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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
MARTA REGINA SANTOS DO CARMO
EFEITO NEUROPROTETOR DO ANTAGONISMO DOS RECEPTORES P2X7 NO
PARKINSONISMO EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-OHDA
FORTALEZA
2015
MARTA REGINA SANTOS DO CARMO
EFEITO NEUROPROTETOR DO ANTAGONISMO DOS RECEPTORES P2X7 NO
PARKINSONISMO EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-OHDA
Tese apresentada à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal do
Ceará, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em
Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de
Andrade.
FORTALEZA
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
C285e Carmo, Marta Regina Santos do.
Efeito neuroprotetor do antagonismo dos receptores P2X7 no parkinsonismo experimental
induzido por 6-OHDA / Marta Regina Santos do Carmo. – Fortaleza, 2015.
108 f. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2015.
Área de concentração: Farmacologia.
Orientação: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade.
1. Trifosfato de Adenosina. 2. Doença de Parkinson. 3. Antagonistas do Receptor Purinérgico
P2X. 4. Fármacos Neuroprotetores. I. Título.
CDD 615.1
MARTA REGINA SANTOS DO CARMO
EFEITO NEUROPROTETOR DO ANTAGONISMO DOS RECEPTORES P2X7 NO
PARKINSONISMO EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-OHDA
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia, da Universidade
Federal do Ceará, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor em
Farmacologia.
.
Aprovada em 30/01/2015
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________
Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
____________________________________________________
Prof. Dr. Rui Daniel Schröder Prediger
Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC
_______________________________________________
Prof. Dr. Alexander Henning Ulrich
Universidade de São Paulo - USP
_______________________________________________
Profª Dra. Gerly Anne de Castro Brito
Universidade Federal do Ceará – UFC
_______________________________________________
Profª. Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar
Universidade Federal do Ceará – UFC (Sobral)
Dedico este trabalho
aos meus pais, que sempre
me deram força e me incentivaram
a estudar, me deixando como maior
herança, o conhecimento.
AGRADECIMENTOS
À Deus por se fazer presente, dando-me forças para enfrentar todos os momentos
dessa caminhada, me ajudando a concluir mais esta etapa da minha vida com sucesso.
Aos meus pais pelo exemplo de vida, de moral, ética e humildade. Por não terem
medido esforços para que eu e meus irmãos pudéssemos estudar. Por todo o empenho,
confiança, dedicação e amor que me foram passados e que foram cruciais para minha
formação pessoal e profissional.
Aos meus irmãos por todo amor e carinho e por terem me apoiado na
concretização deste objetivo.
Aos meus sobrinhos por todos os momentos felizes compartilhados.
Ao Nuno pelo amor, companheirismo e apoio, pela ajuda nos experimentos e nos
estudos, e pela paciência em todos os momentos.
À Minha orientadora Professora Geanne Matos Andrade pela dedicação e
competência na execução deste trabalho, por ter contribuído para a minha formação científica
e pela oportunidade dos ensinamentos que serão importantes para a construção da minha
trajetória profissional, mas acima de tudo pela amizade e simpatia com que sempre me
presenteou.
Aos Amigos do Laboratório de Neurociências e Comportamento: Julliana
Catharina, Juliana Pereira, Ana Paula, Diego, Patrícia, Analú, Kelly Rose, Ana Carla e Carol,
pela amizade e companheirismo, pela ajuda nos experimentos e pela ótima convivência em
todos esses anos, fazendo do nosso laboratório um ótimo ambiente de trabalho.
Aos Amigos do Laboratório de Neurociências e Comportamento: Amanda,
Priscila, Emerson, Neila, Arnaldo, Mara, Thales, Thaís, Júlia, Albert, Alex, Jéssica, meu
agradecimento a todos vocês por terem colaborado na minha pesquisa científica, fazendo do
trabalho diário um ambiente agradável e alegre.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Cunha da Universidade de Coimbra, Portugal, por ter me
recebido em seu laboratório, momento que foi muito importante para minha formação
científica, assim como pelos ensinamentos, colaboração, suporte e simpatia.
À Profa. Dra. Flávia Santos de Almeida e ao Prof. Dr. Hélio Vitoriano Nobre
Júnior por prontamente participarem da minha banca de Exame de Qualificação.
Aos Professores do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia por me terem
transmitido seus conhecimentos, os quais adquiriram com muito esforço e dedicação.
A Capes e ao CNPq por ter colaborado financeiramente para a realização dessa
pesquisa.
“A verdadeira viagem do descobrimento não consiste em
procurar novas paisagens, e sim em ter novos olhos.”
Marcel Proust
RESUMO
A doença de Parkinson (DP) é caracterizada por uma degeneração progressiva dos neurônios
da substância negra (SN) e uma concomitante diminuição do conteúdo de dopamina no
estriado, que pode ser mimetizada pela administração de 6-OHDA. Visto que o ATP liberado
das células danificadas exerce efeitos deletérios diretos sobre os neurônios, agindo através de
receptores P2X7, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos do Brilliant Blue G
(BBG), um antagonista dos receptores P2X7, sobre a neurotoxicidade induzida por 6-OHDA.
Ratos Wistar machos receberam injeções estereotáxicas de 6-OHDA (18 µg/3µl) no estriado
direito e foram tratados com BBG (45 mg/kg, i.p. 48/48hs) durante 14 dias. Em uma série
adicional de experimentos, os animais receberam o antagonista seletivo A-438079 (10 µM
i.c.v.) por 14 dias. O tratamento com BBG diminuiu o número de rotações contralaterais no
teste da apomorfina, efeito que foi mimetizado pelo antagonista seletivo A-438079. O BBG
também melhorou o desempenho dos animais no teste da esquiva passiva (memória de curta
duração), assim como na versão com plataforma sinalizada do labirinto aquático. O
antagonismo dos receptores P2X7 pelo BBG preveniu ainda a redução do conteúdo de
dopamina no estriado e SN, assim como a perda de neurônios dopaminérgicos, a microgliose
e astrogliose no estriado. O tratamento com BBG também diminuiu os níveis de IL-1β no
estriado, apesar das diferenças observadas entre os grupos não serem estatisticamente
diferentes. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação do BBG, foram
utilizados modelos in vitro explorando a sinaptotoxicidade (sinaptossomas estriatais) e
neurotoxicidade (células SH-SY5Y dopaminérgicas diferenciadas). Além da demonstração da
presença dos receptores P2X7 nos terminais nervosos estriatais, foi observado que o BBG 100
nM preveniu a disfunção sinaptossomal. Também demonstramos a presença dos receptores
P2X7 nas células SH-SY5Y, assim como sua co-localização com tirosina hidroxilase, onde o
pré-tratamento com BBG 100 nM diminuiu o dano celular, avaliado através da liberação de
lactato desidrogenase. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que os receptores
P2X7 contribuem para a patogênese da DP através de um triplo mecanismo sobre a
sinaptotoxicidade, gliose e neurotoxicidade, ressaltando o potencial terapêutico dos
antagonistas desses receptores na doença.
Palavras-chave: ATP. Receptores P2X7. Doença de Parkinson. Brilliant Blue G.
Neuroproteção.
ABSTRACT
Parkinson’s disease (PD) is characterized by a progressive degeneration of dopaminergic
neurons in the substantia nigra (SN) and a concomitant decrease of dopamine (DA) in the
striatum, which can be modeled by 6-OHDA administration. Since ATP released from
damaged cells can exert noxious effects on neurons, acting through its P2X7 receptors
(P2X7R), the aim of the present study was to investigate the effects of a P2X7R antagonist,
Brilliant Blue G (BBG) on 6-OHDA-induced neurotoxicity. Male Wistar rats received
stereotaxic injections of 6-OHDA (18 µg/3µl) into the right striatum and were treated with
BBG (45 mg/kg, i.p. 48/48 h) for two weeks. In an additional experiment, animals were
treated with the selective antagonist A-438079 (10 µM i.c.v.) for two weeks. BBG decreased
the number of contralateral rotations in the apomorphine test, an effect mimicked by the
selective P2X7R antagonist A438079. BBG has also improved the animals’ performance in
the passive avoidance test (short-term memory) and in the cued version of the Morris Water
maze. The antagonism of P2X7R by BBG has also prevented the reduction of dopamine
content in the striatum and SN as well as the loss of dopaminergic neurons, and microgliosis
and astrogliosis in the striatum. BBG treatment also decreased the IL-1β levels in striatum,
despite the observed effect not being statistically significant. To grasp the mechanism of
action of BBG, we used in vitro models exploring synaptotoxicity (striatal synaptosomes) and
neurotoxicity (dopamine-differentiated SH-SY5Y cells). Besides showing that P2X7R are
present in striatal dopaminergic terminals, we observed that BBG 100 nM prevented the 6-
OHDA-induced synaptosomal dysfunction. Furthermore, we have shown the presence of
P2X7 receptors in SH-SY5Y cells, their co-localization with tyrosine hydroxilase, and that
BBG attenuates the cell damage, evaluated through lactate dehydrogenase release. The
present results suggests that P2X7R contribute to PD pathogenesis through a triple impact on
synaptotoxicity, gliosis and neurotoxicity, highlighting the therapeutic potential of P2X7R
antagonists in the disease.
Keywords: ATP. P2X7 receptor. Parkinson’s disease. Brilliant Blue G. Neuroprotection.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Representação esquemática sobre a organização funcional normal dos núcleos da
base e na Doença de Parkinson. .............................................................................................. 18
Figura 2 – Vias de degradação extracelular dos nucleotídeos purínicos. .............................. 28
Figura 3 – Diagrama esquemático mostrando as relações funcionais entre os receptores P2X7,
microgliose e eventual neurodegeneração............................................................................... 32
Figura 4 – Estrutura química do Brilliant Blue G (BBG). ..................................................... 34
Figura 5 – Desenho experimental mostrando a sequência dos testes comportamentais
realizados nos subgrupos de animais. ..................................................................................... 38
Figura 6 – Representação da diferença de neurônios dopaminérgicos nigroestriatais nos
hemisférios cerebrais após lesão unilateral com 6-OHDA no hemisfério direito
................................................................................................................................................. 40
Figura 7 – Arena do teste de campo aberto dividido em quatro quadrantes iguais ................41
Figura 8 – Animal durante o movimento de rearing no teste do cilindro ..............................41
Figura 9 – Animal no aparelho esquiva passiva. ....................................................................42
Figura 10 – Labirinto aquático com a plataforma sinalizada ..........................................................43
Figura 11 – O bloqueio dos receptores P2X7 atenua o comportamento rotacional assimétrico
dos animais parkinsonianos no teste da apormorfina. ............................................................ 54
Figura 12 – O bloqueio dos receptores P2X7 não afeta a atividade locomotora espontânea
avaliada pelo teste do campo aberto........................................................................................ 56
Figura 13 – O antagonista do receptor P2X7, Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.), não
diminui a assimetria dos membros anteriores dos animais parkinsonianos, avaliada no teste do
cilindro..................................................................................................................................... 57
Figura 14 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) atenua o déficit na memória aversiva
dos animais parkinsonianos. ................................................................................................... 59
Figura 15 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) atenua a diminuição da performance
dos animais parkinsonianos submetidos a uma versão com plataforma sinalizada do labirinto
aquático. .................................................................................................................................. 60
Tabela 1 – Efeitos do antagonista do receptor P2X7, Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg), sobre
a diminuição dos níveis de dopamina e DOPAC (ng/mg tecido) no estriado direito e
mesencéfalo de ratos parkinsonianos....................................................................................... 61
Figura 16 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) diminui a perda do marcador
dopaminérgico tirosina hidroxilase (TH) no estriado de ratos submetidos à lesão com 6–
OHDA. .................................................................................................................................... 63
Figura 17 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) atenua a perda do marcador
dopaminérgico tirosina hidroxilase (TH) na substância negra de ratos submetidos à lesão com
6–OHDA ................................................................................................................................. 64
Figura 18 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) diminui a astrogliose e microgliose no
estriado de ratos submetidos à lesão com 6–OHDA. .............................................................. 66
Figura 19 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) não diminui a astrogliose e microgliose
na substância negra de ratos submetidos à lesão com 6–OHDA. ........................................... 67
Figura 20 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) não altera os níveis de IL–1β de forma
significativa no estriado de ratos submetidos à lesão com 6–OHDA. .................................... 68
Figura 21 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) aumenta a expressão dos receptores
P2X7 no estriado de ratos. ....................................................................................................... 69
Figura 22 – A exposição à 6–OHDA aumenta os níveis de ATP no meio das células SH–
SY5Y. ...................................................................................................................................... 70
Figura 23 – Microfotografias mostrando que as células SH–SY5Y marcadas para tirosina
hidroxilase (TH) estão também marcadas com P2X7. ............................................................ 71
Figura 24 – BBG não protegeu contra a citotoxicidade causada pela exposição à 6-OHDA
nas células SH-SY5Y, avaliada pela redução do MTT. .......................................................... 73
Figura 25 – BBG 100 nM diminuiu a citotoxicidade causada pela exposição à 6-OHDA nas
células SH-SY5Y, analisada pela liberação da LDH citoplasmática. ..................................... 74
Figura 26 – Microfotografias mostrando a co-localização dos receptores P2X7 (em vermelho)
e dos marcadores dopaminérgicos (em verde) TH ou DAT em sinaptossomas estriatais. ......75
Figura 27 – BBG 100 nM diminuiu a perda da viabilidade metabólica mitocondrial dos
sinaptossomas estriatais expostos à 6-OHDA, verificada pela redução do Alamar Blue. .......76
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de variância
AP Ântero-posterior
ATP Trifosfato de Adenosina
BBG Brilliant Blue G
BSA Albumina bovina
CEPA Comissão de Ética em Pesquisa Animal
cm centímetros
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
COMT Catecol-O-metil transferase
DA Dopamina
DAB 3,3’-diaminobenzidina
DAG Diacilglicerol
DAT Transportador de dopamina
DOPAC Ácido diidroxifenilacético
DP Doença de Parkinson
DV Dorso-ventral
EPM Erro padrão médio
FBS Soro fetal bovino
FO Falso-operado
FPM Feixe prosencefálico medial
GABA Ácido γ-amino butírico
GFAP Glial fibrillary acidic protein
i.c.v. intracerebroventricular
IL-1β Interleucina-1β
i.p. Intraperitoneal
IP3 Trifosfato de inositol
HPLC Cromatografia líquida de alta performance
LDH Lactato desidrogenase
LTP Potenciação de longa duração
LTD Depressão de longa duração
MAO Monoamina oxidase
mg miligrama
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
MIF Média de Intensidade de Fluorescência
mL mililitro
ML Médio-lateral
mm milímetros
mM milimolar
MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidroxipiridina
MPP+ 1-metil-4-fenil-piridinium
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NAc Núcleo accumbens
nM nanomolar
NMDA N-Metil-D-Aspartato
NF-κB Fator nuclar kappa B
6-OHDA 6-hidroxidopamina
PBS Tampão fosfato com salina 0,9%
PPADS Ácido piridoxal-5’-fosfato-6-azofenil-2’,4’-dissulfônico
PKC Proteína quinase C
RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro
rpm rotações por minuto
SOS Ácido octanosulfônico sódico
SN Substância negra
SNpc Substância negra parte compacta
SNpr Substância negra parte reticulada
TA Temperatura ambiente
TH Tirosina hidroxilase
TNF Fator de necrose tumoral
TBS-T Tampão Tris-salina com 0,1% de Tween 20
µg microgramas
µL microlitros
µM micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16
1.1 Doença de Parkinson ......................................................................................................... 16
1.1.1 Epidemiologia ................................................................................................................ 16
1.1.2 Fisiopatologia ................................................................................................................. 17
1.1.3 Tratamentos para a DP ................................................................................................... 19
1.1.4 Modelos experimentais de DP ....................................................................................... 21
1.1.4.1 Modelo de DP in vitro: células SH-SY5Y ....................................................................22
1.1.4.2 6-hidroxidopamina .......................................................................................................22
1.1.5 Inflamação na DP ............................................................................................................24
1.2 Memória na DP...................................................................................................................25
1.3 Trifosfato de Adenosina (ATP) ......................................................................................... 27
1.3.1 Modulação da neurotransmissão dopaminérgica pelo ATP ........................................... 30
1.3.2 Receptores P2X7............................................................................................................. 31
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 36
2.1. Objetivos Gerais ...............................................................................................................36
2.2. Objetivos específicos ........................................................................................................36
3.0. METODOLOGIA ............................................................................................................37
3.1 EXPERIMENTOS IN VIVO ..............................................................................................37
3.1.1 Animais............................................................................................................................37
3.1.2 Drogas............................................................................................................................. 37
3.1.3 Cirurgia Estereotáxica.................................................................................................... 37
3.1.4 Protocolo Experimental ................................................................................................. 38
3.1.5 Testes Comportamentais ............................................................................................... 39
3.1.5.1 Teste da apomorfina ...................................................................................................39
3.1.5.2 Teste do Campo Aberto ...............................................................................................40
3.1.5.3 Teste do Cilindro .........................................................................................................41
3.1.5.4 Esquiva Passiva ..........................................................................................................42
3.1.5.4 Teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze)
..................................................................................................................................................43
3.1.6 Dosagem de monoaminas por HPLC ............................................................................ 44
3.1.7 Análises imunohistoquímicas ....................................................................................... 44
3.1.7.1 Imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (TH) ................................................... 44
3.1.7.2 Dupla marcação para GFAP e CD-11b .................................................................... 45
3.1.7.3 Imunohistoquímica para iba-1................................................................................... 46
3.1.8 Western Blot para anti-ILlβ .......................................................................................... 47
3.1.9 Densidade dos receptores P2X7 ................................................................................... 47
3.2 EXPERIMENTOS IN VITRO ......................................................................................... 48
3.2.1 Cultura de células SH-SY5Y e condições de incubação .............................................. 48
3.2.1.1 Ensaios de viabilidade celular....................................................................................48
3.2.1.1 1 Teste do MTT .......................................................................................................... 48
3.2.1.1 2 Liberação de LDH .................................................................................................. 49
3.2.1.2 Mensuração de ATP .................................................................................................. 49
3.2.1.3 Co-localização P2X7/ TH .......................................................................................... 50
3.2.2 Preparação dos sinaptossomas estriatais ...................................................................... 50
3.2.2.1 Co-localização para P2X7/ TH e P2X7/ DAT ............................................................ 51
3.2.2.2 Teste do Alamar Blue ................................................................................................ 51
3.3. Análise Estatística .......................................................................................................... 52
4.0 RESULTADOS ............................................................................................................... 53
4.1 EXPERIMENTOS IN VIVO............................................................................................ 53
4.1.1 Efeitos do BBG e do A-438079 no comportamento rotacional induzido por apomorfina
de ratos parkinsonianos ......................................................................................................... 53
4.1.2. Efeitos do BBG e do A-438079 sobre a atividade locomotora (Teste do Campo aberto)
em ratos parkinsonianos ........................................................................................................ 55
4.1.3 Efeitos do BBG sobre a assimetria dos membros anteriores (Teste do Cilindro) em ratos
parkinsonianos ....................................................................................................................... 55
4.1.4 Efeitos do BBG sobre a memória aversiva (Teste da Esquiva Passiva) de ratos
parkinsonianos........................................................................................................................ 58
4.1.5 Efeitos do BBG sobre a aprendizagem relacionada a hábitos de ratos parkinsonianos no
teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada ........................................................... 58
4.1.6 Efeitos do BBG sobre os níveis de monoaminas de ratos parkinsonianos ................... 61
4.1.7 Efeitos do BBG sobre a imunorreatividade para TH de ratos parkinsonianos ............. 62
4.1.8 Efeitos do BBG sobre a microgliose e astrogliose em ratos parkinsonianos ................65
4.1.9 Efeitos do BBG sobre os níveis de IL-1β de ratos parkinsonianos .................................68
4.1.10 Efeitos da 6-OHDA e do BBG sobre a densidade dos receptores P2X7.......................69
4.2 EXPERIMENTOS IN VITRO ............................................................................................70
4.2.1 Efeito da 6-OHDA sobre os níveis de ATP no sobrenadante das células SH-SY5Y
diferenciadas ............................................................................................................................70
4.2.2 Expressão dos receptores P2X7 nas células SH-SY5Y diferenciadas ............................71
4.2.3 Efeito do BBG sobre a citotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células SH-SY5Y...72
4.2.3.1 Teste do MTT ...............................................................................................................72
4.2.3.2 Quantificação da liberação de LDH ...........................................................................72
4.2.4 Expressão dos receptores P2X7 nos sinaptossomas estriatais ....................................... 75
4.2.5 Efeito do BBG sobre a diminuição da viabilidade metabólica induzida pela 6-OHDA em
sinaptossomas estriatais .......................................................................................................... 76
5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 77
6 CONCLUSÕES ....................................................................................................................88
7 REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 89
ANEXO A ............................................................................................................................. 108
16
1. INTRODUÇÃO
1.1 Doença de Parkinson
1.1.1 Epidemiologia
A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum
depois da Doença de Alzheimer, afetando cerca de 1% da população acima de 60 anos
(SPRENGER; POEWE, 2013). No Brasil, a prevalência é estimada em cerca de 3,3% em
pessoas com idade acima de 65 anos (BARBOSA et al., 2006).
