บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 2การติรวจสอบจ�ลิ�นทร�ย์�ในน��านม
(Determination of Microorganism in Milk )
การติรวจสอบจ�ลิ�นทร�ย์�โดย์อ�อม 2.1 เมทธิ�ลี�นบลี�รี�ดั�กชั่��นเทสต์�
2.2 การีต์รีวจสอบรี�ซาซ�รี�นการติรวจสอบจ�ลิ�นทร�ย์�โดย์ติรง 23. การีน�บจ�ลี�นทรี�ย์�โดัย์กลี�องจ�ลีทรีรีศน� 24 การีน�บจ�ลี�นทรี�ย์�บนจานเลี� ย์งเชั่! อ 25 การีต์รีวจแบคท�เรี�ย์โคลี�ฟอรี�มการติรวจสอบแบคท�เร�ย์อ"�นๆ
2.6 การีต์รีวจหาแบคท�เรี�ย์โรีคเต์�านมอ�กเสบ 27 การีทดัสอบย์าปฏิ�ชั่�วนะในน* านมดั�วย์โย์เก�ต์
บทปฏิ�บ�ติ�การ 21.การติรวจสอบโดย์การเปลิ��ย์นส�ของเมทธิ�ลิ�น บลิ&
(Methylene Blue Reduction Test , MBRT)
หลิ�กการ (Principles)- MBRT เป,นว�ธิ�การีทดัสอบจ�ลี�นทรี�ย์�โดัย์ทางอ�อมหลี�กการี : Methylene Blue เม!�ออย์�-ในสภาวะท��ม�
O2
จะม�ส�น* าเง�น จะเปลี��ย์นเป,นส�ขาวในสภาพท��ม� CO
2
-ชั่��วโมงการีเปลี��ย์นของ MRBT จะส�มพ�นธิ�ต์รีงข�ามก�บจ*านวนแบคท�เรี�ย์
ข�อจ*าก�ดัอย์�-บ�างในการีต์รีวจสอบดั�งน� -แบคท�เรี�ย์บางชั่น�ดั เชั่-น BB . .
Subtilis จะเปลี��ย์นส�ไดั�ชั่�า - Somatic cell แลีะเม3ดัโลีห�ต์ขาวจะฟอกส�
Methylene Blue ไดั�เชั่-นก�น
ว�ธิ�การ (Method) 1 . ไปเปทสารีลีะลีาย์ของ MRBT 1ml. ลีงในหลีอดัต์รีวจสอบ 2. ไปเปทน* านมต์�วอย์-าง 10 ml. ลีงหลีอดัทดัสอบดั�งกลี-าวพรี�อมท� งป4ดัฝา
น*าเข�าไปแชั่-ในอ-างน* าอ� -น 37( + 5 C) ป4ดัฝาอ-างป6องก�นแสง 3. จ�บเวลีาส�งเกต์การีเปลี��ย์นแปลีงส�ของเมธิ�ลี�น บลี� ท�กๆชั่-วงเวลีา 12 1
2 37 8 ชั่ม .อ-านผลีโดัย์กลี�บหลีอดัไป-มา แลี�วดั�ลี�กษณะส�ท��
ปรีากฏิเห3นในแต์-ลีะชั่ม. 4. ท*าหลีอดัควบค�มโดัย์ใชั่�น* านม แต์-ไม-ใส-สารีลีะลีาย์ส�
การว�เคราะห�ผลิ
อ�นดั�บ เกรีดั รีะย์ะเวลีาของการีรี�ดั�วซ�1 ดั�
มากไม-เปลี��ย์นส�ในเวลีา 8 ชั่ม.
2 ดั� เปลี��ย์นส� 8 ชั่ม. แต์-ไม-น�อย์ กว-า 6 ชั่ม.
3 พอใชั่�
เปลี��ย์นส� 6 ชั่ม. แต์-ไม-น�อย์ กว-า 2 ชั่ม.
4 ไม-ดั� เปลี��ย์นส�ภาย์ในเวลีา < 2 ชั่ม.
บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 22.การติรวจสอบร�ซาซ&ร�น (Resazurin
Reduction Test, RRT)
หลิ�กการ (Principles) - RRT ค!อปฎิ�กรี�ย์า - oxidation reduction ของสารีเคม�ท��ม�ความไวเปลิ��ย์นส�- ใชั่�หลี�กการีคลี�าย์ MRBT-การีเปลี��ย์นส�ของต์�วอย์-างน* านม จะอ-านผลีภาย์ใน 1ชั่��วโมงข��นติอนปฏิ�ก�ร�ย์า
ข� น 1 Resazurin ---------------- > Resorufin
(ส�น* าเง�น ) ( ส�ชั่มพ� ) ข� น 2 Resorufin---------------- > Hydroresorufin (ส�ชั่มพ� ) (ไม-ม�ส� ,ขาว)
ว�ธิ�การ (Method) 1. ไปเปท รี�ซาซ�รี�น 1ml. ใชั่�ในหลีอดัต์รีวจสอบ 2. ไปเปทต์�วอย์-างนม 10ml. ใส-ลีงไปในหลีอดัดั�งกลี-าว ป4ดัฝาแลีะกลี�บ หลีอดัไปมา - 23
ครี� ง แลีะน*าไปวางในอ-างน* าท�� อ�ณหภ�ม� 37 +5
C) ป4ดัฝาอ-างน* าให�ม�ดัชั่�ดั 3. เม!�อครีบเวลีา 1 ชั่��วโมง น*าหลีอดัทดัสอบมาเท�ย์บส�ก�บจานส� lovibond comparation
การว�เคราะห�ผลิ
ส�ของติ�วอย์-างน��านม ค�ณภาพของน��านม การติ�ดส�น
ส�น��าเง�น (ไม-เปลิ��ย์นส� ), Blue ด�มาก ด�มากส�ม-วงปนชมพ& , Lavender ด� ด�ส�ชมพ& , Pink พอใช� น��านมก�าลิ�งเส�ย์ส�ขาว , Colourless ไม-ด� น��านมเส�ย์
บทปฏิ�บ�ติ�การ 23การติรวจน�บจ�ลิ�นทร�ย์�โดย์กลิ�องจ�ลิทรรศน�
(Direct Microscopic Count, DMC)
หลิ�กการ (Principles)
-เป,นว�ธิ�ต์รีวจน�บแบคท�เรี�ย์ในน* านมโดัย์ต์รีงดั�วย์กลี�องจ�ลีทรีรีศน�
ให�ผลีรีวดัเรี3วแลีะส� นเปลี!องน�อย์ - แต์-ต์�องอาศ�ย์ความชั่*านาญ
ว�ธิ�การ (Method)การเติร�ย์มแผ-นสไลิด�ติ�วอย์-างนม โดย์ท*าเครี!�องหมาย์รี�ปส��เหลี��ย์มพ! นท�� 1 ต์รี.ซม .ไว�ท��ใต์�แผ-นสไลีดั�
1 cm2 1 cm2
การท�า smear-อ� -นน* านม (37 C ) แลีะ กวนให�เป,นเน! อเดั�ย์วก�น -ใชั่� loop ท��ฆ่-าเชั่! อแลี�ว แต์ะน* านมต์�วอย์-าง 1 loop001( . ml. ) เกลี��ย์ลีงบนพ! นท��ส��เหลี��ย์มให�เต์3ม
แลีะเรี�ย์บ-ปลี-อย์แผ-นสไลีดั�ให�แห�งบนถาดัอ�-นสไลีดั�
3 การย์�อมส� -จ�-มแผ-นสไลีดั�ท��ท*า smear แลี�ว ลีงใน Xylene นาน
- 12 นาท� เพ!�อขจ�ดัไขม�น-ลี�างสไลีดั�ดั�วย์น* าเปลี-า โดัย์เป4ดัน* าก?อกเบาๆ รี�นผ-านส�กครี� - แลี�วปลี-อย์ให�แห�ง- น*าแผ-นสไลีดั�ท��แห�งแลี�ว มาจ�-มแอลีกอฮอลี� 95%นาน - 12 นาท� เพ!�อ fix smear
