viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI HTQT CẤP NHÀ NƯỚC THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ NHANH CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU VÀ SÀNG LỌC

CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THẢO DƯỢC NHẰM TẠO RA CÁC SẢN PHẨM CÓ GIÁ TRỊ

CHỦ NHIỆM ĐỀ ÁN: GS.TS. CHÂU VĂN MINH PGS. TS. PHẠM QUỐC LONG

7793 08/03/2010

HÀ NỘI – 2010

Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ ViÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

ViÖn ho¸ häc çc hîp chÊt thiªn nhiªn

NhiÖm vô Hîp t¸c quèc tÕ

theo nghÞ ®Þnh th viÖt nam-bØ

b¸o ço tæng hîp

kÕt qu¶ khoa häc nhiÖm vô

“Nghiªn cøu x©y dùng çc ph¬ng ph¸p ®¸nh gÝa

nhanh chÊt lîng dîc liÖu vµ sµng läc çc chÊt

cã ho¹t tÝnh sinh häc tõ th¶o dîc nh»m t¹o ra

çc s¶n phÈm cã gi¸ trÞ”

c¬ quan chñ tr×: viÖn ho¸ häc çc hîp chÊt thiªn nhiªn

viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

chñ nhiÖm nhiÖm vô: GS.TS ch©u v¨n minh

pgs.ts ph¹m quèc long

Hµ néi-3/2010

Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ ViÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

ViÖn ho¸ häc çc hîp chÊt thiªn nhiªn

NhiÖm vô Hîp t¸c quèc tÕ theo nghÞ ®Þnh th viÖt nam-bØ

b¸o ço tæng hîp kÕt qu¶ khoa häc nhiÖm vô

“Nghiªn cøu x©y dùng çc ph¬ng ph¸p ®¸nh gÝa nhanh chÊt lîng dîc liÖu vµ sµng läc çc chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc tõ th¶o dîc nh»m t¹o ra

çc s¶n phÈm cã gi¸ trÞ”

chñ nhiÖm nhiÖm vô

GS.TS ch©u v¨n minh

c¬ quan chñ tr× nhiÖm vô

Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ

Hµ néi-3/2010

VIỆN HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 14 tháng 12 năm 2009. BÁO CÁO THỐNG KÊ

KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ I. THÔNG TIN CHUNG 1. Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu xây dựng các phương pháp đánh giá nhanh chất lượng dược liệu và sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ một số cây cỏ nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị. Thuộc: Nhiệm vụ Hợp tác Quốc tế theo Nghị định thư Việt Nam-Bỉ giai đoạn 2007-2009.

2. Chủ nhiệm nhiệm vụ: Phía Việt Nam: 1. GS TS Ch©u V¨n Minh, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam §Þa chØ: 18 Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi, ViÖt Nam Tel: 84 4 8363375; Fax: 84 4 8345390; Email: [email protected] 2. PGS.TS Ph¹m Quèc Long, ViÖn Hãa häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn 18 Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi, ViÖt Nam Tel: 84 4 7562378; Fax: 84 4 8345390; email: [email protected] Phía Bỉ: 1. GS Yvan Vander Heyden, Trêng §¹i häc Tæng hîp Brussel (VUB) §Þa chØ: Laarbeeklaan, 103 B-1090 Brussels, Belgium Tel: 32 2 4774734; Fax: 32 2 4774435; Email: [email protected] 2. GS Joelle Quetin-Leclercq, Trêng §¹i häc Tæng hîp Louvain §Þa chØ: Avenue E. Mounier, 72 B-1200 Brussels, Belgium Tel: 32 2 764 7254, Fax: 32 2 764 7253, Email: [email protected]

3. Tổ chức chủ trì đề tài/dự án: Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên Điện thoại: 0438360830 ; Fax: 84 4 8345390; email: [email protected] Địa chỉ: 18- Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS. TS Phạm Quốc Long Số tài khoản: 931.01.016 Ngân hàng: Kho bạc Cầu Giấy, Hà Nội Tên cơ quan chủ quản đề tài: Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN 1. Thời gian thực hiện nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng đã ký kết: 31 tháng từ ngày 1 tháng 6/ năm 2007 đến ngày 31 tháng 12 năm 2009 - Thực tế thực hiện: từ tháng 6/ năm 2007 đến tháng 12 năm 2009

2. Kinh phí và sử dụng kinh phí: 1.450 tr.đ 3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án: Số TT

Số, thời gian ban hành văn bản Tên văn bản

1 QĐ số 823/QĐ-BKH CN ngày 22/5/2007

Phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác Quốc tế về khoa học và công nghệ theo Nghị định thư bắt đầu thực hiện từ năm 2007

2 Hợp đồng 34/2007/HĐ-NĐT ngày 7 tháng 11 năm 2007

Hợp đồng thực hiện nhiệm vụ “Nghiên cứu xây dựng các phương pháp đánh giá nhanh chất lượng dược liệu và sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ một số cây cỏ nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị”

5. Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ: a. Thành viên chính

Stt Hä vµ tªn C¬ quan c«ng t¸c 1 GS.TS Ch©u V¨n Minh ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 2 PGS.TS Phan V¨n KiÖm ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 3 PGS.TS Ph¹m Quèc Long ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 4 PGS.TS Lª Mai H¬ng ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 5 TS NguyÔn Hoµi Nam ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 6 NCS NguyÔn H¶i §¨ng ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 7 NCS NguyÔn Xu©n Cêng ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 8 GS.TSKH NguyÔn NghÜa Th×n §¹i häc Khoa häc tù nhiªn 9 TS Ninh Kh¾c B¶n ViÖn ST Vµ TNSV 10 NCS NguyÔn ThÞ Kim Thanh §¹i häc Khoa häc tù nhiªn

b. Cán bộ tham gia

Stt Hä vµ tªn C¬ quan c«ng t¸c 11 NCS NguyÔn ThÞ Hång V©n ViÖn Ho¸ häc çc HCTN 12 ThS §oµn Th¸i Hng C«ng ty Dîc §«ng d¬ng 13 TS Vò M¹nh Hïng Häc ViÖn Qu©n Y 14 TS NguyÔn C«ng Thùc ViÖn Y häc cæ truyÒn Qu©n ®éi 15 TS Lª ThÞ Ph¬ng Quúnh ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 16 TS NguyÔn TiÕn §¹t ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 17 CN TrÇn Hång Quang ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 18 ThS NguyÔn V¨n Thanh ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 19 ThS NCS NguyÔn ThÞ Mai §¹i häc Giao th«ng VËn t¶i 20 ThS Ph¹m H¶i YÕn ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 21 CN NguyÔn Ph¬ng Th¶o ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 22 CN §inh Thu Thñy ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 23 CN TrÇn Hång H¹nh ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn 24 NCS §oµn Lan Ph¬ng ViÖn Ho¸ häc çc Hãa häc çc Hîp chÊt thiªn nhiªn

6. Tình hình hợp tác quốc tế:

Số TT

Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia...)

Thực tế đạt được (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham

gia...) A Đoàn ra 1 Năm 2007:

Nội dung: Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Mallotus và một số loài thực vật khác trong khuôn khổ dự án Thời gian: 06 tháng Kinh phí: Theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS Joelle Quetin-Leclercq Trêng §¹i häc Tæng hîp Louvain Tên cán bộ Việt Nam: NCS Nguyễn Thị Hồng Vân

Năm 2007: Nội dung: Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Mallotus và một số loài thực vật khác trong khuôn khổ dự án Thời gian: 06 tháng (tháng 5 đến tháng 11 năm 2007) Kinh phí: Theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS Joelle Quetin-Leclercq Trêng §¹i häc Tæng hîp Louvain Tên cán bộ Việt Nam: NCS Nguyễn Thị Hồng Vân

2 Năm 2007: Nội dung: Nghiên cứu phát triển phương pháp dấu vân tay sắc ký trong quản lý chất lượng các mẫu thực vật được lựa chọn Thời gian: 05 tháng Kinh phí: Theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS Yvan Vander Heyden, Trêng §¹i häc Tæng hîp Brussel (VUB) Tên cán bộ Việt Nam: NCS Nguyễn Hoài Nam

Năm 2007: Nội dung: Nghiên cứu phát triển phương pháp dấu vân tay sắc ký trong quản lý chất lượng các mẫu thực vật được lựa chọn Thời gian: 05 tháng (tháng 5 đến tháng 10 năm 2007) Kinh phí: Theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS Yvan Vander Heyden, Trêng §¹i häc Tæng hîp Brussel (VUB) Tên cán bộ Việt Nam: NCS Nguyễn Hoài Nam

3 Năm 2008: Nội dung: Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Mallotus và một số loài thực vật khác Thời gian: 03 tháng Kinh phí: Theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS Joelle Quetin-Leclercq Trêng §¹i häc Tæng hîp Louvain Tên cán bộ Việt Nam: Ths Trần Hồng Quang

Năm 2008: Nội dung: Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Mallotus và một số loài thực vật khác trong khuôn khổ dự án Thời gian: 03 tháng (tháng 4 đến tháng 7 năm 2008) Kinh phí: Theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS Joelle Quetin-Leclercq Trêng §¹i häc Tæng hîp Louvain Tên cán bộ Việt Nam: Ths Trần Hồng Quang

4 Năm 2008: Nội dung: Nghiên cứu phát triển phương pháp dấu vân tay sắc ký trong quản lý chất lượng các mẫu thực vật được lựa chọn

Năm 2008: Nội dung: Nghiên cứu phát triển phương pháp dấu vân tay sắc ký trong quản lý chất lượng các mẫu thực vật được lựa chọn Thời gian: 05 tháng (tháng 5 -10/2008)

Thời gian: 05 tháng Kinh phí: Theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS Yvan Vander Heyden, Trêng §¹i häc Tæng hîp Brussel (VUB) Tên cán bộ Việt Nam: NCS Đoàn Lan Phương

Kinh phí: Theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS Yvan Vander Heyden, Trêng §¹i häc Tæng hîp Brussel (VUB) Tên cán bộ Việt Nam: NCS Đoàn Lan Phương

B Đoàn vào 1 Năm 2008:

Nội dung: Chủ nhiệm nhiệm vụ phía Bỉ đến thăm và làm việc với chủ nhiệm dự án phía Việt Nam, Thời gian: tháng 8 năm 2008, Địa điểm: Viện Hóa học các HCTN-Việt Nam, Kinh phí: theo thỏa thuận giữa hai chủ nhiệm, Số đoàn: 01, số lượng: GS.TS Yvan Vander Heyden và GS.TS Joelle Quetin-Leclercq

Năm 2008: Nội dung: Chủ nhiệm nhiệm vụ phía Bỉ đến thăm và làm việc với chủ nhiệm dự án phía Việt Nam, Thời gian: 25 tháng 10 đến 30 tháng 10 năm 2008.

Địa điểm: Viện Hóa học các HCTN-Việt Nam, Kinh phí: phía Bỉ tự túc vé và đi lại, phía Việt Nam hỗ trợ ăn ở. Số đoàn: 01, số lượng: 1-2 người

2 Năm 2009: Nội dung: Chủ nhiệm nhiệm vụ phía Việt Nam và Bỉ bàn bạc về kết quả dự án và kế hoạch cho giai đoạn 2 Thời gian: tháng 5 năm 2009, Địa điểm: Viện Hóa học các HCTN-Việt Nam. Kinh phí: theo thỏa thuận giữa hai chủ nhiệm, Số đoàn: 01, số lượng: 1-2 người

Điều chỉnh nội dung đoàn vào do phía đối tác thay đổi kế hoạch sang Việt Nam.

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

Số TT

Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

điểm )

Thực tế đạt được (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm )

1 Nội dung: Hội nghị giữa các chủ nhiệm đề tài về kế hoạch thực hiện nhiệm vụ Thời gian: 1/2007 Địa điểm: Bỉ Thành viên: VUB, UCL, INPC

Nội dung: Hội nghị giữa các chủ nhiệm đề tài về kế hoạch thực hiện nhiệm vụ Thời gian: 9 / 01/ 2007 Địa điểm: Bỉ Thành viên: VUB, UCL

2 Nội dung: Hội thảo khoa học giữa các chủ nhiệm đề tài và các thành viên về các kết quả nghiên cứu năm 2007 và kế hoạch 2008 Thời gian: 9/2007 Địa điểm: Bỉ

Nội dung: Hội thảo khoa học giữa các chủ nhiệm đề tài và các thành viên về các kết quả nghiên cứu năm 2007 và kế hoạch 2008 Thời gian: 18/09/2007 Địa điểm: Bỉ Thành viên: VUB (GS Yvan), UCL (GS Joelle),

Thành viên: VUB, UCL, INPC INPC (NCS Nguyễn Hoài Nam, NCS Nguyễn Thị Hồng Vân)

3 Nội dung: Hội thảo khoa học giữa các chủ nhiệm đề tài và các thành viên về kế hoạch nghiên cứu tiếp theo năm 2008 và kết quả đạt được 6 tháng đầu năm 2008 Thời gian: 4/2008 Địa điểm: Bỉ Thành viên: VUB, UCL, INPC

Nội dung: Hội thảo khoa học giữa các chủ nhiệm đề tài và các thành viên về kế hoạch nghiên cứu tiếp theo năm 2008 và kết quả đạt được 6 tháng đầu năm 2008 Thời gian: 21/5/2008 Địa điểm: Bỉ Thành viên: VUB (GS Yvan), UCL (GS Joelle), INPC (ThS Trần H. Quang, Đoàn Lan Phương)

4 Nội dung: Hội thảo khoa học giữa các chủ nhiệm đề tài và các thành viên về kế hoạch nghiên cứu về kết quả đạt được giữa hai đối tác Thời gian: 8/2008 Địa điểm: Bỉ Thành viên: VUB, UCL, INPC

Nội dung: Hội thảo khoa học giữa các chủ nhiệm đề tài và các thành viên về kế hoạch nghiên cứu tiếp theo năm 2008 và kết quả đạt được 6 tháng đầu năm 2008 Thời gian: 26/10 đến 27/10/2008 Địa điểm: Viện HCTN, Việt Nam Thành viên: VUB (GS Yvan), UCL (GS Joelle), INPC (GS.TS Châu Văn Minh và cộng sự)

5 Nội dung: Hội thảo khoa học tổng kết kết quả thực hiện nhiệm vụ Thời gian: 11/2009 Địa điểm: Việt Nam Thành viên: Phía Việt Nam

Nội dung: Hội thảo khoa học tổng kết kết quả thực hiện nhiệm vụ Thời gian: 12/11/2009 Địa điểm: Việt Nam Chủ trì hội thảo GS.TS Châu Văn Minh.

8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Thời gian Số TT

Các nội dung, công việc chủ yếu

(Các mốc đánh giá chủ yếu) Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

Người, cơ quan

thực hiện 1 Tæng quan tµi liÖu:

TËp hîp çc tµi liÖu trong vµ ngoµi níc cã liªn quan ®Õn chi Ba bÐt

9/2006 - 2/2007

2/2007 GS.TS Châu Văn Minh, PGS.TS Ph¹m Quèc Long, NCS Nguyễn Hải Đăng Viện Hóa HCTN

2 Thu thËp mÉu, t¹o tiªu b¶n, x¸c ®Þnh tªn loµi, ph©n bè, …phôc vô cho c¬ së d÷ liÖu.

2/2007 8/2007

4/2007 GS.TS Nguyễn Nghĩa Thìn và cs, Đại học KHTN, Viện HCTN

3 T¹o chiÕt phÈm th« vµ çc ph©n ®o¹n dÞch chiÕt thÝch hîp

08/2007 12/2007

7/2007 ThS Nguyễn Xuân Cường, Viện HCTN

4 Sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc - Ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸ - Ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo -Ho¹t tÝnh kh¸ng sinh cña dÞch chiÕt tæng vµ çc dÞch chiÕt

10/2007 - 3/2008

12/2007 TS Lê Mai Hương và cs, Viện HCTN GS Joelle Quetin-Leclercq, Trường đại học Louvain, Bỉ

5 Nghiªn cøu hãa häc theo ®Þnh 03/3008 GS.TS Châu Văn Minh

híng HTSH ®Ó chiÕt xuÊt çc ho¹t chÊt, x¸c ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc çc ho¹t chÊt. §¸nh gi¸ ho¹t tÝnh sinh häc cña çc hîp chÊt ph©n lËp ®îc (cho 6 loµi thùc ®îc lùa chän)

- 03/2009

03/2009

và cộng sự, Viện HCTN GS Joelle Quetin-Leclercq (UCL, Bỉ)

6 Nghiªn cøu ph¸t triÓn ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trong qu¶n lý chÊt lîng çc mÉu thùc vËt ®îc chän

12/2007 - 3/2009

3/2009

GS.TS Châu Văn Minh và cộng sự, Viện HCTN GS Yvan Vander Heyden, Đại học VUB, Bỉ

7 Ph©n lËp lîng ®ñ lín çc chÕ phÈm cho çc nghiªn cøu dîc lý

12/2007 03/2009

03/2009 PGS.TS Phan Văn Kiệm và cộng sư, Viện Hóa học các HCTN

8 B¸o ço tæng kÕt khoa häc 9/2009 12/2009

12/2009 GS.TS Châu Văn Minh và cộng sự Viện Hóa HCTN

III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN 1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I:

Số TT

Tên sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng chủ yếu

Đơn vị đo Số lượng Theo kế

hoạch Thực tế đạt được

1 Mẫu: Mẫu thực vật thu thập trong khuôn khổ đề tài Mẫu

Không đăng ký số

lượng

Không đăng ký số lượng 78

2 Sản phẩm: Sản phẩm thực phẩm chức năng viên nang Mallotus

viên 10000 10000 10000

3 Vật liệu: Các hoạt chất sạch phân lập và xác định cấu trúc trong khuôn khổ đề tài

chất Không

đăng ký số lượng

Không đăng ký số lượng 48

b) Sản phẩm Dạng II:

Yêu cầu khoa học cần đạt

Số TT Tên sản phẩm

Theo kế hoạch


Ghi chú

1 Phương pháp: Phương pháp sắc ký vết (fingerprint) trong xác định chất lượng dược liệu

01 01 Đủ số lượng

2 Tiêu chuẩn: Tiêu chuẩn VSAT thực phẩm chức năng 01 01 Đủ số

lượng 3 Quy trình: Quy trình tách

chiết, tinh chế và phân lập các chất có HTSH từ cây thuốc

06 07 Vượt số lượng

c) Sản phẩm Dạng III và IV

Yêu cầu khoa học cần đạt

Số

TT Tên sản phẩm

Theo kế hoạch


Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản)

1 Bài báo: Công trình khoa học đăng ở tạp chí trong và ngoài nước 10 14

Tạp chí quốc tế: 07

Tạp chí trong nước: 07

2 Sách chuyên khảo: Chi Mallotus, hóa học, hoạt tính sinh học và sắc ký fingerprint 01 01

In 250 cuốn, số đăng ký 830-2009/CXB/033-03/KHTNCN, Nhà xuất bản KHTN&CN

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng Số TT

Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Theo kế

hoạch Thực tế đạt

được

Ghi chú (Thời gian kết thúc)

1 Thạc sỹ 01 01 Bảo vệ năm 2008

2 Tiến sỹ 01 03 02 đã bảo vệ cấp NN 2009. 01 sẽ bảo vệ năm 2010

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Kết quả Số TT

Tên sản phẩm đăng ký Theo

kế hoạch Thực tế đạt được

Ghi chú (Thời gian kết thúc)

1

Sản phẩm đăng ký sở hữu trí tuệ: Hợp chất axít 3,5 dihydroxy-4-methoxy-2-C-beta-D-glucopyranosyl-benzoic và phương pháp chiết hợp chất này từ cây ba bét lùn (Mallotus nanus)

01 01

Quyết định chấp nhận đơn hợp lệ số 3217/QĐ-SHTT ngày 2 tháng 2 năm 2009, Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ KH và CN Việt Nam

2. Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ: - Đã tranh thủ tiếp cận thông tin, bí quyết công nghệ và trang thiết bị tiến tiến trong lĩnh vực đánh giá chất lượng dược liệu của phía đối tác Bỉ. Qua đó đã góp phần hỗ trợ các nhà khoa học trong nước tiếp cận nhanh với các nghiên cứu khoa học mà phía đối tác đang thực hiện, phục vụ phát triển và nâng cao năng lực nghiên cứu trong lĩnh vực đánh giá chất lượng dược liệu.

- Đã phát hiện được những chất có hoạt tính sinh học thú vị và đã thực hiện được những đánh giá về hoạt tính, phân tích các mẫu phức tạp mà trong nước chưa thực hiện được. Qua đó góp phần nâng cao năng lực đội ngũ cán bộ khoa học và công nghệ của Việt Nam theo tiêu chuẩn quốc tế. b) Hiệu quả về kinh tế xã hội: - Góp phần mở rộng giao lưu và hội nhập quốc tế của cộng đồng khoa học và công nghệ Việt Nam, tham gia Nhiệm vụ nghị định thư với tư cách là một bộ phận quan trọng trong hoạt động đối ngoại của đất nước - Góp phần tạo ra những sản phẩm có giá trị dược dụng phục vụ chương trình chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký)

Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

Danh môc ch÷ viÕt t¾t

MS Phæ khèi lîng Mass Spectroscopy

ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry HR-FAB-MS Phæ khèi lîng ph©n gi¶i cao b¾n ph¸ nguyªn tö nhanh

High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry FT-ICR-MS Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry 13C-NMR Phæ céng hëng tõ h¹t nh©n cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR Phæ céng hëng tõ h¹t nh©n proton

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy DEPT Distoritionless Enhancement by Polarization Transfer 2D-NMR Phæ céng hëng tõ h¹t nh©n hai chiÒu

Two Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity IR Phæ hång ngo¹i - Infrared Spectroscopy NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy [α]D §é quay cùc - Specific Optical Rotation mp. §iÓm ch¶y - Melting Point HPLC S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao

High Performance Liquid Chromatography TLC S¾c ký líp máng - Thin Layer Chromatography CC S¾c ký cét - Column Chromatography Rha Rhamnose Glc Glucose Ac Nhãm axetyl Me Nhãm metyl MeOH Metanol EtOAc Etyl Axetat DMSO Dimetyl Sulfoxit IC50 Nång ®é øc chÕ 50% - 50% Inhibition Concentration

Môc lôc Më ®Çu 1

PhÇn I: Tæng quan, m« h×nh vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu 3

Ch¬ng I. Tæng quan vÒ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu 3

I.1. Tæng quan vÒ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu trªn thÕ giíi. 3

I.2. Tæng quan hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña mét sè loµi Mallotus trªn thÕ giíi

5

I.3. Tæng quan vÒ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu ë ViÖt Nam. 25

I.4. Mét sè øng dông cña ph¬ng ph¸p s¾c ký fingerprint trong ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu

28

Ch¬ng II. M« h×nh nghiªn cøu vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu 34

II.1. M« h×nh nghiªn cøu. 34

II.2. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu. 34

II.2.1. Ph¬ng ph¸p thu thËp mÉu vµ gi¸m ®Þnh tªn ph©n lo¹i 34

II.2.2. Ph¬ng ph¸p xö lý mÉu, t¹o dÞch chiÕt vµ sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc.

35

II.2.3. Ph¬ng ph¸p ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc 36

II.2.4.Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu vÒ an toµn chÕ phÈm. 42

II.2.5. Ph¬ng ph¸p Fingerprint trong kiÓm so¸t chÊt lîng dîc liÖu. 43

PhÇn II: KÕt qu¶ nghiªn cøu 63

Ch¬ng III. KÕt qu¶ thu thËp mÉu, t¹o dÞch chiÕt vµ x©y dùng c¬ së d÷ liÖu 63

Ch¬ng IV. KÕt qu¶ sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc 81

Ch¬ng V. KÕt qu¶ nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc mét sè loµi Mallotus cña ViÖt Nam.

92

Ch¬ng VI. KÕt qu¶ nghiªn cøu t¹o s¶n phÈm thùc phÈm chøc n¨ng 232

VI.1. T¹o s¶n phÈm thùc phÈm chøc n¨ng viªn nang Mallotus 232

VI.2. KÕt qu¶ øng dông ph¬ng ph¸p fingerprint trong ®¸nh gi¸ chÊt lîng viªn nang Mallotus

236

VI.3. X©y dùng ph¬ng ph¸p fingerprint trong ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu Mallotus ë ViÖt Nam

238

PhÇn III: KÕt luËn vµ ®¸nh gi¸ chung 262

DANH Môc c¸c s¶n phÈm ®· hßan thµnh vµ ®¸nh gi¸ 264

Tµi liÖu tham kh¶o 268

Phô lôc danh môc c¸c s¶n phÈm 278

1

Më ®Çu

Th¶o dîc thêng cã mÆt ë nhiÒu n¬i trªn thÕ giíi, ®Æc biÖt lµ çc khu vùc nhiÖt ®íi. Th¶o dîc hiÖn ®ang ®ãng vai trß quan träng trong çc liÖu ph¸p ch÷a bÖnh b»ng y häc cæ truyÒn t¹i çc níc ph¬ng §«ng. Th¶o dîc kh«ng nh÷ng mang ®Õn çc nguån lîi vÒ dîc häc cho céng ®ång d©n c sinh sèng t¹i nh÷ng n¬i cã th¶o dîc mµ cßn ®ãng gãp vµo çc liÖu ph¸p ch÷a bÖnh cho céng ®ång ë nh÷ng khu vùc kh¸c. H¬n thÕ n÷a, trong y häc hiÖn ®¹i ngêi ta cßn sö dông th¶o dîc trong nh÷ng liÖu ph¸p trÞ bÖnh trùc tiÕp theo nh÷ng liÖu ph¸p cña y häc cæ truyÒn, trong viÖc lµm nguyªn liÖu c¬ së cho çc qu¸ tr×nh tæng hîp hoÆc b¸n tæng hîp çc lo¹i dîc phÈm phøc t¹p, çc hîp chÊt ph©n lËp ®îc tõ th¶o dîc cßn ®îc sö dông lµm chÊt kh¬i mµo trong tæng hîp çc hîp chÊt míi cã ý nghÜa cao trong y häc vµ cuèi cïng th¶o dîc cã thÓ ®îc sö dông nh çc chØ thÞ trong ph©n lo¹i thùc vËt ®Ó gióp sù nghiªn cøu qu¸ tr×nh h×nh thµnh çc hîp chÊt míi. Trong nhiÒu n¨m gÇn ®©y, th¶o dîc ®· thu hót nhiÒu sù quan t©m cña çc nhµ dîc häc vµ y häc cña ph¬ng t©y. Bëi v× çc t¸c dông dîc lý cao, kh¶ n¨ng g©y ®éc thÊp vµ rÊt Ýt çc biÕn chøng phô so víi t©y dîc. Theo nh÷ng ®¸nh gi¸ cña tæ chøc y tÕ thÕ giíi WHO, cho ®Õn nµy cã kho¶ng 80% d©n sè trªn thÕ giíi thùc sù tin vµo liÖu ph¸p ch÷a bÖnh b»ng y häc cæ truyÒn. Trong ®ã mét phÇn lín cña liÖu ph¸p ch÷a bÖnh b»ng y häc cæ truyÒn liªn quan ®Õn viÖc sö dông çc th¶o dîc hoÆc çc thµnh phÇn ho¹t tÝnh cña th¶o dîc. Còng theo ®¸nh gi¸ trªn cã kho¶ng 25% ®¬n thuèc t¹i Mü (TÝnh tõ n¨m 1959 ®Õn 1980) cã ®Ò cËp ®Õn çc th¶o dîc hoÆc çc thµnh phÇn chÝnh ®îc chiÕt xuÊt tõ th¶o dîc. Riªng n¨m 1980 ngêi tiªu dïng t¹i Mü ®· chi 8 tØ ®« la ®Ó tiªu thô çc s¶n phÈm cã nguån gèc tõ th¶o dîc. Çc nghiªn cøu trªn toµn thÕ giíi cña tæ chøc y tÕ thÕ giíi còng kh¼ng ®Þnh tÇm quan träng cña th¶o dîc. Tuy nhiªn, sù gi¸o dôc, ®µo t¹o vµ nghiªn cøu mét çch bµi b¶n trong lÜnh vùc y häc cæ truyÒn cha thùc sù ®¹t ®îc nh÷ng chuÈn mùc nh t©y dîc. Ngay c¶ çch ®¸nh gi¸ ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh lîng vÒ møc ®é an toµn vµ hiÖu lùc cña y häc truyÒn thèng cßn rÊt thiÕu hôt vµ cha ®¹t ®îc nh÷ng tiªu chÝ cÇn thiÕt ®Ó gióp cho viÖc sö dông y häc cæ truyÒn réng kh¾p trªn ph¹m vi toµn thÕ giíi nh t©y dîc. Lý do cho sù thiÕu hôt trªn mét phÇn lµ do çc chÝnh s¸ch ch¨m sãc søc khoÎ céng ®ång vµ phæ biÕn kiÕn thøc y häc cæ truyÒn, phÇn cßn l¹i lµ do sù thiÕu hôt trong viÖc x©y dùng çc ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ y häc cæ truyÒn mét çch cã bµi b¶n. Kh¸c h¼n so víi t©y dîc, th¶o dîc vµ çc s¶n phÈm tõ th¶o dîc thêng tån t¹i rÊt nhiÒu çc thµnh phÇn ho¸ häc phøc t¹p. T¬ng t¸c gi÷a çc thµnh phÇn phøc t¹p nµy cã thÓ lµ mét phÇn cña liÖu ph¸p ch÷a bÖnh b»ng y häc cæ truyÒn vµ còng chÝnh çc thµnh phÇn nµy còng g©y rÊt nhiÒu khã kh¨n trong viÖc x¸c ®Þnh thµnh phÇn nµo cã t¸c dông chÝnh trong çc liÖu ph¸p ch÷a bÖnh. Nh vËy, nghiªn cøu cµng nhiÒu çc

2

thµnh phÇn cã mÆt trong th¶o dîc sÏ gãp phÇn ®a th¶o dîc tiÕn gÇn nh÷ng tiªu chÝ cÇn thiÕt ®Ó cã thÓ gióp cho viÖc sö dông y häc cæ truyÒn réng h¬n.

Ngµy nµy cã rÊt nhiÒu ph¬ng ph¸p vµ c«ng cô ®Ó nghiªn cøu çc thµnh phÇn ho¸ häc cã mÆt trong th¶o dîc ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt lîng th¶o dîc. VÝ dô nh ph¬ng ph¸p ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc th«ng thêng, ph¬ng ph¸p nµy cã thÓ ph¸t hiÖn vµ ph©n lËp ®îc mét sè hîp chÊt trong th¶o dîc. Tuy nhiªn trong th¶o dîc tån t¹i rÊt nhiÒu hîp chÊt, nhiÒu hîp chÊt chØ tån t¹i víi hµm lîng rÊt thÊp, ®«i khi kh«ng bÒn, d¹ng ®ång ph©n, dÔ bÞ ph©n huû ngay khi ®îc ph©n lËp. Do ®ã viÖc sö dông ph¬ng ph¸p ph©n lËp th«ng thêng gÆp rÊt nhiÒu khã kh¨n trong viÖc ®¸nh gi¸ chÊt lîng cña th¶o dîc. Trong ®iÒu kiÖn ®ã, mét ph¬ng ph¸p ®ang ®îc ph¸t triÓn vµ øng dông ®ã lµ ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký, ph¬ng ph¸p nµy ®îc øng dông trong viÖc ®¸nh gi¸, kiÓm so¸t chÊt lîng dîc liÖu.

B¸o ço tæng hîp nµy ®Ò cËp ®Õn: - Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ ho¸ häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña mét sè loµi

dîc liÖu ë ViÖt Nam - M« h×nh, ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký vµ çch thùc hiÖn ph¬ng ph¸p

dÊu v©n tay s¾c ký trong øng dông bíc ®Çu kh¶o s¸t nguyªn liÖu loµi th¶o dîc Mallotus cña ViÖt nam

- KÕt qu¶ øng dông ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trong viÖc ®¸nh gi¸ chÊt lîng cña chÕ phÈm thùc phÈm chøc n¨ng viªn nang Mallotus, mét s¶n phÈm øng dông cña ®Ò tµi trong lÜnh vùc thùc phÈm chøc n¨ng.

3

PhÇn I: Tæng quan, m« h×nh vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu Ch¬ng I. Tæng quan vÒ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu I.1. Tæng quan vÒ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ dîc liÖu trªn thÕ giíi.

Theo tæ chøc y tÕ thÕ giíi WHO, cã 80% d©n sè thÕ giíi n»m ë khu vùc çc níc ®ang ph¸t triÓn vµ 80% d©n sè ë çc níc ®ang ph¸t triÓn sö dông th¶o dîc nh mét lùa chän hµng ®Çu trong ®iÒu trÞ vµ ch¨m sãc søc khoÎ. Theo dù ®o¸n, d©n sè thÕ giíi sÏ ®¹t 10 tû ngêi vµo nöa cuèi thÕ kû 21. Víi sù gia t¨ng d©n sè khæng lå, nhu cÇu sö dông hiÖu qu¶ çc ph¬ng ph¸p ch¨m sãc søc kháe céng ®ång ngµy cµng lµ mét th¸ch thøc lín ®èi víi nh©n lo¹i. Cïng víi sù c¹n kiÖt cña çc nhiªn liÖu tù nhiªn nh than ®¸, dÇu má, viÖc sö dông çc dîc phÈm tæng hîp còng sÏ gÆp rÊt nhiÒu khã kh¨n. Bªn c¹nh ®ã, viÖc ph¸t sinh çc lo¹i bÖnh míi còng nh sù kh¸ng thuèc cña çc nh©n tè viªm nhiÔm còng lµ mét th¸ch thøc lín cÇn gi¶i quyÕt. Híng ®i phï hîp gi¶i quyÕt çc vÊn ®Ò trªn cã lÏ lµ ph¸t triÓn çc dîc phÈm míi cã nguån gèc thùc - ®éng vËt phôc vô cho viÖc ch¨m sãc søc kháe vµ kÐo dµi tuæi thä con ngêi.

