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非金属化合物及其代谢产物的测定
Determination of nonmetal compounds and their
metabolites
第三章
2
第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
本章介绍内容
尿硫氰酸盐硫氰酸盐氰化物
血碘,尿碘碘
尿氟,血氟,发氟氟
血硒,尿硒硒工作周末尿砷,发砷砷
均为班末
尿中 2-硫代噻唑烷 -4-羧酸终末呼出气中二硫化碳
2-硫代噻唑烷 -4-羧酸 TTCA
二硫化碳
均为班末血中碳氧血红蛋白
终末呼出气中 CO 碳氧血红蛋白一氧化碳
备注生物监测指标代谢产物项目
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
一氧化碳Carbon monoxide
第一节
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
一、理化特性
一氧化碳( CO)是煤、木材、石油等含碳物质燃烧不
完全的产物,为无色、无臭、无刺激性的有毒气体。
在空气中爆炸浓度 12%~ 74%。
水中溶解度很低,易溶于氨水。
空气中较稳定。高温下和硫反应生成羰基硫 (COS),
与过渡金属反应生成金属羰基化合物,对银盐、钯盐、
钼酸盐、五氧化二碘等显示还原性。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
二、代谢和生物监测指标 职业接触
非职业接触:
CO含量:火药爆炸后气体: 30~60%; 汽车废气: 0.6~ 10%; 香烟烟雾:~ 4%。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
碳氧血红蛋白CO与血红蛋白的亲和力比O2高
250倍,与血红蛋白生成碳氧血红
蛋白( carboxyhaemoglobin)。氧合血红
蛋白的解离度比碳氧血红蛋大 3000
倍。
正常人体内碳氧血红蛋白浓度大
约为 0.5%,而吸烟者碳氧血红蛋
白最高可达 15%~ 20%。中毒死亡可达 90%
询问吸烟史
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
CO 中毒
呼吸系统毒性,头痛、头晕、意识模糊、
昏迷,并发脑水肿,呼吸衰竭休克致死!
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
HbCO 含量 中毒症状
评价接触水平时注意吸烟史、用药史、贫血等
生物监测指标:血 HbCO,呼出气中 CO浓度
BEI : HbCO 为 Hb 的 3.5% ; CO 23.4ppm (均为班末);BEL : HbCO为 Hb的 5%(班末)。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
CO的体内代谢
吸收后的 CO绝大部分以原形由肺部排出,排
出速度取决于从血红蛋白释放的快慢、肺通气
量、吸入氧气的浓度和 HbCO的浓度等。
CO 半 排 出 期 128 ~ 409min , 平 均 约
300min。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
三、样品采集及保存
呼出气
接触 CO后 3h临近班末进行,收集终末呼出
气。按常规采集,收集在采样管或复合膜采气袋中,密封,带回实验室尽快测定。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
血液
HbCO 的生物半减期约为 5h,应在接触
CO3h后的班末或接触最高浓度时采集静脉血或
末稍血。血样置于加肝素的密闭容器中, 4℃ 保
存可一周。用氟化钠作防腐剂。受检者在采样当
天不能吸烟。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
一氧化碳的生物监测
呼出气中一氧化碳浓度:采用气相色谱法。但
要求衍生,操作复杂。
血液碳氧血红蛋白:采用分光光度法
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
四、血中碳氧血红蛋白的测定WS/T 42-1996 (一)分光光度法
1. 原理:血液中含还原血红蛋白( Hb),氧合血
红蛋白( HbO2),碳氧血红蛋白( HbCO)及微量高铁
血红蛋白(MetHb)。用还原剂连二亚硫酸钠将HbO2和
HbMet 还原为 Hb,血样中只有 HbCO 和 Hb。 HbCO
和 Hb的最大吸收波长分别为 420nm和 430nm,测定血样在两波长下的 A,用公式计算求得HbCO百分浓度
本法最低检测浓度为 2%HbCO( 0.02 吸光度对应浓度, 10µl血样),测定范围 2%~ 70%HbCO。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
2 .样品测定
冷藏血样室温放置,混匀。迅速取
10l,加入内盛 15ml Tris溶液的具塞试管
中 (或直接取血 10l),加入 60mg连二亚硫
酸钠,轻轻混匀放置 10min ,测其在
420nm和 430nm处的吸光度值。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
结果计算
式中:X ——血中碳氧血红蛋白的浓度,%;A420——血样 420 nm的吸光度值;
A430——血样 430nm的吸光度值;
K1——HbCO420 nm吸光常数;
K2——HbCO430nm的吸光常数;
K3——Hb420 nm吸光常数;
K4——Hb430 nm吸光常数。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
吸光度的加合性原则
A420=K1.CHbCO+K3.CHb
A432=K2.CHbCO+K4.CHb
K2A420=K1K2CHbCO+K2K3CHb (1)K1A432=K1K2CHbCO+K1K4CHb (2)
(1)-(2):K2A420-K1A432=K2K3CHb-K1K4CHb
CHb=K2A420-K1A432/K2K3-K1K4
CHbCO=K4A420-K3A432/K1K4-K2K3
CHbCO%=CHbCO/CHbCO+CHb
怎么来的呢?