แลี�วต์ากให�แห�ง-น*าสไลีดั�มาย์�อมดั�วย์ส� Loeffler's methylene
blue โดัย์หย์ดัน* าย์าส� - 12 หย์ดัให�น* าย์าท-วมแผ-นสไลีดั� ท� งไว� 2 นาท� ลี�างส�ออกดั�วย์น* าเปลี-าอ�กครี� ง -แลี�วต์ากแห�ง ก-อนน*าไปส-องในกลี�องจ�ลีทรีรีศน�ต์-อไป
การใช�กลิ�องจ�ลิทรรศน�การใช�กลิ�องจ�ลิทรรศน�-ปรี�บกลี�องจ�ลีทรีรีศน� เรี��มจากก*าลี�งขย์าย์ต์*�า 40
X แลี�วจAงปรี�บไปท��ห�วoil
ข�อส�งเกต์ในการีต์รีวจข�อส�งเกต์ในการีต์รีวจ- แบคท�เรี�ย์ ย์�อมต์�ดัส�น* าเง�นเข�ม- เม3ดัเลี!อดัขาว ย์�อมต์�ดัส�น* าเง�นเข�ม- โซมาต์�กเซลีลี� ย์�อมต์�ดัส�น* าเง�นเข�ม- โปรีต์�น ย์�อมต์�ดัส�ฟ6าเป,นพ! นหลี�ง- ไขม�น ย์�อมต์�ดัส�ขาวหรี!อไม-ต์�ดัส�- ส��งสกปรีก,ฝ�Bน ย์�อมต์�ดัส�เป,นเม3ดัดั*าหรี!อ
น* าต์าลี
การค�านวณจ�านวณแบคท�เร�ย์ (Calculation)
จ�านวนแบคท�เร�ย์ใน 1 ml. = ค-าเฉลิ��ย์จ�านวนแบคท�เร�ย์ใน 1 field x conversion factor
ย์กติ�วอย์-างการค�านวณหาแบคท�เร�ย์ในน��านมกลิ�องจ�ลิทรรศน�ม�ห�ว oil เส�นผ-าศ&นย์�กลิางเท-าก�บ 0.21
ม�ลิลิ�เมติร จ�านวนโคโรน�ท��น�บได�ใน 30 flied ค"อ 4 5 จ�านวนแบคท�เร�ย์ในน��านม ?
1. หาค-าเฉลิ��ย์จ�านวนแบคท�เร�ย์ใน 1 field = 45 30/ 1= .5
2. จ�านวนแบคท�เร�ย์ในน��านม = 1.5 x 300 000,
= 450,000 เซลิลิ� / ml.
บทปฏิ�บ�ติ�การ 24การน�บจ�ลิ�นทร�ย์�บนจานเลิ��ย์งเช"�อ (Standard
Plate Count, SPC)
หลิ�กการ (Principles)-ว�ธิ� Standard Plate Count น� เป,นการีเพาะเลี� ย์ง
เชั่! อในอาหารีท��จ�ลี�นทรี�ย์�ส-วนมากสามารีถเจรี�ญเต์�บโต์ไดั�
-หลี�งจากน� นแลี�วจAงน�บจ*านวนโคโลีน� (colony)-ค-าท��ไดั�บ-งชั่� ถAงความสะอาดัของน* านมดั�บ(ความสะอาดั
ในการีรี�ดันม แลีะความสะอาดัของอ�ปกรีณ� โรีคเต์�านมอ�กเสบ)
ว�ธิ�การ (Method) 1 .การวางแผนการท�า Dilution
ในน��านมด�บจะม�จ�านวนแบคท�เร�ย์อย์&-เป4นจ�านวนมาก จ5งติ�องท�าเจ"อจางก-อนเพาะเลิ��ย์ง1 .ข��นติอนการเติร�ย์ม dilution น��านมชน�ดติ-าง ๆ
Dilutionท��เหมาะสมควรม�จ�ลิ�นทร�ย์�เก�ดอย์&-ในช-วง - 30300 โคโลิน�
9ml. H2
O11:0
A
9ml. H2
O11:0 0B
9ml. H2
O11:0 00
C
9ml. H2
O11:0 ,00
0D
1.
1.
1.
1.
