 0,00 0,00-22,81IFI 23,08 8,18-50,26
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José Angelo Lauletta Lindoso
• Instituto de Infectologia Emílio Ribas – SES-SP
• 3896-1236
• Instituto de Medicina Tropical
• 3061-7023
E-mail: [email protected]