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
3.摩尔吸光系数的测定
取不吸烟健康人血液(肝素抗凝),水稀释 5 倍,取0.3ml用稀释液( Tris)稀释至 90ml。
通氧气 30min(流速 30ml/min)。
从中取 4 份,每份 15ml 于试管中;其中 2 份通氮
10min除氧,得 HbO2液。另 2份通纯 CO10min,得
HbCO 液。立即将 HbO2、 HbCO 制备液分别转入盛
Na2S2O4试管中,放 10min后测 430nm和 420nm的
吸光度值作为计算用摩尔吸光系数。
一氧化碳
氧气
氮气
水稀释 5倍
抗凝健康人血
用 Tris稀释至90ml
通氧 30min(30ml/min)
通氮 10min通 CO10min各取 15ml
立即将 HbO2 、 HbCO 制备液分别转入盛 Na2S2O4 试管中,放 10min 后测430nm和 420nm的吸光度值作为计算用摩尔吸光系数。
摩尔吸收系数测定示意图摩尔吸收系数测定示意图
取 0.30ml
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
Tris缓冲液
Tris即三羟甲基氨基甲烷〔 tris
(hydroxymethyl) aminomethane〕。
分子式: C4H11NO3 ,分子量: 121.14 , 为白
色结晶体,溶于甲醇、乙酸等有机溶剂。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
Tris-HCl的优点: 对生物化学过程干扰很小,不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。电泳电流小。
缺点:① pH值受溶液浓度影响较大,稀释十倍, pH值的化大于 0.1;②温度效应大,温度变化对pH值的影响大,即: △ pKa/℃=- 0.031 , 4℃时缓冲液的 pH= 8.4,则 37℃ 时的 pH= 7.4,一定要在使用温度下配制 ③易吸收空气中的 CO2 ,配制的缓冲液要盖严密封。 ④此缓冲液对某些 pH电极发生一定的干扰作用,所以要使用与 Tris溶液具有兼容性的电极。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
磷酸盐缓冲液优点:容易配成各种浓度和 pH的缓冲液,受温度影响小,抗稀释。
缺点:与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀;会抑制某些生化过程,如酶的活性。电泳电流大。
有机酸缓冲液(甲酸、乙酸、柠檬酸等):天然的代谢产物。对生化过程产生干扰;易与 Ca2+结合。
硼酸缓冲液:碱性范围常用缓冲液;易与代谢物络合,尤其与糖类羟基生成复合物影响。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
应用高纯氮和氧,否则微量一氧化碳干扰测定。
连二亚硫酸钠遇水易分解,在空气中易被氧化,应以
小瓶分装使用,避免接触空气和水分。可用 I2 标定。
测定吸光系数必须采用新鲜血液,一次测定值在仪器
波长稳定的情况下可以使用一段时间。
测试液应尽量避免接触空气,及时测定,否则会造成
结果偏低。
注意啦!