Como a prevalência da doença de Parkinson aumenta com a idade, um aumento
global dos casos da doença é esperado nas próximas décadas. Baseado em estudos de
prevalência publicados, um importante estudo fez uma projeção para os próximos anos, do
número de indivíduos com DP nos cinco países mais populosos da Europa Ocidental e nos 10
países mais populosos do mundo, incluindo o Brasil. Foi demonstrado que o número de
indivíduos com DP acima de 50 anos que nesses países estava em torno de 4,1 e 4,6 milhões
em 2005, irá dobrar para números entre 8,7 e 9,3 milhões de pessoas em 2030 (DORSEY et
al., 2007).
Embora a DP seja uma doença que atinge ambos os sexos, os estudos
epidemiológicos demonstram uma maior frequência da doença no sexo masculino. Os fatores
levados em consideração que podem contribuir para isso vão desde o estilo de vida, à
exposição a fatores ambientais, e até uma possível ação neuroprotetora dos estrogênios
(WOOTEN et al., 2004). Estudos recentes acerca da incidência da doença apontam que ela
atinge mais indivíduos brancos que negros que habitam grandes cidades nos Estados Unidos
(WILLIS et al., 2011).
17
1.1.2 Fisiopatologia
As principais características fisiopatológicas da DP são a progressiva degeneração dos
neurônios mielinizados da parte compacta da substância negra (SNpc) e a presença de
inclusões citoplasmáticas, conhecidas como corpúsculos de Lewy, que são formadas
principalmente por α-sinucleína e ubiquitina (EMBORG, 2004).
A degeneração dos neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal leva a uma
intensa redução dos níveis de dopamina no estriado, bem como em outros núcleos da base
(GERLACH; RIEDERER, 1996). Os núcleos ou gânglios da base compõem um grupo de
núcleos subcorticais que possuem como função primordial o controle dos movimentos
voluntários, são eles: estriado (caudado e putâmen), globo pálido (interno e externo), núcleo
subtalâmico, e substância negra (parte compacta e reticulada) (BURCH; SHEERIN, 2005).
Os núcleos da base podem ser considerados como uma alça lateral moduladora
que regula o fluxo de informação do córtex cerebral para os neurônios motores da medula
espinhal (Figura 1). Áreas motoras corticais projetam de maneira somatotópica para o
estriado, estabelecendo conexões sinápticas excitatórias glutamatérgicas com neurônios
GABAérgicos espinhosos médios. Esses neurônios dão origem a duas eferências estriatais,
chamadas de vias direta e indireta, que comunicam o estriado com o globo pálido interno e a
parte reticulada da substância negra (SNpr), através dos quais toda informação processada
deixa os núcleos da base. Na via direta, os neurônios projetam-se de maneira monossináptica
à SNpr e ao segmento interno do globo pálido; estes, por sua vez, fazem uma retransmissão
para o tálamo ventral anterior e ventral lateral. Como o neurotransmissor de ambas as
ligações é o GABA, que é inibitório, o efeito final da estimulação da via direta é um impulso
excitatório para o córtex. Na segunda via, chamada indireta, neurônios GABAérgicos
projetam-se para o segmento externo do globo pálido, daí para o núcleo subtalâmico e,
finalmente, para o globo pálido interno. Todavia, esta ligação final do núcleo subtalâmico
para o globo pálido interno e SNpr é uma via glutamatérgica excitatória. Por conseguinte, o
efeito final da estimulação da via indireta a nível do estriado, consiste na redução do efluxo
excitatório do tálamo para o córtex cerebral (BEDIN, FERRAZ, 2003).
O aspecto chave desse modelo de função dos gânglios da base, que é responsável
pelos sintomas observados na DP, consiste no efeito diferencial da dopamina proveniente da
substância negra compacta (SNpc) nas vias direta e indireta. Os neurônios do estriado que dão
18
origem à via direta expressam fundamentalmente receptores D1 excitatórios, enquanto os
neurônios que formam a via indireta expressam primariamente neurônios D2, inibitórios.
Dessa forma, a dopamina liberada no estriado tende a aumentar a atividade da via direta e
reduzir a da via indireta, enquanto a depleção que ocorre na DP tem efeito oposto. O efeito
final da redução de influxo dopaminérgico na DP consiste em acentuado aumento do efluxo
inibitório da SNpr e do globo pálido interno para o tálamo e redução da excitação do córtex
motor (SANTENS et al., 2003).
Figura 1 – Representação esquemática sobre a organização funcional normal dos núcleos da base (A)
e na Doença de Parkinson (B). SNc: substância negra (parte compacta); SNr: substância negra (parte
reticulada); GPE: globo pálido externo; GPI: globo pálido interno; NST: núcleo subtalâmico, D1 e D2:
receptores dopaminérgicos. Linha cheia = função normal, linha interrompida = função diminuída.
Adaptado de Alexander e Crutcher (1990).
Assim, a perda de neurônios dopaminérgicos está associada com o início, apesar
de lento, de sintomas motores, havendo uma relação direta entre a duração da doença,
extensão da perda de dopamina e disfunção motora (DAMIER et al., 1999). Os sintomas
motores clássicos da DP são bradicinesia, tremor de repouso, rigidez muscular e instabilidade
postural e estes só se manisfestam quando já houve perda de cerca de 60% dos neurônios
nigrais e depleção de 80% do conteúdo de dopamina do estriado (DAUER; PRZEDBORSKI,
2003). Sintomas não-motores como déficits cognitivos, distúrbios do sono, disfunção olfatória
e depressão são outras manifestações incapacitantes comuns da doença (ZIEMSSEN;
REICHMANN, 2007).
A B
19
Apesar dos sintomas da DP estarem bem caracterizados, os mecanismos
subjacentes e as causas da doença ainda não estão completamente esclarecidos. Mutações
genéticas patogênicas em genes como α-sinucleína, parkin, PINK-1 e LRRK-2 podem levar a
formas familiares da DP. Fatores ambientais, como metais pesados, pesticidas e fungicidas
também têm sido associados com um elevado risco para a doença (ALI; BINIENDA; IMAM,
2011). Vários estudos sugerem que a doença de Parkinson se desenvolve a partir de uma
complexa combinação de fatores genéticos e ambientais, envolvendo múltiplas vias
moleculares que levam à neurodegeneração. Diversos fatores têm sido relacionados, dentre
eles a disfunção mitocondrial, agregação de proteínas, estresse oxidativo, excitotoxicidade,
inflamação, apoptose e deficiência de fatores neutróficos (TERZIOGLU; GALTER, 2008;
ALI; BINIENDA; IMAM, 2011).
Diversos autores têm descrito que a neurodegeneração característica da DP é
precedida por uma disfunção inicial dos contatos sinápticos no estriado (FORNO et al., 1994;
SCOTCHER et al., 1991; DAY et al., 2006), levando à perda dos terminais nervosos
dopaminérgicos estriatais (sinaptotoxicidade), que evolui para a perda de neurônios
dopaminérgicos (neurotoxicidade) (BERENDSE et al., 2001).
1.1.3 Tratamentos para DP
A terapia da DP consiste essencialmente na reposição de dopamina, inibição de
sua degradação ou no uso de agonistas dopaminérgicos, para o tratamento sintomático das
principais características clínicas da doença (EMBORG, 2004). A maioria dos pacientes faz
uso da levodopa, considerada o padrão ouro no tratamento da DP.
A levodopa é uma amina precursora de dopamina, oralmente ativa e absorvida
no intestino delgado, sendo logo descarboxilada pela enzima dopa descarboxilase e apenas
uma pequena dose chega inalterada no SNC. A meia vida plasmática da levodopa é muito
curta, não passando de 90 minutos. Assim, uma alta dose é requerida para que haja efeito, o
que leva a vômitos e náuseas nos pacientes. Para bloquear os efeitos periféricos da dopamina
e aumentar a biodisponibilidade da levodopa, ela é coadministrada com a carbidopa ou a
benzerazida, que são inibidores da descarboxilase do ácido amino aromático (PETZINGER;
20
JAKOWEK, 2007). Apesar destes efeitos, a levodopa reduz os sintomas motores da DP, no
entanto, não diminui outros sintomas, nem impede a degeneração nigroestriatal (SINGH;
PILLAY; CHOONARA, 2007).
A terapia com a levodopa é altamente efetiva durante os primeiros estágios do
tratamento, no entanto, o tratamento a longo-prazo causa, em combinação com a progressão
da doença, o desenvolvimento de movimentos involuntários denominados discinesias
(BARGIOTAS; KONITSIOTIS, 2013). Flutuações na concentração de levodopa no sangue
e no cérebro, produzidas na administração periódica de levodopa podem levar a estimulação
de receptores dopaminérgicos no estriado, o que pode causar flutuações na resposta clínica
levando as discinesias (NAGATSU; SAWADA, 2009). As discinesias são geralmente
movimentos involuntários hipercinéticos, sendo os distônicos e de coréia/coreiformes, os
mais comuns (KIEBURTZ, 2008).
Além da levodopa, drogas que são prescritas atualmente no tratamento da DP
incluem agonistas dos receptores de DA, tais como, selegilina (inibidor de MAO-B),
amantadina (anti-viral com influência na síntese da DA), inibidores de catecol-O-metil
transferase (COMT) e anticolinérgicos (NAGATSU; SAWADA, 2009).
As intervenções cirúrgicas para DP mostraram-se benéficas para alguns sintomas
refratários. No entanto, estas cirurgias apresentam indicações específicas e a eficácia a longo
prazo é limitada. Recentes avanços nessa área têm levado a uma maior quantidade de
procedimentos cirúrgicos. A estimulação cerebral profunda tem sido atualmente a intervenção
de escolha, por ser uma técnica potencialmente mais segura do que outras opções disponíveis
(SCHAPIRA et al., 2006; SINGH; PILLAY; CHOONARA, 2007).
Apesar da pesquisa farmacológica intensiva e dos avanços realizados nas últimas
décadas, os tratamentos disponíveis não alteram a progressão do processo neurodegenerativo
da DP. A maioria dos pacientes irá ainda sofrer eventualmente durante o tratamento, com
complicações motoras que são difíceis de controlar e significantemente diminuem a qualidade
de vida, sendo portanto, necessária a descoberta de estratégias neuroprotetoras para diminuir
ou parar a progressão da doença.
21
1.1.4 Modelos experimentais de DP
O desenvolvimento de modelos relevantes de doença de Parkinson é essencial
para o melhor entendimento dos processos patológicos subjacentes à doença e para avaliação
de alvos promissores para intervenção terapêutica. Os modelos mais utilizados são baseados
na administração sistêmica ou intra-cerebral de neurotoxinas e são capazes de replicar muitas
características patológicas e fenotípicas da doença (BLANDINI; ARMENTERO, 2012).
A maior parte dos estudos pré-clínicos têm sido realizados em modelos bem
estabelecidos em roedores e primatas não-humanos, utilizando-se 6-hidroxidopamina (6-
OHDA) ou 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidroxipiridina (MPTP) (DECRESSAC;
MATTSSON; BJÖRKLUND, 2012). Além desses, alguns agentes químicos utilizados na
agricultura como a rotenona e o paraquat, quando administrados sistemicamente, podem
induzir algumas das características da DP, apesar de serem modelos menos reprodutíveis
(SPIVEY, 2011).
Novos modelos como a super-expressão de α-sinucleína, utilizando-se vetores
virais, ou o uso de camundongos geneticamente modificados, que mimetizam as causas
genéticas da DP, também têm sido utilizados recentemente e ajudam a esclarecer muitos
eventos moleculares envolvidos com a patologia da doença (DECRESSAC; MATTSSON;
BJÖRKLUND, 2012). A maioria das novas estratégias terapêuticas para doença de Parkinson
são avaliadas primeiramente em modelos celulares. O uso de cultura de células para pesquisa
em DP tem a vantagem de permitir um rápido screening para potenciais drogas, assim como
restringe o número necessário de animais para os experimentos. No entanto, existem algumas
limitações para o uso de células, como o fato destas não se desenvolverem no seu ambiente
natural, ou seja, de estarem desprovidas de suas conexões aferentes e eferentes
(FALKENBURGER; SCHULZ, 2006)
Atualmente, os modelos celulares para pesquisa em DP incluem principalmente
linhagem celulares de tumores não-neuronais, como as células de Feocromocitoma (PC12),
linhagem celulares de tumores neuronais, como as células de neuroblastoma humano (SH-
SY5Y), e neurônios primários mesencefálicos. Essas células mimetizam muitos aspectos da
morte neuronal dopaminérgica observada na DP quando tratadas com 1-metil-4-fenil-
piridinium (MPP+), 6-hidroxidopamina (6-OHDA) ou rotenona (XIE; HU; LI, 2010).
22
1.1.4.1 Modelo de DP in vitro: células SH-SY5Y
A linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y é um subclone derivado de
células SK-N-SH que foram obtidas originalmente de um sítio metastático da medula óssea
(BIEDLER et al., 1978). Essa linhagem celular tem sido bastante utilizada como um modelo
in vitro de DP, visto que as células possuem muitas características de neurônios
dopaminérgicos, como a expressão de DAT (transportador de dopamina) e a capacidade de
sintetizar dopamina e noradrenalina, pois expressam tirosina e dopamina β-hidroxilases (XIE;
HU; LI, 2010).
Entretanto, diversos estudos demonstram que após diferenciação com alguns
agentes, como o ácido retinóico, as células adquirem um fenótipo neuronal dopaminérgico
mais pronunciado, com a exibição de longos processos neuríticos e interrupção do
crescimento celular (LOPES et al., 2010; ENCINAS et al., 2000).
O ácido retinóico é a forma biologicamente ativa da vitamina A, necessária para o
desenvolvimento normal, incluindo apoptose, diferenciação e morfogênese de vários orgãos e
sistemas (BAIN et al., 1995). In vitro, o ácido retinóico promove a diferenciação e inibe a
divisão celular, bloqueando as células na fase G1/S do ciclo celular (MALIK; BLUSZTAJN;
GREENWOOD, 2000). A indução do processo de diferenciação ocorre pelo aumento da
produção de catecolaminas e pela expressão da enzima enolase e de fatores de crescimento.
Isso leva à modificação da morfologia celular, como formação de projeções citoplasmáticas
(neuritos), ocasionando ainda um aumento do conteúdo de marcadores dopaminérgicos como
TH e DAT (EDSJÖ; HOLMQUIST; PÅHLMAN, 2007).
1.1.4.2 6-hidroxidopamina
A 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é uma das neurotoxinas mais frequentemente
utilizadas em modelos experimentais de degeneração da substancia negra, tanto in vitro como
in vivo (SCHOBER, 2004). Devido a sua similaridade estrutural com a dopamina, a 6-OHDA
tem uma elevada afinidade pelo DAT (transportador de dopamina) e por essa razão, destrói
seletivamente neurônios dopaminérgicos e catecolaminérgicos (LEHMENSIEK et al., 2006).
Apesar do exato mecanismo subjacente à toxicidade da 6-OHDA ainda estar sob investigação,
23
o entendimento atual é que, a 6-OHDA inicia a degeneração neuronal através da combinação
de estresse oxidativo e disfunção da cadeia respiratória mitocondrial (DUTY; JENNER,
2011).
Uma vez dentro dos neurônios, a 6-OHDA se acumula e sofre auto-oxidação
enzimática promovendo a formação de espécies reativas de oxigênio (MAZZIO; REAMS;
SOLIMAN, 2004), redução dos níveis de proteínas anti-oxidantes, como glutationa total e
superóxido dismutase (KUNIKOWSKA; JENNER, 2001), e elevação dos níveis de ferro na
substância negra (OESTREICHER et al., 1994), assim como interação direta com os
complexos I e IV da cadeia respiratória mitocondrial, levando ao estresse oxidativo
(GLINKA; GASSEN; YOUDIM, 1997). Muitos desses eventos parecem ocorrer no cérebro
durante o desenvolvimento da DP, o que fornece suporte para a validade do modelo com 6-
OHDA (DUTY; JENNER, 2011).