Ngîc dßng lÞch sö cho thÊy cha «ng ta ®· sö dông thùc vËt nh lµ nguån dîc liÖu chñ yÕu trong phßng ch÷a bÖnh. §Õn kho¶ng gi÷a thÕ kû 19, cã Ýt nhÊt 80% çc lo¹i thuèc ®Òu cã nguån gèc tõ th¶o dîc. Sau ®ã, cuéc çch m¹ng c«ng nghiÖp ®· dÉn ®Õn sù thèng trÞ cña çc thuèc tæng hîp, tuy vËy, th¶o dîc vÉn t×m ®îc chç ®øng cña m×nh trong ®êi sèng nh©n d©n. ThËm chÝ cho ®Õn nay, thùc vËt vÉn hÇu nh lµ nguån cung cÊp chÝnh trong ph¸t triÓn çc lo¹i thuèc míi trªn thÕ giíi. Çc dîc phÈm cã nguån gèc tù nhiªn chiÕm tíi 50% tæng sè dîc phÈm ®ang ®îc sö dông trong l©m sµng vµ 25% tæng sè thuèc cã nguån gèc thùc vËt bËc cao. Trong sè 520 thuèc míi ®îc c«ng nhËn trªn thÞ trêng tõ 1983 ®Õn 1994, cã tíi 39% thuèc cã nguån gèc thiªn nhiªn, 60 – 80% thuèc kh¸ng sinh, chèng ung th xuÊt ph¸t tõ s¶n phÈm tù nhiªn. Trong sè 20 thuèc b¸n ch¹y nhÊt trªn thÞ trêng thuèc n¨m 1999, cã 9 s¶n phÈm cã nguån gèc tõ thiªn nhiªn: simvastatin, lovastatin, enalapril, pravastatin, atorvastatin, augmentin, ciprofloxaxin, clarithrommycin vµ cyclosporin víi doanh thu hµng n¨m lªn ®Õn 16 tû ®« la. Ngêi ta còng íc tÝnh r»ng doanh sè th¶o dîc vµ çc s¶n phÈm cña nã ®¹t trªn 100 tû ®« la/n¨m.

Sau hµng thÕ kû sö dông th¶o dîc dùa trªn kinh nghiÖm, nh÷ng ho¹t chÊt ®Çu tiªn ®· ®îc ph©n lËp vµo ®Çu thÕ kû 19 (morphine, strychnine, quinine) ®¸nh dÊu bíc chuyÓn m×nh trong viÖc sö dông c©y thuèc, më ra mét thêi kú míi nghiªn cøu vÒ c©y thuèc trªn thÕ giíi. Tuy nhiªn, sù quan t©m cña thÕ giíi ®· chuyÓn sang ph¸t triÓn çc dîc phÈm cã nguån gèc tæng hîp hay tõ çc vi sinh vËt sau nh÷ng n¨m 1945. Cho tíi 2 thËp kû gÇn ®©y, viÖc ph¸t triÓn dîc phÈm cã nguån gèc thùc vËt l¹i t¨ng lªn mét çch ®¸ng kÓ. Sù thiªu thô th¶o dîc ë çc níc ph¬ng T©y t¨ng gÊp ®«i trong thêi kú nµy. Nh÷ng c«ng ty dîc phÈm lín ®· cho thÊy sù quan

4

t©m trë l¹i ®èi víi viÖc nghiªn cøu ph¸t triÓn t×m kiÕm çc ho¹t chÊt sinh häc tõ th¶o dîc. Th¶o dîc ngµy nay ®îc sö dông chñ yÕu ë 2 d¹ng: 1. Trong hçn hîp çc thµnh phÇn kh¸c nhau (hçn hîp tinh dÇu, dÞch chiÕt, dÞch c«, chng cÊt…) 2. Ho¹t chÊt ®¬n lÎ: Çc ho¹t chÊt ®¬n lÎ ®îc cho lµ çc thµnh phÇn cã ho¹t tÝnh chÝnh trong th¶o dîc, chóng thÓ hiÖn ho¹t tÝnh rÊt cao, ®Æc hiÖu, yªu cÇu liÒu dïng vµ çch sö dông chÝnh x¸c. Ngîc l¹i, viÖc sö dông çc dÞch chiÕt, hçn hîp thêng ®îc ¸p dông cho çc th¶o dîc thÓ hiÖn dîc tÝnh thÊp hoÆc ho¹t chÊt chñ yÕu cña chóng cha ®îc ph¸t hiÖn.

ViÖc ph¸t triÓn çc ho¹t chÊt lµm thuèc tõ thùc vËt bËc cao hiÖn vÉn cßn ®îc khai ph¸ réng r·i. Trong kho¶ng 250.000 – 500.000 loµi thùc vËt trªn thÕ giíi, míi cã 1 – 2% lµ ®îc nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc. Mét trong nh÷ng nç lùc lín trong viÖc ph¸t hiÖn çc ho¹t chÊt sinh häc ®· ®îc thùc hiªn bëi ViÖn Nghiªn cøu Ung th Quèc gia Hoa kú. Trong kho¶ng thêi gian tõ 1957 cho tíi nay, ®· cã trªn 35000 loµi ®îc thu thËp tõ kh¾p n¬i trªn thÕ giíi ®Ó nghiªn cøu ho¹t tÝnh chèng ung th. Tr¶i qua thêi kú nghiªn cøu l©u dµi nh vËy nhng cho tíi nay míi cã 5 ho¹t chÊt ®îc ®a vµo thö nghiÖm l©m sµng vµ cha cã mét ho¹t chÊt nµo cã mÆt trªn thÞ trêng thuèc th«ng qua qu¸ tr×nh trªn. Nh÷ng loµi nµy vÉn ®îc coi lµ cha nghiªn cøu ®èi víi çc ho¹t tÝnh kh¸c. Qu¸ tr×nh ph¸t hiÖn çc ho¹t chÊt hµng ®Çu tõ thùc vËt ®Õn viÖc ph¸t triÓn çc dîc chÊt ®ã lµ mét qu¸ tr×nh l©u dµi, gian khæ, yªu cÇu sù phèi hîp chÆt chÏ, liªn ngµnh gi÷a çc nhµ khoa häc nh thùc vËt häc, dîc häc cæ truyÒn, hãa häc, dîc häc, ®éc tÝnh häc…

Trong kho¶ng 20 n¨m gÇn ®©y, míi chØ cã vµi thuèc míi cã nguån gèc tõ thiªn nhiªn ®îc giíi thiÖu trªn thÞ trêng. §iÓn h×nh nh Taxol, mét ditecpen ph©n lËp tõ c©y th«ng (Taxus brevifolia Nutt.), lµ mét chÊt chèng ung th hiÖu qu¶. Ngµy nay ho¹t chÊt nµy ®îc s¶n xuÊt dùa trªn qu¸ tr×nh b¸n tæng hîp sö dông nguyªn liÖu lµ çc tinh thÓ ph©n lËp tõ c©y Th«ng ®á Taxus baccata L. Ngoµi ra, mét sè thuèc chèng ung th cã nguån gèc thùc vËt nh docetaxel hay camtothecin còng lµ çc vÝ dô ®¸ng quan t©m. Artemisinin, mét thuèc chèng sèt rÐt míi ®îc ph¸t hiÖn gÇn ®©y ®· cho thÊy hiÖu qu¶ cña viÖc nghiªn cøu ph¸t hiÖn çc nguån dîc liÖu thiªn nhiªn. Thùc tÕ cho thÊy viÖc nghiªn cøu ph¸t triÓn thuèc tõ nguån gèc thiªn nhiªn cã hiÖu qu¶ h¬n rÊt nhiÒu so víi çc thuèc tõ qu¸ tr×nh tæng hîp bëi v× çc hîp chÊt thiªn nhiªn cã cÊu tróc ®a d¹ng vµ phøc t¹p h¬n rÊt nhiÒu so víi çc chÊt tæng hîp hiÖn nay. Thªm vµo ®ã, çc ho¹t chÊt tõ tù nhiªn cã ph©n tö khèi nhá, phï hîp víi çc ho¹t ®éng dîc häc, chóng sÏ dÔ dµng hÊp thu trong c¬ thÓ. Ngêi ta tÝnh r»ng tû lÖ ph¸t hiÖn thµnh c«ng mét dîc phÈm cã nguån gèc thiªn nhiªn lµ 1/125 so víi 1/10.000 ®èi víi çc dîc phÈm cã nguån gèc tæng hîp. Ngµy nay, ngµy cµng cã nhiÒu c«ng nghÖ míi víi thiÕt bÞ hiÖn ®¹i ®îc øng dông trong nghiªn cøu ph¸t triÓn çc thuèc míi tõ th¶o dîc. Çc kü thuËt hãa häc tæ hîp (Combinatorial

5

Chemistry), sµng läc hµng lo¹t (High Throughput Screening), çc kü thuËt phæ hiÖn ®¹i, çc kü thuËt s¾c ký míi (HPLC, CE, HPTLC…) vµ çc kü thuËt s¾c ký phèi hîp (chromatography hyphenated tecniques) nh LC/MS, LC/MS/MS, LC/NMR hiÖn ®· trë thµnh çc c«ng cô hµng ngµy trong çc phßng thÝ nghiÖm ph¸t triÓn thuèc trªn thÕ giíi. Tuy nhiªn, hiÖu qu¶ thu ®îc l¹i cha ®îc nh mong muèn. Nh ®· ®Ò cËp ë trªn, viÖc ph¸t triÓn çc thuèc míi vÉn cha thu ®îc nh÷ng kÕt qu¶ kh¶ quan. VËy ®©u lµ nguyªn nh©n dÉn ®Õn nh÷ng khã kh¨n trªn?

Gi¸ trÞ cña hãa häc tæ hîp vµ sµng läc hµng lo¹t trong viÖc ph¸t hiÖn t×m kiÕm thuèc hiÖn ®ang lµ mét dÊu hái lín. VÝ dô hãa häc tæ hîp cã thÓ h÷u dông trong t×m kiÕm çc ho¹t chÊt nhanh chãng h¬n, tuy vËy, chóng kh«ng thÓ ph¸t hiÖn nh÷ng t¬ng t¸c hçn hîp cña çc thµnh phÇn kh¸c cã ¶nh hëng tíi ho¹t ®éng cña ho¹t chÊt chÝnh ®ã. Nguyªn nh©n chñ yÕu ®ã lµ nh÷ng kü thuËt nµy ®îc ¸p dông mµ thiÕu sù hîp lý, h¬n n÷a sù s¸ng t¹o, suy luËn khoa häc hÇu nh kh«ng ®îc xem xÐt ®Õn. KÕt qu¶ lµ viÖc ph¸t triÓn thuèc ®ang ngµy cµng trë nªn tèn kÐm vµ ®ßi hái nç lùc l©u dµi (ngêi ta íc tÝnh ph¶i tèn kho¶ng 600-800 triÖu ®« la ®Ó ®a mét s¶n phÈm thuèc tõ phßng thÝ nghiÖm ra thÞ trêng trong kho¶ng thêi gian 5-7 n¨m).

V× vËy, ®Ó qu¸ tr×nh t×m kiÕm, ph¸t triÓn thuèc tõ nguån dîc liÖu cÇn cã nh÷ng bíc tiÕp cËn ®óng ®¾n, khoa häc. Theo ®ã, viÖc hiÓu râ vµ sö dông hiÖu qu¶ sù ®a d¹ng hãa häc cña çc s¶n phÈm tù nhiªn cã lÏ lµ ch×a khãa cho thµnh c«ng. Sù kÕt hîp gi÷a nh÷ng hiÓu biÕt vÒ y häc cæ truyÒn vµ ¸p dông tiÕn bé cña khoa häc sÏ ®em l¹i hiÖu qu¶ cao h¬n cho qu¸ tr×nh trªn. Thùc tÕ ®· chøng minh r»ng çc thuèc cã nguån gèc thùc vËt trªn thÞ trêng ®Òu ®îc ph¸t hiÖn qua qu¸ tr×nh nghiªn cøu gi¸ trÞ sö dông cña çc c©y thuèc trong y häc d©n téc. Do ®ã, sù phèi hîp gi÷a çc nhµ thùc vËt häc, dîc häc cæ truyÒn, hãa häc vµ y häc trong ph¸t triÓn çc dîc phÈm míi lµ híng ®i tÊt yÕu, ®¶m b¶o cho sù ph¸t triÓn thµnh c«ng cña lÜnh vùc nghiªn cøu c©y thuèc trong t¬ng lai. I.2. Tæng quan hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña mét sè loµi Mallotus trªn thÕ giíi Chi ba bÐt (Mallotus) lµ mét chi kh¸ lín, gåm kho¶ng 150 loµi, ph©n bè t¹i çc khu vùc tõ Ên §é, Sri Lanka ®Õn Th¸i Lan, Lµo, Campuchia, ViÖt Nam vµ kh¾p vïng Malesian. VÒ phÝa Nam, chóng ph©n bè tíi miÒn §«ng Fiji, miÒn B¾c vµ §«ng Australia. Lªn phÝa B¾c, cã thÓ b¾t gÆp kh¸ nhiÒu loµi ph©n bè t¹i Trung Quèc, TriÒu Tiªn vµ NhËt B¶n. RÊt nhiÒu loµi Mallotus ®· ®îc sö dông lµm thuèc ®Ó ch÷a nhiÒu lo¹i bÖnh kh¸c nhau nh: bôc nói cao M. japonicus ®îc sö dông trong y häc d©n téc Trung Quèc ®Ó ch÷a bÖnh viªm loÐt d¹ dµy, t¸ trµng vµ ®iÒu hßa çc chøc phËn cña bé m¸y tiªu hãa nãi chung; ë níc ta loµi bai b¸i M. contubernalis lµm thuèc ch÷a çc bÖnh thÊp khíp, u phong, môn nhät, ngøa; loµi bôc trên M. repandus ®îc sö dông t¹i Th¸i Lan ®Ó ch÷a bÖnh viªm d¹ dµy, viªm ®au gan, viªm ®au khíp vµ ch÷a r¾n ®éc c¾n...

6

Çc loµi Mallotus lµ çc c©y thuèc quý, chøa nhiÒu chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc ®¸ng quan t©m. Nh»m mang ®Õn cho ®éc gi¶ mét çi nh×n kh¸i qu¸t çc nghiªn cøu vÒ thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tinh sinh häc chi Mallotus, trong ch¬ng nµy chóng t«i tr×nh bµy tæng quan çc nghiªn cøu ®· ®îc c«ng bè trªn thÕ giíi vÒ thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña mét sè loµi Mallotus ®iÓn h×nh.

I.2.1. Hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus japonicus

Thµnh phÇn hãa häc cña loµi M. japonicus ®îc çc nhµ khoa häc NhËt B¶n quan t©m vµ nghiªn cøu tõ rÊt sím, n¨m 1939 hîp chÊt bergenin (1) ®· ®îc ph¸t hiÖn tõ vá c©y vµ ®Õn n¨m 1949 hîp chÊt rutin ®îc ph¸t hiÖn tõ l¸ cña loµi nµy6.

O

O

HO

H3C

O

OH

CH2OH

HOH

OH

H

1

R1

HHO

OH

OO

H

R2

3

R1 R2 2 CHO H 3 CH3 OH 4 CH2OH H 5 CH2OH OH

N¨m 2000, çc nhµ khoa häc Hµn Quèc ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu kh¶ n¨ng gi¶i ®éc gan cña bergenin ph©n lËp tõ loµi M. japonicus b»ng ph¬ng ph¸p thö nghiÖm trªn tÕ bµo gan chuét nu«i cÊy ®· ®îc g©y ®éc b»ng cacbon tetrachloride (CCl4). KÕt qu¶ cho thÊy, bergenin lµm gi¶m m¹nh ho¹t lùc cña çc enzym glutamic, piruvic transaminaz vµ sorbitol dehydrogenaz ®îc gi¶i phãng tõ çc tÕ bµo gan ®· g©y ®éc b»ng CCl4. T¸c dông gi¶i ®éc gan cña bergenin còng ®îc chøng minh b»ng çch ®¸nh gi¸ ho¹t lùc cña çc enzym glutathione S-transferaz vµ glutathione reductaz vµ hµm lîng cña glutathione trong tÕ bµo gan ®· g©y ®éc b»ng CCl4

7. Ngoµi ra, t¸c dông cña hîp chÊt nµy lªn çc tÕ bµo chuét ®· ®îc g©y ®éc b»ng D-galactosamine còng ®· ®îc nghiªn cøu. ë nång ®é 100 µM, bergenin lµm gi¶m sù tiÕt cña çc enzym glutamic piruvic transaminaz vµ sorbitol dehydrogenaz ra m«i trêng trong 14 h víi 1,5 mM galactosamine t¬ng øng lµ 50,9 vµ 45%. §ång thêi, sù suy gi¶m tæng hîp ARN kÝch thÝch bëi galactosamine (1,5 mM) ®îc phôc håi bëi bergenin (100 µM) cao h¬n 2,5 lÇn so víi ®èi chøng8. N¨m 1975, tõ h¹t loµi M. japonicus thu thËp t¹i ngo¹i « thµnh phè Fukuoka, NhËt B¶n, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Okabe ®· ph©n lËp ®îc 8 hîp chÊt glycosit tim (cardiac glycoside) trong ®ã cã 3-O-α-L-rhamnopyranoside vµ 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosides cña corotoxigenin (2), mallogenin (3), coroglaucigenin (4) vµ panogenin (5). CÊu tróc hãa häc cña chóng ®îc x¸c ®Þnh b»ng çc d÷ kiÖn h»ng sè vËt lý, phæ céng hëng tõ h¹t nh©n proton (1H-NMR) kÕt hîp víi çc ph¬ng ph¸p hãa häc (thñy ph©n vµ chuyÓn hãa).6

7

COCH3

OHHO

H3C

OCH3

HOCOCH3

OH

CH3

OCH3

COCH3

OHHO

H3C

OCH3

HOCOCH3

OH

O

AcOHHO

H3C

OCH3

HOAc

OH

ROH

AcOHHO

H3C

OCH3

HOCO-R

OH

OH

10

11

6 R = CH2CH=CMe27 R = CH2CHOHC(Me)=CH2

8 R = CH2CH2Me9 R = CHMe2

Çc dÉn xuÊt phloroglucinol tõ loµi M. japonicus ®îc çc nhµ khoa häc quan t©m vµ nghiªn cøu kü nhÊt. N¨m 1983, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Shigematsu c«ng bè sù ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña 02 dÉn xuÊt phloroglucinol míi lµ 3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-methoxybenzyl)-phloracetophenone (6) vµ 3-(3,3-dimethyl-2-hydroxybut-3-enyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-methoxybenzyl)-phloroacetophenone (7) tõ qu¶ ®· bá h¹t cña loµi M. japonicus9. §Õn n¨m 1985, nhãm nghiªn cøu nµy c«ng bè thªm 2 dÉn xuÊt phloroglucinol míi n÷a lµ 3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-methoxybenzyl )-phlorobutyrophenone (8) vµ -phloroisobutyrophenone (9)10. Còng trong n¨m 1985, hai dÉn xuÊt phloroglucinol míi ®îc ®Æt tªn lµ mallotophenone (10) vµ mallotochromene (11), cïng víi hai hîp chÊt ®· ®îc biÕt ®Õn lµ 3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-methoxybenzyl)-phlora-cetophenone vµ 2,6-dihydroxy-3-methyl-4-methoxyacetophenone ®îc ph©n lËp tõ vá qu¶ loµi M. japonicus thu thËp t¹i Sugitani, Toyama, NhËt B¶n. Çc hîp chÊt 10, 11 vµ 2,6-dihydroxy-3-methyl-4-methoxyacetophenone thÓ hiÖn ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo cao trªn çc dßng tÕ bµo ung th KB vµ L-5178Y víi gi¸ trÞ ED50 t¬ng øng lµ 0,58/0,74, 2,40/6,10 vµ 2,10/1,25 μg/ml11.

Ac

OHHO

H3C

OCH3

HO

CO-R

OH

OH

OH

AcOHHO

H3C

OCH3

HO

CO-R

OH

O

OH

12 R = Propyl16 R = Isopropyl

13 R = Me13a R = n-Butyl14 R = Propyl15 R = Isopropyl

N¨m 1986, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Arisawa tiÕp tôc c«ng bè sù ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña mallotolerin (12) vµ mallotochromanol (13) tõ vá qu¶ loµi Mallotus japonicus. Hîp chÊt 12 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo cao trªn çc dßng tÕ bµo KB vµ L-5178Y víi gi¸ trÞ ED50 t¬ng øng lµ 0,95 vµ 0,82 μg/ml12. Çc nghiªn cøu tiÕp theo cña nhãm t¸c gi¶ nµy vÒ thµnh phÇn hãa häc cña vá qu¶ loµi M.

8

japonicus ®· ph©n lËp thªm ®îc bèn dÉn xuÊt phloroglucinol míi lµ butyrylmallotochromene (14) and isobutyrylmallotochromene (15), isomallotolerin (16) and isomallotochromanol (17). Çc hîp chÊt 14, 15, 16 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo cao trªn dßng tÕ bµo KB víi ED50 t¬ng øng lµ 2,55, 0,4 vµ 0,84 μg/ml13,14.

Ac

OHHO

H3C

OCH3

HOAc

OH

OR

COCH3

OHHO

H3C

OCH3

HOCOCH3

OH

OH17 R = OH17a R = H 18

B¶ng I.2.1.a. Tæng hîp ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo cña çc dÉn xuÊt phloroglucinol trªn çc dßng tÕ bµo ung th nu«i cÊy kh¸c nhau (IC50 µg/ml)15

Dßng tÕ bµo Hîp chÊt

KB Hep-2 PC-13 B16 L5178Y P338

Mallophenone >20 >20 >20 >20 >20 >20

2,6-Dihydroxy-3-methyl-4-

methoxyacetophenone >20 >20 >20 >20 >20 >20

Mallotophenone (10) 2,40±0,17 6,30±0,60 3,75±0.24 4,80±0,23 3,65±0,49 10,08±0,58

Mallotojaponin (18) 0,58±0.03 0,60±0,04 0,54±0,04 0,70±0,06 0,81±0,08 1,14±0,05

Butyrylmallotojaponin 0,72±0,07 0,41±0,03 0,91±0,02 0,60±0,03 1,08±0,10 2,85±0,03

Isobutyrylmallotojaponin 0.98±0,10 1,10±0,12 3,05±0,43 1,75±0,92 2,50±0,40 3,00±0,45

Mallotochromene (11) 2,10±0,18 0,72±0,14 0,82±0,02 1,08±0,19 1,26±0,31 1,71±0,31

Butyrylmallotochromene (14) 3,03±0,18 1,70±0,25 1,30±0,18 1,29±0,09 2,36±0,32 3,40±0,35

Isobutyrylmallotochromene (15) 0,40±0,03 1,08±0,21 1,77±0,06 1,44±0,05 2,78±0,16 4,03±0,56

Isomallotochromene 2.20±0,12 - - - - -

Mallotolerin (12) 1,22±0,12 1,08±0,08 1,53±0,12 1,01±0,23 1,61±0,02 2,18±0,04

Butyrylmallotolerin 0,95±0,11 0,91±0,20 0,63±0,06 2,38±0,24 1,27±0,04 1,22±0,19

Isobutyrylmallotolerin 0,84±0,09 0,93±0.09 1,80±0,43 1,96±0,28 2,50±0,15 3,85±0,06

Mallotojaponol >20 >20 >20 >20 >20 >20

Mallotochromanol (13) >20 >20 >20 >20 >20 >20

Butyrylmallotochromanol (13a) 13,50±1,10 - - - - -

Isobutyrylmallotochromanol 14,60±0,55 - - - - -

Mallotochroman 8,90±0,40 - - - - -

Isomallotochromanol (17) >20 >20 >20 >20 >20 >20

Isomallotochroman (17a) 16,02±0,64 - - - - -

Trong sè 20 dÉn xuÊt phloroglucinol ®îc thö nghiÖm, cã tíi 10 hîp chÊt thÓ hiÖn ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo cao trªn tÊt c¶ çc dßng tÕ bµo thö nghiÖm. Hîp chÊt mallotojaponin (18) ®· ®îc tiÕn hµnh nghiªn cøu ho¹t tÝnh kh¸ng u in vivo trªn

9

chuét ®· bÞ g©y bÖnh b¹ch cÇu L5178Y. KÕt qu¶ cho thÊy, hîp chÊt nµy cã t¸c dông kÐo dµi thêi gian sèng cao nhÊt ë liÒu 20 mg/kg. Khi t¨ng lªn liÒu 40 mg/kg th× l¹i g©y ®éc ®èi víi c¬ thÓ chuét.15

B¶ng I.2.1.b. ¶nh hëng cña mallotojaponin (18) lªn chuét ®· g©y bÖnh b¹ch cÇu L5178Y15

Trong lîng c¬ thÓ (g) LiÒu (mg/kg) ngµy 0 ngµy 7

MSTa) (ngµy)

ILSb) (%)

Sè ç thÓ sèng sãt trªn tæng sè sau 60 ngµy thÝ nghiÖm

0 22,1 23,6 16 0/7

10 23,5 24,6 54,5 240 3/7

20 23,5 24,1 60,0 275 7/7

40 22,6 22,7 49,0 206 3/7

ThÝ nghiÖm kÕt thóc ë ngµy thø 60 sau khi cÊy çc tÕ bµo bÖnh b¹ch cÇu. a) Thêi gian sèng trung b×nh; b) Sù kÐo dµi thêi gian sèng = [MST (®iÒu trÞ)/MST (chøng)]×100 - 100

Ngoµi ra, çc dÉn xuÊt phloroglucinol cßn ®îc tiÕn hµnh thö nghiÖm ho¹t tÝnh øc chÕ sù t¸i b¶n cña virót ecpet tip 1 (HSV1 - Herpes Simplex Virus type 1) vµ ®éc tÝnh trªn tÕ bµo HeLa. ChØ sè trÞ liÖu (therapeutic index) b»ng tû sè gi÷a ®éc tÝnh vµ ho¹t tÝnh kh¸ng ecpet còng ®· ®îc x¸c ®Þnh cho tÊt c¶ çc dÉn xuÊt. TÊt c¶ çc hîp chÊt thö nghiÖm ®Òu thÓ hiÖn ®éc tÝnh víi gi¸ trÞ ID50 tõ 285 ng/ml ®Õn 49,1 µg/ml vµ ho¹t tÝnh kh¸ng ecpet víi gi¸ trÞ ED50 tõ 88 ng/ml ®Õn 48 µg/ml. TÝnh ®Æc hiÖu ®· ®îc biÕt ®Õn cña çc t¸c nh©n kh¸ng virut ®· chØ ra r»ng chØ cã çc hîp chÊt cã ho¹t tÝnh kh¸ng virut in vitro ®éc lËp so víi ®éc tÝnh Ýt nhÊt tõ 7 ®Õn 8 lÇn míi ®¸ng ®îc quan t©m ®Ó tiÕn hµnh çc nghiªn cøu tiÕp theo. Do ®ã, hîp chÊt butyrylmallotochromanol (13a) vµ isomallotochroman (17a) thÓ hiÖn ho¹t tÝnh kh¸ng virut vµ rÊt ®¸ng ®îc quan t©m ®Ó tiÕn hµnh çc nghiªn cøu s©u h¬n15.

B¶ng I.2.1.c. Tæng hîp ®éc tÝnh vµ ho¹t tÝnh kh¸ng HSV-1 cña çc dÉn xuÊt phloroglucinol15

Hîp chÊt §éc tÝnh ID50 (ng/ml)

Kh¸ng HSV-1 ED50 (ng/ml)

ChØ cè trÞ liÖu ID50/ED50

Mallophenone 14800 6180 2,4

2,6-Dihydroxy-3-methyl-4-

methoxyacetophenone 3400 18600 1,8

Mallotophenone (10) 25200 5600 4,5

Mallotojaponin (18) 365 185 2,0

Butyrylmallotojaponin 362 165 2,2

Isobutyrylmallotojaponin 340 88 3,9

Mallotochromene (11) 5500 3180 1,7

Butyrylmallotochromene (14) 3680 2080 1,8

Isobutyrylmallotochromene (15) 2200 1140 1,9

Isomallotochromene 285 116 2,5

Mallotolerin (12) 470 154 3,1

10

Butyrylmallotolerin 342 196 1,7

Mallotojaponol 2450 890 2,8

Mallotochromanol (13) 21200 1920 1,1

Butyrylmallotochromanol (13a) 2500 230 10,9

Isobutyrylmallotochromanol 6900 6600 1.0

Mallotochroman 49100 48000 1.0

Isomallotochromanol (17) 2640 655 4,0

Isomallotochroman (17a) 8800 970 9,1

N¨m 1991, bèn dÉn xuÊt phloroglucinol, mallotophenone, mallotochromene, mallotojaponin (18) vµ mallotolerin, ph©n lËp tõ vá qu¶ loµi M. japonicus ®îc tiÕn hµnh ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh øc chÕ enzym phiªn m· ngîc cña HIV. KÕt qu¶ cho thÊy, trong 4 hîp chÊt nghiªn cøu, mallotojaponin vµ mallotochromene thÓ hiÖn ho¹t tÝnh rÊt cao. Sù kh¸c nhau vÒ kh¶ n¨ng øc chÕ kh¸c nhau cña çc chÊt nµy lµ do sù mÊt ®i vµ b¶n chÊt tù nhiªn cña m¹ch bªn. KiÓu øc chÕ ho¹t ®éng cña enzym bëi mallotojaponin lµ c¹nh tranh so víi khu«n⋅måi (rA)n⋅(dT)12-18 vµ kh«ng c¹nh tranh so víi c¬ chÊt triphosphat, dTTP16.

CÆn chiÕt níc cña vá qu¶ loµi M. japonicus vµ çc dÉn xuÊt phloroglucinol: mallotophenone, mallotojaponin (18), butyrylmallo-tolerin, mallotochromanol, isomallotochromanol, isobutyrylmallotoch-romanol vµ isomallotochromene ®îc ph©n lËp tõ loµi nµy øc chÕ sù s¶n sinh Nit¬ Oxit bëi tÕ bµo chuét d¹ng ®¹i thùc bµo (murine macrophage-like cell line), RAW 264.7, ®îc ho¹t hãa bëi lipopolysaccharide (LPC) vµ Interferon-Gamma (IFN-γ). Trong ®ã, isomallotochromanol (17) thÓ hiÖn ho¹t tÝnh m¹nh nhÊt víi gi¸ trÞ IC50 = 10,7 µM17.

H×nh I.2.1.a. ¶nh hëng cña 04 dÉn xuÊt phloroglucinol lªn ho¹t lùc cña enzym phiªn m· ngîc cña HIV-116. Ho¹t lùc enzym phiªn m· ngîc ®îc ®o víi hÖ ph¶n øng cña khu«n⋅måi (rA)n⋅(dT)12-18 (A) vµ ARN phage MS-2 (B) ®· ®îc khëi ®Çu lµm måi chuÈn díi ®iÒu kiÖn tèi u cho çc måi t¬ng øng. Ký hiÖu (o) biÓu diÔn cho mallotojaponin, (•) mallotolerin, (r) mallotochromene, vµ (�) mallotophenone. Gi¸ trÞ 100% lµ 5,8 (A) vµ 2,7 (B) pmol.

11

O

OH

OHHOOHHO

HO

OCCO

O

CH2O

OR1

OOC

OH

OH

OR2HO

O

OH

CH2HO

O

O

OOC

OH

OH

OR2

CO

OH

OHOO

COO

O

OHO

OH

OHOH

O

HH

19 R1 = Galloyl, R2 = H20 R1 = H, R2 = Galloyl 22

H

Çc hîp chÊt tanin tõ loµi M. japonicus còng ®îc çc nhµ khoa häc quan

t©m nghiªn cøu kh¸ sím. N¨m 1989, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Saijo R c«ng bè sù ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña 5 hîp chÊt tanin míi lµ 1,2-di-O-galloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucose (19) vµ 1-O-digalloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucose (20), mallojaponin (21), mallonin (22) vµ mallotusinin (23), cïng víi 15 hîp chÊt ®· ®îc biÕt ®Õn lµ 2,3-(S)-HHDP-D-glucose (24), pterocaryanin B (25), 6-O-galloyl-2,3,4,6-bis-(S)-HHDP-glucose (26), 4,6-di-O-galloyl-2,3,4,6-bis-(S)-HHDP-glucose (27), 1(β),6-di-O-galloyl-2,3,4,6-bis-(S)-HHDP-glucose (28), pterocaryanin C (29), 1(β)-O-galloyl-2,3,4,6-bis-(S)-HHDP-glucose, corilagin (30), punicafolin (31), geraniin (32), elaeocarpusin (33), furosin (34), axit mallotinic (35), axit mallotusinic (36), vµ terchebin (37) tõ vá th©n loµi M. japonicus thu thËp t¹i Fukuoka, NhËt B¶n18. CÊu tróc hãa häc cña chóng ®îc x¸c ®Þnh b»ng phæ khèi lîng, phæ céng hëng tõ h¹t nh©n, kÕt hîp víi çc ph¬ng ph¸p hãa häc. Trong ®ã, hîp chÊt 35 lµ mét ellagitanin rÊt hiÕm víi nhãm cÊu tróc ®éc ®¸o 1,1'-(3,3',4,4'-tetrahydroxy)-dibenzofuran-dicarboxyl18.