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
(二)氢氧化钠法
1 .原理 正常人血样在碱性条件下立即转变成草绿色(
碱性正铁血红素的形成),而存在碳氧血红蛋白会使颜
色转变时间增长,颜色转变所需时间与碳氧血红蛋白浓
度之间存在相关性,从变色时间大致估计出碳氧血红蛋
白的浓度。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
2 滴氢氧化钠
转变时间测定
阴性查表得HbCO
2.测定方法
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
变色时间与碳氧血红蛋白浓度
75502510 浓度(%)
80503015变色时间( s)
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
其他的鉴定实验 1 .煮沸法 取血 2~3ml水浴加热,发生凝固。一氧化碳血呈砖红色凝固体,正常血呈褐色或黑褐色凝块。
简便快速,含量 40%才可测出。 2 .硫化铵法 取水 10ml,血 5 滴,硫化铵 5 滴混合,加少量10%醋酸使微呈酸性,一氧化碳血呈玫瑰色,正常血为绿褐色。
此法灵敏,含量在 10%即可检出。 取正常血同时做对照试验,以作对比。
现场,快速!
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
五、终末呼出气中一氧化碳浓度测定(一) CO测定仪法
可用便携式 CO 测定仪 (CO 传感器)
CO红外测定仪,利用 CO对 4.67µm、 4.72µm波长的红外
辐射具有选择性吸收的原理定量。
CO电化学测定仪, CO分子在扩散式电极上氧化,电化学方法检
测定量。(可与报警器配套使用 )
催化型可燃气体传感器
扩散型 CO测定仪的原理是 CO经扩散后遇到专用指示胶产生由
粉红色至棕色的颜色变化而定量。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
CO 电极反应
工作极上 CO + H2O → CO2 + 2H+2e
对极上 O2 + 4H+4e→2H2O
总反应 2CO + O2 → 2CO2
在工作电极上所释放的电子产生的电流与 CO
浓度成正比
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
气相色谱法
原理 在铁氰化钾存在下,加热使血样中 CO
释放出来,在色谱柱上与其他气体分离,然后
用热导池检测器测定,或转化为甲烷( H2 )后
,用火焰离子化检测器测定。用血量各为 2ml
和 1ml。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
第二节
二硫化碳Carbon disulfide
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
一、重要理化特性 二硫化碳能自燃。常温为无色透明。难溶于水,能
溶于强碱和有机溶剂。易挥发、易燃、易爆、具腐
蚀性,蒸气比空气重 2.63倍。
二硫化碳体内代谢产物 2-硫代噻唑烷 -4-羧酸( 2-
thio-thiazolidine-4-carboxylic acid , TTCA ), 是
二硫化碳与谷胱甘肽结合所生成的特异性代谢产
物。CH COOHCH2
S HN
C
S
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
二、毒性、代谢
CS2
80%
原形呼出
血液
肝肾 尿代谢物
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
二硫化碳在体内代谢途径CO2 + ( )SO4 CO2 ( )S 4O CS2 ºô³öÆø
¶þÑõ»¯Ì¼
C
O
SH SG C
O
SH SG CS
S
H NH R
CH COOHCH2
S NH
C
O
CH COOHCH2
S HN
C
C NH2NH2
S
Áòëå
2-Ñõ´ú-àçßòÍé -4-ôÈËá 2-Áò´ú-àçßòÍé -4-ôÈËᣨTTCA£©
HC N
C
O
C SH
S
2-ÛÏ»ù-2-àçßòßøͪ--5
2
S
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
三、 CS2的生物监测指标
班末尿中 TTCA可作为接触 CS2的生物指标。
周末、班末尿中 TTCA的浓度高于工作周第一
班末的尿样。
呼出气中二硫化碳浓度也可作为生物监测指标 BEI: TTCA 5mg/g肌酐(班末);
BEL: TTCA 2.2mg/g肌酐(班末)。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
样品采集
1. 尿样 尿样采集时间为工作班末或周末。采集
后尽快测定,置于- 8℃冰箱中可保存 1周。
2. 呼出气 常规采样。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