Como a 6-OHDA não consegue atravessar a barreira hemato-encefálica, a mesma
deve ser administrada através de injeção estereotáxica na substância negra (SN), no feixe
prosencefálico medial (FPM), ou no estriado. Após injeções de 6-OHDA no FPM ou SN, os
neurônios dopaminérgicos começam a se degenerar dentro de 24hs e morrem sem apresentar
morfologia apoptótica (JEON; JACKSON-LEWIS; BURKE, 1995). Quando a 6-OHDA é
injetada no estriado, esta produz uma degeneração retrógrada dos neurônios nigroestriatais
(SAUER; OERTEL, 1994).
Para lesões estereotáxicas no estriado, a 6-OHDA é normalmente injetada
unilateralmente, com o lado contralateral servindo como controle. Essas injeções produzem
um comportamento circular assimétrico, do qual a magnitude depende do grau da lesão
nigroestriatal (PRZEDBORSKI et al., 1995). A lesão unilateral pode ser obtida
quantitativamente, havendo por isso, uma notável vantagem no uso desse modelo para o teste
de novas drogas anti-parkinsonianas.
24
1.1.5 Inflamação na DP
O processo neuroinflamatório tem uma função importante na patogênese da
doença de Parkinson. Estudos em animais e humanos dão suporte à presença de uma cascata
neuroinflamatória na DP, principalmente com uma grande atividade microglial (MOSLEY at
al., 2006).
Dentro do microambiente cerebral, as células gliais desempenham um papel
fundamental nos mecanismos homeostáticos que promovem a sobrevida neuronal. As células
microgliais funcionam como uma defesa imune especializada e medeiam a resposta imune
inata à invasão de patógenos secretando uma gama de fatores que incluem citocinas,
quimiocinas, prostaglandinas, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, e fatores de
crescimento. Alguns desses fatores têm funções neuroprotetoras e neurotróficas, ajudando no
processo de reparação do cérebro, enquanto outras aumentam o estresse oxidativo e
desencadeiam a apoptose (TANSEY; GOLDBERG, 2010).
Na DP, a degeneração dos neurônios dopaminérgicos está associada com uma
grande atividade microglial, que pode ser consequência da morte neuronal ou pode refletir
uma participação ativa da micróglia no processo neurodegenerativo. Se essa ativação
microglial protege ou exacerba a perda neuronal ainda é assunto de debate (HIRSCH;
HUNOT; HARTMANN, 2005), embora a maioria das evidências sugiram que ela exerce
efeitos tóxicos para os neurônios.
Diversos estudos demonstraram a presença de micróglia ativada, acúmulo de
citocinas e ativação da via do fator nuclear kappa B (NF-κB) em cérebros de pacientes com
DP, que também são evidentes em tecidos post-mortem de indivíduos com DP (MCGEER et
al., 1988; HIRSCH; HUNOT, 2009) e na maioria dos modelos experimentais. Gerhard e
colaboradores (2006) demonstraram que pacientes com DP idiopática apresentam uma
ativação microglial intensa nos gânglios basais e regiões do córtex frontal e temporal, quando
comparadas com os controles saudáveis de idades semelhantes. Além disso, outros estudos
evidenciaram uma diminuição dos riscos de desenvolvimento da DP em usuários regulares de
drogas anti-inflamatórias não-esteroidais (CHEN et al., 2003).
25
1.2 Memória na DP
A DP é conhecida principalmente por ser uma desordem do movimento, no
entanto, atualmente também tem sido reconhecida como causa de distúrbios cognitivos,
psiquiátricos, autonômicos e sensórios (SHIBA et al., 2000; CHAUDHURI; HEALY;
SCHAPIRA, 2006; WILLIAMS-GRAY et al., 2007). A distribuição da degeneração
dopaminérgica no neoestriado é um fator crítico que contribui para os déficits cognitivos na
DP (LEVERENZ et al., 2009).
Os déficits cognitivos são comuns na DP e podem progredir para demência em
15% a 20% dos pacientes (SCHRAG; JAHANSHAHI; QUINN, 2000). O período em que os
esses déficits surgem pode ser referido como uma fase pré-motora da doença, sendo
apontados como preditores importantes da qualidade de vida dos pacientes (SCHRAG;
JAHANSHAHI; QUINN, 2000; TOLOSA; COMPTA; GAIG, 2007). Antes de apresentar os
principais prejuízos cognitivos observados na DP, faz-se necessário uma breve descrição dos
conceitos básicos referentes aos processos de aprendizado e memória.
A memória humana é considerada um complexo subsistema envolvendo
diferentes redes anátomo-funcionais, com provável uso de diferentes sistemas de
neurotransmissão (DUJARDIN; LAURENT, 2003). Podemos defini-la como um mecanismo
pelo qual ocorre à aquisição, retenção e recuperação das informações obtidas pelas
experiências diárias (LENT, 2001). Atualmente, existem dezenas de diferentes classificações
para os processos de aprendizado e memória, que sofrem grande variação conforme o enfoque
utilizado pelo autor. De maneira geral, os tipos de memória podem ser classificados de acordo
com o seu tempo de retenção e sua natureza ou conteúdo.
As memórias podem ser classificadas quanto ao seu tempo de retenção (ou
duração) em: memórias de longa duração, memórias de curta duração e memórias de trabalho
(working memory) (GOLD; McGAUGH, 1975; LENT, 2001). A memória de trabalho ou
operacional é muito breve e fugaz e serve para o armazenamento temporário (segundos ou
poucos minutos) de informações que serão úteis apenas para o raciocínio imediato e resolução
de problemas, podendo ser descartadas (esquecidas) logo a seguir (IZQUIERDO; MEDINA,
1991). Ao contrário dos demais tipos de memória, a memória operacional não deixa traços e
26
não produz arquivos. Usamos a memória operacional, por exemplo, para gravarmos números
de telefones e para realizarmos contas matemáticas.
Em paralelo, formam-se as memórias de curta duração, que duram minutos ou
horas e servem para proporcionar a continuidade do nosso sentido do presente. Essa memória
a curto prazo engloba o tempo durante o qual a memória de eventos em curso está sendo
consolidada e convertida à memória remota, de longo prazo. Durante este tempo, a memória
de curta duração é vulnerável e sujeita a desaparecer, ao passo que as memórias remotas são
extremamente resistentes e persistem na presença de grave lesão cerebral (SQUIRE; ZOLA-
MORGAN, 1996). O processo de consolidação que converte memórias de curto prazo em
memórias de longo prazo envolve o hipocampo e as porções adjacentes entorrinal, perirrinal e
para-hipocampal do córtex temporal medial (SQUIRE; ZOLA-MORGAN, 1996) e consiste
na alteração da atividade dos circuitos envolvidos através de plasticidade neural. Os
mecanismos propostos para os fenômenos de plasticidade neural que suportam a formação de
memórias são a potenciação de longa duração (LTP, do inglês “long-term potentiation”) e a
depressão de longa duração (LTD, do inglês “long-term depression”) (BLISS;
COLLINGRIDGE, 1993; IZQUIERDO; McGAUGH, 2000).
As memórias de longa duração podem ser divididas, quanto a sua natureza ou
conteúdo, em memórias explícitas ou declarativas e memórias implícitas ou não-declarativas.
A memória declarativa geralmente refere-se à memória explícita de “o que” - e está
relacionada a experiências próprias, reconhecimento de cenas e de objetos familiares. A
memória declarativa envolve a recuperação consciente de eventos ou fatos ocorridos, nos
quais está incluída a memória episódica, que se refere a informações que estão relacionadas a
um lugar e tempo específicos, assim como a memória semântica que se refere a um
conhecimento geral não ligado a contexto espacial ou temporal em particular (ERICSSON;
KINTSCH, 1995).
A memória não declarativa, implícita ou “de procedimento” (procedural) de
“como fazer” refere-se a várias formas de memória que não estão diretamente acessíveis à
consciência. Estas incluem habilidades e hábitos de aprendizagem, condicionamento clássico,
assim como “priming” ou pré-ativação, que pode ser definido como a habilidade de detectar
ou identificar um estímulo como um resultado de uma exposição prévia (ERICSSON;
KINTSCH, 1995).
27
Atualmente, existem muitas evidências na literatura de que os diferentes tipos de
memória são organizados e controlados por sistemas neuroanatômicos distintos (Revisado por
PREDIGER, 2005). Segundo Moscovitch (1992), a memória teria quatro componentes
essenciais: um componente neocortical não-frontal que modula a percepção na realização dos
testes de memórias implícitas; um componente dos gânglios da base que interfere nos testes
de memórias procedurais sensóriomotoras; um componente temporal medial/hipocampal que
mediaria a aquisição, retenção e evocação de memórias explícitas e um componente do lobo
frontal que controla as memórias operacionais ou de trabalho.
Dessa forma, visto que os pacientes com DP apresentam uma depleção nos níveis
de DA nos gânglios da base (GERLACH; RIEDERER, 1996) e em outras áreas cerebrais,
como o córtex pré-frontal (SCATTON et al., 1983; STEBBINS et al., 1999), seria esperado
um prejuízo específico nas memórias implícitas e operacionais, respectivamente. Apesar de
existirem divergências na literatura quanto aos tipos de memória que estariam comprometidos
na DP, a hipótese mencionada acima parece ser verdadeira (PREDIGER, 2005). Pacientes
com DP apresentam déficit na aquisição de vários tipos de memória de procedimento devido
às alterações estriatais (PACKARD; KNOWLTON, 2002). Além disso, déficits na função
executiva e na memória de trabalho (operacional) em pacientes com DP parecem ser
produzidas devido a danos no lobo frontal (LEWIS et al., 2003). Por outro lado, tem sido
demonstrado que as memórias declarativas, normalmente associadas ao hipocampo e o córtex
entorrinal, encontram-se mais preservadas na DP (DUBOIS; PILLON, 1997; RIEKKINEN et
al., 1998).
1.3 Trifosfato de Adenosina (ATP)
O Trifosfato de Adenosina (ATP) desempenha uma importante função na
sinalização a curto-prazo, ocorrida durante a neurotransmissão e secreção de hormônios,
assim como na sinalização a longo-prazo, envolvida na proliferação, diferenciação e
regeneração ou morte celular em estados patológicos (FRANKE; ILLES, 2006;
BURNSTOCK, 2007).
A concentração citoplasmática de ATP na maioria dos neurônios está entre 2 e 4
mM, mas pode chegar a 100 mM dentro das vesículas sinápticas (BURNSTOCK, 2007). A
liberação no meio extracelular pode ocorrer por exocitose ou indiretamente, por danos na
28
membrana, podendo atingir elevados níveis, apesar do restrito controle exercido pelas
ectonucleotidases (ATPase, apirase e ecto-5’-nucleotidase) (Figura 2) que tentam manter a
concentração extracelular em níveis fisiológicos baixos (VOLONTÉ et al., 2003;
ZIMMERMANN, 2006).
As ectonucleotidases degradam o ATP formando adenosina, com subsequente
ativação dos receptores do tipo P1. Os receptores P1 são subdivididos de acordo com
evidências moleculares, bioquímicas e farmacológicas em quatro subtipos: A1, A2A, A2B e A3,
todos acoplados à proteína G (ZIMMERMANN, 2006) e envolvidos em diversas funções do
sistema nervoso central que incluem regulação do sono, ansiedade, memória e performance
cognitiva (ROSSO; LIPPA; MOSSEY, 2008).
O ATP liberado das células danificadas pode exercer efeitos deletérios direto aos
neurônios, ou pode agir como modulador de processos inflamatórios mediados pelas células
microgliais, envolvidas no estabelecimento de várias condições patológicas (SPERLÁGH;
ILLES, 2007). O ATP extracelular age através de receptores P2, que compreende sete
subunidades de receptores P2X ionotrópicos (P2X1–7), formados por receptores monoméricos
e heteroméricos (NORTH, 2002), e oito de receptores P2Y metabotrópicos (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12,
13, 14) (LAZAROWSKI; BOUCHER; HARDEN, 2003).
Figura 2 – Vias de degradação extracelular dos nucleotídeos purínicos. Adaptado de Majumder et al.
(2007).
29
Os receptores P2X foram descritos tanto em neurônios pré- quanto pós-sinápticos
e células gliais. Esses receptores formam uma grande família de canais iônicos ativados por
ligantes, que permitem a passagem rápida e não seletiva de cátions através da membrana,
resultando em um aumento na concentração de Ca++ intracelular e despolarização da
membrana, sendo responsáveis por mediar as ações rápidas do ATP (JAMES; BUTT, 2002;
NORTH, 2002; ILLES; RIBEIRO, 2004; PUCHAŁOWICZ et al., 2014).
As respostas mediadas por receptores P2Y se desenvolvem a uma velocidade
consideravelmente menor que aquelas mediadas por receptores P2X, pois estão envolvidas
com a geração de segundos mensageiros e com a interação com receptores para outros
transmissores (VOLONTÉ et al., 2003; FRANKE; KRÜGEL; ILLES, 2006). Os receptores
P2Y podem ser ativados não somente pelo ATP, mas também por outros nucleotídeos, como
adenosina difosfato (ADP), uridina difosfato (UDP) e uridina trifosfato (UTP), ou no caso dos
receptores P2Y14, pela UDP-glicose (FRANKE; KRÜGEL; ILLES, 2006).
A maioria dos receptores P2Y está acoplado à proteína Gq/11, estando os
receptores P2Y12, P2Y13 e P2Y14 acoplado à proteína Gi/o (HUSSL; BOEHM, 2006). Assim a
ativação dos receptores P2Y leva à estimulação da fosfolipase C e subsequente formação de
diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP3), que posteriormente mobiliza Ca++
intracelular. O DAG estimula diferentes subtipos de proteína quinases C (PKC) levando a
ativação de diferentes cascatas ativadas por essas proteínas. Em adição, o receptor P2Y11
medeia a estimulação, enquanto os receptores P2Y12 e P2Y13 medeiam a inibição da adenilato
ciclase (VON KÜGELGEN, 2006).
Além de agir como neurotransmissor isolado, a liberação vesicular de ATP está
co-localizada com outros neurotransmissores como acetilcolina, noradrenalina, GABA,
dopamina ou glutamato nas mesmas fibras nervosas. Assim, o ATP pode interagir com outros
neurotransmissores ou fatores de crescimento, modulando seus efeitos (BURNSTOCK;
KNIGHT, 2004).
Rodrigues et al. (2005) demonstraram, em um estudo utilizando terminais
nervosos purificados, que o ATP modula pré-sinapticamente a liberação evocada de
glutamato, em um manejo bifásico através da ativação dos receptores pré-sinápticos
facilitatórios, P2X1, P2X2/3 e P2X3 e inibitórios, P2Y1, P2Y2 e P2Y4. Isso sugere que a
liberação de glutamato estimulada por ATP pode contribuir para os efeitos deletérios da alta
30
concentração de ATP (CHOI, KOH, 1998). A super estimulação dos receptores NMDA do
glutamato resulta em um excessivo influxo de cálcio que culmina na ativação de uma gama de
mecanismos potencialmente neurotóxicos, como ativação de, endonucleases, NOS e produção
de radicais livres (LE FEUVRE; BROUGH; ROTHWELL, 2002).
1.3.1 Modulação da neurotransmissão dopaminérgica pelo ATP
Nos últimos anos, diversos estudos têm demonstrado que a adenosina endógena e
o ATP modulam a neurotransmissão nas principais projeções alvo dos neurônios
dopaminérgicos, como núcleo accumbens (NAc) e área tegmental ventral (KRÜGEL et al.,
2001, 2003), assim como em sua origem, no mesencéfalo (KRÜGEL et al., 2001, 2003,
2004).
Neurônios dopaminérgicos dessas áreas cerebrais regularmente geram potenciais
de ação espontâneos de 2 a 4Hz (GRACE; ONN, 1989; KITAI et al., 1999) e liberam
dopamina dos terminais axonais (STAAL; MOSHAROV; SULZER, 2004), assim como dos
compartimentos somatodendríticos (CHEN; RICE, 2001; ADELL; ARTIGAS, 2004;
BECKSTEAD et al., 2004). Esses padrões de disparos fornecem vários tipos de informação
sobre comportamentos motores, recompensa e estímulo motivacional, emoção e alguns tipos
de memória (KITAI et al., 1999; SCHULTZ, 2001).
Choi e colaboradores (2009) demonstraram que 65% dos neurônios
dopaminérgicos expressam RNAm para receptores P2X, principalmente os subtipos P2X2,
P2X4 e P2X6, e que o ATP modula os disparos espontâneos nos neurônios da substância
negra parte compacta possivelmente através desses receptores.
As taxas de disparos espontâneos neuronais também estão diretamente
relacionadas aos níveis basais de Ca++ e o ATP aumenta a atividade de disparos nos neurônios
dopaminérgicos mesmo em altas concentrações, como 1mM. Isso poderia levar a um elevado
acúmulo de Ca++ e causar toxicidade em certas condições como convulsões, hipóxia e
isquemia, podendo ser mais deletério aos neurônios dopaminérgicos (CHOI et al., 2009).
31
Dessa forma, podemos presumir que o ATP desenvolve uma importante função na
regulação das atividades dopaminérgicas neuronais através de receptores P2. No entanto, o
padrão de expressão desses receptores e suas funções na DP ainda são pouco compreendidos.
1.3.2 Receptores P2X7
Os receptores P2X7 estão expressos em células do sistema imunológico, como
macrófagos e monócitos, células dendríticas e linfócitos, assim como em células gliais,
incluindo micróglia, astrócitos, oligodentrócitos e células de Schwann (DI VIRGILIO et al.,
2001, 2009). Células epiteliais, fibroblastos, osteoblastos, células pituitárias e algumas
populações neuronais também expressam os receptores P2X7 (GRÖSCHEL-STEWART et al.,
1999; KOSHIMIZU et al., 2000; DEUCHARS et al., 2001).
A localização dos receptores P2X7 nos neurônios, em várias regiões cerebrais,
ainda é bastante controversa. Nos últimos anos, diferentes estudos têm demonstrado a
presença dos receptores P2X7 em áreas como cerebelo (HERVÁS; PÉREZ‐SEN; MIRAS‐
PORTUGAL, 2003), hipocampo (ARMSTRONG et al., 2002), substância negra e estriado
(AMADIO et al., 2007; YU et al., 2008), assim como em terminais sinápticos corticais
(MIRAS-PORTUGAL et al., 2003).
Esses receptores foram incialmente clonados em 1996 e classificados como
membro da família de receptores P2X devido a sequência homóloga de aminoácidos
(SURPRENANT et al. 1996). Similar a outros membros da família P2X, os receptores P2X7
funcionam como canal iônico em resposta ao ATP extracelular e é permeável a vários cátions
como K+, Na+ e Ca2+ (NORTH, 2002). Contudo, diferente dos outros receptores P2X, os
receptores P2X7 tem uma longa cauda C-terminal que interage com várias proteínas e lipídios
no citoplasma (SURPRENANT et al. 1996; NORTH, 2002), assim, o ATP pode ativar
múltiplas vias de sinalização intracelular através desse receptor.