O

OH

OHHOOHHO

HO

OCCO

O

CH2O

O

O

OOC

OH

OH

OR2

COOH

OHOO

COO

O

OHO

OH

OHOH

O

HH

O

OH

OHHOOHHO

HO

OCCO

O

CH2O

O

O

OOC

OH

OH

OR2

HO

HO OH

OH

O

OCCO

21 23

H

HO

HO OH

O

O

OCO

CO

OH HO OH

OH

HOOC 38

DHHDP:

HO OHO

OH

OH

COCO

OHO

H

OH

OH

OR2

OC

COOH

OHOO

COO

O

OHO

OH

OHOH

O

HHH

HO OHO

OH

OH

COCO

O HOH

(R)HHDP:

O

HOOC

OH

OHHOOHHO

HO

OC CO

HO OH

OHHOOHHO

HO

OC CO

OHG: Ela:

(R)Val:

12

O

OR2O

O

HO

HO OH

OH

OH

CC

OR1

R3O

OO

HO R1 R2 R3 24 H H H 25 H G H 26 H H G 27 H G G 28 (β)G H G 29 (β)G G G

O

OR2O

O

OOH

OH

OH

O CO

R2

R1 R1 R2 30 H, H (R)HHDP 31 G, G (R)HHDP 21 DHHDP (R)HHDP 33 Ela (R)HHDP 34 DHHDP H, H 35 H, H (R)Val 36 DHHDP (R)Val 37 DHHDP G, G

N¨m 1990, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Hatano T. ph©n lËp ®îc hîp chÊt polyphenol ®· ®îc biÕt ®Õn lµ axit valoneic dilactone (38) vµ tiÕn hµnh nghiªn cøu ¶nh hëng cña hîp chÊt nµy cïng víi 37 hîp chÊt tanin vµ polyphenol kh¸c ®îc ph©n lËp tõ nhiÒu loµi thùc vËt kh¸c nhau lªn ho¹t ®éng cña enzym xanthine oxidase (XOD). KÕt qu¶ thu ®îc cho thÊy: Hîp chÊt 38 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh m¹nh nhÊt víi gi¸ trÞ IC50 = 0,76 μM. KÕt qu¶ nghiªn cøu ®éng häc cho thÊy, hîp chÊt nµy øc chÕ kh«ng c¹nh tranh enzym XOD ë nång ®é 0,8 μM19. Nh chóng ta ®· biÕt, axit uric, nguyªn nh©n g©y lªn bÖnh gót (gout), ®îc t¹o ra tõ xanthine khi cã mÆt cña enzym XOD. Vµ anion O2

-, sinh ra cïng víi sù t¹o thµnh axit uric, ®· ®îc ph¸t hiÖn lµ nguyªn nh©n hñy ho¹i «xy hãa çc m«. Do ®ã, çc hîp chÊt øc chÕ enzym XOD m¹nh sÏ cã tiÒm n¨ng øng dông cao trong viÖc nghiªn cøu ph¸t triÓn çc dîc phÈm ®iÒu trÞ bÖnh gót vµ mét sè bÖnh nguy hiÓm kh¸c. GÇn ®©y nhÊt, n¨m 2008 nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Tabata ®· ph©n lËp, x¸c ®Þnh cÊu tróc vµ thö ho¹t tÝnh chèng «xy hãa cña corilagin (30), geraniin (32), axit mallotinic (35), axit mallotusinic (36), rutin, vµ axit ellagic tõ dÞch chiÕt níc nãng cña l¸ c©y Mallotus japonicus20.

B¶ng I.2.1.d. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh chèng «xy hãa cña çc hîp chÊt20

Hîp chÊt DPPH• a O2• b

Axit mallotinic 6,2 267 Axit mallotusinic 9,1 299 Corilagin 4,5 307 Geraniin 6,2 281 Axit gallic 2,9 63 Rutin 1,7 7 Axit ellagic 3,6 44 EGCG 5,0 339 Quercetin 2,7 18 Axit chlorogenic 1,1 23

a KÕt qu¶ biÓu thÞ ë nång ®é 1 mM mÉu thö t¬ng ®¬ng víi sè mM cña trolox. b KÕt qu¶ biÓu thÞ sè ®¬n vÞ enzym superoxide dismutase (SOD) t¬ng ®¬ng víi 1 ml mÉu thö ë nång ®é 1 mM (U/ml).

13

KÕt qu¶ thö nghiÖm ho¹t tÝnh chèng «xy hãa cho thÊy, çc hîp chÊt 30, 32, 35, vµ ®Æc biÖt lµ hîp chÊt 36 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh thu dän gèc tù do DPPH rÊt m¹nh. Mét ®iÒu ®¸ng lu ý lµ tÊt c¶ bèn hîp chÊt tanin ®Òu cã ho¹t tÝnh t¬ng ®¬ng hay thËm chÝ cao h¬n so víi epigallocatechin gallate (EGCG), mét hîp chÊt ®· ®îc biÕt ®Õn víi ho¹t tÝnh chèng «xy hãa rÊt cao. Ho¹t tÝnh cña çc hîp chÊt nµy cã thÓ liªn quan ®Õn mËt ®é thÕ cao cña çc nhãm hydroxyl. Gèc tù do O2

• ®îc t¹o ra ë giai ®o¹n ®Çu cña ph¶n øng «xy hãa trong c¬ thÓ vµ sÏ s¶n sinh ra çc gèc tù do g©y hñy ho¹i tÕ bµo. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh thu dän gèc tù do O2

• cña çc hîp chÊt cho thÊy, çc tanin ph©n lËp tõ l¸ c©y M. japonicus thÓ hiÖn ho¹t tÝnh m¹nh h¬n tÊt c¶ çc chÊt kh¸c ngo¹i trõ EGCG. Ho¹t tÝnh thu dän gèc tù do DPPH vµ gèc O2

• cña hîp chÊt 36 t¬ng øng m¹nh gÊp 3,4 vµ 16,6 lÇn so víi quercetin, mét hîp chÊt ®îc biÕt ®Õn nhiÒu bëi cã ho¹t tÝnh chèng «xy hãa rÊt m¹nh vµ ®· ®îc dïng lµm chÊt chuÈn d¬ng trong mét sè ph¬ng ph¸p thö nghiÖm ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng «xy hãa in vitro. Nh vËy, t¬ng tù nh chÌ xanh cã chøa EGCG, l¸ loµi M. japonicus chøa çc hîp chÊt chèng «xy hãa rÊt m¹nh vµ cã thÓ lµ nguån nguyªn liÖu tù nhiªn tuyÖt vêi ®Ó s¶n xuÊt çc chÕ phÈm cã t¸c dông chèng «xy hãa20. I.2.2. Hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus philippensis T¬ng tù nh ë loµi Mallotus japonicus, çc dÉn xuÊt phloroglucinol còng ®· ®îc ph¸t hiÖn tõ loµi M. philippensis. Çc hîp chÊt ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp tõ vá qu¶ loµi nµy lµ rottlerin (5,7-dihydroxy-2,2-dimethyl-6-(2,4,6-trihydroxy-3-methyl-5-acetylbenzyl)-8-cinamoyl-1,2-chromene) (39), chÊt mµu ®á (red compound, 40) vµ isoallorottlerin (41)21,22. Rottlerin thÓ hiÖn nhiÒu ho¹t tÝnh sinh häc ®¸ng quan t©m, ®Æc biÖt lµ ho¹t tÝnh øc chÕ m¹nh vµ ®Æc hiÖu enzym tæng hîp protein PKCδ (Protein Kinase C - δ), PKB (Protein kinase B), enzym tæng hîp protein phô thuéc canxi/calmodulin I, II vµ III (CaMKI - CaMKIII). Thªm vµo ®ã, hîp chÊt nµy cã ®Æc tÝnh kh«ng b¾t cÆp ty thÓ g©y nªn hiÖn tîng suy gi¶m ATP vµ øc chÕ çc qu¸ tr×nh tÕ bµo ®îc ®iÒu tiÕt b»ng çc ph©n tö phosphoril hãa. Rottlerin còng thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng ung th m¹nh th«ng qua sù øc chÕ qu¸ tr×nh phosphorin hãa cña çc enzym ERK (enzym tæng hîp ®îc ®iÒu tiÕt bëi çc tÝn hiÖu ngo¹i bµo: extracellular signal-regulated kinase) vµ Akt (hay PKB) vµ sù ®iÒu tiÕt ©m (down-regulation) cña çc protetin thiÕt yÕu cho chu kú tÕ bµo nh çc cyclin vµ cdk23.

OHHO

OCH3

HO

OH

O

O

O O

OH O

OH

HO

H3C

COCH3HO39 41

O

OH

HO

O

O

40 N¨m 2002, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Akihiro Daikonya ph©n lËp ®îc hai dÉn xuÊt phloroglucinol míi, ®Æt tªn lµ mallotophilippen A (42) vµ B (43), tõ ph©n

14

®o¹n chiÕt hexan cña cÆn chiÕt axeton cña qu¶ loµi M. philippensis. CÊu tróc hãa häc cña chóng ®îc x¸c ®Þnh t¬ng øng lµ 1-[5,7-dihydroxy-2,2-dimethyl-6-(2,4,6-trihydroxy-3-isobutyryl-5-methyl-benzyl)-2H-chromen-8-yl]-2-methyl-butan-1-one vµ 1-[6-(3-Acetyl-2,4,6-trihydroxy-5-methyl-benzyl)-5,7-dihydroxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl]-2-ethyl-butan-1-one b»ng çc ph¬ng ph¸p phæ kÕt hîp víi çc ph¬ng ph¸p hãa häc24.

OHHO

H3C

OCH3

HO

OH42 43

O

O

O

OHHO

H3C

OCH3

HO

OH

O

O

O

Çc hîp chÊt nµy ®îc ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh øc chÕ sù h×nh thµnh nit¬ oxit (NO) vµ sù biÓn hiÖn gen m· hãa enzym tæng hîp NO (NO synthase - iNOS) ë tÕ bµo d¹ng ®¹i thùc bµo chuét (RAW 264.7) ®· ®îc ho¹t hãa b»ng lipopolysacarit (LPS) vµ interferon-γ (IFN-γ) chuét t¸i tæ hîp. KÕt qu¶ cho thÊy, çc hîp chÊt 42 (IC50 = 4,2 µM) vµ 43 (IC50 = 3,2 µM) øc chÕ sù s¶n sinh NO m¹nh h¬n nhiÒu so víi quercetin (IC50 = 26,8 µM)24.

H×nh I.2.2.a. Ho¹t tÝnh øc chÕ sù s¶n sinh

NO kÝch thÝch b»ng LPS vµ IFN-γ cña mallotophilippen A (42) vµ B (43)24

H×nh I.2.2.b. Ho¹t tÝnh øc chÕ sù biÓu hiÖn

gen iNOS kÝch thÝch b»ng LPS vµ IFN-γ cña mallotophilippen A (42) vµ B (43)24

Thªm vµo ®ã, hai hîp chÊt nµy øc chÕ (phô thuéc nång ®é) sù biÓu hiÖn cña ARN th«ng tin m· hãa cho enzym iNOS (h×nh II.2.b.). Ho¹t ®éng cña iNOS ®îc ®iÒu tiÕt bëi çc cytokin còng nh qua çc ®¸p øng viªm vµ miÔn dÞch. Çc kÕt qu¶ ph©n tÝch RT-PCR cho thÊy xö lý b»ng LPS/IFN-γ gia t¨ng møc ®é biÓu hiÖn cña ARN th«ng tin m· hãa iNOS vµ hai dÉn xuÊt phloroglucinol th× h¹n chÕ. Do dã, sù øc chÕ s¶n sinh NO cña hai hîp chÊt nµy cã thÓ ®îc thùc hiÖn bëi sù ¸p chÕ çc nh©n tè ho¹t hãa qu¸ tr×nh phiªn m·. Çc kÕt qu¶ nghiªn cøu còng cho thÊy, ë nång ®é tõ 0,3 ®Õn 10 µg/ml chóng kh«ng thÓ hiÖn ®éc tÝnh ®¸ng kÓ ®èi víi tÕ bµo RAW 264.7 ®îc xö lý b»ng LPS/IFN-γ trong 24 giê24. Ngoµi ra, çc hîp chÊt 42 vµ 43 cßn k×m h·m sù gi¶i phãng histamin tõ tÕ bµo mµng bông chuét ®îc kÝch thÝch b»ng hîp chÊt 48/80 víi gi¸ trÞ IC50 t¬ng øng

15

lµ 8,6 vµ 13,8 µM. KÕt qu¶ trªn kh¼ng ®Þnh çc hîp chÊt nµy cã ho¹t tÝnh kh¸ng viªm. Do ®ã, çc hîp chÊt nµy cã thÓ lµ çc ph©n tö ®Çy høa hÑn cho viÖc nghiªn cøu ph¸t triÓn çc thuèc míi ®Ó ®iÒu trÞ çc bÖnh viªm cÊp vµ m·n tÝnh24.

HO

OH

44 R = H45R = OH 46

O

O

OH

R

HO

OH

O

O

OH

OH

HO

O

O O

CH2OR

O

O

Me

HO OH

HO

COCH3

OH

OH

Me

47 R = H

48 R =

§Õn n¨m 2004, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Daikonya A. tiÕp tôc c«ng bè sù cã mÆt cña 3 dÉn xuÊt chalcon míi cã cÊu tróc hiÕm gÆp ®îc ®Æt tªn lµ mallotophippen C (44), D (45) vµ E (46) tõ qu¶ loµi M. philippensis. CÊu tróc hãa häc cña chóng ®îc x¸c ®Þnh lÇn lît lµ 1-[6-(3,7-dimethyl-octa-2,6-dienyl)-5,7-dihydroxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl]-3-(4-hydroxy-phenyl)-propenone, 3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-1-[6-(3,7-dimethyl-octa-2,6-dienyl)-5,7-dihydroxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl]-propenone vµ 1-[5,7-dihydroxy-2-methyl-6-(3-methyl-but-2-enyl)-2-(4-methyl-pent-3-enyl)-2H-chromen-8-yl]-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-propenone. Çc hîp chÊt nµy còng ®îc tiÕn hµnh ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh øc chÕ sù s¶n sinh NO trªn dßng tÕ bµo RAW 264.7 ®îc kÝch thÝch b»ng LPS/IFN-γ. KÕt qu¶ cho thÊy c¶ 3 hîp chÊt ®Òu thÓ hiÖn ho¹t tÝnh øc chÕ sù s¶n sinh NO víi gi¸ trÞ IC50 lÇn lît lµ 7,6, 9,5 vµ 38,6 µM. Çc hîp chÊt nµy kh«ng thÓ hiÖn ®éc tÝnh khi thö víi nång ®é cao nhÊt lµ 30 µg/ml. Ngoµi ra, mallotophippen C, D vµ E cßn øc chÕ sù biÓu hiÖn cña çc gen m· hãa cho çc enzym iNOS, COX-2 (cyclooxygenase-2), IL-6 (interleukin-6) vµ IL-1β (interleukin-1β)25. Dùa trªn kÕt qu¶ thu ®îc, çc t¸c gi¶ nhËn ®Þnh r»ng c¬ chÕ ho¹t tÝnh cña çc chÊt nµy lµ do sù v« ho¹t NF-κB. Nh ®· biÕt, enzym iNOS tham gia t¹o nªn çc biÕn ®æi bÖnh häc cña chøng viªm khíp vµ sù øc chÕ nã sÏ lµm gi¶m çc biÕn ®æi nµy. §· cã b»ng chøng chøng tá sù gia t¨ng s¶n sinh NO trong çc bÖnh l©y nhiÔm viªm d¹ dµy ruét vµ thÊp khíp. Do ®ã, çc hîp chÊt 44, 45 vµ 46 lµ çc øng viªn cho çc thuèc trÞ bÖnh g©y ra do sù qu¸ biÓu hiÖn cña enzym iNOS.25 Do cã cÊu tróc ®éc ®¸o vµ ho¹t tÝnh sinh häc ®¸ng quan t©m, hîp chÊt mallotophilipen C (44) ®· ®îc çc nhµ khoa häc Trung Quèc nghiªn cøu thµnh c«ng quy tr×nh tæng hîp toµn phÇn tõ nguån nguyªn liÖu ban ®Çu lµ phloroacetophenone víi 11 bíc vµ hiÖu suÊt tæng thÓ ®¹t 28%26.

H×nh I.2.2.c. KÕt qu¶ ph©n tÝch RT-PCR (ph¶n øng chuçi polymerase

phiªn m· ngîc) cña mallotophippen C (44), D (45) vµ E (46)25

16

Çc nghiªn cøu vÒ thµnh phÇn flavonoit tõ c©y çnh kiÕn còng thu ®îc nhiÒu kÕt qu¶ kh¶ quan. N¨m 1998, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Tanaka T. c«ng bè sù ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña hai hîp chÊt bichalcon míi, kamalachalcone A (47) vµ B (48), tõ loµi nµy27. §iÒu ®¸ng quan t©m lµ hai hîp chÊt nµy cã mét hÖ cÊu tróc vßng ®éc ®¸o. CÊu tróc nµy cã thÓ ®îc sinh tæng hîp tõ sù dimer hãa cña hai ®¬n vÞ chalcon gièng nhau trong trêng hîp cña kamalachalcone A vµ cña mét ®¬n vÞ chalcon vµ mét ph©n tö rottlerin (39) ë kamalachalcone B. Sù dimer hãa b»ng kÕt cÆp phenol vµ ph¶n øng Diels-Alder ®«i khi x¶y ra gi÷a çc hîp chÊt flavonoit. Tuy nhiªn, sù dimer hãa gi÷a vßng dimetyl chromene vµ nhãm hydroxyl vßng th¬m rÊt hiÕm gÆp ë çc hîp chÊt tån t¹i trong tù nhiªn27.

OO

OH

HO

OH

COCH3

H3C

HO

O

OH HO

OH

O

O

O OH

OH

COCH3

49 50

HO

OO

O

O

COCH3

HO

HO

COCH3

OH

OH

MeO

O

HO OH

O

51 §Õn n¨m 2005, mét hîp chÊt flavon míi, 4'-hydroxyisorottlerin (49), hai dÉn xuÊt chalcon míi, kamalachalcone C (50) vµ D (51), vµ 7 hîp chÊt ®· biÕt rottlerin, isoallorottlerin, kamalachalcone A, kamalachalcone B, isorottlerin, 5,7-dihydroxy-8-methyl-6-prenylflavanone vµ 6,6-dimethylpyrano-(2",3":7,6)-5-hydroxy-8-methylflavanone (52), tiÕp tôc ®îc çc nhµ khoa häc NhËt B¶n ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc28. Hîp chÊt lín nhÊt, kamalachalcone D, cã mét hÖ cÊu tróc vßng dung hîp ®éc ®¸o ®îc t¹o thµnh tõ hai ®¬n vÞ hydroxy-chalcon t¹o nªn sù g¾n kÕt cña 8 vßng benzen d¹ng pyran. Hai hîp chÊt, rottlerin vµ kamalachalcone C thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng «xy hãa trªn hÖ DPPH víi gi¸ trÞ SC50 lÇn lît lµ 5,6 vµ 44 µM.

OHO

OH O

OO

OH O

5352

OHO

OO 54

Míi ®©y, trong ch¬ng tr×nh nghiªn cøu t×m kiÕm çc hîp chÊt kh¸ng chñng xo¾n khuÈn Helicobacter pylori (vi khuÈn g©y viªm loÐt d¹ dµy t¸ trµng vµ ung th d¹ dµy), çc nhµ khoa häc NhËt B¶n vµ Pakistan ph¸t hiÖn thÊy dÞch chiÕt etanol 70% cña loµi M. philipensis thÓ hiÖn ho¹t tÝnh m¹nh kh¸ng t¸m chñng H. pylori ë nång ®é 15,6-31,2 mg/l. Çc nghiªn cøu tiÕp theo cña nhãm t¸c gi¶ nµy dÉn ®Õn sù ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña 5 hîp chÊt lµ 5,7-dihydroxy-8-methyl-6-prenylflavanone (53), 3'-prenylrubranine (54), rottlerin (39), chÊt mµu ®á (red compound) (40) vµ isorottlerin (41). KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh diÖt khuÈn cho thÊy,

17

hîp chÊt rottlerin thÓ hiÖn ho¹t tÝnh diÖt khuÈn trªn nhiÒu chñng H. pylori ph©n lËp l©m sµng bao gåm çc chñng cña NhËt B¶n, Pakistan, 9 chñng kh¸ng clarithromycin vµ 7 chñng kh¸ng metronidazole m¹nh nhÊt víi gi¸ trÞ nång ®é diÖt khuÈn tèi thiÓu (minimum bactericidal concentration - MBC) tõ 3,12-6,25 mg/l. Ngoµi ra, çc chñng kh¸ng clarithromycin ®îc ®¸nh gi¸ víi çc ®iÓm ®ét biÕn t¹i A2143G vµ A2144G cña gen ARN vËn chuyÓn 23s ®Ó x¸c ®Þnh mèi t¬ng quan gi÷a gi¸ trÞ MBC víi çc d¹ng ®ét biÕn. KÕt qu¶ thu ®îc cho thÊy, dÞch chiÕt cån loµi M. philipensis vµ hîp chÊt rottlerin (39) thÓ hiÖn ho¹t tÝnh kh¸ng H. pylori m¹nh, ®Æc biÖt lµ víi çc chñng kh¸ng clarithromycin vµ metronidazole, do ®ã cã thÓ ®îc sö dông ®Ó nghiªn cøu ph¸t triÓn çc dîc phÈm míi ®iÒu trÞ çc bÖnh g©y ra do xo¾n khuÈn P. pylori29.

N¨m 2008, çc nhµ khoa häc NhËt B¶n ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu thµnh phÇn tritecpenoit tõ c©y çnh kiÕn vµ ph©n lËp ®îc 6 hîp chÊt gåm cã 4 hîp chÊt d¹ng khung friedelane lµ friedelin (55), 3-hydroxy-D:A-friedoolean-3-en-2-one (56), 2β-hydroxy-D:A-friedooleanan-3-one (57) vµ 3α-hydroxy-D:A-friedooleanan-2-one (58), cïng víi hai hîp chÊt d¹ng khung lupane lµ lupeol vµ betulin30.

HR

O

HO

HO55 R = H57 R = OH 56

HO

HO

58

Çc hîp chÊt nµy ®îc ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh øc chÕ sù ho¹t hãa kh¸ng nguyªn sím virót Epstein-Barr (Epstein-Barr virus early antigen: EBV-EA) kÝch thÝch b»ng 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA). Kh¶ n¨ng øc chÕ cña çc hîp chÊt 56 (IC50 = 292 tû lÖ mol/32 pmol/TPA) vµ 58 (IC50 = 288), m¹nh h¬n çc hîp chÊt cßn l¹i vµ m¹nh h¬n c¶ chÊt ®èi chøng d¬ng lµ curcumin (IC50 = 343). Ngoµi ra, hîp chÊt 58 cßn øc chÕ m¹nh mÏ sù ph¸t triÓn cña khèi u da chuét trªn m« h×nh g©y ung th in vivo hai giai ®o¹n30.

I.2.3. Hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus apelta Çc nghiªn cøu vÒ hãa thùc vËt loµi Mallotus apelta ®· ®îc çc nhµ khoa häc Trung Quèc quan t©m nghiªn cøu kh¸ sím. N¨m 1993, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Feng L. c«ng bè sù ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña 4 hîp chÊt tõ rÔ loµi M. apelta ®ã lµ 3β,29-dihydroxylupane (59), erythrodiol-3-acetate (60), β-sitosterol vµ axit acetylursolic (61). Nghiªn cøu ho¹t tÝnh kh¸ng khuÈn cho thÊy, çc hîp chÊt 59-61 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh kh¸ng çc chñng vi khuÈn Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, vµ Bacillus pyocyaneum31.

18

HO

R1

R2

H

O

O

R1

H3C R3

R2

59 CH3(CH)CH2OH H

R1 R2

60 OH H CH361 COOH CH3 H

R1 R2 R3

OO

O

CH2OH

H3CO

O

R2

R3

R1

R1 R2 R3

69 OCH 3 OH OCH3

70 OCH 3 OH H

71 OCH 3 OH OH

§Õn n¨m 1998, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Cheng X.F. c«ng bè thªm 1 hîp chÊt alkanoit d¹ng pyridine míi lµ maloapentine (4-methoxy-3-cyano-pyridine 1-oxide) (62) vµ axit 4,5,4'-trimethyl-ellagic (63) tõ rÔ loµi M. apelta32.

N

OCH3

CN

O

O

O

OHH3CO

OCH3

H3COO

O

CH2OH

OH

R2R1

R

62 63 64 R = R1 = OH, R2 = H68 R = R1 =H, R2 = OH

OHO

OO

HOO

HO

65 66 67

HO

N¨m 1999, nhãm nghiªn cøu trªn tiÕp tôc c«ng bè sù ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña 5 hîp chÊt ditecpen míi lµ 2α,4β,15,16-tetrahydroxydolabradan (64), 10-hydroxycembren-5-one (65), 6-hydroxycembrene-5,10-dione (66)33, malloapeltene (6,10-dihydroxy-cembrene-5-one) (67), vµ malloapeltin (4α,15,16-trihydroxy-dolabradane) (68)34. Hãa lËp thÓ cña c¸c hîp chÊt ®îc x¸c ®Þnh b»ng kü thuËt phæ NOESY.

C¸c nghiªn cøu tiÕp theo cña nhãm t¸c gi¶ trªn ®· x¸c ®Þnh thªm ®îc 3 hîp chÊt coumarino-lignoit lµ aquillochin (69), cleomiscosin A (70) vµ 5'-demethylaquillochin (71) tõ rÔ loµi M. apelta35. N¨m 2001 nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ An T. Y. c«ng bè sù ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña 7 dÉn xuÊt benzopyran lµ 4-hydroxy-2,6-dimethyl-6-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-8-(3-methyl-2-butenyl)-2H-1-benzopyran-5,7(3H,6H)-dione (72); 4-hydroxy-2,6,8-trimethyl-6-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran-5,7(3H,6H)-dione (73); 5-hydroxy-2,8-dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)-8-(3,7-dimethyl-2,6-octadiennyl)-2H-1-benzopyran-4,7(3H,8H)-dione (74); 5-hydroxy-2,8,6-trimethyl-8-(3,7-dimethyl-2,6-

19

octadiennyl)-2H-1-benzopyran-4,7-(3H,8H)-dione (75); 2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2,6-dimethyl-8-(3-methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopy-ran-4-one (76); 2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2,8-dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4-one (77); 2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-4H-1-benzopyran-4-one (78) tõ l¸ loµi M. apelta.

O

OH

O

O

R1

CH3

R2

CH3

72 CH2-CH=C(CH 3)-(CH2)2-CH=C(CH 3)2 CH2-CH=C(CH3)273 CH2-CH=C(CH 3)-(CH2)2-CH=C(CH 3)2 CH3

OO

O

CH3

OH

R2

R1

74 CH2-CH=C(CH 3)2 CH2-CH=C(CH3)-(CH2)2-CH=C(CH3)2 75 CH3 CH2-CH=C(CH3)-(CH2)2-CH=C(CH3)2

O

OH O

R1

HO R2

R3 76 CH2-CH=C(CH3)2 CH3 CH377 CH3 -CH2-CH=C(CH3)2 CH3 78 CH3 CH3 CH3

R1 R2

R2R1

R1 R2 R3

TÊt c¶ 7 hîp chÊt trªn ®· ®îc ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng sinh trªn c¸c chñng Staphylococcus aureus, Micrococcus lutens, Pseudomonas aerugionsa vµ Escherichia coli. KÕt qu¶ thu ®îc cho thÊy, chØ cã hîp chÊt 72 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh trung b×nh trªn chñng M. lutens víi gi¸ trÞ nång ®é øc chÕ tèi thiÓu (MIC) lµ 7,34 µg/ml36.

O

O

O

OH

H

O

O

O

O

OH

H

O

79 80 §Õn n¨m 2003, nhãm nghiªn cøu nµy c«ng bè thªm 2 hîp chÊt benzopyran míi lµ 6β-hydorxy-2α,8β-dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)-8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran-4,5,7(3H,6H,8H)-trione (79) vµ 6β-hydroxy-2α,6α,8β-trimethyl-8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran-4,5,7(3H,6H,8H)-trione (80) tõ l¸ loµi M. apelta37.

N¨m 2006, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Shu Xu nghiªn cøu kh¶ n¨ng kh¸ng vi rót viªm gan B in vivo (duck hepatitis B virus: D-HBV) cña rÔ loµi M. apelta trªn vÞt. KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, rÔ loµi nµy cã t¸c dông ng¨n c¶n sù ph©n chia cña tÕ bµo D-HBV in vivo. MÆc dï t¸c dông yÕu h¬n chÊt ®èi chøng d¬ng lµ lamivudine, rÔ loµi nµy l¹i cã t¸c dông kÐo dµi h¬n38.

20

H×nh I.2.3.a. Thay ®æi m« bÖnh häc cña m« gan vÞt bÞ g©y nhiÔm D-HBV tríc vµ sau thÝ nghiÖm38. (A) tríc thÝ nghiÖm, (B) sau khi ®iÒu trÞ b»ng lamivudine, (C) sau khi ®iÒu trÞ b»ng rÔ M. apelta. GÇn ®©y nhÊt, vµo n¨m 2008, b»ng con ®êng sµng läc t×m kiÕm çc hîp chÊt thiªn nhiªn cã t¸c dông b¶o vÖ gan, çc nhµ khoa häc Trung Quèc ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 3 hîp chÊt coumarino-lignoit míi lµ malloapelin A (81), B (82) vµ C (83) cïng víi 3 coumarino-lignoit ®· biÕt lµ cleomiscosin A (84), cleomiscosin B (85) vµ 5'-demethylaquillochin (86)39.

OO

O

CH2OH

R1

O

HO

R3

R2

OO

OHOH2C

H3CO

O

OH

R3R2

R1 R2 R3

81. OH OH OCH3

84. OCH 3 OH OCH3

85. OCH 3 H OCH3

R1 R2 R3

82. OH OH OCH3

83. OCH 3 OH OCH3

86. OCH 3 H OCH3

7'

8

B¶ng I.2.3.a. T¸c dông b¶o vÖ gan cña çc hîp chÊt 81-8339 trªn dßng tÕ bµo WB-F344 ®îc g©y ®éc b»ng D-galactosaminea

Hîp chÊt Nång ®é (M) Tû lÖ tÕ bµo sèng sãt (%) % øc chÕ B×nh thêng 100,0±9,3

§èi chøng ©m 26,4±0,7 bicyclolb 10-4 55,0±8,7 38,9

81 10-4 29,0±2,2 3,5 82 10-4 34,7±5,9 11,3 83 10-4 45,7±2,0 26,2

a. KÕt qu¶ biÓu thÞ lµ mean±SD (n = 3, b×nh thêng vµ ®èi chøng n=6) b. ChÊt ®èi chøng d¬ng Çc coumarino-lignoit ®îc ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh b¶o vÖ gan trªn dßng tÕ bµo gan chuét WB-F344 ®îc g©y ®éc b»ng D-galactosamine. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh b¶o vÖ gan (¶nh hëng lªn tû lÖ sèng sãt cña tÕ bµo) ë b¶ng II.3.a cho thÊy, çc hîp chÊt 81-83 ®Òu thÓ hiÖn ho¹t tÝnh in vitro ë nång ®é 10-4 M vµ kh«ng thÓ hiÖn ®éc tÝnh ®¸ng kÓ khi so s¸nh víi chÊt ®èi chøng d¬ng lµ bicyclol vµ silybin (øc chÕ 45,5% ë 50 µM), lµ çc hîp chÊt ®· ®îc biÕt ®Õn víi ho¹t tÝnh b¶o vÖ gan rÊt m¹nh. Trong ®ã, hîp chÊt 83 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh rÊt Ên tîng. Nhãm t¸c gi¶ nµy còng ®· s¬

21

bé nghiªn cøu mèi liªn hÖ gi÷a cÊu tróc hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña çc hîp chÊt nµy. KÕt qu¶ cho thÊy, çc coumarinolignoit víi cÇu nèi –C-7'–O–C-8– thÓ hiÖn ho¹t tÝnh m¹nh h¬n çc ®ång ph©n vÞ trÝ kh¸c39.

I.2.4. Hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus repandus Thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi bôc trên Mallotus repandus còng ®îc çc nhµ khoa häc NhËt B¶n quan t©m nghiªn cøu tõ rÊt sím. N¨m 1976, hai hîp chÊt ®itecpen lact«n míi mallotucin A (87) vµ B (88) ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi nµy. CÊu tróc hãa häc cña chóng ®îc x¸c ®Þnh b»ng çc ph¬ng ph¸p phæ nh IR, UV, NMR vµ b»ng ph¬ng ph¸p nhiÔu x¹ X-Ray40.

O

O

O

MeH

O

O

OAc

O

Me

O

O

MeO2C CO2Me O

O

R

Me

O

O

MeO2C

87 8889 R = βOH90 R = αOH

H

R

O COH

H

R

O CH

H

OCH3

91 R = αΗ, βOH92 R = αH, βOBz93 R = αΟΗ, βH94 R = αΟBz, βH 95 R = ΟBz

§Õn n¨m 1981, nhãm nghiªn cøu nµy tiÕp tôc c«ng bè thªm 2 hîp chÊt ®itecpen lact«n míi ®Æt tªn lµ mallotucin C (89), vµ D (90) tõ loµi M. repandus. CÊu tróc hãa häc cña chóng ®îc x¸c ®Þnh b»ng çc ph¬ng ph¸p chuyÓn hãa hãa häc so víi 88 vµ b»ng ph©n tÝch chi tiÕt phæ cña çc dÉn xuÊt axetat cña chóng41. N¨m 1977, ba hîp chÊt tritecpen míi, 3β-hydroxy-13α-ursan-28,12β-olide (91), 3β-hydroxy-13α-ursan-28,12β-olide 3-benzoate (92) vµ 3α-hydroxy-13α-ursan-28,12β-olide (93), cïng víi axit ursolic, friedelin, lupeol vµ α-amyrin ®îc ph©n lËp tõ loµi M. repandus mäc t¹i Hång K«ng42. N¨m 1999, nhãm nghiªn cøu cña t¸c gi¶ Huang P. L. c«ng bè thªm 3 hîp chÊt tritecpenoit míi lµ, 3α-hydroxy-13α-ursan-28,12β-olide 3-benzoate (94), 3α-hydroxy-28β-methoxy-13α-ursan-28,12β-epoxide 3-benzoate (95) vµ axit 3α-hydroxy-13α-ursan-28-oic (96) tõ vá rÔ loµi bôc trên43.

H

HO

COOH

96

C

R

97 R = O98 R = αOBz, βH99 R = αH, βOH

O

O

Nghiªn cøu gÇn ®©y nhÊt vÒ thµnh phÇn tritecpenoit tõ th©n loµi M. repandus c«ng bè thªm 3 hîp chÊt D:A-friedo-oleanan lact«n míi lµ 3-oxo-D:A-friedo-oleanan-27,16α-lactone (97), 3α-benzoyloxy-D:A-friedo-oleanan-27,16α-lactone (98) vµ 3β-hydroxy-D:A-friedo-oleanan-27,16α-lactone (99). CÊu tróc hãa häc cña chóng ®îc x¸c ®Þnh b»ng çc ph¬ng ph¸p phæ NMR mét chiÒu vµ hai chiÒu. Ngoµi ra, hãa lËp thÓ cña hîp chÊt 98 ®îc kh¼ng ®Þnh b»ng ph¬ng ph¸p nhiÔu x¹ X-Ray44.