四、 CS2及其代谢产物的测定方法
呼气中 CS2用气相色谱法测定(WS/T41-1996)。
碘-叠氮化钠褪色法:尿中 CS2的代谢产物催化碘
还原成碘离子,根据碘褪色所需时间及尿样中肌酐含
量计算。灵敏度低、特异性差。
HPLC法:定量测定尿中 TTCA。
TTCA 很少商品出售,需自己合成。非职业接触者尿中不含 TTCA。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
五、 TTCA的高效液相色谱法
1. 原理
尿样经盐酸酸化后,用乙醚萃取 TTCA,
浓缩后进样 HPLC,经反相 C18柱分离,紫外
检测器 273nm测定。以保留时间定性,峰高
定量。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
3. 样品处理及测定1ml经离心后的尿样
漩涡混匀 2min
3000rpm离心 10min
乙醚 5ml
0.1ml 2mol/L HCl
乙醚层 40℃水浴氮气挥干
0.20ml甲醇溶解后HPLC 分析
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
4. 仪器操作条件
色谱柱:反相 C18柱;
柱温:室温;
流动相:甲醇-水-冰乙酸= 14.5+ 84.5
+ 1
流速: 1.5ml/min;
紫外检测波长: 273nm。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
尿样 TTCA液相色谱图
本法最低检测浓度 20µg/L
(尿样 1ml)
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
5. 注意事项 TTCA的制备方法
1.12g碳酸钾 /6ml 水 + 0.96g L-胱氨酸,温热至全
溶,冷至室温后,加 CS2 1.2ml,强烈搅拌 24h。反应完全后,
调 pH1.0 ,以 100ml乙醚分 3次提取,然后用 3ml10%HCl
洗涤。用无水硫酸镁干燥乙醚层,再真空干燥,得粗品 TTCA。用
1:1HCl加热溶解,再用少许活性炭脱色,趁热过滤,滤液冷却
后,析出无色针状结晶 TTCA(mp180℃),烘干即可。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
六、呼气中 CS2的GC法测定
1. 原理
将终末呼出气收集在双阀气管中,直接进样,或将样品富集在高分子多孔微球吸附剂上,热解吸后进样,经
OV-17色谱柱分离, FID检测器检测,以保留时间定
性,峰高或峰面积定量。
OV - 17: 苯基 (50%) 甲基硅酮 phenyl methyl
silicone(50%)
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
2. 样品采集、保存和处理
受试者正常呼吸 1min 后,将双阀采气管两端活塞打
开,采样管一端含入口中,向管内深吐气,吐气完毕关
上两端活塞。室温存放, 24h内分析。
当浓度太低时,需将样品富集,方法是:将采气管一端
接 TenaxGC 管,另一端接 100ml 注射器,用 6 倍
于采气管体积的空气或氮气以 200ml/min速度冲洗,
将管内样品富集在 Tenax GC管中测定。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
3. 仪器操作条件色谱柱: 1m×3mm 不锈钢柱,填充 OV-
17 (丙酮溶剂), Chromosorb W AW DMCS( 80~100目)= 5+100。
柱温: 70℃ ;气化室温度: 120℃ ;检测室温度
200℃ ;载气: N236ml/min ;助燃气: air
220ml/min;燃气:H2 175ml/min。
检测器: FID; 140℃解吸 3min。 Chromosorb W AW DMCS 即经酸洗( AW )并经二甲基二氯硅烷(DMCS)处理过的多孔性高分子微球W( chromosorb W)。
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
4. 样品测定
直接进样:用注射器从采气管中抽取呼气样
1.00ml直接进样;重复 3次,以标准曲线法定
量。
浓缩进样:将已富集样品的 Tenax GC管的进气
端作为出气端,联接在色谱柱进样口。控制热解
吸时间为 3min进行测定。标准曲线法定量
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
CS2 GC图谱
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第三章非金属化合物及其代谢产物的测定
5. 注意事项
采集不同阶段的呼气结果不同,为保证结果准确,采集
肺泡气,即收集呼出气最后的 200ml左右。
富集样品测定时,冲洗用气量不少于采气管容积的 6
倍;冲洗用气的温度不高于室温;热解吸时间不少于
3min,以保证样品完全转移和完成样品的瞬间释放。