Os receptores P2X7 podem ainda interagir funcionalmente com os receptores
P2X4. O receptor heteromérico P2X4/P2X7 parece ter as mesmas propriedades farmacológicas
de ambos os subtipos de receptores monoméricos (GUO et al., 2007). Entretanto, na micróglia
32
e macrófagos, foi demonstrado que tanto os receptores P2X4, quanto P2X7, ocorrem
preferencialmente na forma monomérica (NICKE, 2008; BOUMECHACHE et al., 2009).
Os receptores P2X7 possuem algumas propriedades únicas como: a necessidade de
concentrações mais elevadas de ATP (na faixa milimolar) para ativá-los, maiores que as
requeridas para ativar os outros receptores P2X (SURPRENANT et al. 1996); a atividade do
canal induzida pelo ATP é acompanhada por uma lenta ou pela não dessensibilização,
enquanto uma rápida dessensibilização é observada para os outros receptores P2X (NORTH,
2002); além disso, uma prolongada ativação dos receptores P2X7 resulta na formação de um
poro na membrana plasmática (Figura 3), que permite a passagem de moléculas maiores que
900 Da, levando à morte celular (DI VIRGILIO et al., 1998; SUN et al., 2010; VOLONTÉ et
al., 2012; PUCHAŁOWICZ et al., 2014).
Figura 3 – Diagrama esquemático mostrando as relações funcionais entre os receptores P2X7,
microgliose e eventual neurodegeneração. MONIF; BURNSTOCK; WILLIAMS, 2010.
33
Em astrócitos, os receptores purinérgicos P2X7 regulam a neurotransmissão
induzindo a liberação de gliotransmissores, como o glutamato, enquanto na micróglia,
estimulam o processamento e liberação de citocinas como interleucina-1β (IL-1β), que está
envolvida na inflamação e neurodegeneração. Além disso, esses receptores demonstraram
estimular a transcrição do fator nuclear kappa B (NF-κB), TNF-α e proteínas quinases
ativadas por estresse (FERRARI et al., 1997; BROUGH et al., 2002).
A liberação de glutamato pelos astrócitos parece ser mediada diretamente pelos
receptores P2X7 (DUAN et al., 2003), já a liberação de IL-1 induzida por esses receptores em
monócitos de humanos envolve a formação de poros, estando a Panexina-1, uma proteína
GAP junction abundante no cérebro, envolvida com essa formação (PELEGRIN;
SURPRENANT, 2006).
Visto que a neuroinflamação está associada com diferentes doenças
neurodegenerativas, a função dos receptores P2X7 tem sido documentada em diversas
situações de dano neuronal, como isquemia (MELANI et al., 2006; CHU et al., 2012), lesão
da medula espinhal (PENG et al., 2009), epilepsia (ENGEL et al., 2012), doença de
Alzheimer (RYU; MCLARNON, 2008; DÍAZ-HERNÁNDEZ et al., 2012), doença de
Huntington (DÍAZ-HERNÁNDEZ et al., 2009) e depressão (BASSO et al., 2009).
Marcellino et al. (2010) demonstrou que o antagonismo dos receptores P2X7
previne a depleção do conteúdo estriatal de dopamina causado pela administração de 6-
OHDA. Hracskó et al. (2011) demonstrou um efeito protetor contra a toxicidade da rotenona
e do MPTP em células PC-12, entretanto, esses dados não puderam ser replicados quando o
MPTP foi utilizado in vivo. Dessa forma, mais estudos são necessários mais esclarecer o
efeito do bloqueio dos receptores P2X7 em modelos de doença de Parkinson.
Os antagonistas dos receptores P2X7 podem ser classificados em quatro grupos
principais. O primeiro grupo contém cátions divalentes, como Ca2+, Cu2+, Mg2+ e Zn2+, assim
como prótons como H+, que inibem correntes evocadas por ATP através dos canais P2X7. O
segundo grupo inclui os antagonistas não-seletivos Sumarin e PPADS, que bloqueiam os
receptores P2X7 com baixa afinidade (Ki >10 µM), assim como o Brilliant Blue G (BBG), que
é um antagonista mais potente, com uma afinidade nanomolar. O terceiro grupo é formado
pelos grandes cátions orgânicos: calmidazolium e KN-62. E por último, existem os anticorpos
monoclonais, que são usados para bloquear as funções dos receptores P2X7 in vitro
34
(FRIEDLE; CURET; WATTERS, 2010). Todos esses compostos são antagonistas
competitivos, exceto o ATP oxidado (oATP), que é um antagonista irreversível e requer pré-
incubação de 1 a 2 horas para inibir a ativação funcional dos receptores P2X7, além de
necessitar de altas concentrações (100-300 µM) (DI VIRGILIO, 2003).
O Brilliant Blue G (BBG) é um antagonista dos receptores P2X7 comumente
utilizado em estudos experimentais (Figura 4), devido à baixa toxicidade e alta seletividade,
que fazem deste composto um candidato ideal para bloquear os efeitos resultantes da ativação
dos receptores P2X7 (PENG et al., 2009). O BBG é capaz de atravessar a barreira hemato-
encefálica, demonstrando, no entanto, ser significativamente mais efetivo ao inibir os
receptores P2X7 de ratos que de humanos (JIANG et al., 2000), com uma afinidade
nanomolar, mas inibindo também receptores P2X2 e alguns receptores P2Y, em uma faixa
micromolar (FRIEDLE; CURET; WATTERS, 2010).
Recentemente, a Abbott Laboratories desenvolveu uma nova série de antagonistas
P2X7, incluindo os compostos A-740003, A-438079 e A-839977, que são bloqueadores
reversíveis e competitivos (HONORE et al., 2009). O composto A-438079 demonstrou ser
isento de efeitos sobre outros tipos de receptores P2 (IC50 >>10 µM), assim como apresentou
pouca ou nenhuma atividade em outros receptores ou canais iônicos da superfície celular
(NELSON et al., 2006).
Figura 4 – Estrutura química do Brilliant Blue G (BBG). Fonte: FRIEDLE; MARJORIE; CURET,
2010.
35
Visto que o ATP liberado das células danificadas exerce efeitos deletérios diretos
sobre os neurônios, agindo através de receptores P2X7, o objetivo do presente trabalho foi
estudar os efeitos do Brilliant Blue G (BBG) sobre a neurotoxicidade induzida por 6-OHDA,
um modelo de DP. Nós testamos o impacto do BBG em diferentes características da DP in
vivo, avaliando o dano neuronal, déficits motores e de memória, assim como in vitro,
utilizando terminais nervosos purificados e células SH-SY5Y dopaminérgicas (células de
neuroblastoma humano diferenciadas).
36
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Estudar os efeitos do Brilliant Blue G (BBG), um antagonista dos receptores
P2X7, sobre a neurotoxicidade induzida por 6-OHDA, um modelo de DP, tanto in vivo quanto
in vitro.
2.2. Objetivos específicos
Avaliar o efeito do dano neuronal produzido pela 6-OHDA no padrão de expressão dos
receptores P2X7 no estriado;
Avaliar o potencial neuroprotetor do BBG, antagonista do receptor P2X7, sobre o
comportamento motor e memória dos animais submetidos injeção intra-estriatal de 6-
OHDA;
Avaliar o potencial neuroprotetor do BBG sobre o dano neuronal causado pela lesão com
6-OHDA, analisando:
- Imunorreatividade para tirosina hidroxilase, um marcador dopaminérgico, no estriado
e SN;
- Concentração de DA e do metabólito DOPAC no estriado e mesencéfalo;
- Ativação glial (imunorreatividade para GFAP e CD11b) no estriado e SN;
- Níveis da citocina IL-1β no estriado.
Pesquisar a presença dos receptores P2X7 nas células SH-SY5Y diferenciadas com ácido
retinóico;
Avaliar o efeito do BBG sobre a viabilidade das células SH-SY5Y diferenciadas, após
exposição à 6-OHDA;
Pesquisar a presença dos receptores P2X7 nos terminais nervosos dopaminérgicos
estriatais (sinaptossomas);
Avaliar o efeito do BBG sobre a viabilidade de terminais nervosos dopaminérgicos
estriatais, após exposição à 6-OHDA;
37
3. METODOLOGIA
3.1 EXPERIMENTOS IN VIVO
3.1.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos, com peso entre 220-250 gramas,
provenientes do biotério central do Campus do Pici, da Universidade Federal do Ceará (UFC)
e transferidos para o biotério setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
Faculdade de Medicina, UFC. Os animais foram mantidos sob condições de temperatura e
umidade controladas, num ciclo de doze horas de claro e escuro, com livre acesso à
alimentação e à água.
Todos os procedimentos realizados no estudo seguiram os princípios éticos da
experimentação animal, estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA). O estudo foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal
(CEPA) da UFC, sob o número de registro 81/2011 (Anexo A).
3.1.2 Drogas
As seguintes substâncias foram utilizadas: 6-OHDA (Sigma Aldrich, EUA),
Brilliant Blue G (Sigma Aldrich, EUA), A438079 (Tocris, Reino Unido), Quetamina (König,
Argentina), Xilazina (König, Argentina) e Apomorfina (Tocris, Reino Unido). Os demais
reagentes foram de grau analítico.
3.1.3 Cirurgia Estereotáxica
Ratos wistar machos foram anestesiados com xilazina (10 mg/kg, i.p.) e
quetamina (100 mg/kg, i.p.) e receberam, através de cirurgia estereotáxica, três injeções de 1
µL de 6-OHDA (18 µg/3µl) dissolvida em solução de ácido ascórbico a 0,02% em salina. As
injeções foram administradas no estriado direito, de acordo com as seguintes coordenadas (em
mm) relativas ao bregma: (1) AP +0,5, ML +2,5, DV +5,0; (2) AP -0,5, ML +3,0, DV +6,0;
38
(3) AP -0,9, ML +3,7, DV +6,5 (PAXINOS; WATSON, 1986). Esse modelo de
parkinsonismo com 6-OHDA foi proposto por Ungerstedt (1968) e modificado por Sauer e
Oertel (1994). Os animais do grupo falso-operado (FO) foram submetidos aos mesmos
procedimentos cirúrgicos, no entanto, não receberam a neurotoxina 6-OHDA, somente o
veículo na qual esta foi diluída.
3.1.4 Protocolo Experimental
O tratamento com Brilliant Blue G (45 mg/kg) foi realizado por via intraperitoneal
(i.p.), duas horas após a cirurgia e a cada 48 horas por duas semanas, utilizando salina como
veículo. Essa dose de BBG foi demonstrada atingir uma concentração cerebral de 200-220
nM (DÍAZ-HERNÁNDEZ et al., 2012), que está dentro da faixa de efetividade e seletividade
do BBG nos receptores P2X7 (DONNELLY-ROBERTS; JARVIS, 2007).
Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais (n=16): FO tratados
com salina (i.p.) ou BBG (i.p.); 6-OHDA (18g/3L, intra-estriatal) tratados com salina ou
BBG. Após 14 dias de tratamento, os animais de cada grupo foram divididos em subgrupos de
8 (oito) animais. Os animais do primeiro subgrupo foram submetidos a testes para avaliar o
comportamento rotacional, atividade locomotora, assimetria dos membros anteriores e
memória; os testes realizados foram: apomorfina, campo aberto, cilindro e esquiva passiva,
respectivamente. Os animais do segundo subgrupo foram submetidos aos testes para avaliar o
comportamento rotacional (teste da apomorfina) e atividade locomotora (campo aberto),
sendo submetidos também à versão com pistas do water maze (Cued water maze). Os testes
empregados foram realizados de acordo com o desenho experimental abaixo (Figura 5):
Figura 5 – Desenho experimental mostrando a sequência dos testes comportamentais realizados nos
subgrupos de animais.
Tratamento (14 dias)
Campo aberto
Campo aberto Water maze (dia 1)
Dia 1 Dia 15 Dia 16
Cilindro Esquiva Passiva (MR)
Esquiva Passiva (MT)
Water maze (dia 2)
Water maze (dia 3)
Apomorfina
Water maze (dia 4) Apomorfina
Lesão com 6-OHDA
Dia 17 Dia 18 Dia 19
Sacrificio
Subgrupo 1
Subgrupo 2
39
Após os testes, os animais foram sacrificados por decapitação e os cérebros
dissecados para avaliação do conteúdo de monoaminas e western blots. Para as análises
imunohistoquímicas, os animais foram anestesiados com tiopental sódico (100 mg/kg, i.p.) e
perfundidos com paraformaldeído a 4% em PBS (tampão fosfato 0,1 M contendo salina 0,9
%, pH 7,4). Os cérebros foram removidos, fixados em formol tamponado a 10% por 24 hs e
posteriormente crioprotegidos em sacarose a 30% em PBS a 4º C.
Em uma série adicional de experimentos, outro antagonista dos receptores P2X7, o
A438079, foi testado. O A-438079 (10 µM) ou salina (veículo) foram administrados durante
14 dias, através de minibombas de infusão osmótica (osmotic minipumps - Alzet, 2002)
conectadas à uma cânula intracaniana (Alzet Brain Infusion – Kit II). A cânula foi colocada
através de cirurgia estereotáxica no ventrículo lateral direito usando as seguintes coordenadas
relativas ao bregma: AP +1,5 mm, ML +1,0 mm, DV +3,8 mm, abaixo do plano horizontal do
bregma, após a aplicação intraestriatal da 6-OHDA. Nesses dois grupos adicionais, foram
avaliados o comportamento rotacional e a atividade locomotora.
3.1.5 Testes comportamentais
3.1.5.1 Teste da apomorfina
A gravidade da depleção de dopamina foi avaliada pelo comportamento rotacional
induzido por apomorfina, conforme descrito por Ungerstedt e Arbuthnott (1970). Este é um
teste sensível a lesões estriatais com extensões maiores que 80% (DEUMENS; BLOKLAND;
PRICKAERTS, 2002) (Figura 6).
Após 18 dias da lesão estriatal, os animais receberam uma dose de 0,6 mg/kg de
apomorfina i.p. (dissolvidos em salina) e foram colocados em bacias plásticas por 60 minutos.
O comportamento rotacional foi observado e determinado através da contagem do número de
rotações de 360° ipsilaterais (na direção da lesão) e contralaterais (na direção contrária à
lesão).
40
Figura 6 - Representação da diferença de neurônios dopaminérgicos nigroestratais nos hemisférios
cerebrais após administração unilateral de 6-OHDA no hemisfério direito. No teste da apomorfina, o
animal gira em direção ao lado com menos receptores (contralateral à lesão) decorrente de uma up-
regulation dos receptores dopaminérgicos no lado lesionado. Fonte: adaptado de WIETZIKOSKI, 2006.
3.1.5.2 Teste do Campo Aberto
O teste do campo aberto avalia a atividade locomotora e exploratória dos animais
(WALSH; CUMMINS, 1976). O teste foi realizado 15 dias após a cirurgia, utilizando-se uma
arena quadrada de acrílico preto (50 x 50 cm) com o piso dividido em quatro quadrados iguais
(Figura 7). Os animais foram colocados na arena e deixados para explorar o ambiente por 5
minutos, sendo o ambiente iluminado com luz vermelha. Durante este período, foi registrado
o número de quadrantes atravessados pelo animal (crossings), assim como número de
elevações sobre as patas traseiras sem apoio (rearings), que caracteriza o comportamento
exploratório vertical. Após cada animal ser retirado, a arena foi limpa com uma solução de
álcool a 20% e secada com toalhas de papel, para evitar que o cheiro de urina e fezes
interferissem no teste, este procedimento foi feito após cada teste comportamental.
41
Figura 7 - Arena do teste de campo aberto dividido em quatro quadrantes iguais. Fonte: Arquivo
pessoal.
3.1.5.3 Teste do cilindro
Nesse teste foi avaliada a assimetria dos membros anteriores, que é determinada
durante o comportamento de rearing (exploração vertical) (SCHALLERT; WOODLEE;
FLEMING, 2002). Os animais foram colocados em um cilindro de acrílico (60 cm de altura e
18 cm de diâmetro) e observados durantes 5 minutos (Figura 8). Durante o rearing, o contato
com a parede do cilindro é contado, de acordo com o membro anterior que tocar o cilindro:
contralateral (membro afetado), ipsilateral (membro não afetado) ou ambos
(simultaneamente), sendo os percentuais determinados pelas fórmulas:
-Percentual ipsilateral [(ipsi/Total)x100];
-Percentual contralateral [(contra/Total)x100];
-Percentual de ambas [(Ambas/Total)x100];
Figura 8 - Animal durante o movimento de rearing no teste do cilindro. Fonte: Arquivo pessoal.
42
3.1.5.4 Esquiva passiva
Este teste foi baseado no método de DeNOBLE e colaboradores (1986) e nos
permite avaliar as memórias de curta e longa duração (recente e tardia), assim como a
memória com componente aversivo. O aparelho consiste de uma caixa de acrílico (48 x 22 x
22, Ugo Basille®) dividida em dois compartimentos separados por uma porta, um branco
(iluminado) e um preto (escuro), tendo este o piso eletrificado (Figura 9).
Dezessete dias após a cirurgia, o animal foi deixado para ambientação no aparelho
durante um minuto e depois retirado. Após 30 segundos o animal foi colocado novamente no
compartimento iluminado. Visto que a tendência do animal é passar para o lado escuro da
caixa, quando isso acontece, ele recebe um choque de 1,0 mA, durante 1 s, com o tempo de
latência para entrar sendo registrado, até um máximo de 300 segundos (treino). O animal foi
retirado e após 15 minutos, colocado novamente no compartimento claro sendo registrada a
latência de entrada (memória recente). A retenção do aprendizado foi testada após 24 horas
(memória tardia), mas nessa fase, os animais não levaram choque.
Figura 9 - Animal no aparelho esquiva passiva. Fonte: Ugo Basille®.
43
3.1.5.5 Teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze)
No 15º dia após a cirurgia, um subgrupo de animais foi submetido à versão com
pistas do labirinto aquático de Morris (1984), seguindo as modificações introduzidas por
Packard e McGaugh (1992) para avaliação da aprendizagem relacionada a hábitos.
O labirinto aquático consiste em um tanque circular (180 cm de diâmetro) e
paredes de 60 cm de altura, cheio até 10 cm da borda com água (25oC) acrescida de tinta
branca não tóxica (para deixar a água opaca). O aparelho possui uma plataforma de acrílico
(11 x 14 cm de diâmetro) que fica submersa 2 cm abaixo da superfície da água. Foi colocado
na plataforma de escape, uma bola preta de 7 cm de diâmetro que serviu como pista para o
animal sobre a superfície da água (Figura 10).