22

O

O

OHHOOHHO

HO

OCCO

O

CH2O

OOH

OOC

OH

OH

OH

OH

OHHO

HOOC

O CO

O

OH

OHHOO

O

OH

OHHOOHHO

HO

OCCO

O

CH2O

OOH

OOC

OH

OH

OH

O CO

OH

OHHOOHOOC

H

HOOC H

H

101 102

N

NC

O Me

100

Ngoµi thµnh phÇn ®itecpen vµ tritecpen, çc thµnh phÇn hãa häc kh¸c cña loµi M. repandus còng ®îc çc nhµ khoa häc NhËt B¶n nghiªn cøu kh¸ sím. N¨m 1978, b»ng ph¬ng ph¸p nghiªn cøu hãa häc theo ®Þnh híng ho¹t tÝnh chèng viªm loÐt d¹ dµy, çc hîp chÊt mallorepine (cyano-γ-pyridone 100) vµ bergenin ®îc ph©n lËp tõ loµi nµy. Çc t¸c gi¶ cho r»ng, hîp chÊt 100 cã thÓ lµ s¶n phÈm trung gian cña con ®êng sinh tæng hîp tõ nicotinamide sang ricinine45. Thµnh phÇn çc hîp chÊt tanin cña loµi M. repandus còng ®îc çc nhµ khoa häc NhËt B¶n quan t©m nghiªn cøu kh¸ sím. N¨m 1989, mêi ba hîp chÊt tanin vµ çc chÊt liªn quan trong ®ã cã 4 chÊt míi lµ repandusinin (101), axit repandusinic A (102), axit repandusinic B (103) vµ mallotinin (104) cïng víi çc hîp chÊt ®· biÕt ®Õn lµ glucogallin (105), eugeniin (106), corilagin, puricafolin, geraniin, furosin, axit mallotinic, axit mallotusinic vµ brevefolin carboxylic acid (107) ®îc x¸c ®Þnh tõ l¸ loµi M. repandus thu thËp t¹i §µi Loan46.

O

O

OHHOOHHO

HO

OCCO

O

CH2O

OOH

OOC

OH

OH

OH

OH

OHHO

HOOC

O CO

OH

OHHOOHOOC

H

HOOC H

H

O

OH

OHHOOHHO

HO

OCCO

O

CH2O

OH

O

OOC

OH

OH

OH

HO OH

OH

O

O

O

COO

CH2

HOOC

103 104

O

OHHO

OH

HO

OH

OH

OH

O CO

OH

OH

O CO

HOOC

O

HO

OO

O

O

O

OH

OH

OH

O C

OHHO

HO

HO

HOOH

OO

O

HO

HO

HO

C O

OH

OH

OH

CO

106

105

107

Çc hîp chÊt corilagin, puricafolin, geraniin, furosin, axit mallotinic vµ axit mallotusinic (36) còng ®· ®îc nhãm nghiªn cøu nµy ph©n lËp tõ vá th©n loµi M. japonicus thu thËp t¹i Fukuoka, NhËt B¶n. KÕt qu¶ nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy, axit mallotusinic cã t¸c dông øc chÕ enzym epoxi hãa squalene ë ®éng vËt cã x¬ng sèng (Squalene epoxidase - SE) víi gi¸ trÞ IC50 = 8,0 µM. SE lµ enzym xóc t¸c chuyÓn hãa squalene thµnh 3(S)-2,3-oxidosqualene, mét bíc giíi h¹n tû lÖ sinh tæng hîp cholesterol. V× SE ®iÒu tiÕt sù chuyÓn hãa squalene thµnh çc sterol trong sinh tæng hîp cholesterol, çc t¸c nh©n øc chÕ enzym nµy lµ çc ®Ých ®Çy tiÒm n¨ng cho viÖc nghiªn cøu ph¸t triÓn çc thuèc h¹ cholesterol47. §iÒu nµy gîi më híng nghiªn cøu tiÕp theo ®Þnh híng h¹ cholesterol cña hîp chÊt axit mallotusinic còng nh loµi M. japonicus vµ M. repandus.

23

I.2.5. Hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc mét sè loµi Mallotus kh¸c N¨m 1966, b¶y hîp chÊt cardenolides ®îc ph©n lËp tõ loµi Mallotus paniculatus lµ 11-oxouzarigenin (108), mallogenin (109), malloside (110), panoside (111), glucopanoside (112), uzarigenin (113) vµ coroglaucigenin (114)48.

HHO

OH

H

O

O O

R2OH

OH

O O

HOR1

HOH

R2

O O

R1

108109 R1 = R2 = H110 R1 = H, R2 = α-L-rha111 R1 = OH, R2 = α-L-rha112 R1 = OH, R2 = β-D-glc(1->4)α-L-rha

113 R1 = H, R2 = αOH114 R1 = OH, R2 = βOH

Tõ loµi M. anomalus thu thËp t¹i ®¶o Hainan, mét hîp chÊt ®itecpenoit d¹ng ent-kaurene míi, anomaluone (115), vµ aurantiamide acetate ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc vµo n¨m 199049. §Õn n¨m 1992, n¨m çc hîp chÊt diecpen d¹ng khung ent-rosane vµ ent-kaurene míi lµ anomallotusin (116), isoanomallotusin (117), anomalotusinin (118)50, anomaluol (119) vµ anomallotuside (120)51 tiÕp tôc ®îc x¸c ®Þnh tõ loµi nµy. N¨m 1994, hai hîp chÊt maytansinoit míi, mallotusine (121) vµ isomallotusine (122) tiÕp tôc ®îc ph©n lËp tõ loµi M. anomalus. Thö nghiÖm ho¹t tÝnh sinh häc cho thÊy, çc hîp chÊt nµy thÓ hiÖn ho¹t tÝnh kh¸ng u m¹nh trªn c¶ m« h×nh thö nghiÖm in vitro vµ in vivo52.

Me

OMe Me

OH

CH2OH

Me Me

R

R1

CH2

MeO

Me

OHR2

115

116 R = OH, R1= R2 = H117 R = R2 = H, R1 = OH118 R = R1 = H, R2 =OH

Me

HOMe Me

OH

CH2OH

119

HO

Me Me

CH2

MeOH

MeO

120

O

HN

OHOMe Me

O

ON

MeCl

OMe

H

O

MeO

Me

COCH

NR

Me

Me

O

H

R1

O O

MeO

HO

R

OH

MeO OMe

O

O

O

OH

OH

O

121 R = Me, R1= Et122 R = Et, R1 = Me

123

124 R =

125 R =

126

GÇn ®©y, n¨m 2004 dÞch chiÕt th« rÔ loµi M. resinosus ®îc ph¸t hiÖn cã kh¶ n¨ng c¾t m¹ch DNA phô thuéc vµo ion Cu2+. Çc nghiªn cøu tiÕp theo dÉn ®Õn sù ph©n lËp cña mét hîp chÊt coumarin, scopoletin (123). KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh cho thÊy, hîp chÊt nµy cã ho¹t tÝnh c¾t m¹ch DNA rÊt m¹nh khi cã mÆt ion Cu2+.53 Còng trong n¨m ®ã, n¨m dÉn xuÊt phloroglucinol míi, pallidusol (124), dehydropallidusol (125), pallidol (126), mallopallidol (127) vµ homomallopallidol (128), ®îc ph©n lËp tõ l¸ loµi M. pallidus54. Çc nghiªn cøu tiÕp theo dÉn ®Õn sù ph©n lËp thªm mét hîp chÊt phloroglucinol míi lµ mallopallidusol (129) tõ loµi nµy vµo n¨m 200555. Çc hîp chÊt 127 vµ 128 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh kh¸ng HSV vµ HIV rÊt Ên tîng víi gi¸ trÞ ED50 tõ 0,1-7,0 µM56.

24

127 R = CH3128 R = CH2CH3

O

OOH

H3C

HO

OH O

R

OH

CH3

MeO

O

OH

H3C

HO

O

O

HO

CH3

OH

OH

O

OH

H3C

HO

O

O

HO

CH3

OH

OH

O

OH

H3C

HO

O

O

HO

CH3

OH

OH

129 N¨m 2004, hai hîp chÊt galloglucoside míi, mallophenol A (130) vµ mallophenol B (131) cïng víi (6S,9R)-roseoside, aviculin, (+)-lyoniresinol-3α-O-α-L-rhamnopyranoside, (Z)-3-hexenyl-β-D-gluco-pyranoside, 3,3,8,9,10-pentahydroxydibenzo[b,d]pyran-6-one, 3-hydroxy-4,5(R)-dimethyl-2(5H)-furanone vµ axit gallic ®îc ph©n lËp tõ l¸ loµi M. furetianus. Hãa lËp thÓ cña hîp chÊt 130 ®îc x¸c ®Þnh b»ng ph¬ng ph¸p MTPA57.

O

O

OCH2OH

HOHO

OR

OMe

OH

HO

OOO

HOHO

OR

OH

OH

OH

OHO

130 R = G 131 R = G

G =

Tõ l¸ loµi M. roxburghianus, n¨m 2005 çc nhµ khoa häc Ên §é vµ NhËt B¶n ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh ®îc hai chÊt míi axit 3-(1-C-β-D-glucopyranosyl)-2,6-dihydroxy-5-methoxybenzoic (132) vµ 2,4,8,9,10-pentahydroxy-3,7-dimethoxyanthracene-6-O-β-D-rhamnopyranoside (133) cïng víi axit betulinic, axit 4-hydroxybenzoic vµ bergenin. Çc hîp chÊt 132, 133, axit betulinic vµ bergenin thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng oxy hãa m¹nh víi c¬ chÕ øc chÕ sù tù oxy hãa cña axit linoleic, sù thu dän gèc superoxide vµ gèc tù do DPPH58.

COOH

HO

MeO

H

OH

O

HOOH OH

OH

H

OH

OH

OMe

OHOH

OHH

MeO

OO

OH

OH

OH

Me

132 133

OH

O

HO

HH

O

R

O

H

H

134 R = OH135 R = H136 R = OC2H5

N¨m 2006, ba hîp chÊt ditecpenoit d¹ng casbane víi cÊu tróc ®éc ®¸o α,β-kh«ng no γ-lactone ®îc ®Æt tªn lµ hookerianolide A (134), B (135) vµ C (136) ®îc ph©n lËp tõ loµi M. hookerianus. CÊu tróc hãa häc cña chóng ®îc x¸c ®Þnh b»ng çc d÷ kiÖn phæ NMR vµ chuyÓn hãa hãa häc. Hãa lËp thÓ ®îc x¸c ®Þnh b»ng sù ph©n tÝch kÕt hîp gi÷a phæ ROESY vµ phæ CD59.

25

I.3. Tæng quan vÒ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu ë ViÖt Nam I.3.1. Nguån tµi nguyªn thùc vËt ë ViÖt Nam ViÖt Nam n»m ë mét trong nh÷ng khu hÖ thùc vËt phong phó nhÊt trªn thÕ giíi, khu vùc rõng nhiÖt ®íi §«ng Nam ¸. Víi bê biÓn dµi 3200 km vµ ®êng biªn giíi trªn ®Êt liÒn dµi tíi 4630 km, rõng nói chiÕm 3/4 diÖn tÝch c¶ níc, ®Êt níc ta së h÷u mét nguån tµi nguyªn ®éng thùc vËt v« cïng phong phó. Theo çc tµi liÖu ®· c«ng bè, hiÖn nay cã kho¶ng trªn 12000 loµi thùc vËt hiÖn h÷u ë ViÖt Nam. Phan KÕ Léc ®· thèng kÕ ®îc 10386 loµi thùc vËt bËc cao cã m¹ch thuéc 2257 chi vµ 305 hä (trong ®ã cã 733 loµi chØ gÆp trong trång trät). Dùa trªn çc tµi liÖu ®· ®îc c«ng bè trªn thÕ giíi vµ çc thèng kª so s¸nh ë ViÖt Nam, çc nhµ khoa häc ®· íc tÝnh r»ng tæng sè loµi thùc vËt níc ta chiÕm kho¶ng 5% tèng sè loµi thùc vËt bËc cao ®· biÕt trªn thÕ giíi vµ kho¶ng trªn díi 25% sè loµi thùc vËt bËc cao ®· biÕt ë ch©u ¸.

ViÖt Nam, víi lîi thÕ nguån tµi nguyªn thùc vËt phong phó, víi h¬n 4000 loµi thùc vËt ®îc sö dông trong y häc cæ truyÒn ®ang thu hót ®îc sù quan t©m cña çc nhµ khoa häc trong níc vµ trªn thÕ giíi. Nh÷ng c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ hãa häc, dîc häc cña çc c©y thuèc d©n téc ®ang dÇn chiÕm mét tû lÖ lín trong çc nghiªn cøu khoa häc gÇn ®©y. Theo thèng kª cña gi¸o s Norman R. Farnsworth, trong kho¶ng thêi gian tõ 1975 ®Õn 2003 ®· cã kho¶ng trªn 500 bµi b¸o, c«ng tr×nh nghiªn cøu ®îc biÕt cã liªn quan ®Õn hãa häc vµ dîc häc cña thùc vËt ViÖt Nam. §¸ng chó ý lµ nh÷ng nghiªn cøu ®îc gia t¨ng ®¸ng kÓ trong thêi gian gÇn ®©y. Cô thÓ lµ trong kho¶ng thêi gian 10 n¨m trë l¹i ®©y th× sè c«ng tr×nh nghiªn cøu ®· t¨ng gÊp bèn lÇn (393 c«ng tr×nh). Tuy nhiªn, rÊt nhiÒu çc c«ng tr×nh nghiªn cøu ®îc thùc hiÖn ë níc ngoµi, mét sè cßn kh«ng cã sù gãp mÆt cña çc t¸c gi¶ ViÖt Nam. Nh÷ng nghiªn cøu ph¸t hiÖn thuèc tõ nguån th¶o dîc ViÖt Nam nh»m gióp chñ ®éng nguån nguyªn liÖu s½n cã còng ®· ®îc chó ý thùc hiÖn. Cô thÓ, chóng ta ®· nghiªn cøu t¸ch chiÕt thµnh c«ng Artermisin tõ c©y Thanh hao hoa vµng (Artemisia annua L.) vµ chuyÓn hãa thµnh c«ng çc dÉn xuÊt cã ho¹t tÝnh cao h¬n (Artermether, artesunat…) lµm thuèc chèng sèt rÐt. Hay nh viÖc ph©n lËp Taxol tõ c©y th«ng ®á (Taxus baccata L), viÖc chiÕt l-tetrahydropalmatin tõ rÔ cñ cña mét sè lo¹i B×nh v«i (Stephania spp.) lµm thuèc an thÇn, t¸ch chiÕt berberin tõ loµi Vµng ®¾ng (Coscinium fenestratum), curcumin tõ c©y nghÖ (Curcuma longa L.), rutin tõ nô Hoa hße (Styphnolobium japonicum L.), vinblastin, vincristin tõ c©y Dõa c¹n (Catharanthus roseus L.)... I.3.2. T×nh h×nh sö dông thuèc d©n téc ë ViÖt Nam.

ViÖt Nam ®· cã lÞch sö l©u ®êi sö dông c©y cá tù nhiªn ®Ó ch÷a bÖnh cho con ngêi. Tõ thêi V¨n Lang dùng níc, cha «ng ta ®· biÕt dïng trÇu, gõng vµ rîu. §Õn thêi kú An D¬ng V¬ng, ngêi ta ®· biÕt dïng tªn tÈm ®éc trong s¨n b¾n vµ chiÕn ®Êu. Tr¶i qua thêi kú 1000 n¨m B¾c thuéc, viÖc sö dông thuèc cæ truyÒn

26

Trung Quèc trong ch÷a bÖnh ®· trë nªn phæ biÕn ë níc ta. Danh y TuÖ TÜnh, ngêi viÕt cuèn “Nam dîc thÇn diÖu” vµ “ThËp tam ph¬ng gia gi¶m”, ®· liÖt kª 580 c©y thuèc vµ 3932 bµi thuèc d©n téc. «ng còng chÝnh lµ ngêi ®· kh¬i gîi ý tëng “Dïng thuèc ViÖt ®Ó ch÷a cho ngêi ViÖt”. §Õn thêi kú 1720-1791, H¶i Thîng L·n «ng ®· biªn so¹n bé B¸ch khoa th vÒ Y häc cæ truyÒn ViÖt Nam “H¶i Thîng Y T«ng T©m LÜnh”. C«ng tr×nh cña «ng lµ sù ®óc rót kinh nghiÖm, tri thøc vÒ sö dông c©y cá ®Ó ch÷a bÖnh vµ ch¨m sãc søc khoÎ tõ xa xa cña d©n téc ta. Tr¶i qua mét thêi kú dµi kh«ng ®îc sö dông réng r·i do sù du nhËp cña T©y dîc, ngµy nay y häc d©n téc ®· t×m l¹i vÞ trÝ cña m×nh trong ®iÒu trÞ vµ ch¨m sãc søc khoÎ ngêi d©n. §Æc biÖt, víi sù hç trî cña çc ph¬ng ph¸p nghiªn cøu míi, tiªn tiÕn vµ xu thÕ “Quay vÒ víi tù nhiªn”, y häc cæ truyÒn nay ®· vµ ®ang ®îc ¸p dông réng r·i bªnh c¹nh y häc hiÖn ®¹i.

§Õn nay, theo nh÷ng thèng kª ban ®Çu, ®· cã 39813 bµi thuèc vµ ph¬ng thuèc cæ truyÒn ë níc ta. §©y chÝnh lµ kho tµng tri thøc v« gi¸ cÇn ®îc b¶o tån, khai th¸c vµ øng dông trong ®êi sèng, phôc vô cho c«ng t¸c b¶o vÖ, ch¨m sãc søc kháe céng ®ång. Víi truyÒn thèng sö dông thuèc d©n téc tõ l©u n¨m, ViÖt Nam ®· thùc hiÖn viÖc nghiªn cøu ¸p dông y häc cæ truyÒn vµo hÖ thèng y häc hiªn ®¹i tõ nh÷ng n¨m 1950. Toµn quèc cã 03 ViÖn nghiªn cøu y häc cæ truyÒn, 45 bÖnh viÖn y häc d©n téc, 242 bÖnh viÖn cã sö dông thuèc d©n téc trong ®iÒu trÞ bÖnh vµ kho¶ng h¬n 30.000 thÇy thuèc hµnh nghÒ y häc cæ truyÒn ë kh¾p n¬i. Nh÷ng nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy hÇu hÕt çc c«ng ty dîc phÈm ®Òu sö dông nguån nguyªn liÖu tù nhiªn ®Ó s¶n xuÊt thuèc vµ cã kho¶ng 60% ngêi d©n ®îc hái cho biÕt hä lùa chän thuèc d©n téc nh lµ lùa chän hµng ®Çu trong phßng ch÷a bÖnh

Hµng n¨m, nhu cÇu sö dông c©y thuèc íc kho¶ng trªn 60.000 tÊn trong ®ã kho¶ng 30.000 tÊn ®îc sö dông trong hÖ thèng y häc cæ truyÒn vµ phßng ch÷a bÖnh céng ®ång, 20.000 tÊn dïng lµm nguån nguyªn liÖu cho çc c«ng ty dîc phÈm vµ 11.000 tÊn phôc vô cho c«ng t¸c xuÊt khÈu. HÇu hÕt nguån dîc liÖu trªn ®îc thu h¸i tõ thiªn nhiªn vµ chØ mét sè nhá lµ ®îc nu«i trång theo quy ho¹ch. Cïng víi viÖc nhu cÇu sö dông c©y thuèc t¨ng nhanh, mét yªu cÇu míi trong viÖc qu¶n lý chÊt lîng c©y thuèc d©n téc ®îc ®Æt ra. Do viÖc thu thËp, tuyÓn chän mÉu thùc vËt ë ta chñ yÕu dùa trªn kinh nghiÖm thu ®îc do ®ã viÖc nhÇm lÉn, sai lÖch mÉu thùc vËt trong thu h¸i lµ kh«ng thÓ tr¸nh khái, vÊn ®Ò nµy sÏ ®îc ®Ò cËp chi tiÕt h¬n ë phÇn sau. Ngoµi ra, mét vÊn ®Ò ®¸ng chó ý kh¸c còng ®îc ®Ò ra ®ã lµ viÖc thu h¸i tù nhiªn mÉu theo lîng lín sÏ ®e do¹ m«i trêng sinh th¸i. Do vËy, viÖc nghiªn cøu b¶o tån vµ khai th¸c ®óng møc nguån lîi tù nhiªn sÏ kh«ng nh÷ng ®em l¹i lîi Ých kinh tÕ cao mµ cßn gióp duy tr×, g×n gi÷ çc nguån dîc liÖu quý cña cha «ng ta ®Ó l¹i. I.3.4. VÊn ®Ò ®Æt ra trong qu¶n lý chÊt lîng thuèc d©n téc

Víi truyÒn thèng sö dông thuèc d©n téc tõ l©u ®êi viÖc thu h¸i, tuyÓn chän mÉu ®· trë thµnh ho¹t ®éng thêng xuyªn, phæ biÕn. Tõ tríc ®Õn nay, viÖc thu h¸i,

27

lùa chän mÉu thùc vËt, th¶o dîc ®Òu chñ yÕu dùa vµo kinh nghiÖm cña ngêi thùc hiÖn viÖc ®ã mµ hÇu nh kh«ng cã sù chuÈn hãa nµo. H¬n n÷a, sù qu¶n lý chÊt lîng th¶o dîc hiÖn nay còng kh«ng ®îc quan t©m ®Çy ®ñ ë níc ta. Mét trong nh÷ng nguyªn t¾c sö dông thuèc th¶o dîc lµ hiÖu qu¶ vµ tÝnh an toµn. Nhng nÕu trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt dîc liÖu, nguån nguyªn liÖu ban ®Çu kh«ng ®îc kiÓm so¸t vÒ mÆt chÊt lîng th× s¶n phÈm t¹o thµnh còng kh«ng ®¶m b¶o. §èi víi T©y dîc viÖc qu¶n lý chÊt lîng kh«ng ph¶i lµ vÊn ®Ò ®¸ng quan t©m n÷a v× chÊt lîng nguyÖn liÖu ®Çu vµo ®· ®îc chuÈn hãa. Nhng víi th¶o dîc th× viÖc qu¶n lý chÊt lîng phøc t¹p h¬n rÊt nhiÒu. Do hÇu hÕt viÖc thu thËp mÉu th¶o dîc lµ tõ tù nhiªn do ®ã chóng hoµn toµn kh«ng cã sù chuÈn hãa. Mét sè chóng ®îc thu thËp kh«ng chÝnh x¸c. Sù nhÇm lÉn xuÊt ph¸t tõ sù gièng nhau vÒ h×nh th¸i häc cña c©y trong cïng n¬i thu mÉu, tõ sù nhËn d¹ng c©y hoÆc tõ nh÷ng sai sãt tõ çc mÉu thùc vËt nhËp khÈu. VÇn ®Ò nµy hiÖn nay kh«ng chØ x¶y ra ë ViÖt Nam mµ cßn ë çc níc ¸ §«ng, n¬i sö dông rÊt nhiÒu nguån th¶o dîc lµm thuèc ch÷a bÖnh. VÒ mÆt nguyªn t¾c, çc loµi thùc vËt kh¸c nhau th× sÏ cã nh÷ng thµnh phÇn ho¹t chÊt kh¸c nhau. Do vËy viÖc thu thËp mÉu kh«ng chÝnh x¸c sÏ dÉn ®Õn nh÷ng hËu qu¶ kh«n lêng. Mét vÝ dô ®iÓn h×nh tõ mét vÞ thuèc cã tªn §éc ho¹t. §éc ho¹t thêng lµ tªn gäi cho çc rÔ cña loµi thuéc chi Angelica (hä Tróc §µo Apiaceae) nh Xuyªn ®éc ho¹t (A.laxiflora Diels vµ A. megaphylla Diels), H¬ng ®éc ho¹t (A. pubescens Maxim.). VÞ thuèc nµy còng cã thÓ thuéc mét chi kh¸c nh Ngu vÞ ®éc ho¹t (Heracleum hemsleyanum Michx.), §éc ho¹t l«ng mÒm (Heracleum lanatum Michx.). Hay thËm chÝ thuéc mét hä kh¸c nh Cöu nhìn ®éc ho¹t (Aralia cordata, hä Nh©n S©m, Araliaceae). HoÆc nh cïng mét lo¹i dîc liÖu cã tªn Thæ tam thÊt nhng cã ®Õn vµi loµi kh¸c nhau cã cïng tªn nh vËy, ®ã lµ Gynura pseudochina, Stahlianthus thorelii Gagn, thêng ®îc sö dông thay thÕ cho Panax notoginseng mµ kh«ng cã sù quan t©m ®Õn nh÷ng thay ®æi vÒ hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y. Ngoµi ra, viÖc thu thËp mÉu còng gÆp rÊt nhiÒu khã kh¨n, ®Æc biÖt víi nh÷ng mÉu cã h×nh th¸i t¬ng ®èi gièng nhau. VÝ dô nh viÖc thu mÉu c©y ChÌ vµng (Jasminum subtriplinerve Bl.) dïng ®Ó ch÷a çc bÖnh viªm nhiÔm, d¹ dµy, sÏ rÊt dÔ nhÇm lÉn víi c©y L¸ ngãn (Gelsemium elegans Benth.), mét c©y cã ®éc tÝnh rÊt cao, cã thÓ g©y chÕt ngêi.

VÊn ®Ò nµy còng ®îc nh¾c ®Õn trong “Híng dÉn cho ph¬ng ph¸p nghiªn cøu, thö nghiÖm y häc cæ truyÒn” cña tæ chøc Y tÕ thÕ giíi (WHO) n¨m 2000. “MÆc dï ®· tån t¹i vµ sö dông qua hµng thÕ kû, mÆc dï ®· ®îc dïng phæ biÕn trong suèt vµi thËp kû qua, y häc cæ truyÒn vÉn cha ®îc chÝnh thøc c«ng nhËn t¹i hÇu hÕt çc quèc gia. KÕt qu¶ lµ sù gi¸o dôc, ®µo t¹o vµ nghiªn cøu trong lÜnh vùc nµy cha ®îc chó ý ®óng møc. Çc c¬ së d÷ liÖu vÒ chÊt lîng, sè lîng, ®é an toµn vµ hiÖu qu¶ sö dông cña thuèc cæ truyÒn lµ cha ®ñ so víi çc yªu cÇu ®Ó chóng cã thÓ ®îc phæ biÕn réng r·i trªn thÕ giíi. Nh÷ng nguyªn nh©n g©y nªn sù thiÕu hôt nµy kh«ng

28

chØ do çc chÝnh s¸ch vÒ ch¨m sãc søc kháe mµ cßn do thiÕu tÝnh hîp lý hoÆc thiÕu çc ph¬ng ph¸p nghiªn cøu thÝch hîp ®èi víi dîc liÖu cæ truyÒn.

Nh÷ng g× võa ®Ò cËp ë phÇn trªn cho thÊy cã v« sè çc vÊn ®Ò cÇn gi¶i quyÕt trong qu¶n lý chÊt lîng th¶o dîc hiÖn nay. Nghiªn cøu, ¸p dông nh÷ng ph¬ng ph¸p míi, hiÖn ®¹i vµ ®¸ng tin cËy vµo kiÓm so¸t chÊt lîng th¶o dîc ®ang lµ yªu cÇu cÊp b¸ch ®Ò ra ®¶m b¶o cho tÝnh an toµn vµ hiÖu qu¶ trong sö dông thuèc cæ truyÒn ë ViÖt Nam. I.4. Mét sè øng dông cña ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trong ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu trªn thÕ giíi a. Giíi thiÖu vÒ ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký Theo ®Þnh nghÜa, dÊu v©n tay s¾c ký cña mét mÉu th¶o dîc lµ mét s¾c ký ®å (hoÆc mét ®iÖn t©m ®å) cã dîc tÝnh vµ tÝnh chÊt ho¸ häc ®iÓn h×nh cña mét dÞch chiÕt mÉu th¶o dîc ®ã. MÉu s¾c ký ®å nµy ph¶i ®¶m b¶o çc yªu cÇu vÒ sù xuÊt hiÖn “râ rµng” hay “mê nh¹t”, sù “gièng” hay “kh¸c nhau” cña çc yÕu tè ho¸ häc cã mÆt trong dîc liÖu. Dùa vµo nh÷ng ®Æc tÝnh nªu trªn, ph¬ng ph¸p dÊu v©n t¸y s¾c ký ®îc sö dông trong viÖc ®¸nh gi¸ vµ kiÓm so¸t chÊt lîng th¶o dîc. Khã kh¨n cña viÖc kiÓm so¸t chÊt lîng dîc liÖu tõ thiªn nhiªn chñ yÕu lµ do sù phøc t¹p cña çc thµnh phÇn ho¸ häc, trong ®ã cã rÊt nhiÒu sù t¬ng t¸c qua l¹i dÉn ®Õn khã cã thÓ x¸c ®Þnh chÝnh x¸c ®îc thµnh phÇn nµo cã ho¹t tÝnh. ChÝnh v× vËy, nÕu ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu mµ chØ dùa vµo mét sè lîng h¹n chÕ çc hîp chÊt cã ho¹t tÝnh hoÆc ®éc tè th× rÊt khã x¸c ®Þnh ®îc chÊt lîng tù nhiªn cña s¶n phÈm mét çch trän vÑn. Thùc tÕ cho thÊy s¾c ký líp máng lµ ph¬ng ph¸p ®· ®îc ¸p dông tõ l©u vµ kh¸ th«ng dông trong ®Þnh tÝnh dîc liÖu. Nhê u ®iÓm x¸c ®Þnh nhanh, tiÖn lîi vµ gi¸ thµnh rÎ mµ ph¬ng ph¸p nµy hiÖn ®· ®îc ®a vµo çc dîc ®iÓn vµ çc tiªu chuÈn c¬ së ®Ó kiÓm nghiÖm dîc liÖu vµ thuèc tõ dîc liÖu. Kü thuËt dÊu v©n tay dùa trªn nÒn t¶ng cña s¾c ký líp máng hiÖn còng ®ang ®îc sö dông nhiÒu trong çc chuyªn luËn dîc liÖu cña çc dîc ®iÓn. ViÖc ¸p dông kü thuËt dÊu v©n tay trªn c¬ së cña TLC còng ®· ¸p dông vµo viÖc nhËn d¹ng çc dîc liÖu g©y nhÇm lÉn nh: gi÷a ®éc ho¹t Astragalus vµ H¬ng ®éc ho¹t Hedysarum, gi÷a ®¬ng quy cña Trung quèc Angelica sinensis víi Levisticum officinale, Gi÷a nÊm linh chi Ganoderma lucidum qu¶ thÓ Ganoderma applanatum, thµnh phÇn flavonoid trong b¹ch qu¶ Ginkgo biloba, gi÷a lßai ngò vÞ tö Schisandra chinensis víi Schisandra sphenanthera 108. Tuy nhiªn, mét vÊn ®Ò gÆp ph¶i khi sö dông s¾c ký líp máng TLC ®Ó ®¸nh gi¸ dîc liÖu ®ã lµ trong mÉu th¶o dîc thêng cã nhiÒu thµnh phÇn, çc thµnh phÇn nµy cã møc ®é phøc t¹p cao, dÔ ph©n huû vµ bay h¬i, cã nhiÒu thµnh phÇn chång chÐo vµ ë lîng rÊt nhá th× ph¬ng ph¸p s¾c ký líp máng gÆp nhiÒu khã kh¨n. H¬n thÕ, d÷ liÖu cña s¾c ký líp máng lµ d÷ liÖu mét chiÒu kh«ng tho¶ m·n ®îc yªu cÇu cña ph©n tÝch d÷ liÖu nhiÒu chiÒu trong ®iÒu kiÖn hiÖn nay. Thªm vµo

29

®ã viÖc chuyÓn d÷ liÖu ®Ó cã thÓ øng dông çc ph¬ng ph¸p ho¸ thèng kª ®Ó tiÕn hµnh xö lý sè liÖu gÆp nhiÒu khã kh¨n, ®«i khi kh«ng thÓ thùc hiÖn ®îc viÖc chuyÓn ®æi ®Ó xö lý sè liÖu thu ®îc 109, 136, 174 Sù ra ®êi cña ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký dùa trªn çc thiÕt bÞ ph©n tÝch hiÖn ®¹i ®· phÇn nµo kh¾c phôc ®îc nh÷ng h¹n chÕ nªu trªn qua ®ã sÏ gióp cho viÖc x¸c ®Þnh ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh lîng chÊt lîng çc th¶o dîc nhanh chãng vµ ®é chÝnh x¸c ®¸ng tin cËy. KÓ tõ vµi n¨m trë l¹i ®©y, kü thuËt ph©n tÝch dÊu v©n tay s¾c ký ®· ®îc sö dông nhiÒu ®Ó x¸c ®Þnh vµ ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu cña Trung Quèc, Hµn Quèc vµ NhËt B¶n109,110,111. N¨m 2000, Côc Qu¶n lý dîc cña Trung Quèc ®· quyÕt ®Þnh ph¸t triÓn kü thuËt dÊu v©n tay s¾c ký cña dîc liÖu cæ truyÒn (TMC) nh mét tiªu chuÈn ®Ó ®¸nh gi¸ vµ qu¶n lý chÊt lîng cña dîc phÈm112. Trong t¬ng lai kh«ng xa, kü thuËt ph©n tÝch dÊu v©n tay s¾c ký sÏ trë thµnh mét kü thuËt mang tÝnh tiªu chuÈn cho viÖc ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu vµ çc s¶n phÈm thiªn nhiªn kh¸c cã nguån gèc tõ dîc liÖu, trong ®ã bao gåm viÖc ®¸nh gi¸ nh÷ng nguyªn liÖu tinh vµ nguyªn liÖu th« dïng lµm nguyªn liÖu ®Çu vµo cho c«ng nghiÖp hãa dîc. b. Kh¶ n¨ng øng dông cña ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký vµ çc u nhîc ®iÓm.