1. การเลิ"อกใช� dilutions ก�บน��านมชน�ดติ-าง ๆ
ชน�ดติ�วอย์-างน��านมชน�ดติ�วอย์-างน��านม DilutionDilutionss
standard plate c ount (SPC)
Coliform
น��านมด�บ 1: 1,000 (10 -3 )1: 10,000 (10 -4 )
1: 100 (10 -2 )1: 1,000 (10 -3)
น��านมพาสเจอร�ไรส� 1 10 10: ( - 1 ) 1 100 10
-
2 ) 1 1 000 1: , (
0 - 3 )
1 1 10:
1: 1 00,
นมย์&เอชท� 11 10 10: ( - 1 )
11 10
10-1)
SPCกลิ�-ม ............
.ติ�วอย์-างน��านมด�บDilutio
n 1 :10
ว�น
SPCกลิ�-ม ..........
...Contr
olว�นท��
4. การเพาะเช"�อ4.1 น�าจานท��จะใช� มาเข�ย์นช"�อติ�วอย์-าง
น��านม1. การหย์ด Dilution-. ใช� ไปเปท ลินไฟ ก-อนด&ดน��านมจาก dilution ติ-างๆ ท��
ท�าไว� จ�านวน 1ml. ลิงในจานเลิ��ย์งเช"�อ 2. การเท Agar ( ติรวจอ�ณหภ&ม�agarติ�องไม-ร�อนเก�น
ไปใช�หลิ�งม"อแติะขวดพอทนได� )- ใช�ไฟติะเก�ย์งลินปากขวด agar ก-อนเป8ดฝา- แลิะเท agar ประมาณ 15 ซ�ซ� ส&-จานเลิ��ย์ง- วางจานบนโติ:ะใช�ม"อจ�บฝาจาน แกว-งติ�วจาน- ในแนวราบบนโติ:ะให� agar เข�าก�นด�
44. วางรีอจน agar แข3งต์�ว น*าเข�าอบท��อ�ณหภ�ม� 32 C นาน 48 ชั่��วโมง
การีวางจานน� นต์�องกลี�บคว*�าจานเลี� ย์งเชั่! อลีง 46 เม!�อครีบ 48 ชั่��วโมง แลี�วน*าออกมาน�บ
จ*านวนโคโลีน�โดัย์ใชั่�เครี!�อง (colony counter) แลีะรีาย์งานผลีในหน-วย์ของโคโลีน�ต์-อml.ของน* านม ( col
ony/ml )
5. การอ-านผลิ 51. เลิ"อกน�บจากจานท��ม�จ�านวนโคโลิน� 30-300 โคโลิน� หากท�กจานม�มากกว-า 300 โคโลิน�ให� ราย์งานเป4น น�บไม-ได� จ�านวนแบคท�เร�ย์ท��น�บได�ในแติ-ลิะจาน = จ�านวนแบคท�เร�ย์ท��น�บได� / ค-า diluteติ�วอย์-างเช-น
น�บจ�านวนแบคท�เร�ย์ได� 250 โคโลิน� ท�� dilution 1 x 10 - 3 0 001( . )
จะม�จ�านวนแบคท�เร�ย์ = 250 / 0001. = 250,000 cfu/ml
หร"อ= 250 x 1 000 250 000, = , cfu/ml
*cfu = colony forming unit
บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 25 การติรวจสอบแบคท�เร�ย์โคลิ�ฟอร�ม
-เป,นว�ธิ�ท��ใชั่�ต์รีวจสอบน* านมภาย์หลี�งจากท��ท*าการีฆ่-าเชั่! อแลี�ว
-ลี�-มโคลี�ฟอรี�มไดั�แก- Coliform bacteria จ*าพวก -gram negative
เชั่-น BBBBBBBBBBB (E. Coli ) ก�บ Enterobacter (หรี!อ Acrobacter)
ความส*าค�ญของแบคท�เรี�ย์โคลี�ฟอรี�ม 1. โคลี�ฟอรี�มเป,นแบคท�เรี�ย์ท��พบไดั�ท��วไปในนม
ดั�บ 2. โคลี�ฟอรี�มไม-ทนในอ�ณหภ�ม�ฆ่-าเชั่! อนมพาสเจ
อรี�ไรีส�ดั�งน� นการีพบแบคท�เรี�ย์ในน* านมท��พาสเจอรี�ไรีส�แลี�ว
แสดังว-าม�การีปนเปC อน
ว�ธิ�การ (Method)-อ� -น Agar ให�อย์�-ในสภาพลีะลีาย์-เต์�มน* านม dilution ต์�วอย์-างลีะ 1ml. ต์-อ 1 จาน
( หากเป,นน* านมดั�บให�ใชั่� 1101100Dilution : , :แลีะน* านมพาสเจอรี�ไรีส�ใชั่� 11 110: , : )
-ให�เท ว� �นแดัง ( Violet red bile agar) ท�บในแต์-ลีะจาน จานลีะ 10 มลี . หม�นจานให�ส-วนผสมเข�าก�นแลีะต์� งท� งไว�ให�ว� �นแข3ง
-น*าจานว� �นท��แข3งต์�ว บ-มในต์��อ�ณหภ�ม� 37 C นาน 24 ชั่ม .