O teste consiste em 4 treinos por dia durante 4 dias consecutivos, sendo mudado o
lugar da plataforma em cada treino. Em cada treino do dia, o animal será colocado em um
quadrante diferente da piscina e terá 60 segundos para achar a plataforma submersa. É
anotada a latência para o animal encontrar a plataforma em cada treino, sendo este deixado na
mesma durante 10 segundos e posteriormente retirado do tanque por 30 segundos, antes de
iniciar o treino seguinte na próxima posição. Se o animal não encontrar a plataforma ao final
dos 60 segundos, este será conduzido gentilmente até esta.
Figura 10 - Labirinto aquático com a plataforma sinalizada. Fonte: Arquivo pessoal.
44
3.1.6 Dosagem de DA e DOPAC por HPLC
Para a dosagem dos níveis de dopamina (DA) e ácido diidroxifenilacético
(DOPAC) nos tecidos estriatais e mesencefálicos (n=6/grupo) foi utilizado o equipamento de
HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho) por detecção eletroquímica, como descrito
previamente por Aguiar et al. (2006).
Os tecidos foram homogeneizados a 10% em ácido perclórico (HCLO4), sendo em
seguida centrifugados na temperatura de 4ºC por 15 minutos a 15000 rpm. O sobrenadante foi
separado e filtrado através de uma membrana de 0,2 μm (Millipore). Uma alíquota de 20μl
foi injetada no equipamento de HPLC, sendo utilizada uma coluna CLC-ODS(M) com
comprimento de 25 cm, calibre 4,6 cm e diâmetro da partícula de 5 m (Shimadzu, Japão). A
fase móvel utilizada é composta por tampão ácido crítico 0,163 M, pH 3,0 contendo ácido
octanosulfônico sódico 0,69 M (SOS) como reagente formador do par iônico, acetonitrila 4%
v/v e tetrahidrofurano 1,7%v/v.
A DA e seu metabólito DOPAC foram eletricamente detectados usando um
detector amperométrico (Modelo L-ECD-6A da Shimadzu, Japão) pela oxidação em um
eletrodo de carbono vítreo fixado em 0,85V relativo a um eletrodo de referência de Ag-AgCl.
As concentrações das amostras foram calculadas a partir da área dos picos dos padrões
utilizados, e os resultados expressos em ng/mg de tecido.
3.1.7 Análises imunohistoquímicas
3.1.7.1 Imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (TH)
A tirosina hidroxilase (TH) é uma enzima envolvida na síntese de dopamina e um
marcador molecular de neurônios dopaminérgicos. A análise imunohistoquímica foi realizada
como descrito previamente (ALVES et al., 2008; HINKLE et al., 2012). Os cérebros
armazenados em solução de sacarose a 30% em PBS foram cortados em fatias de 50 μm a -
21ºC, utilizando-se um criostato (Leica CM3050 S, Alemanha). As fatias foram armazenados
free-floating em PBS com azida a 0,01% a 4ºC até análise. A marcação para TH foi realizada
em fatias (50 μm de espessura e espaçamento de 300 μm) representativas do estriado e
substância negra.
45
As fatias foram lavadas três vezes por 5 minutos em PBS, sendo o bloqueio da
peroxidase endógena feito com H2O2 1,05% em metanol 10% em PBS, durante 40 minutos a
temperatura ambiente (TA). Após lavar 3 vezes por 10 minutos em PBS e bloquear as
proteínas endógenas com uma solução bloqueadora (10% de soro normal de cabra e 0,1% de
Triton X-100 em PBS) por 2 horas a TA, as fatias foram incubadas no anticorpo primário
anti-TH diluído na solução bloqueadora (rabbit, 1:1000; Millipore) por 48 horas a 4°C.
As fatias foram então lavadas 3 vezes por 10 minutos em PBS, sendo em seguida
incubadas com um anticorpo secundário biotinilado diluído na solução de bloqueio
(biotinylated goat anti-rabbit IgG, 1:200; Vector labs) por 2 horas a TA, e enxaguados
novamente três vezes com PBS. O método ABC (Vector Labs) foi utilizado por 40 minutos a
TA para a amplificação do sinal, sendo a marcação revelada com 3,3’-diaminobenzidina
(DAB Peroxidase Substrate Kit; Vector labs). A reação foi interrompida, lavando-se as fatias
em PBS antes de realizar a montagem em lâminas gelatinizadas. Após secagem, as fatias
foram desidratadas em gradiente de etanol e clarificadas com xileno, sendo finalmente
cobertas com lamínulas utilizando-se o meio de montagem Eukitt (Fluka-Sigma). Os cortes
foram visualizados no microscópio Zeiss Imager Z2 e a imunorreatividade para TH
mensurada pela análise semi-quantitativa da densidade óptica utilizando-se o software Image
J. Foi feita uma média para os valores obtidos para o grupo controle (FO) e todos os outros
foram calculados como percentagem desse valor.
3.1.7.2 Dupla marcação para GFAP e CD11b
As micróglias são células imunocompetentes do cérebro. Para a verificação da
presença e ativação destas células (microgliose) foi empregado o marcador de micróglia,
CD11b. A avaliação da astrogliose foi feita pela imunomarcação com o anticorpo para GFAP
(Glial fibrillary acidic protein).
As fatias foram lavadas 3 vezes por 10 minutos em PBS a TA e depois bloqueadas
com PBS contendo 5% de soro de cavalo durante 45 minutos. Em seguida, realizou-se a
incubação por 48 horas a 4ºC com anticorpo anti-GFAP (rabbit, 1:1000, Dako Cytomation)
em combinação com anti-rat-CD11b (mouse, 1:200, Serotec) diluídos em PBS com 0,25% de
Triton-X100 + 5% de soro de cavalo. As fatias foram então lavadas 3 vezes por 10 minutos
em PBS com 0,25% de Triton-X100 e subsequentemente incubadas por 2 horas a TA com os
46
anticorpos secundários donkey anti-mouse IgG conjugado com Alexa Fluor 594 e donkey
anti-rabbit IgG conjugado com Alexa Fluor 488 (Molecular Probes), diluídos 1:500 em PBS
com 0,25% de Triton-X100 + 5% de soro de cavalo. Após lavar 3 vezes em PBS por 5
minutos cada, as fatias foram montadas em lâminas gelatinizadas com o meio de montagem
fluorescente Dako (Dako, USA). Os cortes foram visualizados em microscópio confocal
(Laser scanning, LSM 510 META, Zeiss).
A imunorreatividade para CD11b e GFAP foram quantificadas em fatias (50 μm
de espessura e espaçamento de 300 μm) representativas do estriado e substância negra. A
quantificação da Média de Intensidade de Fluorescência (MIF) utilizada para mensurar a
imunorreatividade foi calculada através do programa Image J. Foi feita uma média para os
valores MIF obtidos para o grupo controle (FO) e todos os outros foram calculados como
percentagem desse valor.
3.1.7.3 Imunohistoquímica para iba-1
Visto que após dano cerebral, as células microgliais não são as únicas que
expressam CD11b, que também está presente nos neutrófilos, foi realizada ainda a marcação
para a proteína iba-1, que distingui neutrófilos da micróglia e monócitos, sendo portanto mais
específica para determinação da microgliose (JEONG et al., 2013).
Após 3 lavagens por 10 minutos em PBS a TA e bloqueio com PBS contendo 5%
de soro de cabra durante 45 minutos, as fatias free-floating de estriado foram incubadas com o
anticorpo primário anti-iba-1 (rabbit polyclonal, 1:1000; WAKO, Japão) diluído em solução
de bloqueio (PBS com 0,25% de Triton-X100 + 5% de soro de cabra) a 4ºC por 72 horas. As
fatias foram então lavadas 3 vezes por 10 minutos em PBS com 0,25% de Triton-X100 e
subsequentemente incubadas por 2 horas a TA com o anticorpo secundário goat anti-rabbit
conjugado com Alexa Fluor 594 (1:1000; Invitrogen) diluído em solução de bloqueio. Após
lavar 3 vezes em PBS por 5 minutos cada, as fatias foram montadas em lâminas gelatinizadas
com o meio de montagem fluorescente Dako (Dako, USA). Os cortes foram visualizados em
microscópio confocal (Laser scanning, LSM 510 META, Zeiss).
47
3.1.8 Western Blot para anti-ILlβ
Tecidos estriatais foram homogeneizados em 5 mL de tampão de lise (0,32 M
sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM Hepes, 1% BSA, pH 7,4) usando um pistão de vidro (potter).
Os homogenatos foram centrifugados a 3000 g por 10 minutos, sendo os sobrenadantes
coletados e centrifugados novamente a 25000 g por 1 hora. Os pellets resultantes foram
ressuspendidos em SDS 5% com coquetel inibidor de protease (Sigma), e a concentração de
proteínas determinada pelo método de Lowry.
As amostras foram aquecidas a 95ºC por 5 minutos e as proteínas (30 μg) foram
separadas em SDS-PAGE (gel a 12%), sendo eletricamente transferidas às membranas de
PVDF (Bio-rad). Os blots foram bloqueados com leite desnatado 5% em TBS-T (Tampão
Tris-salina com 0,1% de Tween 20) por 1 hora e incubados overnight a 4ºC com os anticorpos
primário anti-ILlβ (Rabbit, 1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA) e anti-α-tubulina (mouse,
1:4000; Sigma, MO). Após lavagens em TBS-T, as membranas foram incubadas com os
anticorpos secundários goat anti-rabbit e goat anti-mouse (horseradish-peroxidase-
conjugated, 1:3000; Bio-Rad) por 1 hora. As bandas imunorreativas foram reveladas com
DAB e as densidades mensuradas utilizando-se o software Image Studio lite 4.0 (LI-COR,
EUA).
3.1.9 Densidade dos receptores P2X7
A técnica de western blot foi realizada como descrito acima, utilizando os
anticorpos primários anti-P2X7 (rabbit, 1:500, Alomone Labs, Israel) e anti-α-tubulina
(mouse, 1:4000; Sigma, MO). Os secundários utilizados foram goat anti-mouse ou anti-rabbit
conjugados com fosfatase alcalina (1:5000, Santa Cruz Biotechnology). Após as incubações
com os anticorpos, as membranas foram incubadas com ECF (Enhanced Chemi-Fluorescence
substrate, GE Healthcare, UK) por cerca de 2 minutos, sendo finalmente detectadas e
analisadas pelos softwares Molecular Imager VersaDoc 3000 e Quantity One (BioRad,
Portugal), respectivamente.
48
3.2 EXPERIMENTOS IN VITRO
3.2.1 Cultura de células SH-SY5Y e condições de incubação
As células SH-SY5Y (LGC Promochem) foram cultivadas em uma mistura 1:1 de
DMEM:F12 (Meio essencial mínimo modificado por Dulbeco: mistura de nutrientes de Ham
F12, Gibco), com 10% de soro fetal bovino (FBS) e uma mistura de antibióticos e
antimicóticos (Invitrogen), em uma atmosfera a 37ºC com 5% de CO2. O cultivo foi realizado
em garrafas de plástico para cultura (75 cm3, volume de 250 mL) até confluência de 80%,
sendo depois tripsinizadas com 2 mL de tripsina.
A suspensão de células foi contada, sendo a viabilidade avaliada pelo azul de
Tripan, e posteriormente, subcultivadas em placas multi-well de 24 poços em uma
concentração de 1 x 104 células/poço. A diferenciação foi induzida em DMEM:F12 com 1%
de FBS, adicionando-se 10µM de ácido retinóico por 7 dias (LOPES et al., 2010). Após
diferenciação, as células foram tratadas com BBG (100 ou 500 nM) por 30 minutos antes da
exposição 6-OHDA 30 µM durante 24 horas. A 6-OHDA foi diluída, minutos antes da
incubação, em solução salina com 0,1% de ácido ascórbico para evitar oxidação.
3.2.1.1 Ensaios de viabilidade celular
3.2.1.1 1 Teste do MTT
Para avaliar a citotoxicidade foi realizado o ensaio do MTT (MOSMANN, 1983)
que se baseia na capacidade da succinato desidrogenase, uma enzima do ciclo de Krebs ativa
em mitocôndrias viáveis, em converter o sal tetrazolium (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-
il)-2,5-difeniltetrazólio, ou MTT) em cristais de formazan de cor púrpura. Ao final da
exposição a drogas, as células foram incubadas com 70 µL da solução de MTT (5 mg/mL em
PBS, preparada minutos antes) e colocadas novamente na estufa por 3 horas para permitir a
redução do MTT. Após incubação, os cristais de formazan foram dissolvidos em 700 µL de
isopropanol durante 30 minutos sob agitação, sendo a solução púrpura resultante medida em
espectrofotômetro a 540 nm.
49
3.2.1.1 2 Liberação de LDH
O dano celular foi adicionalmente avaliado pela mensuração da quantidade da
lactato desidrogenase citoplasmática (LDH) liberada no meio.
Após o período de incubação com as drogas, 20 µL do sobrenadante foi recolhido
para a mensuração da quantidade de LDH, sendo 80 μL armazenados para a dosagem de ATP.
O restante do sobrenadante foi descartado e a placa utilizada para o preparo do lisado celular.
Foi adicionado a cada poço 100 μL do tampão RIPA (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM
NaCl, 1% de NP-40, 1% deoxicolato de sódio, 0,1% de SDS) e a placa foi deixada a -20ºC até
congelamento. Após esse período, as células foram raspadas e coletadas para a mensuração da
atividade da LDH no lisado.
A análise enzimática foi realizada de acordo com as instruções do kit (Kit
Hospitex Diagnosis), baseada na redução de NAD+ pela ação da LDH. A porcentagem de
LDH citoplasmática liberada foi calculada dividindo-se o resultado da mensuração de LDH
no sobrenadante sobre o LDH total (sobrenadante + lisado celular).
3.2.1.2 Mensuração do ATP
A concentração extracelular de ATP foi analisada através do método de
bioluminescência utilizando o complexo luciferina-luciferase, que permite a determinação dos
níveis de ATP na faixa de 2x10-12 a 8x10-5 M. A oxidação enzimática da luciferina pela
luciferase é ATP-dependente e leva a emissão de luz a 565 , que é proporcional aos níveis de
ATP, mensurada pelo leitor de placa VICTOR multilabel (PerkinElmerTM ).
Após o período de incubação, o meio foi coletado (de acordo com item anterior) e
mantido a -80ºC até a realização das dosagens. Um volume de 80 L de meio foi adicionado a
40 L do reagente do kit para dosagem de ATP (Sigma) e depois colocados em uma placa de
96 poços, que foi mantida dentro do luminômetro a temperatura ambiente antes de se iniciar a
mensuração da luminescência (5s de tempo de aquisição). Os níveis de ATP foram
determinados por extrapolação de uma curva padrão obtida mensurando-se a luminescência
de soluções com diferentes concentrações de ATP padrão contido no kit.
50
3.2.1.3 Co-localização P2X7/TH
Para imunocitoquímica, as células foram fixadas em paraformaldeído 4% em PBS
a TA por 20 minutos, lavadas 3 vezes em PBS e bloqueadas por 40 minutos com PBS
contendo 1% de BSA (bovine serum albumin) e 0,1% Triton X-100. As células foram então
incubadas com anticorpo anti-P2X7 (rabbit, 1:500, Alomone) e anti-TH (mouse, 1:1000,
Sigma) diluídos em solução de bloqueio a TA por uma hora, lavadas 3 vezes e depois
incubadas por 40 minutos com os anticorpos secundários, anti-rabbit conjugado com
AlexaFluor-594 e anti-mouse conjugado com AlexaFluor-488 (1:500, Molecular Probes), em
PBS contendo 0,5% de BSA. Após serem lavadas 3 vezes em PBS, os núcleos foram
marcados com DAPI por 10 minutos. As lâminas foram visualizadas no microscópio confocal
(LSM 510 META, Zeiss).
3.2.2 Preparação dos sinaptossomas estriatais
Os sinaptossomas foram preparados do estriado, a partir de uma série de
centrifugações em Sacarose/Percoll como descrito anteriormente (REBOLA et al., 2005;
CANAS et al., 2009). Os estriados do animal foram homogeneizados a 4ºC em solução de
sacarose (0,32 M) contendo 1 mM de EDTA, 10 mM de HEPES, 1 mg/mL de BSA e 1 mM
de DTT, pH 7,6, centrifugados a 3000 g por 10 minutos a 4ºC. Os sobrenadantes foram
coletados e centrifugados a 14000 g por 12 minutos a 4ºC, sendo os pelles resultantes
ressuspendidos em 1 mL de solução de Percoll 45% (v/v) em tampão Kreb (140 mM NaCl, 5
mM KCl, 25 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glucose, pH 7,4). Após centrifugação a
14000 g por 2 minutos a 4ºC, a camada superior (fração sinaptossomal) foi removida e
ressuspendida em 1 mL de tampão Kreb, sendo centrifugada novamente por 2 minutos e o
pellet ressuspendido em tampão Locke (154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl2, 1 mM
MgCl2, 3,6 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 5 mM Glucose, 10 mM glucose, pH 7,4). A
determinação de proteínas foi feita através do método BCA.
51
3.2.2.1 Co-localização para P2X7/TH e P2X7/DAT
Os sinaptossomas, com menos de 2% de contaminações gliais, foram plaqueados
e fixados para os experimentos de dupla-marcação (RODRIGUES et al., 2005) com o
objetivo de definir co-localização dos receptores P2X7 com TH ou DAT.
Os receptores P2X7 foram marcados com anticorpo anti-P2X7 (rabbit, 1:500,
Alomone Labs) que foi incubado com anti-TH (mouse, 1:1000, Sigma) ou anti-DAT (mouse,
1:500, Millipore) por 1 hora a temperatura ambiente, seguido de incubação com os anticorpos
secundários, donkey anti-rabbit conjugado com AlexaFluor-594 e donkey anti-mouse
conjugado com AlexaFluor-488 (1:500, Molecular Probes). As preparações foram examinadas
no microscópio de fluorescência Zeiss Imager Z2 e analisadas com o software ImageJ 1,37v
(NIH, Bethesda, MD). Cada lâmina foi analisada pela contagem de três diferentes campos e
cada campo pela contagem de 500 elementos individualizados (RODRIGUES et al., 2005).
3.2.2.2 Teste do Alamar Blue
O Alamar blue é um corante fluorescente sensível à oxidação-redução, que pode
ser usado como um indicador da função mitocondrial em preparações de tecidos do sistema
nervoso central (SPRINGER; AZBILL; CARLSON, 1998).