Do qu¸ tr×nh sö dông thuèc d©n téc ngµy cµng phæ biÕn nªn viÖc kiÓm so¸t chÊt lîng ®Çu vµo trong tiÕp cËn çc thµnh phÇn hçn hîp ®Ó ®¶m b¶o sù nhËn d¹ng, an toµn vµ æn ®Þnh lµ yªu cÇu quan träng. Cho ®Õn nay, ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký ngµy cµng cã ®îc sù quan t©m cña çc níc cã sö dông y häc d©n téc nh Trung Quèc, NhËt B¶n, Hµn Quèc. GÇn ®©y, ®· cã nhiÒu th«ng b¸o vÒ viÖc sö dông ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trong qu¶n lý, kiÓm so¸t chÊt lîng çc th¶o dîc, vÝ dô nh cho Gingko biloba, viÖc nhËn d¹ng ph©n biÖt çc loµi cïng chi nh Panax ginseng, Panax quinquefolium, Panax noto-ginseng

Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký còng ®· ®îc khuyÕn ço sö dông trong cuèn “Híng dÉn cho ph¬ng ph¸p nghiªn cøu, thö nghiÖm y häc cæ truyÒn” cña tæ chøc Y tÕ thÕ giíi (WHO). Theo ®ã, ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký ®îc khuyÕn ço nh lµ mét ph¬ng ph¸p chuÈn ho¸ trong viÖc nhËn d¹ng thùc vËt, chuÈn bÞ mÉu vµ s¶n phÈm cuèi cïng. Ph¬ng ph¸p nµy ®Æc biÖt ®îc quan t©m sö dông trong nhËn d¹ng çc thµnh phÇn hçn hîp dîc liÖu, khi çc thµnh phÇn ho¹t chÊt chñ yÕu cha ®îc x¸c ®Þnh. S¾c ký cã nhiÒu u ®iÓm trong ph©n t¸ch çc thµnh phÇn hçn hîp thµnh çc ®¬n vÞ dÔ nhËn biÕt h¬n díi d¹ng çc phæ hay s¾c ký ®å. Mét trong nh÷ng ph¬ng ph¸p phæ biÕn hiÖn nay ®Ó nhËn d¹ng, ph©n tÝch vµ kiÓm so¸t çc s¶n phÈm tù nhiªn ®ã lµ lùa chän mét vµi chÊt nh lµ chÊt chØ thÞ “marker”. ë níc ta, viÖc ph©n tÝch, kiÓm so¸t vµ nhËn d¹ng çc thµnh phÇn dîc liÖu còng dùa theo ph¬ng ph¸p trªn. Çc nghiªn cøu chñ yÕu dùa trªn viÖc ph©n tÝch sù cã mÆt cña çc chÊt chØ thÞ trªn s¾c ký ®å th«ng qua çc kÕt qu¶ s¾c ký tõ GC hay HPLC. VÝ dô nh

30

viÖc ph©n biÖt mËt gÊu vµ çc lo¹i kh¸c qua HPLC dùa trªn chÊt chuÈn lµ axÝt tauroursodeoxycholic (TUDC) hay taurochenodeoxycholic (TCDC) ®· ®îc th«ng b¸o bëi çc nhµ khoa häc ViÖt Nam. Tuy nhiªn, ®èi víi y häc d©n téc, cã rÊt nhiÒu dîc liÖu cã cïng thµnh phÇn ho¹t tÝnh gièng nhau do vËy ph¬ng ph¸p nµy lµ kh«ng hiÖu qu¶ trong viÖc nhËn d¹ng chÝnh x¸c mét lo¹i dîc liÖu nhÊt ®Þnh. V× vËy, rÊt cÇn mét ph¬ng ph¸p ®Æc hiÖu ®Ó kiÓm so¸t chÊt lîng dîc liÖu víi çc yªu cÇu phøc t¹p trªn. Ph©n tÝch dÊu v©n tay s¾c ký víi nh÷ng u ®iÓm trong viÖc nhËn d¹ng çc thµnh phÇn hçn hîp trong dîc liÖu vµ çc s¶n phÈm cuèi cïng ®ang trë thµnh mét ph¬ng ph¸p ®¸ng tin cËy trong kiÓm so¸t dîc liÖu cæ truyÒn. Ph¬ng ph¸p nµy sö dông phèi hîp nhiÒu kü thuËt s¾c ký kh¸c nhau nh CE, GC, HPLC, HPTLC, LC/MS…®Ó x©y dùng b¶n mÉu ®Æc hiÖu cho nhËn d¹ng çc thµnh phÇn hçn hîp trong th¶o dîc. ViÖc nhËn d¹ng mÉu çc thµnh phÇn kh«ng chØ phô thuéc vµo mét sè chÊt chØ thÞ mµ ph¶i dùa trªn mét tû lÖ hçn hîp tÊt c¶ çc yÕu tè ph©n tÝch ®îc. Do vËy, viÖc ph©n tÝch sÏ ®¶m b¶o ®îc tÝnh kh¸ch quan, æn ®Þnh vµ ®¸ng tin cËy trong viÖc kiÓm so¸t, chuÈn ho¸ chÊt lîng th¶o dîc. VÝ dô nh viÖc sö dông kü thuËt dÊu v©n tay s¾c ký HPLC ®Ó chøng minh tÝnh æn ®Þnh cña tæng lîng flavonoid cña çc mÉu cÆn chiÕt l¸ c©y B¹ch qu¶ (Ginko biloba) trªn thÞ trêng cïng víi sù ph¸t hiÖn cña nh÷ng mÉu cã pha trén, thÝ nghiÖm nµy ®îc thùc hiÖn bëi çc nhµ khoa häc Trung Quèc. Çc ®iÒu kiÖn s¾c ký vÕt HPLC ®· ®îc tèi u hãa ®Ó ®¹t ®îc kÕt qu¶ tèt nhÊt cho qu¸ tr×nh nhËn d¹ng. §Ó thuËn tiÖn cho viÖc thö nghiÖm, s¾c ký ®å cña mÉu cÆn chiÕt chuÈn Ginko biloba (Egb761) ®îc chia ra thµnh 5 vïng riªng biÖt (nh h×nh I.4.1). Vïng 1 cã 7 pic, vïng 2 cã 3 pic, vïng 3 cã 4 pic, vïng 4 cã 3 pic vµ vïng 5 cã vµi pic nhá. Nh÷ng pic nhá ë vïng 5 kh«ng ®ãng vai trß quan träng trong viÖc nhËn d¹ng, ®¸nh gi¸ mÉu. Víi çch chia nh vËy sÏ gióp ngêi ph©n tÝch dÔ dµng ®¸nh gi¸ ®îc çc mÉu b»ng çch so s¸nh chiÒu cao pic, tû lÖ gi÷a çc pic víi nhau tríc khi ph©n tÝch çc d÷ liÖu thu ®îc tõ çc pic. Trªn s¾c ký ®å h×nh 1, pic cao nhÊt (sè 8) lµ runtin, pic 16 lµ heteroside A vµ pic 17 lµ heteroside B. Tû lÖ gi÷a çc pÝc 8:16:17 lµ 1:0,5:0,45.

H×nh I.4.1. B¶n d©u v©n tay s¾c ký

HPLC chuÈn cÆn chiÕt l¸ c©y Ginko biloba (Egb761).

H×nh I.4.2. NhËn d¹ng t¬ng ®ång çc dÊu v©n tay s¾c ký HPLC cña 19 mÉu

cÆn chiÕt l¸ Ginko biloba trªn thÞ trêng sö dông phÇn mÒm CASE.

31

Sö dông b¶n mÉu s¾c ký vÕt HPLC cña Egb761 nh lµ mét mÉu chuÈn ®Ó so s¸nh víi çc mÉu kh¸c, 19 mÉu EGb tõ çc nguån kh¸c nhau ®· ®îc thu thËp vµ ph©n tÝch, so s¸nh. Qu¸ tr×nh tÝnh to¸n çc tÝn hiÖu pic trªn s¾c ký ®å cña çc mÉu thÝ nghiÖm ®îc thùc hiÖn bëi phÇn mÒm tÝnh to¸n ®é t¬ng ®ång CASE, kÕt qu¶ ph©n tÝch cho thÊy sù t¬ng ®ång rÊt cao cña çc mÉu ph©n tÝch ®èi víi mÉu chuÈn Egb761 víi hÖ sè t¬ng ®ång lªn ®Õn 0,94. Trong sè ®ã, cã 5 mÉu thÓ hiÖn hÖ sè t¬ng ®ång nhá h¬n 0.87 (h×nh I.4.2).

§iÒu nµy cho thÊy tû lÖ vµ sù ph©n bè cña flavonoid trong çc mÉu cÆn chiÕt

kh¸c nhau cña Ginko biloba lµ rÊt æn ®Þnh. Thªm vµo ®ã, b¶n mÉu s¾c ký vÕt cña mÉu sè 1, 2 vµ 4 cho thÊy chóng ®· ®îc pha trén, dêng nh çc mÉu nµy ®· ®îc bæ xung mét lîng rutin nhÊt ®Þnh nh»m lµm t¨ng tæng lîng flavonoid trong cÆn chiÕt. Cã thÓ thÊy râ ë h×nh 3, pic sè 8, rutin cho thÊy nång ®é rÊt cao kh«ng b×nh thêng trong s¾c ký ®å cña çc mÉu trªn, do ®ã cã thÓ nhËn ®Þnh r»ng çc mÉu nµy ®· ®îc phèi trén. Gi¶ thiÕt nµy còng ®îc x¸c nhËn th«ng qua kü thuËt ph©n tÝch thµnh phÇn chñ yÕu (Principal Component Analysis – PCA). §iÓm xuÊt hiÖn trªn ®å thÞ PCA cña çc mÉu 1, 2 vµ 4 çch rÊt xa so víi çc mÉu kh¸c.

c.Nh÷ng øng dông cña dÊu v©n tay trong qu¶n lý chÊt lîng dîc liÖu Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký dùa trªn thiÕt bÞ HPLC ®· ®îc øng dông ®Ó x©y dùng ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh nhanh vµ ®¬n gi¶n th¶o dîc cã tªn lµ Isatis indigotica Fort, trong dîc liÖu cæ truyÒn cña Trung Quèc. Ph¬ng ph¸p nµy ®îc x©y dùng trªn thiÕt bÞ HPLC víi cét s¾c ký pha ®¶o C18, hÖ dung m«i ®îc lùa chän lµ níc vµ methanol (94:4,v/v), tèc ®é dßng lµ 1.0 ml/phót vµ bíc sãng 260 nm113. DÊu v©n tay s¾c ký thu ®îc tõ hÖ HPLC-ELSD ®Ó ®¸nh gi¸ vµ kiÓm so¸t chÊt lîng lo¹i thuèc tiªm QingKailing ®· gióp cho çc nhµ qu¶n lý dîc Trung Quèc kiÓm so¸t rÊt hiÖu qu¶ chÊt lîng cña lo¹i thuèc tiªm nµy 114,115 . Sù kÕt hîp cña loµi th¶o dîc Flos carthami dïng trong y häc cæ truyÒn Trung Quèc víi loµi th¶o dîc Stigma crosi t¹o thµnh mét bµi thuèc rÊt næi tiÕng, do môc ®Ých th¬ng m¹i trªn thÞ trêng ®· xuÊt hiÖn mét lo¹i th¶o dîc rÎ tiÒn Flos hemerocallis dïng thay thÕ th¶o dîc Flos carthami trong çc ®¬n thuèc. Çc nhµ khoa häc Trung Quèc ®· ph¸t triÓn mét ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký dùa trªn thiÕt bÞ ®iÖn di ®Ó ph©n biÖt sù kh¸c nhau gi÷a ba loµi th¶o dîc kÓ trªn, qua ®ã ®· kiÓm so¸t ®îc thµnh phÇn cña

32

bµi thuèc vµ gióp qu¶n lý ®îc chÊt lîng cña bµi thuèc trªn116. §¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu liªn quan trùc tiÕp ®Õn viÖc nghiªn cøu thµnh phÇn cña dîc liÖu, çc thµnh phÇn nµy cã thÓ thay ®æi theo khu vùc ph©n bè, ®iÒu kiÖn ®Þa lý vµ mïa vô thu ho¹ch. N¨m 2004, M.Gu vµ céng sù ®· ®¸nh gi¸ chÊt lîng cña loµi th¶o dîc cã tªn tiÕng ViÖt lµ HuyÕt s©m (Salvia miltiorrhiza) ë çc khu vùc sinh sèng kh¸c nhau vµ kh¶o s¸t sù thay ®æi thµnh phÇn cña loµi th¶o dîc nµy theo ®iÒu kiÖn khÝ hËu, khu vùc sinh sèng b»ng ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c kýx©y dùng trªn hÖ thèng HPLC, çc kÕt qu¶ nghiªn cøu dùa trªn s¾c ký ®å vµ tÝn hiÖu UV cho thÊy khu vùc sinh sèng vµ thêi tiÕt cã t¸c ®éng rÊt lín ®Õn thµnh phÇn ho¸ häc cña loµi HuyÕt s©m nµy117,118,119. B»ng çch sö dông hÖ thèng LC-MS mét sè thµnh phÇn xuÊt hiÖn trªn dÊu v©n tay s¾c ký cña loµi HuyÕt s©m còng ®· ®îc nghiªn cøu vµ x¸c ®Þnh th«ng qua viÖc so s¸nh çc gi¸ trÞ thu ®îc trªn s¾c ký láng cao ¸p kÕt nèi víi khèi phæ víi çc tµi liÖu tham kh¶o120-123.

Trong y häc cæ truyÒn Trung Quèc cã mét lo¹i thuèc cã tªn lµ “Tianmendong”, lo¹i thuèc nµy cã thµnh phÇn chñ yÕu lµ rÔ kh« cña loµi th¶o dîc Thiªn m«n ®«ng “Asparagus cochinchinensis”, lo¹i thuèc nµy trªn thÞ trêng ®«i khi bÞ thay thÕ bëi mét sè loµi th¶o dîc cïng chi nh A. filicinus, A. meioclados hoÆc A. spinasissimus. Do thµnh phÇn hãa häc cña çc loµi trong cïng mét chi còng cã sù kh¸c nhau, sù thay thÕ nªu trªn g©y ra sù mÊt an toµn vµ kh«ng hiÖu qu¶ trong qu¸ tr×nh sö dông lo¹i thuèc cæ truyÒn “Tianmendong”. §Ó ph©n biÖt ®îc thµnh phÇn cña loµi thuèc nµy, n¨m 2003 nhãm nhµ khoa häc Y.C Yang vµ céng sù ®· x©y dùng ph¬ng ph¸p qu¶n lý chÊt lîng lo¹i thuèc nµy dùa trªn kü thuËt fingerprint, kÕt qu¶ ®· ®¸nh gi¸ chÝnh x¸c thµnh phÇn cña çc loµi sö dông trong bµi thuèc vµ qu¶n lý hiÖu qu¶ lo¹i thuèc cæ truyÒn nªu trªn124. Y häc cæ truyÒn Trung Quèc cßn t×m ra lo¹i thuèc “Shiwei” tõ loµi Pryrrosia, trong ®ã cã ba loµi th¶o dîc chiÕm thµnh phÇn chñ yÕu lµ th¹ch b× (Pryrrosia lingua), lé s¬n th¹ch vÜ (P. sheareri) vµ mét loµi thùc vËt cïng hä cã tªn khoa häc lµ P. petiolosa, ®Ó qu¶n lý chÊt lîng cña loµi thuèc nµy, kü thuËt dÊu v©n tay s¾c ký trªn hÖ thèng thiÕt bÞ HPLC còng ®· ®îc nghiªn cøu vµ øng dông thµnh c«ng trong viÖc ph©n lo¹i, ®¸nh gi¸ vµ qu¶n lý chÊt lîng cña ba loµi thùc vËt tõ Pryrrosia125. Ngµy cµng nhiÒu dîc phÈm cã nguån gèc tõ th¶o dîc trong y häc cæ truyÒn cña Trung Quèc ®îc thùc hiÖn ®¸nh gi¸ vµ ®a ra çc tiªu chÝ qu¶n lý th«ng qua ph¬ng ph¸p s¾c ký fingerprint, “Tianjihuang” mét lo¹i thuèc cæ truyÒn kh¸ næi tiÕng cña Trung Quèc, hiÖn ®îc sö dông réng r·i trªn thÞ trêng Ch©u ¸ còng ®îc qu¶n lý vµ ®¸nh gi¸ dùa trªn ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c kýx©y dùng trªn thiÕt bÞ ph©n tÝch HPLC-DAD126. Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c kýcòng ®îc ph¸t triÓn ®Ó ®¸nh gi¸ nguyªn liÖu ®Çu vµo cho thuèc uèng cã tªn “Shuang–Huang–Lian” tõ th¶o dîc cña Trung Quèc127. ThiÕt bÞ HPTLC ®îc sö dông ®Ó x©y dùng çc dÊu v©n tay s¾c ký cña çc isoflavonoid cã mÆt trong th¶o dîc cã tªn tiÕng ViÖt lµ “Çt c¨n” nh»m ph©n biÖt sù kh¸c nhau gi÷a loµi Radix

33

Puerariae Lobate vµ Radix Puerariae Thomsonii128. Ph¸t triÓn ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trªn thiÕt bÞ HPLC ®Ó qu¶n lý chÊt lîng lo¹i th¶o dîc Rheum tanguticum Maxim129. Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký cßn ®îc ¸p dông ®Ó x¸c ®Þnh tæng lîng alkaloid tõ Caulophyllum robustum b»ng HPLC vµ GC-MS, víi kÕt qu¶ thu ®îc chÝnh x¸c vµ ®¸ng tin cËy130. Qu¶n lý vµ ph©n biÖt hai loµi th¶o dîc Pericarpium Citri Reticulatae vµ Pericarpium Citri Reticulatae Viride dùa trªn hÖ HPLC ®Ó x©y dùng dÊu v©n tay s¾c ký vµ ph©n tÝch ®a d÷ liÖu ®Ó xö lý sè liÖu còng ®· ®îc thùc hiÖn, kÕt qu¶ thu ®îc ®· gãp phÇn ®¸nh gi¸ vµ ph©n biÖt ®îc hai loµi th¶o dîc rÊt gièng nhau vÒ ph¬ng diÖn thùc vËt häc131. Sö dông dÊu v©n tay s¾c ký trong qu¶n lý chÊt lîng loµi th¶o dîc §¬ng quy (Angelica sinensis (Oliv.) Diels) b»ng HPLC kÕt hîp víi ph¬ng ph¸p ph©n tÝch d÷ liÖu ®· biÕt ®· thu ®îc nh÷ng kÕt qu¶ rÊt thó vÞ132,133. Çc nghiªn cøu vÒ dÊu v©n tay s¾c ký cña loµi Th¬ng nhÜ tö (Fructus xanthii) ®· ®îc thùc hiÖn trªn thiÕt bÞ chiÕt vi sãng kÕt hîp víi GC–MS134. Sö dông kü thuËt dÊu v©n tay s¾c ký trªn hÖ HPLC ®Ó chøng minh tÝnh æn ®Þnh cña tæng lîng flavonoid cña çc mÉu cÆn chiÕt l¸ c©y B¹ch qu¶ (Ginko biloba) trªn thÞ trêng cïng víi sù ph¸t hiÖn cña çc mÉu cã trén mét sè hîp chÊt, thÝ nghiÖm nµy ®îc thùc hiÖn bëi çc nhµ khoa häc Trung Quèc nh»m ®¸nh gi¸ vµ qu¶n lý chÊt lîng Ginko biloba135,136,140,146. Sö dông dÊu v©n tay s¾c ký còng ®îc øng dông trong ph©n lo¹i vµ ®¸nh gi¸ chÊt lîng çc loµi cïng chi Nh©n s©m nh Panax gingseng, P. quinquefolium, P. noto-gingseng ®· ®îc ¸p dông, kÕt qu¶ thu ®îc ®· gãp phÇn ®¸nh gi¸ chÊt lîng vµ ph©n lo¹i mét sè loµi thuéc chi Nh©n s©m137,138,139. Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký cßn ®îc sö dông ®Ó x©y dùng m« h×nh dù ®o¸n kh¶ n¨ng ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸ trong s¶n phÈm trµ hßa tan dùa trªn c¬ së x©y dùng m« h×nh dÊu v©n tay s¾c ký kÕt hîp víi çc ph¬ng ph¸p hãa thèng kª kh¸c nhau, kÕt qu¶ x©y dùng ®· ®a ra ®îc m« h×nh dù ®o¸n ®îc ho¹t tÝnh chèng «xy hãa trong s¶n phÈm trµ hßa tan142,143, 147. Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký cßn ®îc kÕt hîp víi hãa häc thèng kª ®Ó lËp m« h×nh dù ®o¸n sù thÈm thÊu cña thuèc th«ng qua çc qu¸ tr×nh nghiªn cøu ®éng häc vµ sù chuyÓn hãa cña thuèc trong c¬ thÓ 144,145.

34

Ch¬ng II. M« h×nh nghiªn cøu vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu II.1. M« h×nh nghiªn cøu.

M« h×nh nghiªn cøu ®îc lùa chän trong ®Ò tµi lµ m« h×nh nghiªn cøu ho¸ häc kÕt hîp víi ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt lîng cña dîc liÖu nghiªn cøu (Chromatography dÊu v©n tay combined chemical study). §©y lµ m« h×nh nghiªn cøu cã sù kÕt hîp cña nh÷ng nghiªn cøu hãa häc vµ ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký nh»m x©y dùng m« h×nh ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu. Qua ®ã cã thÓ ®¸nh gi¸ nhanh chÊt lîng cña nguyªn liÖu dîc liÖu phôc vô cho viÖc triÓn khai t¹o s¶n phÈm cô thÓ phôc vô cuéc sèng b»ng con ®êng an toµn nhÊt, n©ng cao gi¸ trÞ øng dông cña dîc liÖu vµ liÖu ph¸p trÞ bÖnh b»ng y häc cæ truyÒn. M« h×nh nghiªn cøu nµy ®· ®îc x©y dùng dùa trªn cë së tham kh¶o nh÷ng tµi liÖu nghiªn cøu vÒ ®¸nh gi¸ chÊt lîng dùoc liÖu cña çc níc tiªn tiÕn trªn thÕ giíi nh Trung quèc, Mü, BØ, NhËt B¶n, Hµn Quèc vµ nh÷ng ph¬ng ph¸p nghiªn cøu hãa häc ®· øng dông thµnh c«ng trong sµng läc çc chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc tõ sinh vËt. Tãm t¾t çc bíc tiÕn hµnh cña m« h×nh nµy ®îc tr×nh bµy ë h×nh II.1.1.

H×nh II.1.1:Tãm t¾t m« h×nh nghiªn cøu cña ®Ò tµi II.2. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu. II.2.1. Ph¬ng ph¸p thu thËp mÉu vµ gi¸m ®Þnh tªn ph©n lo¹i.

• Ph¬ng ph¸p thu thËp mÉu, gi¸m ®Þnh tªn ph©n lo¹i Ph¬ng ph¸p thu thËp mÉu thùc vËt tu©n thñ theo çc ph¬ng ph¸p cña çc chuyªn gia vÒ thùc vËt ®Ó tiÖn cho ph©n lo¹i vµ gi¸m ®Þnh thùc vËt. §Ò tµi ®· tiÕn hµnh thu lÊy mÉu t¹i çc ®Þa ®iÓm ph©n bè thùc vËt ë çc tØnh phÝa B¾c ViÖt Nam vµ mét sè mÉu thùc vËt ë çc d¶i miÒn Trung vµ Nam ViÖt Nam.

Thu thËp mÉu, x¸c ®Þnh mÉu, t¹o c¬ së d÷ liÖu mÉu

Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay

s¾c ký

Xö lý mÉu vµ sµng läc ho¹t tÝnh

Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh híng ho¹t tÝnh

T¹o s¶n phÈm thùc phÈm chøc n¨ng

øng dông thùc tiÔn

§¸nh gi¸ chÊt lîng

s¶n phÈm

§¸nh gi¸ chÊt lîng nguyªn liÖu

35

Çc mÉu cïng loµi ®îc thu thËp t¹i nhiÒu khu vùc kh¸c nhau vµ t¹i çc thêi ®iÓm kh¸c nhau. Çc mÉu thùc vËt thu ®îc ®îc gi¸m ®Þnh tªn ph©n loµi theo çc tiªu chuÈn ph©n lo¹i thùc vËt.

• Ph¬ng ph¸p t¹o b¶n s¾c ký vÕt c¬ së. Ph¬ng ph¸p nµy ®îc x©y dùng t¹i phßng thÝ nghiÖm vÒ ph©n tÝch Ho¸ dîc trêng §¹i häc Vrije –BØ trong khu«n khæ ®Ò tµi.

• Ph¬ng ph¸p t¹o hå s¬ mÉu vµ x©y dùng c¬ së d÷ liÖu vÒ mÉu Bíc 1: Thu thËp çc th«ng tin khoa häc vÒ mÉu (Tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm,

mua thu mÉu, b¶n s¾c ký c¬ së, c«ng dông…). Bíc 2: T¹o çc file d÷ liÖu lu tr÷ th«ng tin vÒ mÉu thùc vËt. Bíc 3: Ph©n tÝch thiÕt kÕ vµ lùa chän hÖ qu¶n trÞ vµ lu tr÷ çc file d÷ liÖu Bíc 4: X©y dùng c¬ së d÷ liÖu hç trî viÖc qu¶n lý, tra cøu th«ng tin.

II.2.2. Ph¬ng ph¸p xö lý mÉu, t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc.

Çc mÉu thùc vËt thu thËp ®îc ®Òu ®îc xö lý s¬ bé ®Ó æn ®Þnh ho¹t hÊt. Sau ®ã tiÕn hµnh chiÕt mÉu víi MeOH, t¹o dÞch chiÕt th«. Çc mÉu ®Òu ®îc chiÕt theo qui tr×nh thèng nhÊt ®îc x©y dùng trong khu«n khæ ®Ò tµi nµy.

a.Xö lý mÉu thùc vËt MÉu thùc vËt sau khi thu vÒ ®îc tiÕn hµnh b¶o qu¶n, t¹o tiªu b¶n theo quy

tr×nh thèng nhÊt sau: - §¸nh dÊu trªn b¶n ®å n¬i lÊy mÉu, chôp ¶nh mÉu. - T¹o tiªu b¶n mÉu. - LËp danh s¸ch mÉu thùc vËt: Ký hiÖu mÉu = VN + B(Belgium) + sè thø tù lÊy mÉu + ký hiÖu VÝ dô: MÉu c©y Mallotus luchenensis thu t¹i L¹ng S¬n, mÉu sè thø tù 01MA

trong ®ît lÊy mÉu. §îc ký hiÖu lµ VNB01MA Çc tiªu b¶n mÉu ®îc lu gi÷ trong phßng lu gi÷ mÉu cña ViÖn Hîp chÊt

thiªn nhiªn ®Ó ®¶m b¶o mÉu kh«ng bÞ háng vµ mÊt tiªu b¶n, tiÖn cho viÖc tra cøu vµ t×m th«ng tin sau nµy.

b. T¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh. Do yªu cÇu cña ph¬ng ph¸p sµng läc ho¹t tÝnh nªn viÖc chuÈn bÞ çc mÉu thùc vËt ®Ó tiÕn hµnh sµng läc cÇn cã mét sù thèng nhÊt trong qu¸ tr×nh chuÈn bÞ mÉu. Qua tham kh¶o vµ nghiªn cøu çc quy tr×nh chiÕt mÉu ®Ó sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc cña çc ®Ò tµi tríc ®©y (ViÖt Nam-Italia, ViÖt Nam-Korea) chóng t«i ®· tiÕn hµnh x©y dùng quy tr×nh chiÕt çc mÉu thùc vËt phôc vô cho ®Ò tµi nh sau:

Bíc 1: ChuÈn bÞ mÉu: Çc mÉu thùc vËt ®îc sÊy kh« hoÆc ph¬i kh«. Bíc 2: C©n lîng mÉu thu ®îc vµ xay mÉu (Tuú theo lo¹i mÉu thùc vËt: l¸,

th©n hoÆc rÔ sö dông çc thiÕt bÞ xay vµ nghiÒn mÉu kh¸c nhau). Bíc 3: Lùa chän dung m«i chiÕt mÉu.

36

Bíc 4: MÉu thùc vËt ®îc tiÕn hµnh chiÕt b»ng dung m«i ®· ®îc lùa chän ë bíc 3 trªn thiÕt bÞ chiÕt siªu ©m (Ultrasonic 2010, 950W) ë nhiÖt ®é 40-50oC, thêi gian chiÕt mçi lÇn tèi thiÓu 60 phót.

Bíc 5: DÞch chiÕt cña ®îc läc qua giÊy läc (Whatman, d=240nm, No 1) gép l¹i vµ tiÕn hµnh cÊt lo¹i dung m«i díi ¸p suÊt gi¶m ë nhiÖt ®é díi 50oC thu ®îc dÞch c« MeOH.

Çch ®¸nh sè ký hiÖu mÉu th«: Ký hiÖu mÉu th« = Ký hiÖu mÉu+ ký hiÖu dung m«i. Trong ®ã: Dung m«i MeOH (Ký hiÖu 00); Dung m«i n-Hexan (01); Dung m«i Clorofom (Ký hiÖu 02); Dung m«i Butanol (Ký hiÖu 03)…

VÝ dô: MÉu c©y Mallotus luchenensis thu t¹i S¬n la, mÉu sè 01 trong ®ît lÊy mÉu

vµ ®îc chiÕt b»ng dung m«i MeOH. §îc ký hiÖu lµ VNB01.00. Bíc 6: C©n dÞch chiÕt vµ tÝnh lîng cÆn dÞch chiÕt phÇn tr¨m hiÖu suÊt. Bíc 7: B¶o qu¶n mÉu trong çc lä ®ùng cÆn dÞch chiÕt (theo tiªu chuÈn b¶o

qu¶n mÉu) ®Ó phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh vµ lu tr÷ l©u dµi.. c. T¹o dÞch chiÕt lîng lín phôc vô nghiªn cøu ho¸ häc

II.2.3. Ph¬ng ph¸p sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc. II.2.3.1. Ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸.

a. C¬ së cña ph¬ng ph¸p: Ph¬ng ph¸p ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸ cña çc mÉu thùc vËt th«ng qua ph¶n

øng bao v©y gèc tù do (DPPH)(Antioxidant activity assay- DPPH free radical scavenging)

b. Nguyªn liÖu, m¸y mãc thÝ nghiÖm: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (Sigma, USA). Axit ascorbic (Sigma, USA); Ethanol 96% (ViÖt Nam). Dimethylsulphoxid (DMSO) 100% (Sigma, USA). PhiÕn vi lîng 96 giÕng (Conning - Mü). B¶n máng Silicagel RP-18 F254s (Art. 1.05559). Pippetman (Gilson - Ph¸p).

M¸y ®äc Elisa. • MÉu thùc vËt MÉu thùc vËt ®îc chuÈn bÞ theo mét quy tr×nh thèng nhÊt theo tiªu chuÈn

thö ho¹t tÝnh sinh häc. c. Ph¬ng ph¸p tiÕn hµnh: + Ph¬ng ph¸p sµng läc s¬ bé kh¶ n¨ng bÉy gèc tù do trªn phiÕn 96 giÕng: Thö nghiÖm chèng «xy ho¸ dùa trªn nguyªn lý: DPPH cã kh¶ n¨ng t¹o ra çc

gèc tù do bÒn trong dung dÞch EtOH b·o hoµ. Khi cho çc chÊt thö nghiÖm vµo hçn hîp nµy, nÕu chÊt cã kh¶ n¨ng lµm trung hoµ hoÆc bao v©y çc gèc tù do sÏ lµm gi¶m cêng ®é hÊp phô ¸nh s¸ng cña çc gèc tù do DPPH. Ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸

37

®îc ®¸nh gi¸ th«ng qua gi¸ trÞ hÊp phô ¸nh s¸ng cña dÞch thÝ nghiÖm so víi ®èi chøng khi ®äc trªn m¸y Elisa ë bíc sãng 515nm .

ChuÈn bÞ mÉu thÝ nghiÖm: - T¹o dung dÞch cã çc gèc tù do: DPPH 300µM trong ethanol. - MÉu thùc vËt pha trong DMSO 100% víi nång ®é 4mg/ml. - Chøng d¬ng tÝnh 1 mM Flavonoid hoÆc 5mM axit Acscorbic.

TiÕn hµnh thÝ nghiÖm: - Trén mÉu vµ DPPH trªn phiÕn 96 giÕng.

- D·y thÝ nghiÖm: 10µl mÉu +190µl DPPH trong Ethanol. - D·y chøng ©m tÝnh: 10µl DMSO 10% +190µl DPPH trong ethanol. - D·y Blank (mÉu tr¾ng): 10µl mÉu +190µl Ethanol. - D·y chøng d¬ng tÝnh: 10µl mÉu +190µl DPPH trong ethanol.

- PhiÕn ®îc bäc kÝn ®Ó tr¸nh ¸nh s¸ng m«i trêng vµ ñ trong tñ Êm 370C trong 2 giê. §äc kÕt qu¶ trªn m¸y Elisa bíc sãng 515nm.

• TÝnh kÕt qu¶: TÝnh gi¸ trÞ % ho¹t ®éng SC% (Scavenging capacity): Gi¸ trÞ trung b×nh cña SC%. §îc ®a vµo ch¬ng tr×nh xö lý sè liÖu Excell

Window t×m ra % trung b×nh ± ®é lÖch tiªu chuÈn cña phÐp thö ®îc lÆp l¹i 3 lÇn theo c«ng thøc: OD thÝ nghiÖm - OD mÉu tr¾ng

SC% = [100 - x 100] ± σ OD chøng ©m tÝnh

§é lÖch tiªu chuÈn σ tÝnh theo c«ng thøc cña Ducan nh sau: Σ (xi - x )2 σ = n - 1

Gi¸ trÞ ho¹t ®éng SC% >50% mÉu ®îc coi lµ cã biÓu hiÖn ho¹t tÝnh sÏ ®îc chän ra ®Ó t×m gi¸ trÞ IC50.