-เม!�อครีบเวลีาให�น*าจานออกมาต์รีวจน�บ -ลี�กษณะโคโลีน�จะเป,นส�แดังเข�มขA นอย์�-ในเน! อว� �น -รีาย์งานผลีเป,น โคโลีน�ต์-อมลี .
= จ*านวนโคโลีน�/จาน x อ�ต์รีาเจ!อจาง
บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 26
การติรวจโรคเติ�านมอ�กเสบโดย์ว�ธิ� California Mastitis Test
-CMT เป,นว�ธิ�ท��ใชั่�การีปรีะมาณค-า somatic cellโดัย์อาศ�ย์ปฏิ�ก�รี�ย์าของ Sodium hydroxide ซA�งจะท*าให�เซลีลี�แต์กสลีาย์ แลีะ ท*าให�โปรีต์�นของเม3ดัโลีห�ต์ขาวเก�ดัการีต์กต์ะกอน-จ�บก�นเป,นก�อนหน!ดั ปรีากฎิให�เห3นดั�วย์ต์าเปลี-า
ว�ธิ�การ ( Method ) 1. ใชั่�ไปเปทดั�ดัน* านมใส-ในจานหลี�มท� ง 4 จาน ๆ ลีะ - 25ml. 2. ไปเปท CMT ใส-จานท� ง 4 จาน (น* าย์า
CMT : น* านมต์�วอย์-าง = 1 :1 ) 3. แกว-งถาดัจานหลี�มวนเป,นวงกลีมอย์-างชั่�า ๆ ให�คะแนนแลีะส�งเกต์การีเก�ดัต์ะกอนจ�บเป,นก�อนท�นท�ภาย์ใน 10 ว�นาท�
ส�ญลิ�กษณ�
% การ ส&ญเส�ย์
ปฏิ�ก�ร�ย์า ลิ�กษณะปฏิ�ก�ร�ย์า จ�านวนจ�ลิ�นทร�ย์� ( / )
- 0 negative ส-วนผสมเหลิวปกติ�ไม-ม�ติะกอน, ส�ม-วง
0-200,00
T 3 trace ส-วนผสมข�นเลิ=ก น�อย์ แติ-ไหลิได�
ปกติ�, ส�ม-วง
150,000- 500,000
1 11 WeakPositive
ส-วนผสมเร��มหน"ดพอเห=นไหลิเป4นเส�น, ส�ม-วง
400,000 - 1,500,000
2 28 DistinctPositive
ส-วนผสมหน"ด ติรงกลิางม�ติะกอนไม-ค-อย์ไหลิ, ส�ม-วง
800,000 - 5,000,000
3 46 StrongPositive
ส-วนผสมหน"ด ติรงกลิางม�ติะกอนเหน�ย์วติ�ดอย์&-ติรงกลิางช�ด, ส�ม-วง
>5,000,000
+ ใส-ส�ญลิ�กษณ�เพ��มในกรณ�
Alkalinemilk
70pH .หร"อมากกว-า
ให�ใส- + ติามติ�วเลิขในกรณ�เห=นเป4นส�ม-วง
การหลิ��งน��านมผ�ดปกติ� เติ�านมอ�กเสบ
แบบไม-ติ�ดเช"�อ ไม-แสดงอาการ
Y ใส-ส�ญลิ�กษณ�เพ��มในกรณ�
Acid milk ,
pH < 5 .2
ให�ใส- Y ติามติ�วเลิขในกรณ�เห=นเป4นส�เหลิ"อง
แสดงว-าม�จ�ลิ�นทร�ย์�ท�าให�น��านมเส�ย์
