Download - запрограммированная смерть микроорганизмов
![Page 1: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/1.jpg)
запрограммированная смерть микроорганизмов.
Федор СеверинНИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ
[email protected]://yeastmolbiol.belozersky.msu.ru
![Page 2: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/2.jpg)
клетка клетка
Неблагоприятные условия
клетка
Неблагоприятные условияклетка
“Альтруистическая смерть”В окружении других клеток
Оторванная от коллектива
Истощение среды роста
![Page 3: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/3.jpg)
PCD in autolysis of S. pneumoniae.
Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; doi:10.1128/MMBR.64.3.503-514.2000
![Page 4: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/4.jpg)
Model of the fate of a bacterial population.
Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; doi:10.1128/MMBR.64.3.503-514.2000
GASP – growth advantage at stationary phase
![Page 5: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/5.jpg)
У слизистого гриба Dictyostelium discoideum переход к многоклеточному образу жизни индуцируется голоданием и начинается с агрегации отдельных амеб
Слизевики
цАМФ
Плодовое тело
споры
сытые
голодныесмерть
“Альтруистическая смерть”
1) Истощение среды роста
2) Выяснение кто слабый
3) Слабые жертвуют себя в пользу сильных
Высокая плотность клеток
![Page 6: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/6.jpg)
«классический» апоптоз:
Сигнал (повреждение ДНК, гормон….)
Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий
Выход цитохрома с и других факторов из межмембранного пространства
цитохром с связывется с APAF
APAF активирует каспазы
![Page 7: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/7.jpg)
Дрожжи Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей
1. Образование АФК (активных форм кислорода)
2. Выход цитохрома с из митохондрий3. Фрагментация ДНК на ранних этапах4. Переход фосфатидилсерина из
внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны
5. Чувствительность к ингибиторам синтеза белка
6. Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных :
- метакаспаза- AIF
Saccharomyces cerevisiae
Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п.
5 мкм
![Page 8: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/8.jpg)
Saccharomyces cerevisiae
α альфа
феромоны
α
Альфа-фактор
α
б Было известно: большие дозы альфа-фактора токсичны для дрожжей.
Вопрос: не связано ли это с индукцией запрограммированной клеточной смерти
![Page 9: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/9.jpg)
АФК Фаза Флоксин Б (мертвые клетки)
Дрожжи а-типа, обработанные высокой (100х) дозой альфа-фактора
-феромон
+феромон
мутант ste20+ феромон
![Page 10: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/10.jpg)
Насколько физиологична 100-кратная доза феромона?
Смесь а- и альфа-клеток: эффект вещества, тормозящегослияние клеточных стенок
без добавок + хлорохин
Окраска флоксином Б
Вывод: при задержке спаривания естественные концентрации феромоновдостигают смертельных значений
![Page 11: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/12.jpg)
Феромоновую смерть можно снизить добавлением антиоксидантов или нокаутом белка Ysp1
Это указывает на то, что феромон – зависимая смерть – не просто пассивный лизис клеток, а активный каскад
![Page 13: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/13.jpg)
Изучение механизма феромон-зависимой смерти:опосредована повышением концетрации кальция в цитозоле.Для повышения эффективности экспериментальной модели вместо Феромона использовали искусственный индуктор повышения концетрации кальция
«пет» - петитная форма дрожжей (без мито-ДНК)«миксо» - миксотиазол, ингибитор дыхательной цепи«ysp1» - нокаут гена, найденного в скрининге «F» - FCCP, протонофор (разобщитель)
Амиодарон, 80 мкМ
Почему FCCP в небольшой концентрации спасает от смерти?
![Page 14: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/14.jpg)
Дыхательная цепь
АТФ-синтаза“протечка”
H+
H+
FCCP
почему снижение сопротивления мембраны может быть полезным?
![Page 15: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/15.jpg)
Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК
Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997
![Page 16: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/16.jpg)
Феромон, как и амиодарон, вызывает гипер-поляризацию митохондрий
![Page 17: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/17.jpg)
Дыхательная цепь
АТФ-синтаза“протечка”
H+
H+
FCCPолигомицин
Каков механизм гипер-поляризации, вызванной амиодароном?
![Page 18: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/18.jpg)
Кон
цен
трац
ия
кисл
ород
а
Вывод: амиодарон увеличивает сопротивление мембраны
![Page 19: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/19.jpg)
Оценка уровня гипер-поляризации митохондрий и АФК методом проточной флуорометрии (FACS)
FCCP снижает оба параметра, а нокаут YSP1 – не снижает.Почему нокаут улучшает выживание?
![Page 20: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/20.jpg)
10 мкм
нокаут YSP1 и N-ацетил-цистеин препятствуют фрагментации митохондрий
реконструкция структуры митохондрий путем объединения 20 оптических срезов через клетку
![Page 21: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/21.jpg)
5 мкм
Модель амиодароновой смерти использовали для поиска участников каскада -с помощью скринирования делеционной библиотеки
Найден ген YSP2 – как и YSP1, мембранный белок без очевидных гомологий
![Page 22: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/22.jpg)
почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клеткуот смерти?
![Page 23: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/23.jpg)
почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клеткуот смерти?
набухание матрикса приводит к разрыву наружной мембраны митохондрий
![Page 24: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/24.jpg)
возможно, в нокаутах по YSP1 и YSP2
фрагментируется только внутренняя мембрана митохондрий?