T×m gi¸ trÞ øc chÕ IC50 Pha mÉu theo 5 thang nång ®é, gi¸ trÞ IC50 ®îc ®a vµo ch¬ng tr×nh Table Curve, th«ng qua nång ®é chÊt thö vµ % ho¹t ®éng cña chÊt thö tÝnh ra nång ®é cña chÊt thö nghiÖm mµ ë ®ã 50% çc gèc tù do ®îc t¹o bëi DPPH ®îc trung hoµ bëi chÊt thö theo c«ng thøc: 1/y=a+blnX Trong ®ã Y: Nång ®é chÊt thö X: Gi¸ trÞ SC (%) + Ph¬ng ph¸p thö nghiÖm trùc tiÕp trªn b¶n máng Ph¬ng ph¸p hiÖn ®å sinh häc trùc tiÕp trªn b¶n máng ®· ch¹y s¾c kÝ (TLC Bioautographic assays) lµ ph¬ng ph¸p ®¬n gi¶n vµ rÎ tiÒn nhÊt, dÔ dµng thùc hiÖn vµ ®ßi hái rÊt Ýt çc trang thiÕt bÞ ®Ó ph¸t hiÖn çc thµnh phÇn chÊt cã ho¹t tÝnh. Ph¬ng ph¸p nµy ®ãng vai trß quan träng trong viÖc ®Þnh vÞ vµ x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh cña chÊt trong qu¸ tr×nh ph©n lËp chÊt theo ®Þnh híng ho¹t tÝnh sinh häc, lµ sù kÕt hîp

38

viÖc ch¹y s¾c kÝ b¶n máng víi thö nghiÖm sinh häc t¹i chç. Nã cho phÐp ®Þnh vÞ vÞ trÝ chÊt cã ho¹t tÝnh trªn b¶n máng trong mét hçn hîp chÊt nÒn (Hostettmann vµ céng sù, 1995, 1997). Tuy nhiªn, ph¬ng ph¸p nµy chØ cã t¸c dông chñ yÕu lµ ph¸t hiÖn ra çc chÊt, thêng lµ çc chÊt dÉn ®êng cho çc nghiªn cøu tiÕp theo. Trong phÇn thö nghiÖm sµng läc ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸ th«ng qua thö nghiÖm b¾t gi÷ çc gèc tù do tiÕp theo, chóng t«i ®· ¸p dông ph¬ng ph¸p phun s¬ng gèc 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) lªn b¶n máng ®· ch¹y chÊt thö (ph¬ng ph¸p TLC-DPPH). MÉu ®îc chÊm trªn b¶n máng víi bÒ réng 9-10mm vµ ph©n t¸ch trªn b¶n nh«m RP-18 (10x20cm). VÞ trÝ khëi ®Çu lµ 12mm tõ c¶ hai mÆt vµ 10mm tõ ®¸y phiÕn. PhiÕn ®îc ph¸t triÓn trªn hÖ dung m«i thÝch hîp. Sau khi ®Ó kh« 15 phót, phiÕn ®îc nhóng hoÆc phun s¬ng víi dung m«i DPPH 0,04% trong 5 gi©y. Sau khi nhóng 2 phót, ¶nh ®îc lu gi÷ díi ¸nh s¸ng kh¶ kiÕn. Ho¹t tÝnh bÉy gèc tù do ®îc x¸c ®Þnh theo ph¬ng ph¸p cña Glavind (1967) b»ng ch¬ng tr×nh phÇn mÒm quÐt ¶nh, th«ng qua sù biÕn thiªn cña cêng ®é mµu cña chÊt thö trªn çc vïng kh¸c nhau cña phiÕn. D¶i chÊt cã mµu vµng s¸ng trªn nÒn mµu tÝa chÝnh lµ vïng cã ho¹t tÝnh bao v©y çc gèc tù do lµm thay ®æi mµu cña ph¶n øng. II.2.3.2. Ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo a. Ph¬ng ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo ®èi víi ba dßng tÕ bµo ung th:

Hep-G2, LU vµ KB t¹i phßng Sinh häc thùc nghiÖm ViÖn Hãa häc çc Hîp chÊt

thiªn nhiªn

b. Ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo ®îc thùc hiÖn t¹i Khoa

dîc lý thuèc vµ ph©n tÝch hãa häc, trêng §¹i häc Catholique de Louvain.

C¬ së cña ph¬ng ph¸p nh sau: Çc cÆn chiÕt vµ çc chÊt thö ®îc thö ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo trªn hai dßng

tÕ bµo: • Nguyªn bµo sîi phæi ngêi (WI-38) : dßng tÕ bµo lµnh tÝnh. • TÕ bµo ung th cæ tö cung ngêi (HeLa) : dßng tÕ bµo ung th.

Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu * Nu«i cÊy tÕ bµo:

Hai dßng tÕ bµo HeLa vµ WI-38 ®îc nu«i cÊy trong m«i trêng DMEM (Gibco® BRL) cã chøa L-glutamin, D-Glucoz¬, sodium pyruvate vµ ®îc bæ sung 10% huyÕt thanh bª non (Gibco BRL) vµ chÊt kh¸ng sinh (100 IU penicillin/ml, 100 µg streptomycin/mL). Çc tÕ bµo ®îc ñ trong m«i trêng kh«ng khÝ Èm chøa 5% CO2.

* Thö nghiÖm Ph¬ng ph¸p nhuém mµu víi muèi tetrazolium (MTT)

39

Ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo trªn hai dßng tÕ bµo HeLa vµ WI-38 cña çc chÊt thö ®îc ®¸nh gi¸ theo ph¬ng ph¸p nhuém mµu víi MTT (Sigma) trªn c¬ së ph©n huû çc chÊt thö bëi enzym succinyl dehydrogenaza cã trong çc tÕ bµo sèng sãt.

Çch tiÕn hµnh Çc dung dÞch mÉu ®îc chuÈn bÞ ë nång ®é 5 mg/mL trong DMSO vµ ®îc

b¶o qu¶n ë nhiÖt ®é -4°C. Kho¶ng 5000 tÕ bµo HeLa hoÆc WI-38 ®îc hoµ trén ®Òu trong 100 µL dung dÞch DMEM cã chøa 10% FBS råi ®îc chia ®Òu vµo çc giÕng trong b¶n 96 giÕng, ñ trong m«i trêng kh«ng khÝ Èm chøa 5% CO2 trong vßng 24 h. Sau 24h ñ, thay thÕ dung dÞch trong çc giÕng bëi 200µl çc dung dÞch chÊt thö ë nång ®é tõ 6,25 ®Õn 200µg/ml (®èi víi çc cÆn chiÕt) vµ tõ 1,5625 ®Õn 50µg/ml (®èi víi çc chÊt tinh khiÕt); çc giÕng chøa mÉu tr¾ng ®îc thªm 200µl dung dÞch DMSO. Mçi nång ®é ®îc tiÕn hµnh thö lÆp l¹i trong 6 giÕng. Sau 72 giê ñ, g¹n bá çc dung dÞch trong çc giÕng vµ thay vµo ®ã lµ 100µl dung dÞch DMEM (kh«ng chøa huyÕt thanh bª non) cã chøa 10µl dung dÞch MTT (3mg/ml trong PBS). Sau 45 phót, g¹n bá phÇn dung dÞch trong çc giÕng vµ cho vµo mçi giÕng 100µl DMSO. Sau ®ã, b¶n 96 giÕng nµy ®îc ®äc mËt ®é quang t¹i hai bíc sãng (570 nm vµ 620 nm). Camptothecin (Sigma) ®îc sö dông lµm chÊt ®èi chøng d¬ng (tõ 0,00025 ®Õn 25 µg/ml) .

MËt ®é quang ®îc biÓu diÔn cho phÇn tr¨m tÕ bµo sèng sãt vµ gi¸ trÞ mËt ®é quang cña mÉu tr¾ng ®îc coi lµ b»ng 100%. PhÇn tr¨m sèng sãt cña çc tÕ bµo ®îc tÝnh dùa vµo c«ng thøc sau:

Viability %= [AT/ANT] x 100 trong ®ã: Viability % lµ phÇn tr¨m tÕ bµo sèng sãt (%)

A lµ ®é hÊp thô; NT mÉu tr¾ng; T çc mÉu ®îc xö lý víi çc chÊt øc chÕ (mÉu thö, chÊt ®èi chøng d¬ng) Gi¸ trÞ IC50 (nång ®é mµ t¹i ®ã çc mÉu thö øc chÕ 50% sù sinh trëng cña tÕ

bµo) ®îc x¸c ®Þnh dùa vµo phÐp ph©n tÝch håi qui cña çc kÕt qu¶ thu ®îc ë 5 nång ®é kh¸c nhau cña mÉu thö. TÊt c¶ çc phÐp thö ®îc lÆp l¹i 3 lÇn. Ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh gi·n m¹ch (vasorelaxant) theo ph¬ng ph¸p cña Morel

ChuÈn bÞ mÉu ®éng vËt thÝ nghiÖm: Thö nghiÖm ®îc tiÕn hµnh trªn chuét trëng thµnh Wistar cã träng lîng c¬ thÓ 250-350g. T¸t c¶ çc con chuét thö nghiÖm ®îc nu«i ë nhiÖt ®é kh«ng ®æi (24 ± 1°C) trong phßng tèi vµ cho ¨n çc thøc ¨n tiªu chuÈn.

Ph¶n øng m¹ch in vitro: Çc thö nghiÖm in vitro ®îc tiÕn hµnh trªn ®éng m¹ch chñ lÊy tõ chuét. Sau khi chÆt ®Çu chuét, ®o¹n ®éng m¹ch chñ ë ngùc chuét ®îc nhanh chãng lÊy ra vµ ®îc ng©m trong dung dÞch sinh lý ®Æc trng. §o¹n ®éng m¹ch chñ ®îc c¾t ra thµnh tõng khoanh trßn, chiÒu dµi 2 mm vµ ®îc ®Þnh vÞ trong çc bån dung tÝch 12.5 ml ®· ®îc lµm ®Çy víi dung dÞch sinh lý ®Æc trng

40

(thµnh phÇn bao gåm (mM) : NaCl, 122; KCl, 5.9; NaHCO3, 15; MgCl2, 1.25; CaCl2, 1.25; glucose, 11), ®îc thæi bät víi dßng hçn hîp khÝ 95% O2, 5% CO2 vµ ®îc gi÷ ë 37°C. Çc khoanh ®éng m¹ch chñ bÞ kÐo c¨ng ra ®¹t ®Õn ®é c¨ng nghØ ë nång ®é 20 mM. §é c¨ng ®¼ng cù (cïng kÝch thíc) ®îc x¸c ®Þnh dùa theo ph¬ng ph¸p cña Morel vµ Godfraind, 19941. Qu¸ tr×nh co m¹ch ®îc g©y ra bëi dung dÞch KCL 100 mM (thµnh phÇn bao gåm (mM) : NaCl, 27; KCl, 100; NaHCO3, 15; MgCl2, 1.25; CaCl2, 1.25; glucose, 11) hoÆc bëi dung dÞch noradrenalin (5.10-7 M). Trong trêng hîp g©y co m¹ch b»ng dung dÞch KCl, qu¸ tr×nh gi·n m¹ch g©y ra bëi çc mÉu thö ®îc so s¸nh víi sù gi·n m¹ch g©y ra bëi ACH 10-6M. Çc ph©n ®o¹n ®îc hoµ tan trong DMSO vµ ®îc thö ho¹t tÝnh ë çc nång ®é 25, 50, 100 vµ 200 µg/mL. Riªng cÆn chiÕt metanol cña M.microcarpus chØ ®îc thö ®Õn nång ®é tèi ®a lµ 100µg/ml v× kh¶ n¨ng hoµ tan vµo níc cña cÆn chiÕt nµy rÊt kÐm. Çc chÊt s¹ch ®îc thö nghiÖm ë nång ®é 50µM. TÊt c¶ çc phÐp thö ®Òu ®îc tiÕn hµnh lÆp l¹i 3 lÇn. II.2.3.3. Häat tÝnh kh¸ng sinh. Ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng sinh cña khoa ph©n tÝch dîc lý thuèc vµ ph©n tÝch hãa häc Trêng §¹i häc Catholique de Louvain.

• Çc chñng vi sinh vËt kiÓm ®Þnh bao gåm: STT Ký hiÖu Tªn khoa häc cña vi sinh vËt Lo¹i VSV

1 S. aur. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Vi khuÈn Gram(+) 2 S. aur. Staphylococcus aureus 104 Vi khuÈn Gram(+) 3 E. fae. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Vi khuÈn Gram(+) 4 E. coli Escherichia coli ATCC 25922 Vi khuÈn Gram(-) 5 E. coli Escherichia coli Vi khuÈn Gram(-) 6 P. aer. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Vi khuÈn Gram(-) 7 P. aer. Pseudomonas aeruginosa ART 159 Vi khuÈn Gram(-) 8 K. pn. Klebsiella pneumoniae 116 Vi khuÈn Gram(-) 9 K. ox. Klebsiella oxytoca 118 Vi khuÈn Gram(-) 10 Ent. clo. Enterobacter cloacae Vi khuÈn Gram(-) 11 Ent. aer. Enterobacter aerogenes Vi khuÈn Gram(-) 12 Cit. fr. Citrobacter freundii Vi khuÈn Gram(-) 13 M. mo. Morganella morganii 180 Vi khuÈn Gram(-) 14 M. mo. Morganella morganii TP Vi khuÈn Gram(-) 15 Sal. ent. Salmonella enteridis Vi khuÈn Gram(-) 16 Sh. son. Shigella sonnei Vi khuÈn Gram(-) 17 Y. ent. Yersinia enterocolitica E 170/98 Vi khuÈn Gram(-) 18 Y. ent. Yersinia enterocolitica E 169/98 Vi khuÈn Gram(-) 19 C alb. Candida albicans NÊm Saccharomycetes 20 C. trop. Candida tropicalis NÊm Saccharomycetes

41

• Ph¬ng ph¸p tiÕn hµnh vµ ®äc kÕt qu¶: Tríc khi thö ho¹t tÝnh, çc cÆn chiÕt, ph©n ®o¹n vµ çc chÊt s¹ch ®îc hoµ

tan trong metanol ë çc nång ®é 4 mg/mL, 10 mg/mL and 20 mg/mL (®èi víi çc cÆn chiÕt vµ çc ph©n ®o¹n) vµ 1,28 mg/mL, 2,56 mg/mL (®èi víi çc chÊt s¹ch). ChÊt ®èi chøng d¬ng tetracycline (Sigma) ®îc hoµ tan trong níc ë nång ®é 1,28 mg/mL. M«i trêng th¹ch Muller-Hinton 2 (bioMerieux, France) ®îc chuÈn bÞ ë nång ®é 38g/L vµ ®îc b¶o qu¶n ë 45°C. Ph¬ng ph¸p pha lo·ng th¹ch ®îc sö dông ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é øc chÕ tèi thiÓu (MIC-nång ®é tèi thiÓu cã t¸c dông øc chÕ hoµn toµn sù sinh trëng cña vi sinh vËt) vµ nång ®é cã ho¹t tÝnh tèi thiÓu (MAC-nång ®é tèi thiÓu cã t¸c dông lµm gi¶m sù sinh trëng cña vi sinh vËt so víi mÉu tr¾ng). Çc vi sinh vËt ®îc nu«i cÊy qua ®ªm trong m«i trêng Tryptone soya broth (Oxoid Ltd., England). Sau ®ã, çc vi sinh vËt nµy ®îc chÊm mét çch tù ®éng bëi m¸y A400 (Denley Instruments Ltd., Anh) thµnh çc chÊm trßn lªn trªn bÒ mÆt cña líp th¹ch Muller-Hinton 2 ®· ®îc bæ sung çc cÆn chiÕt, çc chÊt thö hoÆc chÊt kh¸ng sinh (1ml) ®Ó ®¹t ®îc nång ®é tõ 200 ®Õn 1000 µg/mL (®èi víi çc cÆn chiÕt), tõ 0.5 ®Õn 64 µg/mL (®èi víi tetracycline) vµ t¹i hai nång ®é 64 and 128 µg/mL (®èi víi çc chÊt s¹ch). Çc b¶n th¹ch nµy ®îc ñ 24 h ë nhiÖt ®é 37°C. MÉu tr¾ng (chØ chøa MeOH ®îc sö dông ®Ó hoµ tan çc cÆn chiÕt vµ çc chÊt thö) còng ®· ®îc thö ®ª ®èi chiÕu kÕt qu¶. Çc phÐp thö ®Òu ®îc lÆp l¹i 3 lÇn. II.2.4. Ph¬ng ph¸p ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc. II.2.4.1. Ph¬ng ph¸p ph©n lËp

a. S¾c ký líp máng (TLC) S¾c ký líp máng ®îc thùc hiÖn trªn b¶n máng tr¸ng s½n DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). b. S¾c ký líp máng ®iÒu chÕ S¾c ký líp máng ®iÒu chÕ thùc hiÖn trªn b¶n máng tr¸ng s½n Silica gel 60G

F254 (Merck, ký hiÖu 105875), ph¸t hiÖn vÖt chÊt b»ng ®Ìn tö ngo¹i hai bíc sãng 254 nm vµ 365 nm, hoÆc c¾t r×a b¶n máng ®Ó phun thuèc thö lµ dung dÞch H2SO4 10%, h¬ nãng ®Ó ph¸t hiÖn vÖt chÊt, ghÐp l¹i b¶n máng nh cò ®Ó x¸c ®Þnh vïng chÊt, sau ®ã c¹o líp Silica gel cã chÊt, gi¶i hÊp phô vµ tinh chÕ l¹i b»ng çch kÕt tinh trong dung m«i thÝch hîp.

c. S¾c ký cét (CC) S¾c ký cét ®îc tiÕn hµnh víi chÊt hÊp phô lµ Silica gel pha thêng vµ pha ®¶o. Silica gel pha thêng cã cì h¹t lµ 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha ®¶o ODS hoÆc YMC (30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhùa trao ®æi ion Dianion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.). I.2.4.2. Ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh çc hîp chÊt.

42

a. Phæ IR: Phæ IR (Ðp viªn víi KBr): §o trªn m¸y Jasco 200 (ViÖn Ho¸ häc, ViÖn

Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam).

b. Phæ khèi lîng (MS) Phæ khèi lîng va ch¹m electron (EI-MS) ®îc ghi trong çc dung m«i thÝch

hîp trªn m¸y Agilent LC-MSD ion Trap, cña ViÖn Ho¸ häc çc hîp chÊt thiªn nhiªn, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam . c. Phæ céng hëng tõ h¹t nh©n 1H, 13C (NMR)

§o trªn thiÕt bÞ AVANCE 500 cña ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam. ChÊt néi chuÈn lµ TMS (Tetrametyl Silan). II.2.5. Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký II.2.5.1. M« h×nh tæng quan cña ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký Mét vÝ dô ®¬n gi¶n nhÊt cña viÖc thùc hiÖn ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay ®îc ¸p dông cho kü thuËt nhËn d¹ng v©n tay phôc vô trong ngµnh an ninh. Trong ®ã, dÊu v©n tay cña tõng ç nh©n ®îc t¹o ra qua viÖc lÊy dÊu v©n tay vµ lu tr÷ dÊu v©n tay ®ã cïng víi çc th«ng tin cña ç nh©n. DÊu v©n tay vµ çc th«ng tin cña ç nh©n nµy ®îc coi nh lµ d÷ liÖu dÊu v©n tay chuÈn (1). Khi cÇn kiÓm tra th«ng tin cña ç nh©n ®ã, ngêi ta chØ cÇn thùc hiÖn quy tr×nh lÊy dÊu v©n tay cña ç nh©n ®ã theo quy tr×nh ®· quy ®Þnh. DÊu v©n tay nµy ®îc coi nh d÷ liÖu dÊu v©n tay cÇn x¸c ®Þnh (2). ViÖc so s¸nh gi÷a d÷ liÖu dÊu v©n tay chuÈn vµ d÷ liÖu dÊu v©n tay cÇn x¸c ®Þnh ®îc thùc hiÖn b»ng nhiÒu c«ng cô hç trî vµ çc thuËt to¸n kh¸c nhau (3). KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ cho ra sù gièng nhau hoÆc kh¸c nhau cña çc mÉu cÇn so s¸nh (4). Ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay ®îc øng dông vµo trong çc ngµnh kh¸c: Ngµnh c«ng nghÖ th«ng tin, ngµnh khoa häc vËt liÖu, ngµnh khoa häc kh¶o cæ häc, ngµnh khoa häc y dîc, ngµnh tµi chÝnh ng©n hµng, ngµnh hµng kh«ng ... tïy theo môc ®Ých cña tõng ngµnh mµ cã çc yªu cÇu, tiÕn tr×nh vµ çch thøc x©y dùng vµ ph¸t triÓn quy tr×nh t¹o mÉu dÊu v©n tay theo chuyªn m«n cña tõng ngµnh ®ã. M« h×nh ®¬n gi¶n cña ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay cã thÓ m« t¶ tãm t¾t trªn h×nh II.2.5.1.

H×nh II.2.5.1. M« h×nh ®¬n gi¶n nhÊt cña ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay

D÷ liÖu dÊu v©n tay chuÈn D÷ liÖu dÊu v©n

tay cÇn x¸c ®Þnh

1

X©y dùng dÊu v©n tay

2

3

KÕt qu¶ ®¸nh gi¸

§¸nh gi¸

4

43

II.2.5.2. Çch thøc x©y dùng vµ thùc hiÖn ph¬ng ph¸p s¾c ký dÊu v©n tay a. X©y dùng dÊu v©n tay. MÉu dÊu v©n tay ®îc t¹o ra tuú thuéc vµo tõng ®èi tîng nghiªn cøu. Mçi ngµnh khoa häc cã tiªu chuÈn ®Æc trng riªng cho mÉu dÊu v©n tay. Néi dung cña nhiÖm vô nµy chØ ®Ò cËp ®Õn çc tiªu chÝ ®Ó t¹o mÉu dÊu v©n tay s¾c kýphôc vô cho viÖc ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu trong y häc cæ truyÒn. So s¸nh víi t©y dîc viÖc ®¸nh gi¸ vµ qu¶n lý chÊt lîng kh«ng ph¶i lµ vÊn ®Ò ®¸ng quan t©m nhiÒu v× chÊt lîng cña nguyªn liÖu ®Çu vµo ®· ®îc chuÈn ho¸. §èi víi th¶o dîc vµ çc s¶n phÈm tõ th¶o dîc th× ngîc l¹i, nguyªn liÖu ®Çu vµo cã thÓ tõ mét loµi thùc vËt hoÆc nhiÒu loµi thùc vËt, çc loµi nµy cã thµnh phÇn thay ®æi theo m«i trêng sèng, mïa thu ho¹ch, h×nh thøc b¶o qu¶n, h×nh thøc xö lý mÉu. Mét sè ®îc thu thËp kh«ng chÝnh x¸c víi nguyªn nh©n lµ cã sù nhÇm lÉn do cã sù gièng nhau vÒ h×nh th¸i häc cña c©y trong cïng n¬i thu mÉu, mét sè ph¸t sinh tõ sù nhËn d¹ng sai hoÆc tõ nh÷ng sai sãt tõ çc mÉu thùc vËt nhËp khÈu. Mét sè khã kh¨n cßn n¶y sinh tõ viÖc gäi tªn çc loµi thùc vËt theo çc ng«n ng÷ ®Þa ph¬ng ngay trong cïng mét quèc gia hoÆc réng h¬n trong mét khu vùc, çc quèc gia. Do ®ã, bíc ®Çu tiªn ®ãng vai trß quan träng trong quy tr×nh t¹o mÉu dÊu v©n tay s¾c ký®ã lµ viÖc chuÈn ho¸ qu¸ tr×nh thu thËp mÉu vµ x¸c ®Þnh tªn ph©n lo¹i dîc liÖu

Qu¸ tr×nh thu thËp mÉu (Collecting samples): Nh»m gióp cho viÖc chuÈn ho¸ nguyªn liÖu ®Çu vµo, trong cuèn “Híng dÉn cho ph¬ng ph¸p nghiªn cøu, thö nghiÖm y häc cæ truyÒn” cña Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi WHO148, ngêi ta ®· chia th¶o dîc thµnh çc nhãm nh sau:

Th¶o méc: Th¶o méc bao gåm nh÷ng chÊt liÖu th« cña thùc vËt vÝ dô nh çc l¸, hoa, qu¶, gèc, th©n, rÔ, cµnh, vá.

ChÊt liÖu cña th¶o méc: ChÊt liÖu tõ th¶o méc bao gåm çc thµnh phÇn ho¸ häc cña th¶o méc, çc lo¹i níc Ðp t¬i, chÊt g«m, tinh dÇu, nhùa vµ nh÷ng thµnh phÇn xuÊt ph¸t tõ th¶o méc.

Th¶o méc ®· xö lý: §©y lµ nguyªn liÖu ®Çu vµo cho çc s¶n phÈm th¶o dîc cã thÓ bao gåm çc m¶nh hoÆc bét tõ chÊt liÖu cña th¶o méc, cao chiÕt th«. Çc nguyªn liÖu nµy ®îc t¹o ra b»ng çc ph¬ng ph¸p chiÕt, ph©n ®o¹n, ly t©m, hoÆc b»ng çc qu¸ tr×nh vËt lý vµ sinh häc kh¸c.

Çc s¶n phÈm tõ th¶o méc: Çc s¶n phÈm tõ th¶o méc bao gåm mét hoÆc nhiÒu phÇn cña th¶o méc ®· xö lý tõ nhiÒu nguån kh¸c nhau. Çc s¶n phÈm nµy cã thÕ chøa çc t¸ dîc nh»m hç trî thªm cho çc thµnh phÇn cã t¸c dông. Tuy nhiªn, nÕu s¶n phÈm mµ cã çc thµnh phÇn thªm vµo cã nguån gèc tõ tæng hîp nh©n t¹o hoÆc lµ çc hîp chÊt ®îc ph©n lËp tõ th¶o méc th× s¶n phÈm ®ã kh«ng ®îc c«ng nhËn lµ s¶n phÈm tõ th¶o méc. Mét vµi th¶o dîc cã ®éc tÝnh rÊt cao do ®ã khi thu thËp còng nh khi sö dông cÇn ph¶i cã híng dÉn sö dông víi liÒu lîng thÝch hîp. ViÖc ghi nh·n trªn çc s¶n phÈm tõ th¶o dîc kh«ng chÝnh x¸c còng g©y ra nhiÒu

44

khã kh¨n trong viÖc ®¸nh gi¸ vµ qu¶n lý chÊt lîng cña dîc liÖu. Qu¸ tr×nh thu thËp mÉu cÇn tiÕn hµnh theo tiªu chuÈn thu thËp mÉu cña çc nhµ thùc vËt häc, vÝ dô nh: Ghi nh·n tªn th¶o dîc, tiªu b¶n, chôp ¶nh th¶o dîc, n¬i thu thËp mÉu vµ thêi gian thu thËp mÉu...

Qu¸ tr×nh x¸c ®Þnh tªn khoa häc cña mÉu thu thËp ®îc: ViÖc ®Þnh loµi vµ x¸c tªn khoa häc chÝnh x¸c cña dîc liÖu ®ãng vai trß v« cïng quan träng, c«ng viÖc nµy sÏ tr¸nh ®îc sù nhÇm lÉn vÒ nguån gèc thùc vËt. Bíc ®Çu tiªn trong viÖc ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ hiÖu qu¶ cña th¶o dîc lµ viÖc x¸c nhËn loµi cña th¶o dîc. Çc th«ng tin yªu cÇu cÇn thiÕt lµ tªn Latin, tªn ®ång nghÜa, tiÕp ®ã lµ tªn theo b¶n xø cña th¶o méc, nh÷ng phÇn cña th¶o méc ®îc sö dông nh: gèc, rÔ vµ l¸ hoÆc çc phÇn kh¸c còng cÇn ®îc x¸c ®Þnh râ. Bíc tiÕp theo lµ ghi râ çc th«ng tin chØ dÉn vÒ ®iÒu kiÖn thu thËp vµ m«i trêng nu«i dìng hoÆc m«i trêng sinh sèng cña th¶o méc. Trong cuèn híng dÉn vÒ qu¶n lý chÊt lîng th¶o dîc cña Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi WHO ®· ghi râ çc tiªu chÝ cÇn thiÕt148.

Qu¸ tr×nh chiÕt xuÊt mÉu (Extracting methods): Ph¬ng ph¸p chiÕt mÉu vµ chuÈn bÞ mÉu gãp phÇn quan träng trong viÖc t¹o ra çc dÊu v©n tay s¾c kýtèt cña th¶o dîc.

§Ó cã ®îc nh÷ng b¶n dÊu v©n tay s¾c ký tèt, trªn b¶n s¾c ký ®ã hiÓn thÞ tèi ®a çc thµnh phÇn chñ yÕu cña th¶o dîc phô thuéc vµo rÊt nhiÒu yÕu tè. VÝ dô nh dung m«i chiÕt, ®iÒu kiÖn tiÕn hµnh chiÕt mÉu, tû lÖ hÖ dung m«i chiÕt mÉu, nhiÖt ®é tiÕn hµnh chiÕt mÉu, thiÕt bÞ sö dông ®Ó chiÕt mÉu, ®iÒu kiÖn vËn hµnh thiÕt bÞ chiÕt mÉu. Qu¸ tr×nh chuÈn bÞ mÉu tèt sÏ lµm gi¶m kh¶ n¨ng ¶nh hëng cña nhiÒu thµnh phÇn ®Õn kÕt qu¶ ph©n tÝch. Tuú theo tõng thiÕt bÞ ph©n tÝch ®îc lùa chän (HPLC, CE, GC-MS, LC-MS) ®Ó tiÕn hµnh x©y dùng çc bíc chuÈn bÞ mÉu kh¸c nhau cho phï hîp víi çc thiÕt bÞ ph©n tÝch nªu trªn. Cã nhiÒu mÉu cÇn ph¶i tiÕn hµnh chiÕt theo ph¬ng ph¸p chiÕt láng-láng (Liquid-liquid extraction), cã mÉu cÇn ph¶i chiÕt theo ph¬ng ph¸p chiÕt pha r¾n kÕt hîp víi pha láng hoÆc nguyªn chiÕt pha r¾n (Solid phase extraction).

§Ó ®a ra ®îc mét ph¬ng ph¸p chiÕt mÉu th¶o dîc tèt, ngêi ta thêng tiÕn hµnh thö chiÕt mÉu theo s¬ ®å h×nh II.2.5.2. Híng dÉn chi tiÕt vÒ ph¬ng ph¸p chiÕt vµ chuÈn bÞ mÉu cho çc thiÕt bÞ ph©n tÝch cã thÓ tham kh¶o t¹i149,150.

Kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc cña mÉu (Pharmacological activity): C«ng viÖc nµy ®îc thùc hiÖn theo môc ®Ých tiÕn hµnh ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu cña tõng phßng nghiªn cøu. Çc ho¹t tÝnh sinh häc thêng ®îc xem xÐt nh: Ho¹t tÝnh kh¸ng sinh, ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸, ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo, ho¹t tÝnh øc chÕ sù ph¸t triÓn x¬ng…viÖc kiÓm so¸t chÊt lîng còng bao gåm c¶ viÖc x¸c ®Þnh ho¹t tÝnh tù nhiªn vèn cã còng nh c¶ ®éc tÝnh cña chóng. ViÖc x¸c ®Þnh râ rµng ho¹t tÝnh hoÆc ®éc tÝnh cña th¶o dîc sÏ lµm cho çc s¶n phÈm cã gi¸ trÞ cao h¬n trong nh÷ng øng dông dîc phÈm vµ thùc phÈm. Trong rÊt nhiÒu trêng hîp, çc lo¹i

45

thuèc trong y häc cæ truyÒn ®îc t¹o ra tõ mét hoÆc rÊt nhiÒu lo¹i th¶o dîc. Trong çc loµi th¶o dîc ®ã, cã loµi cã ®éc tÝnh rÊt cao, cã loµi kh«ng thÓ hiÖn ho¹t tÝnh. Ngay c¶ víi nh÷ng loµi cã ®éc tÝnh, khi sö dông çc loµi ®ã víi çc liÖu ph¸p phï hîp th× thµnh phÇn ®éc tÝnh trong th¶o dîc kh«ng nh÷ng kh«ng g©y ®éc mµ cßn ®ãng vai trß tèt trong liÖu ph¸p ch÷a bÖnh. ChÝnh v× vËy, viÖc ®¸nh gi¸ vµ lùa chän ®îc liÒu lîng phï hîp cho çc thµnh phÇn ®ã còng lµ mét trong nh÷ng tiªu chÝ trong qu¶n lý chÊt lîng dîc liÖu149 .

H×nh II.2.5.2. S¬ ®å lùa chän hÖ dung m«i trong qu¸ tr×nh chiÕt mÉu

Lùa chän thiÕt bÞ ph©n tÝch (Measurement instruments): Trong çc ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu, çc ph¬ng tiÖn ph©n tÝch ®ãng vai trß quan träng. Bëi v× viÖc lùa chän vµ sö dông çc ph¬ng tiÖn ph©n tÝch phï hîp víi ®èi tîng nghiªn cøu sÏ mang l¹i hiÖu qu¶ cao trong qu¸ tr×nh ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu. Néi dung tiÕp theo sÏ miªu t¶ ng¾n gän tÝnh n¨ng cña mét vµi thiÕt bÞ vµ c«ng cô nghiªn cøu ®ang ®îc sö dông trong viÖc ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu.

S¾c ký líp máng (TLC): Tríc khi cã sù ra ®êi cña çc thiÕt bÞ ph©n tÝch hiÖn ®¹i nh s¾c ký khÝ-GC vµ s¾c ký láng cao ¸p-HPLC, s¾c ký líp máng ®îc sö dông nhiÒu trong ph©n tÝch th¶o dîc. S¾c ký líp máng cã rÊt nhiÒu tiÖn lîi trong viÖc x©y dùng dÊu v©n tay s¾c kýcña th¶o dîc, ph¬ng ph¸p thùc hiÖn ®¬n gi¶n, kh«ng yªu cÇu tiªu chuÈn kü thuËt cao, linh ho¹t, tèc ®é ph©n tÝnh nhanh, ®é nh¹y ®¸ng tin cËy vµ viÖc chuÈn bÞ mÉu ®¬n gi¶n, dÔ thùc hiÖn trong mäi ®iÒu kiÖn. Tuy nhiªn, TLC bÞ h¹n chÕ ®èi víi çc mÉu phøc t¹p, ®é ph©n gi¶i vµ kh¶ n¨ng chÝnh x¸c so víi çc ph¬ng ph¸p s¾c ký hiÖn ®¹i, kh¶ n¨ng xö lý sè liÖu ®a chiÒu..