หมาย์เหติ� : รีะว�งการีอ-านผลีต์รีวจน* านมจากโคแรีกคลีอดัแลีะชั่-วงปลีาย์การีให�นม ซA�งจะให�ผลีบวก
บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 27 การทดสอบย์าปฏิ�ช�วนะในน��านมด�วย์โย์เก�ติ
-ปDญหาน* านมท��พบบ-อย์ ค!อการีปลีอมปนย์าปฏิ�ชั่�วนะหรี!อสารีป6องก�นการีเส�ย์ของน* านม
ว�ธิ�ต์รีวจอย์-างง-าย์ค!อการีท*าโย์เก�ต์เทส ( Yogurt test )
-โดัย์น* านมท��ม�สารีก�นนมเส�ย์เม!�อใส-จ�ลี�นทรี�ย์�จากโย์เก�ต์ เพาะเลี� ย์งแลี�วจะพบว-าเชั่! อต์าย์ -ต์-างก�บน* านมท��ไม-ม�สารีป6องก�นเส�ย์ เชั่! อจะเจรี�ญไดั� ท*าให�น* านมเก�ดัต์ะกอน
การติรวจสอบย์าปฏิ�ช�วนะเบ"�องติ�นโดย์ว�ธิ� PlainYoghurt
ว�ธิ�การ1.ใชั่�โย์เก�ต์จ!ดั 1 ถ�วย์ 150 กรี�ม ) ผสมน* าเย์3น
150 มลี . คนให�เข�าก�น2.น*าน* านมดั�บ 10 มลี . ต์�มเดั!อดั 10 นาท� แลีะปรี�บอ�ณหภ�ม� - 3537 C3.ใส-โย์เก�ต์ท��เต์รี�ย์มไว� 1 ซ�ซ� . ลีงในหลีอดัน* านม เขย์-าให�เข�าก�น4.บ-มใน Water Bathอ�ณหภ�ม� 48 C นาน 3ชั่��วโมง5.ท*าต์�วอย์-าง Bank แลีะ Control เพ!�อเปรี�ย์บก�บผลีจากน* านมดั�บ
การอ-านผลิ-ถ�าต์�วอย์-างน* านมม�การีจ�บต์�วเป,นก�อน/หน!ดั อ-านผลีเป,นลีบ - ( ) ค!อไม-ม�สารีย์�บย์� งจ�ลี�นทรี�ย์�-ถ�าต์�วอย์-างน* านมย์�งเป,นน* านมปกต์� ไม-หน!ดัให�อ-านผลีเป,นบวก (+) ค!อ อาจม�สารีย์�บย์� งการีเจรี�ญเต์�บโต์จ�ลี�นทรี�ย์�
การติรวจสอบย์าปฏิ�ช�วนะโดย์ว�ธิ� Yoghurt with Bromocresol Purple
-ใชั่� โย์เก�ต์รีสจ!ดัไม-ต์�องเจ!อจาง-ใชั่�นม 2 ซ�ซ� . ต์�มในน* าเดั!อดั 10 นาท� แลีะปรี�บ
อ�ณหภ�ม� - 3537 C-ผสมโย์เก�ต์ 01. ซ�ซ� . ปรีะมาณ 1 หย์ดั + BCP
02. ซ�ซ� B 2 หย์ดั ) เขย์-าให�เข�าก�น-บ-มใน Water Barth อ�ณหภ�ม� 45 C นาน 3
ชั่��วโมง
การอ-านผลิ ต์�วอย์-างถ�าม�ส�เหลี!อง =
ผลีลีบ ต์�วอย์-างถ�าม�ส�น* าเง�น = ผลี
บวก