Para o ensaio, os sinaptossomas foram colocados em placas de 96 poços (50
μg/poço) e incubados a 37ºC com 100 nM de BBG ou veículo e 15 minutos depois foram
adicionados 30 µM de 6-OHDA ou veículo por 2 horas. Posteriormente, 90 μL de
sinaptossomas em tampão Locke foram coletados e misturados com Alamar Blue (10%
volume final do poço) (Sigma). A mistura foi incubada a 37ºC por 100 minutos e depois
centrifugadas a 2200 g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido para outra placa e esta foi
lida a 570 nm. Os valores foram expressos em percentagem da densidade óptica dos
sinaptossomas controles (sem adição de drogas).
52
3.3 Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas pelo Software GraphPad Prism 6.01
(GraphPad Software, Inc.) e todos os dados expressos como média ± EPM (erro padrão
médio). Inicialmente, foi realizado o teste de normalidade D’Agostino e Pearson para
verificar se dados apresentam distribuição normal, sendo determinado o uso de testes
paramétricos para a avaliação estatística dos resultados.
Para os testes de comportamento, utilizou-se a Análise de Variância (ANOVA) de
duas vias, seguida pelo teste de Tukey. Para os testes da esquiva passiva e treino do labirinto
aquático também foram realizados o teste ANOVA de medidas repetidas e, para comparações
dentro dos grupos, o teste de Tukey.
Na avaliação dos demais resultados foi utilizada ANOVA seguida pelo teste de
Bonferroni como teste post-hoc. Para análise dos níveis de ATP no sobrenadante das células
SH-SY5Y foi utilizado o teste t de Student. Em todos os testes o critério de significância
utilizado foi p<0,05.
53
4 RESULTADOS
4.1 EXPERIMENTOS IN VIVO
4.1.1 Efeitos do BBG e do A-438079 no comportamento rotacional induzido por
apomorfina de ratos parkinsonianos
A severidade da lesão dopaminérgica foi analisada através do comportamento
rotacional no teste da apomorfina. Os resultados demonstraram que os animais submetidos à
lesão com 6-OHDA apresentaram número de rotações contralaterais significativamente
maiores que os animais falso-operados (FO: 3,4 ± 1,3; 6-OHDA: 237,0 ± 27,6, p < 0,05).
Esse efeito foi atenuado em torno de 50% pelo tratamento com Brilliant Blue G (BBG, 45
mg/kg) (6-OHDA + BBG: 137,4 ± 27,4, p < 0.05), que não apresentou, entretanto, efeito nos
animais falso-operados (FO + BBG: 1,4 ± 0,7) (Figura 11A).
Um outro antagonista dos receptores P2X7, A-438079 (10 µM), administrado
diretamente no ventrículo lateral direito através de minibombas de infusão, também reduziu
de forma significativa o aumento do número de rotações contralaterais induzidas pelas
injeções de 6-OHDA (FO: 3,9 ± 2,8; 6-OHDA: 275,6 ± 56,7; 6-OHDA + A-438079: 134,7 ±
29,7, p < 0,05) (Figura 11B).
.
54
Figura 11 - O bloqueio dos receptores P2X7 atenua o comportamento rotacional assimétrico dos
animais parkinsonianos no teste da apormorfina (n=8). Os animais foram tratados com BBG (45
mg/kg, i.p) (A) ou A-438079 (10 µM i.c.v.) (B) durante 14 dias, sendo o número de rotações
contralaterais induzidas por apomorfina (0,6 mg/kg i.p.) contados por 60 minutos, 18 dias após a lesão
com 6-OHDA. Os valores estão representados como média EPM. *p < 0,05 vs. FO, ##p < 0,05 vs. 6-
OHDA. ANOVA de duas vias e Teste de Tukey.
A
B
55
4.1.2 Efeitos do BBG e do A-438079 sobre a atividade locomotora (Teste do Campo
aberto) em ratos parkinsonianos
Os resultados obtidos no teste de campo aberto demonstraram que a atividade
exploratória do animal não foi afetada pela lesão com 6-OHDA ou pelo tratamento com BBG
(Figura 12A), visto não haver diferenças estatísticas significativas entres os grupos em relação
ao número de crossings (FO: 20,6 ± 2,2; FO + BBG: 14,5 ± 0,9; 6-OHDA: 17,0 ± 2,2; 6-
OHDA + BBG: 15,3 ± 2,9) e de rearings (FO: 7,9 ± 1,5; FO + BBG: 4,6 ± 1,3; 6-OHDA: 5,5
± 1,9; 6-OHDA + BBG: 5,6 ± 1,8).
No entanto, observou-se uma pequena redução do número de rearings, que mede
a atividade exploratória vertical, no grupo submetido às injeções com 6-OHDA e
administrados com salina (i.c.v.) através de minibombas de infusão osmóticas (6-OHDA: 3,8
± 0,9, p<0,05) em relação aos controles, animais falso-operados que receberam salina i.c.v.
(FO: 8,1 ± 1,0). O tratamento com o A-438079 (i.c.v.) através das minibombas não foi capaz
de reverter essse efeito (6-OHDA + A-438079: 5,1 ± 0,8) (Figura 12B).
4.1.3 Efeitos do BBG sobre a assimetria dos membros anteriores (Teste do Cilindro) em
ratos parkinsonianos
No teste do cilindro, foi observada uma maior atividade da pata anterior do lado
ipisilateral, e uma menor atividade do lado contralateral à lesão com 6-OHDA, demonstrando
um déficit motor nos animais parkinsonianos (% ipsilateral: FO: 13,9 ± 4,2; 6-OHDA: 57,6 ±
8,8; % contralateral: FO: 21,7 ± 4,9; 6-OHDA: 4,4 ± 2,4 e % ambas as patas: FO: 64,4 ± 4,7;
6-OHDA: 37,9 ± 7,9).
Entretanto, não houve melhora dessa assimetria dos membros anteriores nos
animais tratados BBG em relação aos animais submetidos à lesão pela 6-OHDA (%
ipsilateral: 6-OHDA + BBG: 51,7 ± 12,6; % contralateral: 6-OHDA + BBG: 4,8 ± 3,7 e %
ambas as patas: 6-OHDA + BBG: 43,4 ± 10,3) (Figura 13).
56
Figura 12 - O bloqueio dos receptores P2X7 não afeta a atividade locomotora espontânea avaliada
pelo teste do campo aberto (n=8). Os animais foram tratados com BBG (45 mg/kg, i.p) (A) ou A-
438079 (10 µM i.c.v.) (B) durante 14 dias, sendo o número de crossings e rearings contados durante 5
minutos, 15 dias após a injeção intra-estriatal com 6-OHDA. Os valores estão representados como
média EPM. *p < 0,05 vs. FO, ANOVA de duas vias e Teste de Tukey.
Figura 10 - O bloqueio dos receptors P2X7 atenua o comportamento rotacional
assimétrico dos animais parkinsonianos no teste da apormorfina (n=8). (A) O
antagonista P2X7, Brilliant Blue G, (BBG, 45 mg/kg, i.p) dimimui o número de
rotações contralaterais induzidos por apomorfina (0,6 mg/kg i.p.) nos animais
parkinsonianos, contados por 60 minutos, 18 dias após a lesão com 6-OHDA. (B) O
antagonista seletivo A-438079 (10 mM i.c.v.) também dimimui o número de rotações
contralaterais avaliados 18 dias após a lesão intra-estriatal com 6-OHDA. Os valores
estão representados como média EPM. *p < 0,05 vs. FO, ##p < 0,05 vs. 6-OHDA.
ANOVA de duas vias e Teste de Tukey.
A
B
57
Figura 13 – O antagonista do receptor P2X7, Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.), não diminui a
assimetria dos membros anteriores dos animais parkinsonianos, avaliada no teste do cilindro (n=8). O
teste foi realizado 16 dias após injeção intra-estriatal com 6-OHDA. As percentagens foram
calculadas como número de toques com as patas dos lados ipsilateral, contralateral ou ambas as patas,
sobre o total de toques realizados durante o teste. Os valores estão representados como média EPM.
* vs. FO (ipsilateral); # vs. FO (contralateral); ## vs. FO (ambas), p<0,05, ANOVA de duas vias e
Teste de Tukey.
58
4.1.4 Efeitos do BBG sobre a memória aversiva (Teste da Esquiva Passiva) de ratos
parkinsonianos
Na avaliação da memória aversiva através do teste da esquiva passiva, os animais
submetidos às injeções de 6-OHDA apresentaram déficits na aquisição e retenção da memória
(memória recente: 100,8 ± 34,9 s; memória tardia: 120,8 ± 32,8 s) quando comparados aos
animais do grupo falso-operado (memória recente: 299,0 ± 0,0 s; memória tardia: 219,3 ±
32,6 s; p < 0,05) (Figura 14). Através da comparação dentro de cada grupo, foi observado que
os animais controles apresentam melhor desempenho, em relação à memória recente e tardia,
quando comparadas com o treino.
O desempenho dos animais do grupo 6-OHDA tratados com BBG não foi
estatisticamente diferente dos animais do grupo 6-OHDA (memória recente: 217,7 ± 54,0;
memória tardia: 157,3 ± 63,8 s). No entanto, as latências dos animais tratados com BBG
também não foram significativamente diferentes dos ratos falso-operados quando a memória
recente foi avaliada.
4.1.5 Efeitos do BBG sobre a aprendizagem relacionada a hábitos de ratos
parkinsonianos no teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada
A administração de 6-OHDA causou uma diminuição do desempenho dos animais
no teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada em relação aos animais do grupo
falso-operado, visto que as latências dos ratos para escapar da plataforma apresentaram
diferenças estatísticas em todos os dias de treino quando comparados com os controles.
As latências durante os dias de treino dos animais tratados com BBG, não foram
significativamente diferentes dos animais 6-OHDA, apesar de também não serem
estatisticamente diferentes dos animais controles (Figura 15).
59
Figura 14 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) atenua o déficit na memória aversiva dos
animais parkinsonianos (n=8). O teste foi realizado 17 dias após a injeção intra-estriatal de 6-OHDA,
sendo medido o tempo de latência para o animal entrar no lado escuro do aparelho durante sessões de
300 s, realizadas 15 min (memória recente) e 24 hs (memória tardia) após o treino. Os valores estão
representados como média EPM. * p<0.05 vs. FO (memória recente), # p<0.05 vs. FO (memória
tardia), ANOVA de duas vias e Teste de Tukey.
60
Figura 15 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) atenua a diminuição da performance dos
animais parkinsonianos submetidos a uma versão com plataforma sinalizada do labirinto aquático
(n=8). O teste teve início 15 dias após a injeção intra-estriatal de 6-OHDA, sendo o tempo de latência
para o animal escapar da plataforma submersa medido durante 4 dias de treinos, com 4 treinos
consecutivos por dia. Os valores estão representados como média EPM. *p < 0,05 vs. FO, Testes
ANOVA e Tukey.
61
4.1.6 Efeitos do BBG sobre os níveis de monoaminas de ratos parkinsonianos
Os resultados obtidos demonstraram que a 6-OHDA causou uma diminuição de
cerca de 96% no conteúdo de dopamina (DA) no estriado ipsilateral à lesão e no mesencéfalo,
quando comparados ao grupo falso-operado. Um resultado similar foi observado em relação
aos níveis do metabólito DOPAC, que teve o conteúdo diminuído em torno de 88% no
estriado direito e mesencéfalo em relação aos controles. O tratamento com BBG protegeu
significativamente a diminuição do conteúdo de DA e DOPAC no estriado e mesencéfalo,
como pode ser observado na tabela 1.
Tabela 1 - Efeitos do antagonista do receptor P2X7, Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg), sobre a
diminuição dos níveis de dopamina e DOPAC (ng/mg tecido) no estriado direito e mesencéfalo de
ratos parkinsonianos (n=6).
ES
TR
IAD
O
Grupos FO FO + BBG 6-OHDA 6-OHDA + BBG
DA 1332,0 ± 349,3
1294,0 ± 311,9
44,9 ± 21,7* 2214,0 ± 349,3##
DOPAC 471,4 ± 99,9 464,6 ± 92,6 56,2 ± 16,8* 391,7 ± 58,4##
ME
SE
NC
ÉF
AL
O Grupos FO FO + BBG 6-OHDA 6-OHDA + BBG
DA 298,5 ±142,8
129,3 ± 67,2
14,2 ± 4,1* 286,9 ± 94,4##
DOPAC 53,0 ± 34,6
45,2 ± 29,5
6,5 ± 3,0* 125,8 ± 31,8##
Os valores estão representados como média EPM. *p<0,05 vs. FO, ##p<0,05 vs. 6-OHDA. ANOVA
de uma via e teste de Tukey.
62
4.1.7 Efeitos do BBG sobre a imunorreatividade para TH de ratos parkinsonianos
Como pode ser observado na figura 16A, os animais submetidos à lesão com 6-OHDA
apresentaram uma diminuição bastante significativa da área marcada para tirosina hidroxilase
(TH) no estriado ipsilateral quando comparada a dos animais falso-operados (controles) (% da
média dos controles: 6-OHDA: 54,6 ± 0,4%, p< 0,05). Um resultado similar foi observado na
substância negra (% da média dos controles: 6-OHDA: 46,2 ± 1,8%, p < 0,05) (Figura 17A).
O tratamento com BBG protegeu contra a diminuição da imunorreatividade para TH
no estriado causada pela 6-OHDA (% da média dos controles: 6-OHDA: 71,7 ± 6,7, p < 0,05)
(Figura 16B). Na SN, a imunorreatividade para TH foi cerca de 11% maior nos animais
parkinsonianos tratados com BBG (% da média dos controles: 6-OHDA + BBG: 51,2 ± 8,4)
quando comparada aos animais do grupo 6-OHDA, entretanto, a diferença observada não foi
estatisticamente significante (Figura 17B).
O estriado contralateral não foi afetado pela administração de 6-OHDA, visto não ter
sido observado diferenças significativas entre os animais controles e tratados. Já na SN
contralateral, observou-se uma diminuição da imunomarcação para TH no grupo 6-OHDA,
assim como a redução desse efeito nos animais tratados com BBG (Figura 17B).
63
Figura 16 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) diminui a perda do marcador dopaminérgico
tirosina hidroxilase (TH) no estriado de ratos submetidos à lesão com 6-OHDA (n=4-5). (A)
Microfotografias representativas da imunomarcação para TH em seções cerebrais coronais (50 µM)
contendo estriado ipsilateral (aumento 10x); (B) Gráfico em barras mostrando a análise semi-
quantitativa da imunorreatividade para TH no estriado. Os valores estão representados como média
EPM. *p<0,05 vs. FO, ##p<0,05 vs. 6-OHDA. ANOVA de uma via e teste de Bonferroni.
B
A
64
Figura 17 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) atenua a perda do marcador dopaminérgico
tirosina hidroxilase (TH) na substância negra de ratos submetidos à lesão com 6-OHDA (n=4-5). (A)
Microfotografias representativas da imunomarcação para TH em seções cerebrais coronais (50 µM)
contendo SN ipsilateral (aumento 50x); (B) Gráfico em barras mostrando a análise semi-quantitativa
da imunorreatividade para TH na SN. Os valores estão representados como média EPM. *p<0,05 vs.
FO, ##p<0,05 vs. 6-OHDA. ANOVA de uma via e teste de Bonferroni.
A
B
65
4.1.8 Efeitos do BBG sobre a microgliose e astrogliose em ratos parkinsonianos
Os resultados demonstraram que os animais submetidos à lesão com 6-OHDA
apresentaram um aumento na densidade de astrócitos marcados para GFAP (% da média dos
controles: 1.726 ± 150, p<0,05) e de células microgliais marcadas com CD11b (% do
controle: 1.310 ± 166, p<0,05) no estriado ipsilateral, quando comparados aos animais falso-
operados. O tratamento com BBG diminuiu de forma significativa os aumentos da
imunorreatividade para GFAP e CD11b induzidos pela 6-OHDA (Figura 18).
O BBG reduziu ainda a microgliose avaliada pela imunomarcação com iba-1 no
estriado. As fotos menores inseridas no painel A da figura 18 demonstram que a
administração de 6-OHDA causou uma marcação mais intensa dos elementos, que
apresentaram-se com menos prolongamentos, sendo estes também mais espessos, os quais são
características da ativação microglial. Esse perfil não foi observado após o tratamento com
BBG.
Na substância negra, o tratamento com BBG não foi capaz de diminuir a astrogliose e
a microgliose causadas pela lesão com 6-OHDA (Figura 19).
66
Figura 18 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) diminui a astrogliose e microgliose no estriado
de ratos submetidos à lesão com 6-OHDA (n=4-5). (A) Microfotografias demonstrando a dupla-
marcação imunohistoquímica para o marcador de astrócitos GFAP (verde) e o marcador microglial
CD11b (vermelho) em seções cerebrais coronais (50 µM) contendo estriado ipsilateral (aumento
200x). As fotos inseridas nas figura A representam a imunomarcação para iba-1 em cada uma das
condições experimentais. (B, C) Gráfico em barras mostrando a análise semi-quantitativa da
imunorreatividade para GFAP (B) ou CD11b (C) no estriado. Os valores estão representados como
média EPM. *p<0,05 vs. FO, ##p<0,05 vs. 6-OHDA. ANOVA de uma via e teste de Bonferroni.
B C
A
67
Figura 19 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) não diminui a astrogliose e microgliose na
substância negra de ratos submetidos à lesão com 6-OHDA (n=4-5). (A) Microfotografias
demonstrando a dupla-marcação imunohistoquímica para o marcador de astrócitos GFAP (verde) e o
marcador microglial CD11b (vermelho) em seções cerebrais coronais (50 µM) contendo SN ipsilateral
(aumento 200x). (B, C) Gráfico em barras mostrando a análise semi-quantitativa da imunorreatividade
para GFAP (B) ou CD11b (C) na SN. Os valores estão representados como média EPM. ANOVA de
uma via e teste de Bonferroni.
A
B C
68
α-tub
IL-1β
4.1.9 Efeitos do BBG sobre os níveis de IL-1β de ratos parkinsonianos
A análises por Western blot demonstrou que os níveis de IL-1β aumentam após a
injeção de 6-OHDA no estriado, e que o tratamento com BBG reduz esses níveis (Figura 20),
apesar das diferenças observadas não serem estatisticamente significantes (FO: 91,7 ± 7,8; 6-
OHDA: 109,6 ± 11,1; 6-OHDA + BBG: 83,8 ± 10,2).
Figura 20 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) não altera os níveis de IL-1β de forma
significativa no estriado de ratos submetidos à lesão com 6-OHDA. Análise densiométrica (gráfico em
barras) e bandas reativas (em sequência: FO, 6-OHDA e 6-OHDA + BBG, n=3). A α-tubulina foi
utilizada para normalização do sinal da IL-1β. Os valores estão representados como média EPM.