При этом площадь поверхности не изменяется, а максимальный суммарный объем уменьшается
![Page 25: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/25.jpg)
Inactivation of YSP2 protects cells from amiodarone induced death AND increases number of cells with "mosaic" pattern of mitochondria staining
WT
Δysp2
Normal mitochondria network
Mosaic stainingDepolarized mitochondria
(dead cells)
1% 11% 88%
2% 35% 63%
JC-1 staining of amiodarone treated cells
![Page 26: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/26.jpg)
laser laser
Laser hit experiments
![Page 27: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/27.jpg)
ЛАЗЕР??
Wild-type cells
Beforelaser
Afterlaser
5 min 10 min
ysp2-delta cellsA
![Page 28: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/28.jpg)
Электронная микроскопия: митохондрия в ysp2 мутанте
![Page 29: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/29.jpg)
феромон
рецептор амиодарон
∆ste20 подъем [Ca] в цитоплазме
синтез белка
циклогексимид
подъемуровня сопряжения
подъем ∆Ψ
АФК
Ysp1, Ysp2-зависимаяфрагментация митохондрий
падение ∆Ψ, выходцитохрома ц
смерть клетки
низкий FCCPмиксотиазол
NAC, токоферол
∆ysp1, ∆ysp2
мит
охон
дрия
(2)
(1)
(3) (4)
(1а)(5) (6)
(7)
(8)
(9)
(10)
Модель каскада феромон-зависимой смерти
![Page 30: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/30.jpg)
Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК
Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997
как снизить мембранный потенциал «мягким» образом?
![Page 31: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/31.jpg)
Б
- использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации
C12TPP
SkQ1
Положительно-заряженныепротонофоры (ионы класса SkQ)
![Page 32: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/32.jpg)
Б
Положительно-заряженныепротонофоры (ионы класса SkQ)
- использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации
C12TPP
SkQ1
![Page 33: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/33.jpg)
Низкий pH в цитоплазме тормозит дыхательную цепь.Поэтому при закислении средыдобавка FCCP не стимулирует потребление кислорода
В отличии от FCCP, положительно-заряженный протонофор ускоряетдыхание даже при pH=3 в среде
С12TPP – мягкий митохондриально-адресованный протонофор. Перспективное вещество для применения в медицине. Сейчас идутиспытания на мышах
C12-TPP
Стимуляция дыхания
![Page 34: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/34.jpg)
Иногда в ответ на ухудшение условий клетка вырабатывает количество АФК, достаточное для индукции анти-оксидантных систем и таким образом «готовится» к более сильным стрессам.
Рассматривая популяцию дрожжевых клеток, логично ожидать, что относительно небольшой стресс будет индуцировать защитные АФК, а высокий уровень стресса (достаточный для массированного повреждения генома клетки) вызовет АФК-индукторы каскада смерти
повреждающее и защитное действие АФК
![Page 35: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/35.jpg)
метилметансульфонат (ММС) – метилирующий агент, повреждающий ДНК
Ионол (анти-оксидант)
Менадион (про-оксидант)
контроль
![Page 36: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/36.jpg)
Другие про-оксиданты действуют подобно менадиону
![Page 37: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/37.jpg)
контрОкраска на АФК
С12ТРР
СTAB SDS
C12TPP в высокой концентрации – мягкий про-оксидант
Морфология митохондрий
![Page 38: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/38.jpg)
Вы
жив
ание
, %В
ыж
иван
ие, %
ММС, мкМ
без
доба
вок
С12
-ТР
Р
мен
адио
н
акти
ном
ицин
акти
ном
ицин
+ м
енад
ион
акти
ном
ицин
+ С
12-Т
РР
ММС
менадион Н2О2
друг
ие
отв
ет н
а ст
рес
с
кат
абол
изм
Д
НК
-свя
зыва
ющ
ие
А
Б
В
Защитное действиепро-оксидантов опосредовано их эффектом на экспрессию генов
Синхронизованные клетки
Ингибирование транскрипцииубирает защитное действие про-оксидантов
![Page 39: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/39.jpg)
Механизм токсичности агрегации белков, вызванной удлиненными полиглутаминами (полиQ). Экспрессия полиQ-CFP в дрожжах.
CFP- синий цвет, иодид пропидия (мертвые клетки) – красный, FITC-VAD-fmk (детекция каспазной активности) – зеленый.
![Page 40: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/40.jpg)
ко-л
окал
изац
ия, %
103Q накапливается в ядре, делеция дрожжевого гомолога каспаз предотвращает это накопление.
Следовательно, 103Q-зависимая смерть – активный процесс. Значит, можно пытаться прервать каскад нокаутом гена.
![Page 41: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/41.jpg)
Отн
ошен
ие р
азм
еров
кол
оний
при
и б
ез и
ндук
ции
103Q
, %
Дикийтип
нокауты гипер-экспрессия
Ase1 – субстрат циклосомы
![Page 42: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/42.jpg)
циклины Cdk1 этапы фаза деления
циклосома (APC-Cdc20 и APC-Cdh1) поли-убиквитинирование циклинов деградация циклинов в протеасоме переход в G0/G1
регуляция клеточного цикла
![Page 43: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/43.jpg)
рабочая модель:
![Page 44: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/44.jpg)
Отн
ошен
ие р
азм
еров
кол
оний
при
и б
ез и
ндук
ции
103Q
, %
Дикийтип
нокауты гипер-экспрессия
![Page 45: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/45.jpg)
контроль 103Q Δclb6 Δclb6,103Q
- накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.
![Page 46: запрограммированная смерть микроорганизмов](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022012922/568134af550346895d9bc5d7/html5/thumbnails/46.jpg)
контроль 103Q Δclb6 Δclb6,103Q
- накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.
а какова ситуация при нейродегенеративных заболеваниях?