MÉu th¶o dîc

MÉu thö

Lùa chän dung m«i

ChiÕt mÉu thö

KÕt qu¶ chiÕt

X©y dùng ph¬ng ph¸p chiÕt

§¸nh gi¸ kÕt qu¶

46

S¾c ký khÝ (GC): Trong th¶o dîc còng tån t¹i nhiÒu thµnh phÇn, trong ®ã cã thµnh phÇn rÊt dÔ bay h¬i. Çc thµnh phÇn dÔ bay h¬i nµy cã nh÷ng ®Æc trng riªng biÖt cña tõng loµi th¶o dîc, chÝnh nh÷ng tÝnh riªng biÖt nµy t¹o lîi thÕ cho viÖc x©y dùng dÊu v©n tay s¾c ký cña çc th¶o dîc theo ph¬ng ph¸p s¾c ký khÝ. Mét vÝ dô ®iÓn h×nh cña viÖc ¸p dông dÊu v©n tay s¾c kýtrªn hÖ s¾c ký khÝ lµ ph©n tÝch çc d¹ng dÇu bÐo trªn hÖ s¾c ký khÝ. KÕt qu¶ ph©n tÝch nµy còng cho ra mét d¹ng thÝch hîp s¾c ký dÊu v©n tay, d¹ng dÊu v©n tay nµy cã thÓ ®îc sö dông ®Ó nhËn d¹ng th¶o dîc. Thµnh phÇn vµ çc mèi liªn hÖ cña çc hîp chÊt h÷u c¬ cã trong dÇu bÐo chøa ®ùng nh÷ng thµnh phÇn ®Æc biÖt cña th¶o dîc vµ mét phÇn t¹p chÊt trong dÇu bÐo cã thÓ ®îc x¸c ®Þnh. Ph©n tÝch b»ng GC còng thu ®îc sù chÝnh x¸c vµ ®é nh¹y cao cho çc thµnh phÇn ho¸ häc dÔ bay h¬i. Tuy nhiªn, ph¬ng ph¸p ph©n tÝch nµy còng gÆp khã kh¨n khi çc mÉu th¶o dîc ë d¹ng ph©n cùc vµ kh«ng ph¶i lµ thµnh phÇn dÔ ho¸ h¬i.

S¾c ký láng cao ¸p (HPLC): Ph¬ng ph¸p s¾c ký láng cao ¸p (HPLC) lµ mét c«ng cô ph©n tÝch kh¸ næi tiÕng, c«ng cô nµy ®îc sö dông nhiÒu trong çc phßng thÝ nghiÖm. Lîi thÕ cña viÖc sö dông c«ng cô HPLC trong viÖc ph©n tÝch çc th¶o dîc bëi v× çc thiÕt bÞ nµy rÊt dÔ sö dông vµ kh«ng bÞ h¹n chÕ bëi çc thµnh phÇn bay h¬i hay kh«ng bay h¬i còng nh ®é bÒn, ®é ph©n cùc cña mÉu nghiªn cøu. Th«ng thêng hÖ HPLC thêng ®îc sö dông ®Ó ph©n tÝch hÇu hÕt çc hîp chÊt cã mÆt trong th¶o dîc. Çc hîp chÊt cã kh¶ n¨ng hÊp thô quang (chromophic) th× dïng ®Çu dß UV-vis hoÆc ®Çu dß hÊp phô quang Fluorescene detector, ®èi víi çc hîp chÊt kh«ng cã kh¶ n¨ng hÊp thô quang (non-chromophoric) th× dïng ®Çu dß t¸n x¹ ¸nh s¸ng ELSD (evaporative light scattering detector). Çc kü thuËt nµy rÊt thÝch hîp cho viÖc x©y dùng çc dÊu v©n tay s¾c kývµ xö lý, chuyÓn ®æi d÷ liÖu theo çc ph¬ng ph¸p thèng kª ®a biÕn, kÕt qu¶ thu ®îc tin cËy vµ ®¹t chuÈn mùc.

Ph¬ng ph¸p s¾c ký ®iÖn di (CE): S¾c ký ®iÖn di høa hÑn mét tiÒm n¨ng trong viÖc t¸ch vµ ph©n tÝch çc thµnh phÇn ho¹t tÝnh trong th¶o dîc. Mét u ®iÓm cña ph¬ng ph¸p nµy lµ chØ cÇn mét lîng rÊt nhá mÉu hoÆc chÊt chuÈn, ®ång thêi ph¬ng ph¸p nµy ®¹t tèc ®é ph©n tÝch rÊt nhanh vµ cho kh¶ n¨ng ph©n t¸ch tèt. Ph¬ng ph¸p x©y dùng dÊu v©n tay s¾c kýtrªn nÒn t¶ng cña thiÕt bÞ nµy còng mang l¹i kÕt qu¶ cao bëi v× phÇn lín çc øng dông cña s¾c ký ®iÖn di t¬ng tù nh çc øng dông trong HPLC. Mét phÇn kh«ng tiÖn lîi cña ph¬ng ph¸p nµy lµ kÕt qu¶ ph©n tÝch vÉn bÞ ¶nh hëng nhiÒu bëi mét sè thµnh phÇn nh©n t¹o hoÆc lµ do viÖc lùa chän çc dung dÞch ®Öm g©y ra.

Çc ph¬ng ph¸p ph©n tÝch trªn thiÕt bÞ kÕt hîp: Trong khi çc kÕt qu¶ ph©n tÝch b»ng çc ph¬ng ph¸p s¾c ký th«ng thêng bÞ h¹n chÕ hoÆc kh«ng thÓ thùc hiÖn do nhiÒu yÕu tè tù nhiªn hoÆc nh©n t¹o mang l¹i th× kü thuËt s¾c ký kÕt hîp nh: HPLC-MS, HPLC-NMR, CE-MS, GC-MS…mang l¹i hiÖu qu¶ cao trong kü thuËt ph©n tÝch. Trong nhiÒu n¨m gÇn ®©y, viÖc kÕt hîp gi÷a hÖ thèng s¾c ký trùc tiÕp víi

47

çc hÖ khèi phæ ®ang ngµy cµng thu hót ®îc nhiÒu sù quan t©m bëi çc øng dông trong viÖc x¸c ®Þnh vµ kh¼ng ®Þnh sù cã mÆt cña çc hîp chÊt ®· biÕt còng nh mét sè hîp chÊt cha biÕt cÊu tróc trong th¶o dîc. H¬n thÕ d÷ liÖu ph©n tÝch thu ®îc tõ hÖ thèng kÕt hîp nµy lµ d÷ liÖu hai chiÒu, d÷ liÖu nµy kh¸c h¼n çc d÷ liÖu mét chiÒu thu nhËn tõ çc hÖ thèng ®¬n lÎ, d÷ liÖu hai chiÒu cã thÓ cung cÊp nhiÒu th«ng tin h¬n, ®ång thêi d÷ liÖu hai chiÒu nµy còng ®îc sö dông nhiÒu trong ph©n tÝch d÷ liÖu ®a chiÒu b»ng ph¬ng ph¸p ho¸ thèng kª (Chemometric).

HÖ kÕt hîp s¾c ký khÝ vµ khèi phæ GC-MS: HÖ khèi phæ lµ hÖ cã ®é nh¹y cao, ®îc sö dông ®Ó ph©n tÝch khèi lîng. Th«ng tin mang l¹i lµ khèi lîng ph©n tö còng nh çc th«ng tin cã liªn quan ®Õn cÊu tróc cña ph©n tö. Khi kÕt hîp gi÷a s¾c ký khÝ vµ khèi phæ sÏ ®¹t ®îc nh÷ng tiÖn lîi rÊt cao trong x©y dùng s¾c ký dÊu v©n tay. GC-MS ®· ®îc øng dông réng r·i trong viÖc ph©n tÝch tinh dÇu cã mÆt trong th¶o dîc. Víi GC-MS ngêi ta cã thÓ x©y dùng kh«ng chØ b¶n dÊu v©n tay s¾c kýcña tinh dÇu víi kh¶ n¨ng t¸ch tèt mµ cßn cã nh÷ng th«ng tin liªn quan ®Õn ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh lîng çc thµnh phÇn cã mÆt trªn b¶n s¾c ký dÊu v©n tay, nh÷ng th«ng tin nµy rÊt h÷u Ých trong çc nghiªn cøu ®¸nh gi¸ mèi t¬ng quan gi÷a thµnh phÇn ho¸ häc vµ ho¹t tÝnh cña th¶o dîc.

HÖ s¾c ký láng kÕt hîp ®Çu dß DAD hoÆc ELSD, hÖ s¾c ký láng kÕt nèi khèi phæ (HPLC-MS) vµ hÖ s¾c ký láng kÕt nèi thiÕt bÞ NMR (HPLC-NMR): HPLC-DAD ®· trë nªn rÊt quen thuéc trong çc phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi. Víi nh÷ng th«ng tin thu nhËn ®îc tõ ®Çu dß DAD hoÆc ELSD, viÖc ph©n tÝch ®Þnh lîng hoÆc ®Þnh tÝnh çc thµnh phÇn cã kh¶ n¨ng hÊp thô quang hoÆc kh«ng cã kh¶ n¨ng hÊp thô quang tõ th¶o dîc trë nªn dÔ dµng h¬n tríc ®©y. §Æc biÖt, víi sù kÕt hîp gi÷a s¾c ký láng vµ khèi phæ, hoÆc NMR..®· më ra nh÷ng híng ®i míi trong ph©n tÝch. H¬n thÕ, kÕt hîp çc kü thuËt HPLC-DAD-MS mang l¹i kh¶ n¨ng ph©n t¸ch cao, th«ng tin nhiÒu chiÒu (th«ng tin tõ ®Çu dß DAD hoÆc ELSD vµ th«ng tin tõ MS hoÆc NMR). Nh÷ng th«ng tin tõ DAD hoÆc ELSD vµ MS hoÆc NMR cã thÓ cung cÊp trùc tiÕp d÷ liÖu vÒ UV-vis hoÆc MS cho tõng gi¸ trÞ peak riªng lÎ trªn mét s¾c ký ®å. Víi sù trî gióp cña hÖ thèng kÕt hîp nµy, çc peak trªn s¾c ®å cã thÓ ®îc so s¸nh trùc tiÕp víi sè liÖu trong çc th viÖn online ACD hoÆc CAMAG, víi çc hîp chÊt chuÈn ®Ó x¸c ®Þnh chÝnh x¸c cÊu tróc, thµnh phÇn cña hîp chÊt.

HÖ kÕt hîp gi÷a s¾c ký ®iÖn di vµ çc ®ªtect¬ kh¸c CE-DAD, CE-MS and CE-NMR..còng mang l¹i çc u ®iÓm t¬ng tù nh víi çc hÖ thèng kÕt hîp trªn.

Çc ®iÒu kiÖn ph©n tÝch mÉu (Measurement conditions): Việc tìm điều kiện tối ưu cho các thông số cho quá trình tạo sắc ký dÊu v©n tay là nhiệm vụ rất quan trọng. Tuy nhiên, xác định được thông số có ảnh hưởng chính đến thí nghiệm là một nhiệm vụ khó khăn, nhất là đối với các hệ thống như: TLC, sắc ký khí, sắc ký khí kết nối khối phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng cao áp kết nối với khối phổ... Trong hệ thống này có rất nhiều thông số có ảnh hưởng đến kết quả thí

48

nghiệm, thay đổi giá trị của một thông số đồng nghĩa với việc tiến hành lại thí nghiệm với thống số đã thay đổi. Mỗi hệ thống có các thông số kỹ thuật riêng, việc lựa chọn và thay đổi các thông số kỹ thuật sẽ làm thay đổi cả quá trình tạo dÊu v©n tay. Đối với hệ thống kết hợp, ví dụ như hệ sắc ký lỏng kết nối khối phổ là hệ thống có rất nhiều thông số. Thông thường, người ta không tiến hành việc tìm điều kiện tối ưu đồng thời cho cả hệ thống sắc ký lỏng cao áp và khối phổ. Bởi vì tổ hợp các thông số của sắc ký lỏng và khốí phổ sẽ làm cho số thí nghiệm gia tăng và rất khó khăn trong việc tìm điều kiện tối ưu nhất. Thay vào việc tìm kiếm đồng thời, người ta tiến hành tìm điều kiện tôi ưu cho hệ sắc ký lỏng cao áp trước, sau đó sẽ áp dụng điều kiện tối ưu của hệ sắc ký lỏng cao áp vào để tìm tiếp điều kiện tối ưu cho hệ khối phổ.

Cã rÊt nhiÒu çch ®Ó tiÕn hµnh x©y dùng kÕ ho¹ch thùc nghiÖm tèi u, trong khu«n khæ cña cuèn s¸ch nµy chóng t«i kh«ng ®Ò cËp chi tiÕt, chi tiÕt cña çc bíc x©y dùng mét kÕ ho¹ch ho¸ thùc nghiÖm sÏ ®îc m« t¶ trong tµi liÖu gÇn ®©y, trong giíi h¹n cña tµi liÖu nµy chóng t«i chØ ®Ò cËp ®Õn nh÷ng bíc chung nhÊt trong viÖc x©y dùng kÕ ho¹ch ho¸ thùc nghiÖm151:

Sàng lọc tìm yếu tố chính (Screening to find main factors): Bước thí nghiệm này liên quan đến việc tìm kiếm các yếu tố có tầm quan trọng đối với thí nghiệm. Điều này có nghĩa là sự thay đổi thông số của yếu tố chính có ảnh hưởng trực tiếp đến thí nghiệm. Việc lựa chọn bao nhiêu yếu tố là đủ cho thiết kế thí nghiệm còn tuỳ thuộc vào từng thí nghiệm và đối tượng nghiên cứu. Đối với hệ thống sắc ký thông thường, các yếu tố được coi là có ảnh hưởng nhiều nhất đến thí nghiệm là hệ dung môi pha động (dung môi hữu cơ), pha tĩnh (cột sắc ký), bước sóng đối với các đầu dò (VWD, DAD, ELSD..). Đối với hệ sắc ký kết nối với khối phổ, NMR, ngoài các yếu tố đã nêu trên còn có các yếu tổ của phần kết nối ví dụ như nguồn ion hoá (ESI, APCI, APPI..), tốc độ cung cấp khí, nhiệt độ của dòng khí làm khô, tốc độ của đầu phun. Sau khi đã xác định được các yếu tố chính và các thông số ảnh hưởng đến yếu tố chính, mô hình thiết kế thí nghiệm sẽ được xây dựng151.

Tối ưu hoá các yếu tố và các thông số (Optimization factors): Tuỳ theo mô hình thiết kế thí nghiệm và yêu cầu của thí nghiệm mà bước tối ưu hoá sẽ tiến hành trên yếu tố chính nào có ảnh hưởng nhiều nhất đến thí nghiệm. VÝ dô: Trong qu¸ tr×nh tèi u ho¸ ®· lùa chän ®îc bíc sãng lµ yÕu tè chÝnh. Gi¶ sö tõ m« h×nh thiÕt kÕ thÝ nghiÖm x¸c ®Þnh ®îc bíc sãng (UV) lµ yÕu tè chÝnh (H×nh II.2.5.3) cã ¶nh hëng ®Õn thÝ nghiÖm. ViÖc dÞch chuyÓn bíc sãng sÏ thu ®îc nh÷ng cùc ®¹i hÊp thô kh¸c nhau t¬ng øng víi sè peak xuÊt hiÖn. Ban ®Çu m« h×nh thiÕt kÕ thÝ nghiÖm sÏ sö dông gi¸ trÞ bíc sãng ban ®Çu lµ 290 nm, quan s¸t trªn trôc thêi gian lu sÏ kh«ng t×m thÊy çc cùc ®¹i hÊp thô däc theo chiÒu cña trôc thêi gian lu t¬ng øng víi viÖc çc peak xuÊt hiÖn rÊt Ýt. Khi thay ®æi çc møc thÝ nghiÖm (çc bíc sãng)

49

lªn 220 (H×nh II.2.5.3) sù xuÊt hiÖn c¸c cùc ®¹i hÊp thô râ rµng h¬n, tiÕp tôc thay ®æi bíc sãng ®Õn 200 nm râ rµng sè cùc ®¹i hÊp thô t¨ng t¬ng øng víi sè peak trªn s¾c ký ®å t¨ng ®¹t møc nhiÒu nhÊt, sù thay ®æi kh¸c kh«ng mang l¹i kÕt qu¶ kh¶ quan.

Nh vËy, bíc sãng t¹i 200 nm ®îc coi lµ bíc sãng tèi u ®èi víi m« h×nh thÝ nghiÖm nµy.

H×nh II.2.5.3. Tìm kiếm bước sóng tối ưu

Giảm thời gian (Saving time): Thông thường các bước tối ưu hoá có thể tiêu tốn rất nhiều thời gian và công sức, đôi khi không mang lại kết quả và dẫn đến ảnh hưởng nhiều đến mô hình thí nghiệm. Nhằm tiết kiệm thời gian cũng như giảm thiểu những sai sót trong thiết kế thí nghiệm. Gần đây mô hình dự đoán các yếu tố thí nghiệm đã được xây dựng theo các công cụ của hoá thống kê (Chemometric). Ứng dụng các mô hình này có thể giảm được rất nhiều thời gian và công sức thực hiện các thí nghiệm151.

Định lượng mô hình thí nghiệm (Quantitative modelling experimental). Hầu hết các thí nghiệm, bao gồm cả những thí nghiệm đơn giản nhất trong hoá phân tích đến những quá trình vật lý phức tạp. Mọi kết quả tính toán đều được ước lượng và đánh giá tính hiệu quả để có thể kết luận về tính ứng dụng của mô hình. Tại bước này nguời ta có thể bæ sung hoÆc lo¹i trõ c¸c nh©n tè ¶nh hëng chÝnh ®Õn qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm ®Ó thu ®îc nh÷ng m« h×nh thÝ nghiÖm ®¹t ®îc tÝnh ®¬n gi¶n vµ hiÖu qu¶.

Cùc

®¹i

hÊp

thô

Bíc sãng

Thêi gian lu

50

Chu tr×nh cña m« h×nh x©y dùng s¾c ký dÊu v©n tay

H×nh II.2.5.4. Chu tr×nh cña m« h×nh x©y dùng s¾c ký dÊu v©n tay

b. Lu tr÷ d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c kýchuÈn vµ d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c ký cÇn x¸c ®Þnh.

H×nh II.2.5.5. M« h×nh chuyÓn ®æi, lu tr÷ vµ qu¶n lý d÷ liÖu s¾c ký dÊu v©n tay

X¸c lËp çc yªu cÇu vÒ dÊu v©n tay §¸nh gi¸ sù phï hîp çc yªu cÇu

X©y dùng m« h×nh t¹o mÉu X¸c nhËn hiÖu lùc cña m« h×nh

§¸nh gi¸ m« h×nh x©y dùng §¸nh gi¸ m« h×nh ph¸t triÓn

Ph¸t triÓn m« h×nh dÊu v©n tay

§Þnh tÝnh d÷ liÖu

Çc thiÕt bÞ ph©n tÝch

Lu tr÷ d÷ liÖu thñ c«ng

§æi d÷ liÖu sang ASCII

Tù ®éng lu tr÷ d÷ liÖu

N¹p d÷ liÖu s¾c ký v©n tay

Tù ®éng chuyÓn ACSII

HiÖn thÞ s¾c ký v©n tay

Ms Work or Powerpoint

Excel Spread sheets

ChemDraw hoÆc ACD

Merck index hoÆc DNP

Lu tr÷ d÷ liÖu

Lu tr÷ file

C¬ së d÷ liÖu

51

Song song víi viÖc t¹o ra çc mÉu dÊu v©n tay chuÈn vµ mÉu dÊu v©n tay cÇn ®¸nh gi¸. ViÖc lu tr÷ çc d÷ liÖu dÊu v©n tay nµy còng ®ãng vai trß quan träng trong ph¬ng ph¸p s¾c ký dÊu v©n tay. Ngµy nay víi sù ph¸t triÓn kh«ng ngõng cña ngµnh C«ng nghÖ th«ng tin, viÖc lu tr÷ vµ qu¶n lý d÷ liÖu ®· ®îc hç trî rÊt nhiÒu b»ng çc hÖ m¸y tÝnh vµ çc thiÕt bÞ lu tr÷ chuyªn dïng. D÷ liÖu ®îc lu tr÷ ®¶m b¶o sù an toµn, toµn vÑn vµ kh¶ n¨ng qu¶n lý, truy cËp nhanh ®Õn çc d÷ liÖu cÇn sö dông. Cã rÊt nhiÒu çch ®Ó lu tr÷ vµ qu¶n lý d÷ liÖu s¾c ký dÊu v©n tay. ViÖc lu tr÷ nµy cã ý nghÜa rÊt lín trong viÖc x©y dùng çc cë së d÷ liÖu vÒ dÊu v©n tay s¾c kýøng dông trong ®¸nh gi¸ vµ qu¶n lý chÊt lîng dîc liÖu. M« h×nh tr×nh bµy trªn h×nh II.2.5.5 lµ mét vÝ dô minh häa viÖc lu tr÷ vµ qu¶n lý d÷ liÖu s¾c ký dÊu v©n tay. c. §¸nh gi¸ d÷ liÖu s¾c ký dÊu v©n tay.

Trong ph¬ng ph¸p s¾c ký dÊu v©n tay, ®¸nh gi¸ gi÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c ký®ãng vai trß quan träng. Nh÷ng d÷ liÖu vÒ dÊu v©n tay s¾c ký ®· thu thËp ®îc sÏ ®îc xö lý vµ lùa chän ra nh÷ng th«ng tin phï hîp, h÷u Ých. VÝ dô nh, mèi liªn hÖ gi÷a nguån gèc thùc vËt víi ho¹t tÝnh/®éc tÝnh cña dîc liÖu dùa vµo kÕt qu¶ s¾c ký vÕt ®· thu ®îc. Ngµy nay víi sù trî gióp cña çc thiÕt bÞ ph©n tÝch hiÖn ®¹i, çc thµnh phÇn phøc t¹p cã mÆt trong dîc liÖu cã thÓ ®îc ph©n t¸ch rÊt râ rµng, kÕt hîp víi çc ph¬ng ph¸p ho¸ thèng kª (HCA, PCA, PLS, UVE-PLS..)151,152 mét bøc tranh tæng thÓ hiÓn thÞ çc th«ng tin cÇn thiÕt cña th¶o dîc cã thÓ nhËn ®îc.

M« h×nh ®¸nh gi¸ d÷ liÖu ®îc thùc hiÖn qua çc bíc nh sau: Bíc 1: X©y dùng d÷ liÖu s¾c ký dÊu v©n tay Bíc x©y dùng nµy ®· ®îc m« t¶ ë trªn. Çc d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c ký®îc

lu tr÷ vµ qu¶n lý trong çc hÖ c¬ së d÷ liÖu vµ thiÕt bÞ lu tr÷ kh¸c nhau. M« h×nh tæng quan çc bíc ®¸nh gi¸ d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c ký(h×nh

II.2.5.6):

H×nh II.2.5.6. M« h×nh ®¸nh gi¸ d÷ liÖu s¾c ký dÊu v©n tay

X©y dùng dÊu v©n tay s¾c ký TiÒn xö lý d÷ liÖu

KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ dÊu v©n tay s¾c ký

§¸nh gi¸ d÷ liÖu Ph©n tÝch d÷ liÖu

1 2

3 4

52

Bíc 2: TiÒn xö lý d÷ liÖu D÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c ký ®îc x©y dùng tõ nhiÒu thiÕt bÞ ph©n tÝch víi çc

yÕu tè kh¸c nhau do ®ã ®Ó ®¸nh gi¸ ®îc d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c ký cÇn thiÕt ph¶i cã nh÷ng bíc ®¸nh gi¸ tiÒn xö lý d÷ liÖu. Môc ®Ých ®Ó ®a vÒ mét mÆt b»ng ®¸nh gi¸, lo¹i trõ nh÷ng ¶nh hëng cña çc yÕu tè kh«ng mong muèn x¶y ra trong qu¸ tr×nh x©y dùng dÊu v©n tay s¾c ký nh: dÞch chuyÓn çc peak, kh¸c nhau vÒ thêi gian lu, çc lçi, yÕu tè nh©n t¹o, ®é chÝnh x¸c cña thiÕt bÞ ®o thay ®æi. Trong qu¸ tr×nh tiÒn xö lý d÷ liÖu cÇn chó ý ®Õn çc yÕu tè nh mËt ®é tÝn hiÖu, thêi gian lu, diÖn tÝch peak, chiÒu cao peak, çc peak chång chÐo…

ChuyÓn ®æi d÷ liÖu (Tranforming data): Th«ng thêng çc d÷ liÖu ®îc t¹o ra bëi çc thiÕt bÞ s¾c ký kÕt hîp (S¾c ký láng kÕt nèi khæi phæ, s¾c ký khÝ kÕt nèi khæi phæ..) thêng ë d¹ng d÷ liÖu hai chiÒu. D÷ liÖu nµy muèn ®îc sö dông trong çc ph¬ng ph¸p xö lý d÷ liÖu nhiÒu chiÒu b»ng çc ph¬ng ph¸p ho¸ thèng kª (Chemometrics) th× ph¶i chuyÓn ®æi d÷ liÖu sang çc d¹ng Acsii, text... D÷ liÖu nµy tiÕp tôc ®uîc chuyÓn ®æi vµo çc ma trËn víi mçi cét ®¹i diÖn cho d÷ liÖu phæ vµ mçi cét ®¹i diÖn cho sè liÖu cña s¾c ®å t¹i mçi mét bíc sãng hoÆc m/z.. hoÆc ngîc l¹i141. VÝ dô cña chuyÓn ®æi d÷ liÖu ®îc tr×nh bµy trªn h×nh II.2.5.7.

H×nh II.2.5.7. ChuyÓn ®æi d÷ liÖu tõ hÖ thèng kÕt hîp vµ hiÓn thÞ

Lo¹i trõ sù dÞch chuyÓn ®êng nÒn, lo¹i trõ sù ¶nh hëng cña çc biÕn sè kh«ng liªn quan ®Õn çc thµnh phÇn chñ yÕu trªn dÊu v©n tay s¾c kýb»ng ph¬ng ph¸p: ph¬ng ph¸p snv, ph¬ng ph¸p colum centering, normalization147,159. HiÖu

D÷ liÖu s¾c ký mét chiÒu t¹i thiÕt bÞ LC

MÉu qua hÖ thèng kÕt nèi

D÷ liÖu s¾c ký hai chiÒu t¹i thiÕt bÞ UV hoÆc ELSD

ChuyÓn ®æi d÷ liÖu

Qu¸ tr×nh chuyÓn ®æi d÷ liÖu tõ çc thiÕt bÞ kÕt hîp thµnh çc d÷ liÖu hai chiÒu

HiÓn thÞ d÷ liÖu

D÷ liÖu d¹ng 2D miÕng mµu

D÷ liÖu d¹ng 2D contour

D÷ liÖu d¹ng 3D

plot

53

chØnh sù dÞch chuyÓn thêi gian lu t¹i çc dÊu v©n tay s¾c ký cña th¶o dîc: Khi ®¸nh gi¸ nhiÒu s¾c ®å dÊu v©n tay thu nhËn ®îc tõ cïng mét mÉu th¶o dîc cïng mét nguån, nhiÒu nguån hoÆc tõ çc nguån th¶o dîc kh¸c nhau. Tríc hÕt ph¶i xem xÐt sù gièng nhau vµ kh¸c nhau cña çc dÊu v©n tay s¾c ký ®ã. Tuy nhiªn, cÇn ph¶i xem xÐt sù dÞch chuyÓn thêi gian lu cña çc peak trªn çc s¾c ®å, sù dÞch chuyÓn nµy thêng kh«ng tr¸nh khái trong qu¸ tr×nh ph©n tÝch, bëi v× (1) sù suy biÕn cña pha tÜnh, ®Æc biÖt lµ do ®Æc tÝnh kh«ng bÒn v÷ng cña silica t¹i ®iÒu kiÖn ph©n tÝch cã gi¸ trÞ pH cao, sù g·y vôn cña çc liªn kÕt C-18 trong çc cét bëi v× sù ph©n cùc qu¸ cao trong dung m«i pha ®éng; (2) mét sù thay ®æi nhá trong thµnh phÇn cña dung m«i pha ®éng g©y ra bëi sù thay ®æi nhiÖt ®é, ¸p suÊt, tû lÖ dßng, thay ®æi cña gradient; (3) Mét sè trêng hîp x¶y ra do lçi cña çc detect¬; (4) Khi cét ph©n tÝch bÞ qu¸ t¶i do mét lîng lín mÉu ®îc b¬m vµo qu¸ thÓ tÝch yªu cÇu cña cét ph©n tÝch hoÆc mét vµi thµnh phÇn trong mÉu ph©n tÝch cã nång ®é qu¸ cao vît qu¸ ngìng ph©n tÝch; (5) mét sè sai lÖch ®Õn tõ chÝnh thiÕt bÞ ph©n tÝch. NÕu çc ®iÒu kiÖn trªn tån t¹i th× viÖc dÞch chuyÓn thêi gian lu cña çc peak trªn çc dÊu v©n tay s¾c kýlµ kh«ng thÓ tr¸nh khái.

Khi sù dÞch chuyÓn thêi gian lu x¶y ra trong çc mÉu dÊu v©n tay s¾c ký th× viÖc ®¸nh gi¸ d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c kýgÆp rÊt nhiÒu khã kh¨n. §Æc biÖt khi ¸p dông çc ph¬ng ph¸p ph©n tÝch nhiÒu biÕn nh: PCA, PLS, UVE-PLS, rÊt nh¹y dï sai lÖch rÊt nhá còng ¶nh hëng ®Õn kÕt qu¶145,146,147.

Nh vËy, ®Ó ®¸nh gi¸ ®îc d÷ liÖu ®iÒu cÇn thiÕt lµ ph¶i ph¸t hiÖn ra ®îc sù dÞch chuyÓn thêi gian lu cña çc dÊu v©n tay s¾c ký vµ sau ®ã çc th«ng sè cña dÊu v©n tay s¾c ký ph¶i ®îc hiÖu chØnh b»ng viÖc ®ång bé thêi gian lu cña çc peak trªn çc s¾c ký dÊu v©n tay. Trong nhiÒu thËp kû qua, nhiÒu ph¬ng ph¸p ®· ®îc ph¸t triÓn ®Ó hiÖu chØnh thêi gian lu gi÷a çc peak trªn çc s¾c ký dÊu v©n tay141,142,143. Mét vµi ph¬ng ph¸p tiÕn hµnh hiÖu chØnh thêi gian lu b»ng çch sö dông çc chÊt chuÈn ®Ó lµm çc chÊt chØ thÞ “marker” hoÆc chÊt néi chuÈn “internal standar”136. Mét sè ph¬ng ph¸p chia dÊu v©n tay s¾c ký thµnh çc phÇn gièng nh çc cöa sæ nhá ®Ó tiÕn hµnh so s¸nh çc phÇn nhá nµy víi nhau. Mét vÝ dô ®iÓn h×nh lµ viÖc chia s¾c ký ®å cña mÉu cÆn chiÕt chuÈn Ginko biloba thµnh çc vïng riªng biÖt (H×nh II.2.5.8)136. Vïng 1 cã 7 pic, vïng 2 cã 3 pic, vïng 3 cã 4 pic, vïng 4 cã 3 pic vµ vïng 5 cã vµi pic nhá. Nh÷ng pic nhá ë vïng 5 kh«ng ®ãng vai trß quan träng trong viÖc nhËn d¹ng, ®¸nh gi¸ mÉu. Víi çch chia nh vËy sÏ gióp ngêi ph©n tÝch dÔ dµng ®¸nh gi¸ ®îc çc mÉu b»ng çch so s¸nh chiÒu cao pic, tû lÖ gi÷a çc pic víi nhau tríc khi ph©n tÝch çc d÷ liÖu thu ®îc tõ çc pic. Trªn s¾c ký ®å h×nh II.2.5.8, pic cao nhÊt (sè 8) lµ runtin, pic 16 ®îc nhËn d¹ng lµ heteroside A vµ pic 17 ®îc nhËn d¹ng lµ heteroside B. Tû lÖ gi÷a çc pÝc 8:16:17 lµ 1:0,5:0,45. Sö dông b¶n mÉu s¾c ký vÕt HPLC cña Egb761 nh lµ mét mÉu chuÈn ®Ó so s¸nh víi çc

54

mÉu kh¸c, 19 mÉu EGb tõ çc nguån kh¸c nhau ®· ®îc thu thËp vµ ph©n tÝch, so s¸nh.

H×nh II.2.5.8. Ph©n chia s¾c ký ®å thµnh çc vïng riªng biÖt (TrÝch dÉn theo b¶n s¾c ký vÕt HPLC chuÈn cÆn chiÕt l¸ c©y Ginko biloba136)

Qu¸ tr×nh tÝnh to¸n vµ xö lý çc tÝn hiÖu pic trªn s¾c ký ®å cña çc mÉu thÝ nghiÖm ®îc thùc hiÖn bëi phÇn mÒm tÝnh to¸n ®é t¬ng ®ång CASE, kÕt qu¶ ph©n tÝch cho thÊy sù t¬ng ®ång rÊt cao cña çc mÉu ph©n tÝch ®èi víi mÉu chuÈn Egb761 víi hÖ sè t¬ng ®ång lªn ®Õn 0,94. DÔ dµng nhËn thÊy nÕu cã mét b¶n mÉu chuÈn cña dîc liÖu th× cã thÓ sö dông b¶n mÉu ®ã nh lµ b¶n tiªu chuÈn ®Ó ®¸nh gi¸ çc mÉu kh¸c cïng loµi, viÖc so s¸nh vµ ph©n biÖt, ®¸nh gi¸ sÏ hoµn toµn tù ®éng nhê viÖc lu tr÷ vµ xö lý d÷ liÖu trªn çc hÖ thèng m¸y tÝnh.