ANOVA de uma via e teste de Bonferroni.
69
4.1.10 Efeitos da 6-OHDA e do BBG sobre a densidade dos receptores P2X7
Os resultados demonstraram um aumento da densidade dos receptores P2X7 no
estriado de ratos submetidos ao modelo de parkinsonismo pela administração de 6-OHDA,
apesar dos valores observados não serem estatisticamente diferentes dos controles. O
tratamento com BBG, entretanto, aumentou de forma significativa a expressão dos receptores
quando comparadas ao animais parkinsonianos e controles (Figura 21).
Figura 21 – O Brilliant Blue G (BBG, 45 mg/kg, i.p.) aumenta a expressão dos receptores P2X7 no
estriado de ratos. Análise densiométrica (gráfico em barras) e bandas reativas (em sequência: FO, 6-
OHDA e 6-OHDA + BBG, n=3). A α-tubulina foi utilizada para normalização do sinal de P2X7. Os
valores estão representados como média EPM. *p<0,05 vs. FO, ##p<0,05 vs. 6-OHDA. ANOVA de
uma via e teste de Bonferroni.
70
4.2 EXPERIMENTOS IN VITRO
4.2.1 Efeito da 6-OHDA sobre os níveis de ATP no sobrenadante das células SH-SY5Y
diferenciadas
Com o objetivo de analisar se efeitos tóxicos da 6-OHDA está relacionado, dentre
outros fatores, com os níveis de ATP, foi realizada a quantificação do ATP no meio das células
SH-SY5Y. Os resultados demonstraram um aumento significativo dos níveis de ATP no meio
das células expostas à 6-OHDA quando comparadas as células expostas somente ao veículo
(Controle: 1,64 ± 0,67; 6-OHDA: 6,65 ± 0,59 nM, p<0,05) (Figura 22).
.
Figura 22 - A exposição à 6-OHDA aumenta os níveis de ATP no meio das células SH-SY5Y (n=6).
Após diferenciação com ácido retinóico (10 µM por 7 dias), as células foram expostas à 6-OHDA 30
µM ou veículo (salina com ácido áscórbico 0,1%) durante 24 hs. Os resultados estão expressos em
média ± EPM (n=6). *p<0,05 vs. controle. Teste t de Student.
71
4.2.2 Expressão dos receptores P2X7 nas células SH-SY5Y diferenciadas
A diferenciação com ácido retinóico (10 µM por 7 dias) induziu um crescimento
extensivo de neuritos nas células SH-SY5Y, sendo observado ainda, que as mesmas passaram a
apresentar um fenótipo dopaminérgico (identificadas como imunopositivas para TH, figura
23A). Foi identificado também que as células SH-SY5Y expressam receptores P2X7 (Figura
23B), que foram demonstrados estar co-localizados em 42,5 ± 4,4% das células marcadas para
TH (Figura 23C).
Figura 23 - Microfotografias (aumento 400x) mostrando que as células SH-SY5Y marcadas para tirosina
hidroxilase (TH) (A) estão também marcadas com P2X7 (B), como pode ser visualizado na sobreposição
das imagens (co-localização) (C). Imunorreatividade para TH em verde fluorescente e para P2X7 em
vermelho fluorescente. A co-localização pode ser observada em amarelo. Não foi observada marcação
fluorescente quando os anticorpos primários foram omitidos do ensaio (não mostrado).
72
4.2.3 Efeito do BBG sobre a citotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células SH-SY5Y
4.2.3.1 Teste do MTT
A exposição das células SH-SY5Y à 6-OHDA (30 µM) por 24 horas diminuiu a
viabilidade celular, mensurada pelo ensaio do MTT, para 67,8 ± 5,3 % (p<0,05) em relação ao
controle (Figura 24).
O pré-tratamento com BBG na concentração de 100 nM apresentou um melhor
efeito em relação a diminuição da toxicidade causada pela 6-OHDA, sem entretanto, afetar
significativamente a viabilidade, provavelmente devido ao fato do BBG per se já alterar a
função das células. Já a concentração de BBG 500 nM apresentou diminuição significativa da
viabilidade em relação ao controle, sendo portanto, descartada para realização de outros
experimentos.
4.2.3.2 Quantificação da liberação de LDH
A quantidade de lactato desidrogenase (LDH) liberada no meio das células SH-
SY5Y também foi utilizada como indicador de dano celular.
Os resultados demonstraram que a 6-OHDA (30 µM) por 24 horas aumentou de
forma significativa a concentração de LDH (% do controle: 262,7 ± 26,8, p< 0,05). O BBG
(100 nM) preveniu o dano celular, diminuindo a quantidade de LDH liberada no meio (% do
controle: 182,3 ± 17,4, p< 0,05) (Figura 25).
73
Figura 24 – BBG não protegeu contra a citotoxicidade causada pela exposição à 6-OHDA nas células
SH-SY5Y, avaliada pela redução do MTT. Após diferenciação com ácido retinóico (10 µM por 7
dias), as células foram tratadas com BBG (100 ou 500 nM) por 30 min antes da exposição 6-OHDA
30 µM durante 24 hs. Os resultados estão expressos em média ± EPM. *p<0,05 vs. CTR (Controle).
ANOVA de uma via e teste de Bonferroni.
74
Figura 25 – BBG 100 nM diminuiu a citotoxicidade causada pela exposição à 6-OHDA nas células
SH-SY5Y, analisada pela liberação da LDH citoplasmática (valores expressos como percentagem do
controle, como indicado pela linha tracejada). Após diferenciação com ácido retinóico (10 µM por 7
dias), as células foram tratadas com BBG 100 nM por 30 min antes da exposição 6-OHDA 30 µM
durante 24 hs. Os resultados estão expressos em média ± EPM. *p<0,05 vs. controle. ## p<0,05 vs. 6-
OHDA. ANOVA de uma via e teste de Bonferroni.
75
4.2.4 Expressão dos receptores P2X7 nos sinaptossomas estriatais
Foi demonstrado a presença dos receptores P2X7 nos terminais nervosos
dopaminérgicos do estriado, assim como a co-localização deste receptor com dois marcadores
dopaminérgicos, tirosina hidroxilase (TH) e transportador de dopamina (DAT). A
imunorreatividade para receptores P2X7 foi identificada em 6,4 ± 1,3 dos terminais nervosos
estriatais marcados para TH (Figura 26A) e em 5,3 ± 1,9% dos marcados para DAT (Figura
26B).
Figura 26 - Microfotografias (aumento 400x) mostrando a co-localização dos receptores P2X7 (em
vermelho) e dos marcadores dopaminérgicos (em verde) TH em (A) ou DAT em (B) em
sinaptossomas estriatais, como indicado pelas setas (n=4). Não foi observada marcação fluorescente
quando os anticorpos primários foram omitidos do ensaio (não mostrado).
76
4.2.5 Efeito do BBG sobre a diminuição da viabilidade metabólica induzida pela 6-
OHDA em sinaptossomas estriatais
A exposição dos terminais nervosos estriatais de ratos à 30 µM de 6-OHDA levou
a uma diminuição de 6,7 ± 0,8% (n=4; p< 0,05) na viabilidade metabólica avaliada pela
redução do Alamar Blue (Figura 27), sendo esse efeito prevenido pelo pré-tratamento com
100 nM de BBG.
Figura 27 - BBG 100 nM diminuiu a perda da viabilidade metabólica mitocondrial dos sinaptossomas
estriatais expostos à 6-OHDA, verificada pela redução do Alamar Blue (valores expressos como
percentagem do controle). Os sinaptossomas foram tratados com BBG, 15 min antes da exposição à 6-
OHDA 30 µM, durante 2 hs. Os resultados estão expressos em média ± EPM (n=4). *p<0,05 vs.
controle, ## p<0,05 vs. 6-OHDA. ANOVA de uma via e teste de Bonferroni.
77
5 DISCUSSÃO
A doença de Parkinson é caracterizada por uma degeneração progressiva dos
neurônios da substância negra (SN) e uma concomitante diminuição do conteúdo de
dopamina no estriado, que pode ser mimetizada pela injeção intra-estriatal de 6-OHDA. Os
sintomas e a neurodegeneração característicos dessa doença neurodegenerativa são precedidos
pela perda de terminais nervosos estriatais, que evolui para a morte de neurônios
dopaminérgicos nigrais (SCOTCHER et al., 1991; FORNO et al., 1994; DAY et al., 2006).
Essa evolução da sinaptotoxicidade à neurotoxicidade é acompanhada por uma
função anormal das células gliais, tipicamente astrogliose e microgliose, que podem ser
observadas tanto no estriado quanto na substância negra (TEISMANN; SCHULZ, 2004;
HALLIDAY; STEVENS, 2011). Assim, estratégias que objetivam preservar a viabilidade dos
terminais nervosos, atenuar a gliose ou prevenir a morte neuronal, podem ter a capacidade de
bloquear o aparecimento ou diminuir a gravidade dos sintomas motores característicos da
doença (MEISSNER et al., 2011). Entretanto, devido à natureza multifatorial da DP, as
terapêuticas disponíveis têm uma eficácia limitada, sendo necessário portanto, a descoberta de
novas drogas que atuem sobre as diferentes características da doença.
Sobre condições patológicas, altas concentrações de nucleotídeos purínicos são
liberadas das células danificadas, astrócitos ativados, micróglia e células endoteliais no espaço
extracelular (JAMES; BUTT, 2002; MELANI et al., 2005; FRANKE; KRÜGEL; ILLES,
2006). Devido a sua elevada concentração intracelular e ampla presença em todos os tipos de
células, a liberação de ATP no meio extracelular funciona como um sinal deletério, resultante
principalmente da ativação de receptores P2X7, que têm a capacidade particular de formar
poros citotóxicos, ocasionando morte celular (VOLONTÉ et al., 2012; PUCHAŁOWICZ et
al., 2014). Essa função dos receptores P2X7 tem sido documentada em diversas situações de
dano neuronal.
A possível função do ATP na etiopatologia da DP é baseada em uma série de
observações, como a capacidade dos receptores P2 em controlar a liberação de dopamina
(TRENDELENBURG; BÜLTMANN, 2000; KRÜGEL et al., 2003), assim como a
capacidade de controlar o dano estriatal (RYU et al., 2002). Além disso, a expressão dos
receptores P2X7 nas áreas cerebrais dopaminérgicas afetadas pela DP (AMADIO et al., 2007;
78
YU et al., 2008; ABLE et al., 2011); 3) e o controle do dano de células dopaminérgicas pelos
receptores P2X7 (JUN et al., 2007; ORELLANO et al., 2010) demonstram que esse subtipo de
receptor P2 tem um importante envolvimento na doença. Contudo, os poucos estudos que
analisaram o potencial terapêutico dos antagonistas P2X7 em modelos de DP, fizeram
somente uma correlação morfológica ou neuroquímica (MARCELLINO et al., 2010;
HRACSKÓ et al., 2011), falhando em analisar simultaneamente as diferentes causas da DP,
como por exemplo, a habilidade desses antagonistas em prevenir as anormalidades no
comportamento motor causadas pela doença.
Dessa forma, visto que os receptores P2X7 podem afetar a função sináptica
(DIÁZ-HERNÁNDEZ et al., 2008; LEÓN et al., 2008; ORTEGA et al., 2011), astrocítica,
(FERRARI et al., 2006; GANDELMAN et al., 2010), a microgliose (BIANCO et al., 2006;
MONIF et al., 2009) e o dano neuronal (CAVALIERE et al., 2004; SKAPER et al., 2006), o
presente trabalho combinou investigações in vivo e in vitro para testar o impacto de um
antagonista dos receptores P2X7 em diferentes características da DP. Assim, o presente estudo
fornece combinadas evidências comportamentais, neuroquímicas e morfológicas, que dão
suporte a argumentação que o antagonismo dos receptores P2X7 atenua a disfunção e os danos
característicos da DP.
O antagonista do receptor P2X7 utilizado foi o Brilliant Blue G, que é capaz de
atravessar a barreira hemato-encefálica e na dose utilizada no presente estudo, 45 mg/kg i.p.,
atinge uma concentração cerebral de 200-220 nM (DÍAZ-HERNÁNDEZ et al., 2012), que é
uma faixa efetiva na qual o BBG atua nos receptores P2X7 (DONNELLY-ROBERTS;
JARVIS, 2007).
Para causar parkinsonismo nos animais, a 6-OHDA foi injetada unilateralmente
no estriado, causando uma perda retrógrada das células dopaminérgicas da SN, sendo
realizada então, uma extensiva caracterização comportamental e motora.
Sabe-se que lesões feitas pela administração de 6-OHDA no estriado causam
comportamento rotatório quando os animais são desafiados com agonistas dopaminérgicos
(UNGERSTEDT; ARBUTHNOTT, 1970), como a apomorfina. Isso ocorre porque os
receptores pós-sinápticos dopaminérgicos estriatais estão hipersensibilizados no lado
desnervado, apresentando uma up regulation dos receptores D2. Assim, a estimulação pelo
79
agonista dopaminérgico produz rotações contralaterais à lesão (GERLACH; RIEDERER,
1996; DEUMENS; BLOKLAND; PRICKAERTS, 2002).
O teste da apomorfina tem sido usado como padrão-ouro para análises de lesões
causadas pela 6-OHDA, porque é robusto, confiável e detecta as alterações na sensitividade
dos receptores de dopamina estriatais, proporcionando dessa forma, a verificação de extensas
lesões nigroestriatais (MEREDITH; KANG, 2006).
No presente trabalho, os animais submetidos à lesão com 6-OHDA apresentaram
um aumento significativo do número de rotações contralaterais à lesão. Este resultado está de
acordo com diversos estudos (AGUIAR et al., 2008; KHAN et al., 2010; RIZELIO et al.,
2010; TEIXEIRA et al., 2013) que demonstraram um aumento similar, ao realizarem o teste
da apomorfina duas a três semanas após a indução da lesão com 6-OHDA.
O tratamento com BBG diminuiu em torno de 50% o número de rotações
contralaterais dos animais parkinsonianos, sendo um resultado semelhante obtido com a
administração do antagonista A-438079. Este último é um antagonista mais seletivo dos
receptores P2X7 (NELSON et al., 2006), utilizado nesse trabalho para demonstrar que o efeito
protetor observado com o BBG não é resultante de outros efeitos além do antagonismo dos
receptores P2X7, visto que altas concentrações de BBG têm a capacidade de bloquear os
receptores NMDA (NORTH, 2002; BARALDI; VIRGILIO; ROMAGNOLI, 2004), efeito
que poderia ser confundido com os efeitos neuroprotetores do bloqueio dos receptores P2X7.
No teste do campo aberto, não foram observadas diferenças significativas em
relação à atividade exploratória horizontal, avaliada pelo número de crossings, nos animais
injetados com 6-OHDA, assim como observado também em estudos anteriores
(TADAIESKY et al., 2008; TEIXEIRA et al., 2013), apesar de ter sido observado uma
diminuição no comportamento de rearings (comportamento exploratório vertical). Esse
resultado está de acordo com outros estudos que também descreveram a diminuição do
número de rearings nos animais parkinsonianos injetados com 6-OHDA (SRINIVASAN;
SCHMIDT, 2004; RIZELIO et al., 2010; TEIXEIRA et al., 2013).
Os déficits motores observados nos animais parkinsonianos podem ser
comparados aos observados em pacientes com DP em vários aspectos. Na avaliação da
assimetria dos membros anteriores, através do teste do cilindro, observamos uma maior
atividade do lado ipisilateral e uma menor atividade do lado contralateral à lesão com 6-
80
OHDA, assim como descrito em estudos anteriores (SCHALLERT et al., 2000; SHI et al.,
2004). Pacientes com DP apresentam movimentos reduzidos em amplitude (hipocinesia),
assim como déficits na postura e equilíbrio, que levam à anormalidade durante a caminhada
(ROZAS; GARCIA, 1997). No teste do cilindro, as patas dianteiras utilizadas para os animais
iniciarem os movimentos requerem deslocamento de peso e consequente reajuste postural,
assim como os necessários para os humanos ao caminhar (SHI et al., 2004). A dificuldade em
iniciar passos a partir de uma postura em pé ou a recuperação do centro de gravidade é um
dos sinais da extensiva degeneração de neurônios dopaminérgicos na SN, visto que estes
neurônios estão conectados com os gânglios da base e influenciam várias vias descendentes
para a medula espinhal, como a via retículoespinhal responsável pelos ajustes posturais
(MEREDITH; KANG, 2006).
Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que o tratamento com
BBG não alterou a assimetria motora causada pela injeção de 6-OHDA no teste do cilindro.
No entanto, em um estudo com modelo de Doença de Huntington, caracterizada pela morte
neuronal no estriado e córtex, a administração in vivo do BBG aos camundongos preveniu os
déficits na coordenação motora, avaliada no teste do Rotarod (DÍAZ-HERNÁNDEZ et al.,
2009), que foi demonstrado estar correlacionado à redução da morte neuronal. No teste do
Rotarod, assim como no teste do cilindro, a via retículoespinhal parece estar envolvida, visto
que ajustes posturais são necessários para manter os animais no rotômetro (MEREDITH;
KANG, 2006). Até o presente momento, não há outros estudos que demonstrem o efeito do
antagonismo dos receptores P2X7 sobre os déficits motores em modelos animais de doença de
Parkinson.
Apesar da principal característica da DP ser a manifestação de sintomas motores,
alguns sintomas clínicos compreendem manifestações não-motoras, como demência. Os
déficits cognitivos são comuns na DP e cerca de 20% dos pacientes desenvolvem demência
(SCHRAG; JAHANSHAHI; QUINN, 2000). Enquanto as anormalidades motoras resultam da
depleção nigroestriatal de dopamina, os transtornos na memória são induzidos principalmente
pela degeneração de projeções mesocorticolímbicas que se originam na área tegmental ventral
(CALABRESI et al., 2006). Os neurônios do sistema mesolímbico projetam-se
principalmente para o núcleo accumbens, tubérculo olfatório, amígdala e hipocampo; e os
neurônios mesocorticais projetam-se para várias áreas corticais como córtex pré-frontal
medial e perirrinal (SMITH; KIEVAL, 2000; WISE, 2004).
81
No presente trabalho, a indução do parkinsonismo pela injeção de 6-OHDA
causou déficits significativos na memória aversiva de curta e longa duração (recente e tardia).
Corroborando com estes dados, outros estudos também demonstraram que a 6-OHDA causa
déficits na memória aversiva avaliada através do teste da esquiva passiva (MANSOURI;
FARBOOD; SAMERI, 2013; KOPALLI et al., 2013).
A dopamina tem um papel chave na regulação de certos estágios da aprendizagem
e memória e da plasticidade sináptica (JAY, 2003; CALABRESI et al., 2007). Alguns
trabalhos relatam um importante papel dos receptores dopaminérgicos na amígdala basolateral
e seu envolvimento nos comportamentos de medo e ansiedade (ABE et al., 2009; DE LA
MORA et al., 2010). O teste da esquiva passiva ou inibitória depende principalmente do
hipocampo dorsal, mas também do córtex parietal e entorrinal, sendo intensamente modulado
pelo núcleo basolateral da amígdala (LORENZINI et al., 1996; IZQUIERDO; MEDINA,
1997; ROSSATO et al., 2006).
A administração de 6-OHDA também causou déficits no desempenho dos animais
no teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada. A diminuição da habilidade em
realizar a versão com pistas do labirinto aquático após a administração de MPTP ou 6-OHDA
ocorre devido à lesão no estriado dorsolateral, área cuja integridade é necessária para
realização dessa tarefa (PACKARD; MCGAUGH, 1992; DEVAN; MCDONALD 1999; DA
CUNHA et al., 2002; MIYOSHI et al, 2002). Esse teste é um exemplo de estímulo-resposta
ou aprendizagem relacionada a hábitos em que o sujeito aprende a associar gradualmente um
estímulo com uma resposta, que é uma recompensa, sendo mediado pelos gânglios da base
(WHITE; MCDONALD, 2002). No entanto, estudos mais recentes demonstram que o
hipocampo e o estriado dorsal não atuam como sistemas independentes competindo pelo
controle do comportamento de navegação no labirinto aquático, e sim que atuam de forma
coordenada fornecendo estratégias espaciais ou baseadas em pistas, respectivamente
(DeCOTEAU et al., 2007; MIYOSHI et al., 2012).
O tratamento com BBG melhorou a performance dos animais nos testes de
memórias realizados, pois aumentou as latências para entrar no lado escuro da caixa, na
avaliação da memória recente no teste da esquiva passiva, assim como diminuiu as latências
para os animais acharem a plataforma no teste do labirinto aquático. Além disso, os valores
obtidos para o grupo 6-OHDA tratado com BBG não foram diferentes significativamente dos
82
animais controles. Essa diminuição dos déficits de memória está provavelmente relacionada à
redução da depleção de dopamina no sistema nigroestriatal e mesocorticolímbico.
Existem ainda fortes evidências que apontam para o envolvimento do ATP e seus
receptores nos mecanismos de plasticidade sináptica e formação de memória (CUNHA et al.,
1996; PANKRATOV et al., 2002; DÜSTER, PRICKAERTS; BLOKLAND, 2014).
Pankratov et al. (2002), demonstraram que o ATP pode modular a plasticidade sináptica
através de receptores P2X pós-sinápticos situados em neurônios piramidais da área CA1.
Esses receptores, que são canais iônicos operados por ligantes, agem contribuindo para o
influxo sináptico de Ca++, inibindo assim a efetividade dos receptores NMDA em induzir a
LTP. Esse mesmo estudo demonstrou um aumento da LTP, após estímulo de alta frequência,
com o bloqueio dos receptores P2X pelo PPADS, efeito que também foi observado por Wang
et al. (2004).
Visto que a potenciação de longa duração (LTP) pode ser definida como uma
forma ou mecanismo de memória importante no hipocampo e amígdala, estruturas envolvidas
no processamento dos estágios iniciais da memória (consolidação), e também no córtex, onde
se acredita ser o sítio de estocagem da memória (CLUGNET; LE DOUX, 1990;
IZQUIERDO; McGAUGH, 2000), o BBG pode ter contribuído para melhora dos déficits de
memória também através da facilitação da LTP. Um estudo utilizando modelo de
isquemia/reperfusão em ratos demonstrou que o BBG diminuiu os déficits na memória
espacial avaliada através do teste do labirinto aquático de Morris (CHU et al., 2012).
Como dito anteriormente, sendo importante novamente ressaltar, os resultados
referentes à avaliação da memória dos animais submetidos à lesão com 6-OHDA, assim como
os dados obtidos nos testes motores, representam um achado novo, visto que os estudos
anteriores que analisaram o antagonismo dos receptores P2X7 na DP (MARCELLINO et al.,
2010; HRACSKÓ et al., 2011) não analisaram parâmetros comportamentais.
De acordo com a habilidade do bloqueio dos receptores P2X7 em prevenir a
diminuição da função dopaminérgica, nós documentamos que o tratamento com BBG diminui
a depleção dos níveis de dopamina nas áreas mais afetadas na DP, o estriado e mesencéfalo.
Esse resultado foi confirmado ainda pela diminuição da perda de neurônios dopaminérgicos
no estriado, verificada pelo aumento da imunorreatividade para TH nessa região, em
comparação ao grupo 6-OHDA.
83
Resultados semelhantes foram encontrados em um estudo com o antagonista
P2X7, A-438079, que foi capaz de prevenir a depleção de DA estriatal no modelo de DP por
injeção unilateral nigral de 6-OHDA, apesar dos autores não demonstrarem associação com a
diminuição da perda de neurônios dopaminérgicos no estriado (MARCELLINO et al., 2010).
Já os resultados obtidos por Hracskó e colaboradores (2011) demonstraram que a
deleção gênica dos receptores P2X7 ou o bloqueio farmacológico pelo BBG não protegeram
contra a diminuição do conteúdo de dopamina no estriado. No entanto, a falha do BBG em
reduzir a depleção de DA nesse estudo, ocorreu provavelmente devido ao esquema de
tratamento utilizado, que foi o de uma única dose de BBG administrada 90 horas antes da
análise, não conseguindo o BBG dessa forma, proteger contra um estímulo agressivo como
MPTP, que segundo o artigo, causou cerca de 50% de mortalidade nos camundongos.
Adicionalmente, nosso estudo observou que o BBG atenuou a astrogliose e
microgliose causadas pela lesão com 6-OHDA. Esse resultado é corroborado por estudos
anteriores que demonstraram a localização dos receptores P2X7 nos astrócitos e na micróglia,
assim como a habilidade desses receptores em controlar a função das células gliais (BIANCO
et al., 2006; MONIF et al., 2009; GANDELMAN et al., 2010).
O controle da inflamação está associado com a neuroproteção em diferentes
doenças neurodegenerativas (MARCHETTI; ABBRACCHIO, 2005). Tanto as células
microgliais quanto os astrócitos respondem rapidamente a uma situação adversa mudando sua
morfologia, multiplicando-se e migrando para o sítio de injúria. Essas reações são nomeadas
de gliose reativa (microgliose e astrogliose) e envolve a expressão de proteínas estruturais
específicas e receptores de superfície celular. A astrogliose é caracterizada pelo aumento de
filamentos intermediários, como a vimentina e o GFAP, que é acompanhado pela hipertrofia e
aumento do número de astrócitos (ZHANG et al., 2009). A microgliose aumenta a expressão
de novo de marcadores moleculares como CD11b e antígenos MHC (complexo principal de
histocompatibilidade) (McGEER; McGEER, 2002), assim como a liberação de espécies
reativas de oxigênio, proteases e citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 e TNF-α, que
ocasionam um ciclo de auto-propagação da neuroinflamação e neurodegeneração (MONIF et
al., 2009).
Estudos anteriores demonstraram que o BBG foi capaz diminuir a gliose em
modelos de doença de Alzheimer (RYU; McLARNON, 2008), injúria da medula espinhal
84
(PENG et al., 2009) e isquemia/reperfusão (CHU et al., 2012). Esse parece ser um efeito
crucial na contribuição dos receptores P2X7 em controlar a neurotoxicidade, visto que estes
estão supra-regulados nas células gliais após estímulos nocivos (FRANKE et al., 2004), e
muitos outros estudos têm proposto que a neurotoxicidade mediada por receptores P2X7 é
devido principalmente a estimulação dos efeitos deletérios das células gliais sobre a
viabilidade neuronal em condições de dano cerebral (CAVALIERE; DINKEL; REYMANN,
2005; MELANI et al., 2006; SKAPER et al., 2006; CHOI et al., 2007; GANDELMAN et al.,
2010; LEE et al., 2011).
Além da ativação microglial, os receptores P2X7 estão envolvidos na liberação de
alguns mediadores chave na neurodegeneração, como IL-1β (FERRARI et al., 2006;
TAKENOUCHI; SUGAMA; IWAMARU, 2009). Isso foi observado no presente estudo, que
demonstrou o aumento dos níveis de IL-1β de ratos submetidos à lesão com 6-OHDA, assim
como a tendência do BBG em diminuir esses níveis.
Estudos anteriores já haviam demonstrado que o bloqueio farmacológico dos
receptores P2X7 (ENGEL et al, 2012), assim como a deleção gênica (BASSO et al., 2009)
desses receptores, leva à diminuição dos níveis de IL-1β em modelos de convulsões e de
depressão, respectivamente. A liberação através de microvesículas parece ser o principal
mecanismo relacionado com a secreção de IL-1β pela micróglia (TUROLA et al., 2012). Yu
et al. (2013) demonstrou em um modelo de isquemia/reperfusão, que além da diminuição da
expressão de IL-1β, o antagonismo dos receptores P2X7 pelo BBG leva à diminuição da
ativação da MAP quinase p38, proteína cuja ativação é necessária para a liberação das
microvesículas pela membrana plasmática das células gliais.
Os resultados discutidos até agora apontam para a hipótese do BBG agir como
neuroprotetor através de dois mecanismos principais, o controle simultâneo da perda de
neurônios dopaminérgicos e da neuroinflamação. Enquanto a função dos receptores P2X7 em
controlar a neuroinflamação já está bem estabelecida (DI VIRGILIO, 2007), o controle direto
da neurodegeneração pelos receptores P2X7 neuronais ainda não está bem documentado
(ORTEGA et al., 2011). Por esse motivo, o próximo passo do presente estudo foi testar se o
BBG afeta diretamente a viabilidade neuronal em um modelo celular livre de células gliais.
Assim, nós primeiro confirmamos que a diferenciação das células SH-SY5Y com
ácido retinóico produz células com fenótipo dopaminérgico, assim como demonstrado por
85
LOPES et al. (2010), e que nestas células estão expressos receptores P2X7, como também
descrito anteriormente em outros estudos (LARSSON; HANSEN; DISSING, 2002;
ORELLANO et al., 2010). Além disso, o presente estudo demonstrou uma proteção direta
contra a neurotoxicidade induzida por 6-OHDA, que dá suporte a um efeito neuroprotetor
direto do bloqueio dos receptores P2X7, assim como observado em estudos anteriores usando
células PC-12 (HRACSKÓ et al., 2011) ou diferentes tipos de neurônios em cultura (JUN et
al., 2007; ORTEGA et al., 2011; NISHIDA et al., 2012).
Esses resultados indicam a importante participação dos receptores P2X7 em
diferentes processos que contribuem para a disfunção e dano neuronal de regiões cerebrais
afetadas pelo modelo de DP causado pela administração de 6-OHDA. Isso está de acordo com
o conceito de que o ATP é um sinal extracelular indicativo de dano cerebral (DI VIRGILIO,
2000), corroborado pela observação direta de que diferentes estímulos deletérios ao cérebro
estimulam o aumento dos níveis extracelulares de ATP (DAVALOS et al., 2005; GOURINE
et al., 2005; MELANI et al., 2005). Nós ampliamos essas observações, demonstrando o
aumento dos níveis extracelulares de ATP no meio das células SH-SY5Y após exposição à
toxina 6-OHDA.
Com o objetivo de compreender melhor a função dos receptores P2X7 na DP, nós
avaliamos ainda a expressão dos receptores P2X7 no estriado de ratos submetidos à
administração de 6-OHDA e observamos um aumento da densidade desses receptores.
Hracskó et al. (2011) já havia observado resultado similar, demonstrando um aumento da
expressão de receptores P2X7 no estriado e substância negra após administração de MPTP in
vivo e da exposição de rotenona in vitro. Esses resultados fornecem mais uma evidência de
que o ATP agindo via receptores P2X7, desenvolve um importante papel no processo de
degeneração observado na doença de Parkinson.
O bloqueio dos receptores P2X7 pelo BBG levou a um aumento ainda mais
pronunciado da densidade dos receptores P2X7 em relação aos animais submetidos à lesão
intra-estriatal por 6-OHDA. A up-regulation induzida por antagonistas é um fenômeno
comum em outros tipos de receptores, incluindo receptores opióides, adrenérgicos,
colinérgicos, serotoninérgicos e dopaminérgicos, podendo levar a uma diminuição dos efeitos
desses antagonistas e/ou hiperssensibilização dos receptores (DE LIGT et al., 2000). Esse
fenômeno ainda não foi descrito para receptores purinérgicos, entretanto, pode estar
relacionado ao tratamento crônico com BBG, provavelmente por um tempo maior que o
86
observado no presente estudo, apesar de estudos mais detalhados serem necessários para
esclarecer esse efeito.
Visto que os receptores P2X7 afetam a sobrevida e morte neuronal de uma forma
bastante complexa e que a lesão dopaminérgica na DP se inicia nos terminais nervosos antes
de evoluir para o dano neuronal (SCOTCHER et al.,1991; BERENDSE et al., 2001;
BÉZARD et al., 2001; FORNO et al., 1994), foi testada também a hipótese dos receptores
P2X7 serem particularmente eficientes em controlar a disfunção nos sinaptossomas estriatais.
Estudos anteriores demonstraram que os receptores P2X7 estão presentes nos
terminais nervosos (DEUCHARS et al., 2001; CAVALIERE et al., 2004; ALLOISIO et al.,
2008), assim como a capacidade desses receptores em controlar a maturação desses terminais
(DÍAZ-HERNÁNDEZ et al., 2008) e a liberação de neurotransmissores (WIRKNER et al.,
2005; MARCOLI et al., 2008). Nós agora ampliamos essas observações, demonstrando que
os receptores P2X7 estão especificamente localizados nos terminais nervosos do estriado de
ratos. Isso está acordo com a habilidade dos receptores P2 em controlar a liberação de
dopamina (TRENDELENBURG; BÜLTMANN, 2000; KRÜGEL et al., 2003), assim como
algumas funções dopaminérgicas (KITTNER; KRUGEL; ILLES, 2001, KITTNER et al.
2004). Adicionalmente, nós demonstramos que os receptores P2X7 podem controlar
diretamente a viabilidade metabólica dos terminais nervosos, visto que o BBG preveniu a
perda da capacidade metabólica dos terminais nervosos purificados expostos à 6-OHDA.
Assim, os dados obtidos no presente estudo indicam que o BBG pode agir através
de um mecanismo potencialmente triplo para proteger contra a disfunção e o dano
característicos da DP como: a sinaptoxicidade inicial que ocorre nos terminais nervosos do
estriado, a gliose que está associada com a evolução das doenças neurodegenerativas
(MARCHETTI; ABBRACCHIO, 2005; McGEER; McGEER, 2008) e o controle direto da
viabilidade dos neurônios dopaminérgicos, que é principal característica histológica da DP
(BÉZARD et al., 2001). Essa tripla ação contribui para a capacidade do BBG de preservar os
níveis de dopamina nigrais e estriatais, assim como diminuir os déficits motores e de
memória.
É importante ainda ressaltar que o BBG foi mais efetivo em controlar as
modificações morfológicas no estriado do que na substância negra. Isso sugere que a
modulação dos receptores P2X7 pode ser mais efetiva em controlar as fases iniciais, como
87
visto pela diminuição da sinaptotoxicidade estriatal, em vez de fases mais tardias, como por
exemplo, a perda de células dopaminérgicas nigrais. Dessa forma, o presente estudo fornece
evidências de que os receptores P2X7 podem agir como alvo de drogas modulatórias, que
podem ser exploradas com terapias adjuvantes na fase inicial da doença de Parkinson.
O BBG é menos potente em antagonizar receptores P2X7 de humanos que de ratos
(IC50 de 200 nM e 10 nM, respectivamente) (JIANG et al., 2000). Outros antagonistas como
KN-62 são mais potentes em receptores P2X7 de humanos (HUMPHREYS et al., 1998),
apresentando dessa forma uma eficácia limitada para o uso em estudos pré-clínicos in vivo
(DONNELLY-ROBERTS; JARVIS, 2007).
O antagonista A-438079, apesar de mais seletivo para os receptores P2X7,
apresenta meia-vida curta (cerca de 1 hora) e limitada biodisponibilidade (19%), que não são
apropriadas para protocolos de administração crônica intraperitoneal (DÍAZ-HERNANDEZ
et al., 2009). No entanto, visto que alguns estudos demonstram a sua aplicabilidade para
outras condições como o tratamento da dor crônica (DONNELLY-ROBERTS; JARVIS,
2007), é provável que outras vias de administração ou moléculas derivadas possam ser
exploradas em breve.
Dessa forma, em vista dos resultados apresentados, assim como o estado atual de
pesquisas em relação a novos antagonistas P2X7, o BBG tem provavelmente o melhor
potencial para ser utilizado em estudos clínicos. O BBG apresenta ainda a vantagem de ter
baixa toxicidade, que pode ser também baseada no amplo uso de seu análogo Brilliant Blue-
FCF (FD&C blue dye No. 1), semelhante ao BBG tanto estruturalmente quanto
funcionalmente, como corante na produção de alimentos por décadas (PENG et al., 2009).
Além disso, dados sobre a utilização do BBG para cromovitrectomia e cirurgia de catarata
têm sido obtidos nos últimos anos, tendo este, em acompanhamentos a longo prazo, não
demonstrado sinais de toxicidade (DIB et al., 2009).
Assim, os resultados obtidos no presente estudo demonstram que o BBG é uma
droga promissora para a pesquisa translacional na doença de Parkinson, que tem se fortalecido
nos últimos anos, unindo descobertas das ciências básicas com a investigação clínica,
podendo ter esses resultados traduzidos em modificações da prática clínica.
88
6 CONCLUSÕES
O Brilliant Blue G (BBG), antagonista dos receptores P2X7, demonstrou efeito
neuroprotetor contra a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA, um modelo de parkinsonismo
experimental.
Os resultados obtidos demonstraram uma ação tripla dos receptores P2X7, visto
que estes parecem ser capazes de afetar diferentes processos em diferentes fases na DP, como
a iniciação (sinaptotoxicidade dopaminérgica estriatal), a propagação (astrogliose e
microgliose) e a execução (perda de células dopaminérgicas), o que contribui para o
entendimento da habilidade do BBG, em prevenir características neuroquímicas, como a
preservação dos níveis de dopamina nigrais e estriatais, assim como diminuir os déficits
motores e de memória causados pela doença.
Assim, os resultados indicam que o bloqueio dos receptores P2X7 pode ser uma
estratégia terapêutica promissora para o tratamento da doença de Parkinson.
89
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