Mét vÊn ®Ò thêng gÆp ph¶i trong qu¸ tr×nh so s¸nh vµ nhËn d¹ng dÊu v©n tay s¾c ký ®ã lµ sù dÞch chuyÓn thêi gian lu cña çc pÝc trªn s¾c ®å cÇn x¸c ®Þnh víi s¾c ®å mÉu chuÈn. Mét ph¬ng ph¸p sö dông c«ng cô to¸n häc ®Ó hiÖu chØnh thêi gian lu b»ng çch tÝnh to¸n cña ho¸ häc th«ng kª còng ®îc ph¸t triÓn, phÇn mÒm sö dông cã tªn lµ COW-(correlation optimised warping method). Ch¬ng tr×nh COW (xem s¬ ®å thuËt to¸n h×nh II.2.5.9) ®îc viÕt b»ng ng«n ng÷ Matlab vµ ch¹y trªn hÖ m¸y tÝnh Pentium IV151,153. Nhîc ®iÓm cña ph¬ng ph¸p COW lµ tèn nhiÒu thêi gian vµ tµi nguyªn CPU cña m¸y tÝnh ®Ó cã thÓ hiÖu chØnh çc peak trªn çc s¾c ký ®å, c«ng viÖc tÝnh to¸n nµy cÇn nhiÒu hiÓu biÕt vÒ kü thuËt m¸y tÝnh vµ thèng kª. H¬n thÕ, c«ng viÖc hiÖu chØnh cÇn ph¶i biÕt râ peak trªn dÊu v©n tay s¾c ký nµo phï hîp víi peak trªn dÊu v©n tay s¾c ký kh¸c. Trong mét sè trêng hîp do kh«ng lùa chän phï hîp sÏ g©y ra sù nhÇm lÉn cña çc pÝc cã thêi gian lu gÇn s¸t nhau. Trong mét vµi trêng hîp khi kh«ng x¸c ®Þnh râ sù phï hîp cña çc peak sÏ dÉn ®Õn viÖc s¾p xÕp nhÇm peak trªn çc s¾c ký dÊu v©n tay.

Mét vÊn ®Ò kh¸c n¶y sinh trong qu¸ tr×nh sö dông mét hoÆc nhiÒu chÊt chuÈn hoÆc thµnh phÇn ho¹t tÝnh ®Ó lµm chØ thÞ “marker” thêng kh«ng mang l¹i hiÖu qu¶ cao. Bëi v× ph¬ng ph¸p nµy gÆp khã kh¨n nÕu chÊt chuÈn ®îc lùa chän còng cã

55

mÆt ®ång thêi trong çc mÉu dÊu v©n tay s¾c kýcÇn so s¸nh. §ång thêi chÊt chuÈn lµ chÊt míi hoÆc chÊt chØ cã mÆt trong th¶o dîc víi hµm lîng rÊt thÊp. H¬n thÕ thµnh phÇn ho¸ häc cña çc th¶o dîc thêng phô thuéc nhiÒu vµo ®iÒu kiÖn ®Þa lý n¬i th¶o méc sinh sèng, phô thuéc vµo mïa vô thu ho¹ch, qu¸ tr×nh xö lý th¶o méc vµ mét sè yÕu tè kh¸c. Trong mét vµi trêng hîp, chÊt chuÈn bÞ lîi dông ®Ó ®a thªm vµo dîc liÖu nh»m t¹o ra nh÷ng dîc liÖu gi¶ thay thÕ cho nh÷ng dîc liÖu tèt nh»m môc ®Ých th¬ng m¹i. Do ®ã ®Ó sö dông hiÖu qu¶ ph¬ng ph¸p cÇn ph¶i lùa chän ®îc chÊt chuÈn ®Æc trng chØ cã riªng ®èi víi loµi th¶o dîc ®ã.

H×nh II.2.5.9. S¬ ®å thuËt to¸n hiÖu chØnh thêi gian lu b»ng COW153

Bíc 3: Ph©n tÝch d÷ liÖu Ph©n tÝch d÷ liÖu b»ng çch so s¸nh d÷ liÖu trùc tuyÕn: T×m kiÕm trªn th

viÖn trùc tuyÕn lµ mét trong nh÷ng c«ng cô quan träng trong viÖc x¸c ®Þnh çc hîp chÊt cã mÆt trong th¶o dîc còng nh trong ph©n tÝch ®Þnh lîng, ®Þnh tÝnh th¶o dîc.

Trong nhiÒu n¨m gÇn ®©y cã rÊt nhiÒu çc th viÖn d÷ liÖu trùc tuyÕn ®îc x©y dùng. VÝ dô th viÖn CAMAG Bibliography Service (CCBS) lµ mét th viÖn tham kh¶o toµn diÖn vÒ s¾c ký líp máng. D÷ liÖu nµy cã kho¶ng 7700 tµi liÖu tÝnh tõ

N¹p d÷ liÖu s¾c ký

HiÖu chØnh ®êng nÒn

S¾c ®å tiÒu chuÈn

X¸c ®Þnh çc peak trªn s¾c ®å

X¸c ®Þnh peak trong mÉu sè 1

Sè mÉu >1

T¹o s¾c ®å

Kh«ng

Cã

So s¸nh çc peak cña mÉu víi mÉu chuÈn

HiÖu chØnh thêi gian lu cña çc peak

X¸c ®Þnh çc peak trong mÉu

kÕ tiÕp

Stop

56

n¨m 1982 ®Õn 2003135. Mét th viÖn d÷ liÖu øng dông s¾c ký trùc tuyÕn kh¸c lµ ACD/Chromatography Applications Database. Th viÖn nµy cã 5444 sè liÖu øng dông cña çc ph¬ng ph¸p s¾c ký nh: GC, CE, HPLC. Khi cÇn tra cøu sè liÖu, d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c ký®îc x©y dùng theo tiªu chuÈn cña çc c¬ së d÷ liÖu trùc tuyÕn nµy cã thÓ tra cøu ®Ó ph©n tÝch trùc tuyÕn d÷ liÖu (H×nh II.2.5.2.10)161.

H×nh II.2.5.10. Ph©n tÝch d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c kýcña Ginkgo biloba trùc tuyÕn135

Ph¬ng ph¸p tÝnh hÖ sè t¬ng quan (Correlation coefficient), hÖ sè t¬ng ®ång (Congruence coefficient)136. Môc ®Ých cña x©y dùng dÊu v©n tay s¾c ký lµ ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu. Nh ®· tr×nh bµy ë trªn, nguyªn t¾c c¬ b¶n ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt lîng cña dîc liÖu lµ dùa trªn cë së çc thµnh phÇn tån t¹i trong th¶o dîc vµ sö dông chÝnh çc thµnh phÇn nµy ®Ó x¸c ®Þnh dîc liÖu chÝnh t«ng vµ dîc liÖu lµm gi¶ ®Ó qua ®ã ®¸nh gi¸ ®îc chÊt lîng cña dîc liÖu. Nh vËy, môc ®Ých cña viÖc ®¸nh gi¸ nµy lµ so s¸nh ®Ó t×m ra sù gièng nhau, kh¸c nhau cña çc s¾c ký dÊu v©n tay. §Ó ®¹t ®îc môc ®Ých ®ã th× çc møc ®é ph©n t¸ch cña çc peak vµ nång ®é, mËt ®é ph©n bè cña çc peak trªn dÊu v©n tay s¾c ký ph¶i ®îc xem xÐt vµ ®¸nh gi¸. Ph¬ng ph¸p th«ng dông nhÊt ®Ó ®¸nh gi¸ sù gièng nhau vµ kh¸c nhau cña çc dÊu v©n tay s¾c kýlµ ph¬ng ph¸p tÝnh hÖ sè t¬ng quan vµ hÖ sè t¬ng ®ång: C«ng thøc tÝnh hÖ sè t¬ng quan (Correlation coefficient):

∑∑

−−−−

= 2/122/121 ))(())(())((yyxx

yyxx

ii

iir (1)

C«ng thøc tÝnh hÖ sè t¬ng ®ång (Congruence coefficient):

∑∑= 2/122/122 ))(())(( ii

ii

yxyx

r (1’)

Víi xi, yi lµ thµnh phÇn ith trong çc mÉu dÊu v©n tay kh¸c nhau, víi x, y lµ çc thµnh phÇn t¬ng øng víi n thµnh phÇn c¬ b¶n trªn s¾c ký dÊu v©n tay. x vµ y lµ gi¸ trÞ trung b×nh cña n thµnh phÇn trªn dÊu v©n tay s¾c kýcña x vµ y,

nx

x i∑= vµ

ny

y i∑= . Nh vËy, nÕu r1 =1 vµ r2 =1 th× dÊu v©n tay s¾c ký®îc coi lµ gièng nhau hoµn toµn, sù sai kh¸c gia t¨ng khi çc gi¸ trÞ r1à0, r2 à0. NÕu r1 =0 vµ r2 = 0 th× mÉu dÊu v©n tay s¾c ký ®îc coi lµ kh¸c nhau.

57

M« h×nh ®¸nh gi¸ d÷ liÖu s¾c ký dÊu v©n tay cña dîc liÖu b»ng çc ph¬ng ph¸p ho¸ thèng kª (chemometric). Cã rÊt nhiÒu ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ d÷ liÖu dÊu v©n tay s¾c kýb»ng ho¸ thèng kª. Çc ph¬ng ph¸p hãa th«ng kª sö dông trong tµi liÖu nµy lµ çc ph¬ng ph¸p ®ang ®îc øng dông nhiÒu nhÊt hiÖn nay: Ph©n tÝch thµnh phÇn chÝnh (Principal component analysis-PCA), Ph©n tÝch nhãm (Cluster analysis), Ph©n tÝch b×nh ph¬ng tèi thiÓu riªng phÇn (Partial Least Square-PLS) vµ mét ph¬ng ph¸p suy réng cña PLS (Elimination of Uninformative Variable Partial Least Square-UVE-PLS)147,152, 154. Tãm t¾t mét sè ph¬ng ph¸p ho¸ thèng kª: Ph¬ng ph¸p ph©n tÝch thµnh phÇn chÝnh (Principal component analysis-PCA)162: Ph¬ng ph¸p nµy ®Ó xö lý håi quy ®a biÕn trong ®ã çc biÕn cã quan hÖ tuyÕn tÝnh víi nhau trong çc thµnh phÇn chÝnh PCn (n-sè thµnh phÇn chÝnh). Môc ®Ých cña ph¬ng ph¸p lµ chØ ra çc thµnh phÇn chÝnh cã mÆt trªn s¾c ®å dÊu v©n tay vµ lo¹i trõ nh÷ng thµnh phÇn kh«ng cã ý nghÜa thèng kª (H×nh II.2.5.11).

H×nh II.2.5.11. Sµng läc vµ hiÓn thÞ çc biÕn cã ý nghÜa th«ng kª

TÝnh to¸n cña PCA dùa trªn gi¸ trÞ cña trÞ riªng (eigenvalue), gi¸ trÞ ®Çu tiªn cña thµnh phÇn chÝnh ®îc gi÷ l¹i sÏ ®îc hiÓn thÞ ®Ó x¸c ®Þnh sù gièng nhau hoÆc kh¸c nhau so víi çc thµnh phÇn chÝnh cßn l¹i (Hinh II.2.5.11). Ph¬ng ph¸p tÝnh PCA vµ tr×nh diÔn kÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy chi tiÕt trong tµi liÖu152,154,162. VÝ dô vÒ h×nh ¶nh thu ®îc bëi kü thuËt PCA cña 19 mÉu cÆn chiÕt Egb, trong ®ã nh÷ng nhãm kh¸c biÖt ®îc ph©n biÖt râ rµng th«ng qua çc vïng ph©n bè trªn b¶n PCA (H×nh II.2.5.12).

H×nh II.2.5.12. H×nh ¶nh vÕt thu ®îc bëi kü thuËt PCA cña 19 mÉu cÆn chiÕt EGb

58

Ph©n tÝch nhãm (Cluster analysis): C¬ së cña ph¬ng ph¸p dùa chñ yÕu trªn çc kho¶ng çch gi÷a çc cÆp cña çc s¾c ®å dÊu v©n tay (trong trêng h¬p çc s¾c ®å dÊu v©n tay) trong giíi h¹n ®o møc ®é gièng nhau cña mçi s¾c ký ®å. MÆc dÇu cã rÊt nhiÒu kiÓu gi¶i thuËt trong phÐp ph©n tÝch nhãm: K-means152, FCV153nhng gi¶i thuËt ®îc øng dông nhiÒu nhÊt lµ gi¶i thuËt ph©n nhãm theo cÊp ®é. Theo gi¶i thuËt nµy th× ®iÓm b¾t ®Çu cña c©y ph©n nhãm ®îc coi lµ gèc, çc nh¸nh m« t¶ sù gièng nhau ®îc coi nh lµ çc cµnh cña c©y ph©n cÊp, sù gièng nhau hoÆc kh¸c nhau gi÷a çc nót ®îc tÝnh dùa trªn kho¶ng çch gi÷a çc nót trªn çc ®Çu cµnh (H×nh II.2.5.13). ThuËt to¸n, ph¬ng ph¸p thùc hiÖn ®îc tr×nh bµy trong tµi liÖu151,152.

H×nh II.2.5.13. H×nh ¶nh cña ph¬ng ph¸p ph©n nhãm s¾c ký dÊu v©n tay Ph¬ng ph¸p b×nh ph¬ng tèi thiÓu riªng phÇn (PLS-Partial Least Square):Phương pháp bình phương tối thiểu riêng phần(PLS)147,152,154 diễn đạt mối liên hệ giữa n x p dữ liệu của ma trận X và một véc tơ phụ thuộc y (nx1) như sau:

X = TPT + E (2) và y = Tq + f (3) Trong đó T là ma trận kết quả (nxn), PT là ma trận chuyển đổi của ma trận ban đầu (nxp), q (nx1) véc tơ ban đầu, E(n, p) và f(n,1) là nxp và nx1 phần còn lại của ma trận. Mục đính của phương pháp bình phương tối thiểu là xây dựng mô hình dự đoán, đánh giá và phân tích dữ liệu dựa trên việc xây dựng mối liên quan giữa dữ liệu sắc ký dÊu v©n tay và dữ liệu liên hệ (dữ liệu về hoạt tính..). Qua đó xây dựng được mô hình dự đoán mối tương quan giữa số liệu sắc ký dÊu v©n tay với số liệu dùng để đánh giá chất lượng (số liệu về hoạt tính, số liệu về tổng hàm lượng flavonoit, ancaloid..).

Để có thể dự đoán được giá trị yi (hoạt tính, hàm lượng các chất) cho giá trị sắc ký dÊu v©n tay mới xi, phương trình tính toán (6) có thể sử dụng như sau:

bxyy i+=ˆ (4). Trong đó iy là giá trị dự đoán, iy là giá trị số liệu trung bình của các giá trị các sắc ký dÊu v©n tay, b(px1)vector của PLS hệ số phát triển (regression coefficients). Các hệ số này có thể được tính toán như sau: qPb .= (5)

59

Mức độ tối ưu hoá của mô hình có thể được xác định thông qua phương pháp leave-one-out cross-validation (LOO-CV). Giá trị của sai số bình phương tối thiểu (RMSECV) được tính toán cho mỗi thành phần trong mô hình PLS159,160.

∑=

∧

−=

N

i

iicv

Nyy

fRMSECV1

2, )(

)( (6)

Trong đó yi giá trị phản hồi của ith mẫu, icvy ,ˆ là giá trị phản hồi từ phương trình tính toán với các dữ liệu trên bỏ qua số liệu của mẫu ith , N số mẫu tính toán, f là số thành phần chính của PLS. Để xác định mức độ tối ưu, giá trị RMSECV được trình diễn với các thành phần chính của PLS. Ví dụ trên hình II.2.5.2.14 trình bày một trong những cách xác định giá trị RMSECV và số thành phần của PLS159.

H×nh II.2.5.14. Sè thµnh phÇn PLS t¹i ®ã RMSECV ®¹t gi¸ trÞ nhá nhÊt UVE-PLS (Ph¬ng ph¸p lo¹i trõ çc th«ng tin kh«ng cã gi¸ trÞ trong ph¬ng

ph¸p b×nh ph¬ng tèi thiÓu riªng phÇn). Trong çc dÊu v©n tay s¾c ký bao giê còng tån t¹i mét sè th«ng tin kh«ng cã gi¸ trÞ, çc th«ng tin nµy sinh ra mét çch tù nhiªn do ¶nh hëng cña çc t¸c nh©n kh«ng mong muèn trong qu¸ tr×nh vËn hµnh çc thiÕt bÞ ph©n tÝch nh ®é ån, ®é nhiÔu, sai lÖch cña cét ph©n tÝch, ¶nh hëng cña cét b¶o vÖ, dung dÞch ®Öm. Çc ph¬ng ph¸p tiÒn xö lý d÷ liÖu ®Ó hiÖu chØnh dÞch chuyÓn ®êng nÒn, sù dÞch chuyÓn çc peak.. hÇu nh kh«ng cã t¸c dông lo¹i bá çc th«ng tin kh«ng cã gi¸ trÞ. Mét phÇn lµ do çc ph¬ng ph¸p tiÒn xö lý d÷ liÖu kh«ng nhËn d¹ng ®îc th«ng tin nµo lµ cÇn thiÕt vµ ngîc l¹i. UVE-PLS nhằm mục đích loại bỏ những thông tin không cần thiết trong sắc ký dÊu v©n tay và xây dựng mô hình dự đoán, đánh giá và phân tích dữ liệu dựa trên việc xây dựng mối liên quan giữa dữ liệu sắc ký dÊu v©n tay và dữ liệu liên hệ (dữ liệu về hoạt tính..), lý thuyết cơ bản của phương pháp UVE-PLS dựa trên các thuật toán cơ sở của PLS, trong giới hạn của cuốn sách này các tác giả chi dừng lại ở mức giới thiệu phương pháp và cách ứng dụng. Chi tiết của các thuật toán và chương trình có thể tham khảo tại tài liệu151,154. Dưới đây là các bước tóm tắt của phương pháp UVE-PLS.

60

Xác định mức độ tối ưu của mô hình PLS đã xây dựng bằng thủ tục leave-one-out cross-validation (LOO-CV). Tìm giá trị RMSECV của mô hình PLS với phương trình (6) ở trên.

Khởi tạo một biến nhân tạo (nxr) với ma trận R trong đó có r biến nhân tạo, với các con số được khởi tạo một cách ngẫu nhiên và được nhân với một hằng số (10-10). Gộp ma trận (nxr) R thành ma trận (nxp) X để hình thành một ma trận nx (p+r) XR.

Tính toán mô hình PLS với dữ liệu là ma trận XR theo thứ tự leave one out cross validation (LOO-CV). n là số vectơ của b hệ số hồi quy.

Xác định mỗi hệ số hồi quy, với mức độ ổn định của hệ số hồi quy cj=bj/s(bj), mức độ ổn định này được xác định bằng giá trị trung bình của cột trong

ma trận XR ∑=

=n

i

ijj n

bb

1

chia cho giá trị của sai lệch chuẩn 2/1

1

2

))1()(

()( ∑= −

−=

n

i

jijj n

bbbs )

Xác định giá trị bị loại bỏ (cj=bj/s(bj)) để phân biệt giữa thông tin hữu ích và thông tin không hữu ích.

Loại trừ các thông tin không hữu ích là những thông tin có giá trị abs(cj)<abs(max(cartif)) từ ma trận X.

Xây dựng mô hình PLS cuối sau khi đã loại trừ các thông tin không cần thiết. Bíc 4: §¸nh gi¸ d÷ liÖu

Đây là bước cuối cùng trong toàn bộ phương pháp, kết quả của bước này là câu trả lời cuối cùng cho việc ứng dụng phương pháp để giải quyết vấn đề gì. Có nhiều cách đánh giá dữ liệu, cách thông thường và dễ hiểu nhất là dựa trên các biểu đồ hoặc các đồ thị, đ¸nh gi¸ d÷ liÖu dùa trªn sù kiÓm tra çc gi¸ trÞ kÕt qu¶ (score) vµ gi¸ trÞ n¹p (loading) cña çc biÓu ®å thu nhËn đîc tõ çc ph¬ng ph¸p ph©n tÝch sè liÖu. Nh vËy çc mèi liªn hÖ gi÷a çc dÊu v©n tay s¾c ký với çc thµnh phÇn trong dîc liÖu nh: thµnh phÇn hãa häc, ho¹t tÝnh sinh häc, ®éc tè…®îc gi¶i quyÕt vµ hiÓn thÞ. Dùa vµo çc tiªu chÝ cô thÓ ®Ó thu ®îc çc kÕt qu¶ ph©n tÝch, các kết quả có thể chỉ đơn giản là vÒ sù gièng nhau hoÆc kh¸c nhau gi÷a çc s¾c ký dÊu v©n tay, çc mèi liªn hÖ, çc gi¸ trÞ dù ®o¸n.

61

PCA PLS UVE-PLS

- Kh¶o s¸t çc gi¸ trÞ hiÓn thÞ kÕt qu¶ vµ n¹p kÕt qu¶ trªn biÓu ®å. - §¸nh gi¸ sù gièng nhau vµ kh¸c nhau - KiÓm tra sè liÖu thèng kª, NhËn d¹ng çc mÉu ho¸ häc, ®¸nh gi¸ çc líp, çc nhãm, Çc sè liÖu

dù ®o¸n (ho¹t tÝnh, tæng hµm lîng flavonoit...)

Chän thiÕt bÞ nghiªn cøu: TLC, GC-MS, CE/DAD/MS, CE/DAD/ELSD/MS

ChuÈn bÞ mÉu ph©n tÝch vµ mÉu chÊt chuÈn

TiÒn xö lý sè liÖu cña çc mÉu dÊu v©n tay s¾c ký

ChuÈn bÞ mÉu vµ ph©n tÝch mÉu

ChuÈn ®o¸n - Lùa chän vµ x¸c ®Þnh çc hîp chÊt chuÈn. - TÝnh to¸n nång ®é, mËt ®é, chiÒu cao hoÆc chiÒu réng peaks. - TÝnh to¸n çc tØ lÖ vµ møc ®é kh«ng ch¾c ch¾n.

Ph©n chia s¾c ký ®å - TÝnh to¸n çc dÉn xuÊt cho tõng s¾c ®å. - X¸c ®Þnh nh÷ng vïng quan träng vµ thiÕt yÕu. - HiÖu chØnh thêi gian lu cña çc peak trªn çc s¾c ®å.

Ph©n tÝch d÷ liÖu b»ng çc ph¬ng ph¸p thèng kª nhiÒu biÕn

HCA Parafac

§¸nh gi¸ d÷ liÖu

H×nh II.2.5.15. Tãm t¾t tiÕn tr×nh ph©n tÝch sè liÖu b»ng çc ph¬ng ph¸p ho¸ thèng kª (Chemometric)

62

H×nh II.2.5.16. Tãm t¾t ph¬ng ph¸p s¾c ký dÊu v©n tay

Bíc ®¸nh gi¸

Bíc lùa chän

Bíc khëi t¹o

Thu thËp

Çc s¶n phÈm tõ th¶o dîc

Th¶o dîc tù nhiªn

Çc th«ng tin cña th¶o dîc: §Þa h×nh, thêi gian thu mÉu, tªn khoa häc… Çc th«ng tin cña s¶n phÈm:

Thµnh phÇn, c«ng dông…

§¸nh gi¸ s¬ bé

ChiÕt mÉu

Kh¶o s¸t ho¹t tÝnh

Lùa chän c«ng cô t¹o dÊu v©n tay s¾c ký

TLC

GC

HPLC

CE

GC-MS

HPLC-DAD/MS

CE-DAD/MS

HPLC/MS/NMR

Tèi u çc th«ng sè

Lùa chän çc th«ng sè

T¹o fingerprint

§¸nh gi¸ d÷ liÖu v©n tay PLS

UVE-PLS

PCA

HCA

Chemometrics

ThiÕt bÞ ph©n tÝch

C«ng cô ®¸nh gi¸ Matlab…

63

PhÇn II: KÕt qu¶ nghiªn cøu Ch¬ng III. KÕt qu¶ thu thËp mÉu vµ x©y dùng c¬ së d÷ liÖu III.1. KÕt qu¶ thu thËp mÉu, ®Þnh loµi. §Ó thùc hiÖn çc néi dung theo tháa thuËn víi phÝa ®èi t¸c, ®Ò tµi ®· tiÕn hµnh thu thËp mÉu thùc vËt t¹i S¬n La, V¨n Hoa, Hµ Giang, Tam ®¶o, L¹ng S¬n, Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ, Lµo Cai, §¾cl¾c, Cóc Ph¬ng. Çc mÉu thùc vËt thu ®îc ®Òu tiÕn hµnh chôp ¶nh, t¹o tiªu b¶n. Çc tiªu b¶n vµ ¶nh c©y ®îc göi ®Õn chuyªn gia gi¸m ®Þnh thùc vËt GS.TS NguyÔn NghÜa Th×n, §¹i häc Khoa häc tù nhiªn vµ TS Ninh Kh¾c B¶n, ViÖn Tµi nguyªn Sinh vËt gi¸m ®Þnh tªn khoa häc, ®Þnh loµi. KÕt qu¶ thu thËp mÉu vµ ®Þnh loµi ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng III.1a vµ III.1b B¶ng III.1a. Danh s¸ch thùc vËt thu thËp ®îc (2007)

STT KH Tên Việt Nam Tên khoa học N¬i lÊy 1 VNB_01MA Ruèi luchen Mallotus luchenensis S¬n La 2 VNB_02MA Ruèi tr¸i nhá Mallotus microcarpus S¬n La 3 VNB_03MA Bïng bôc Mallotus barbatus S¬n La 4 VNB_MA07 Cha x¸c ®Þnh tªn Mallotus sp V¹n Hoa 5 VNB_NT01 Bïng bôc Mallotus barbatus Hµ Giang 6 VNB_NT02 B«ng bÐt Mallotus paniculatus Hµ Giang 7 VNB_NT03 Ba bÐt metcalf Mallotus metcalfianus Hµ Giang 8 VNB_MA01 Bïm bôp Mallotus apelta (Ma1) Tam §¶o 9 VNB_MA02 Bïm bôp Mallotus apelta (Ma2) Tam §¶o 10 VNB_MA03 B«ng bÐt Mallotus paniculatus Tam §¶o 11 VNB_SP04 ChiÕt çnh Mallotus glabriusculus L¹ng S¬n 12 VNB_SP05 Mät, Ba chia Mallotus philippinensis L¹ng S¬n 13 VNB_MA11 Bïm bôp b«ng to Mallotus macrostachyus L¹ng S¬n 14 VNB_MA12 Ruèi tr¸i nhá Mallotus microcarpus Qu¶ng B×nh 15 VNB_MA13 Cha x¸c ®Þnh tªn Mallotus aff pallitus Qu¶ng B×nh 16 VNB_MA14 Chãc mon Mallotus oflongifolius Qu¶ng TrÞ 17 VNB_MA15 Ba bÐt nhiÒu hoa Mallotus floribundus L¹ng S¬n 18 VNB_MA16 Ba bÐt nh½n Mallotus cuneatus L¹ng S¬n 19 VNB_MA17 Cha x¸c ®Þnh tªn Mallotus aff cuneatus Qu¶ng B×nh 20 VNB_MA18 §¬n x¬ng Mallotus contubernalis Qu¶ng TrÞ 21 VNB_MA19 Ba bÐt v©n nam Mallotus yunnanensis L¹ng S¬n 22 VNB_MA20 Cha x¸c ®Þnh tªn Mallotus aff poilanei KÎ Bµng 23 VNB_MA22 Ba bÐt cuèng l«ng Mallotus hookerianus Dakrong 24 VNB_MA23 Ba bÐt lïn Mallotus nanus Daclak 25 VNB_MA24 Ruèi khª Mallotus anisopodus Qu¶ng trÞ 26 VNB_MA25 Ba bÐt nói cao Mallotus oreophilus Lµo Cai 27 VNB_MA28 Mät Mallotus philippinensis Cóc Ph¬ng 28 VNB_MA29 Bïng bôc Mallotus barbatus Cóc Ph¬ng

B¶ng III.1b Danh s¸ch çc mÉu thùc vËt kh¸c STT Code Tên Việt Nam Tên khoa học N¬i lÊy

1 BM120 Bòi ngòi lớn Hedyotis hedyotidea (DC.) Hand Rubiaceae

2 BM122 Ba soi Macaranga denticulata Euphorbiaceae

3 BM123 Sảng Sterculia lanceolata Sterculiaceae

4 BM124 Sụ thon Phoebe attenuata Nees Lauraceae

64

5 BM125 Mạ ru Marrumia muscosum Blume Melastomataceae

6 BM126 Quỳnh nam Gonocaryum lobbianum (Miers) Icacinaceae

7 VNB-35 NghÓ r¨m Polygonum hydropiper L. Polygonaceae

8 BM150 Vàng nương Prunus fordiana Dunn Rosaceae

9 BM146 Kim cang quả to Smilax megacarpa A. C Smilacaceae

10 SL469 Dầu đấu chẻ ba Tetradium trichotomum Lour. Rutaceae

11 YD431 lá trắng Croton argyratus Bl. Euphorbiaceae

12 SL549 Đảng sâm Codonopsis javanica (Bl.) Hook Campanulaceae

13 VNB-41 Cây đề Ficus religiosa L. Moraceae

14 BM137 Ráy thân to Pothos gigantipes Buchet Araceae

15 SL478 Nghể xuyên lá Polygonum perfoliatum L. Polygonaceae

16 BM142 Đuôi chuột Stachytarpheta jamaicensis (L.) Verbenaceae

17 YK419 đào lôn hột Anacardium occidentale Linn. anacardiaceae

18 YK434 dây gối Salacia pallens Pierre. celastraceae

19 SL492 Giổi xanh Manglietia rufibarbata Dandy Magnoliaceae

20 SL468 Táo mèo Docynia indica (Wall) Dcn. Rosaceae

21 VNB-49 Vai đài Daphniphyllum calycinum Benth. Daphniphyllaceae

22 BM130 dây bò khai Erythropalum scandens Blume Erythropalaceae

23 VNB-51 Chó đẻ thân xanh Phyllanthus amarus Schum Euphorbiaceae

24 BM136 Dây giom Melodinus annamensis Pitard Apocynaceae

25 VNB-53 Dây song bào Diploclisia glaucescens (Blume) Menispermaceae

26 BM132 Ba gạc Rauvolfia verticillata (Lour.) Baill Apocynaceae

27 PH81 Sung bán tâm Ficus semicordata Moraceae

28 SL498 Chanh leo Passiflora edulis Sim. Passifloraceae

29 VNB-57 Phèn đèn Phyllanthus reticulatus Poiz Euphorbiaceae

30 SL432 Thường sơn tía Phlogacanthus turgidus Acanthaceae 31 SL412 dây gối Pleurostylia opposita (Wall.) celastaceae

32 SL418 Quả nổ Ruellia tuberosa Linn. Acanthaceae

33 SL477 Hông Paulownia fargesii Franch. Scrophulariaceae

34 SL487 Chò sót Schima wallichii (DC.) Korth Theaceae

35 VNB-63 Diệp hạ châu TB Phyllanthus annamensis Beille Euphorbiaceae

36 BM128 Ngái phún Ficus hirta Moraceae

37 SL442 lộc vừng cạn Careya sphaerica Roxb. lecythidaceae

38 YD438 giáng hương Pterocarpus macrocarpus Kurz. fabaceae

39 SL502 Tràng quả đeo Desmodium sequax Wall Fabaceae

40 VNB-68 Me pà cò Phyllanthus pacoensis Thin Euphorbiaceae

65

41 BM127 Mộc thông Ioides cirrhosa Turz Icacinaceae

42 SL429 mào gà Aerva sanguinolenta BL. Amaranthaceae

43 SL451 rau đắng Bacopa monnieri (L.) Wettst. scrophulariaceae

44 VNB-72 Chó đẻ răng cưa Phyllanthus urinaria L Euphorbiaceae

45 SL441 găng trương Randia turgida Roxb. rubiaceae

46 SL488 Thông tre Podocarpus neriifolius Podocarpaceae

47 VNB-75 Hoµng liªn « r« Mahonia nepalensis DC. Berberidaceae

48 YD452 củ khỉ Clausena indica (Dalz.) Oliv rutaceae

49 VNB-77 Chùm ruột Phyllanthus acidus (L.) Skeels Euphorbiaceae

50 VNB-78 táo Ventilago harmandiana Pierre. Rhamnaceae

III.2. KÕt qu¶ x©y dùng ph¬ng ph¸p chiÕt, t¹o dÞch chiÕt a. T×m hÖ dung m«i chiÕt Dung m«i chiÕt mÉu ®îc lùa trän trªn kh¶ n¨ng trén lÉn vµ ®é ph©n cùc (H×nh III.1). §ång thêi dung m«i nµy ph¶i ®¸p øng kh¶ n¨ng kh«ng g©y ®éc, g©y ch¸y vµ gi¸ thµnh phï hîp.

H×nh III.1: Gi¶n ®å kh¶ n¨ng trén lÉn vµo nhau cña çc dung m«i Trªn gi¶n ®å h×nh III.1 chóng t«i ®· tiÕn hµnh lùa chän: MeOH, Etanol lµm

dung m«i chiÕt. Hai dung m«i nµy cã kh¶ n¨ng trén lÉn cao vµ gi¸ thµnh phï hîp, kh«ng g©y ch¸y, kh¶ n¨ng g©y ®éc thÊp h¬n so víi çc dung m«i kh¸c. b. T×m hÖ dung m«i chiÕt tèi u

Chóng t«i tiÕn hµnh kh¶o s¸t t×m hÖ dung m«i chiÕt mÉu thÝch hîp nhÊt ®Ó phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh víi çc dung m«i sau (B¶ng III.2). HÖ dung m«i ®îc lùa chän lµ hÖ cã kh¶ n¨ng mang l¹i hiÖu suÊt chiÕt cao nhÊt. ViÖc ®¸nh gi¸ hiÖu suÊt dùa trªn viÖc lùa chän ngÉu nhiªn ba mÉu nghiªn cøu trªn b¶ng III.2, ¸p dông ph¬ng ph¸p chiÕt mÉu ë trªn cho ba ®èi tîng nµy vµ ®¸nh gi¸ hiÖu suÊt chiÕt.

Cã kh¶ n¨ng trén lÉn

Kh«ng cã kh¶ n¨ng trén lÉn

66

B¶ng III. 2: Çc hÖ dung m«i ®îc lùa chän ®Ó kh¶o s¸t t×m hÖ dung m«i chiÕt Sè TT Dung m«i Ghi chó 1 MeOH 2 Ethanol 3 Ethanol:H2O (60:40)

Ba mÉu thùc vËt ®îc lùa chän ngÉu nhiªn (MA01, MA17, MA28), ¸p dông ph¬ng ph¸p chiÕt theo s¬ ®å sau:

H×nh III.2: S¬ ®å chiÕt mÉu thùc vËt t×m hÖ dung m«i tèi u KÕt qu¶ (B¶ng III.3) so s¸nh hiÖu suÊt chiÕt cña çc hÖ dung m«i ®îc lùa chän B¶ng III.3: So s¸nh hiÖu suÊt chiÕt mÉu trªn çc hÖ dung m«i kh¸c nhau

DÞch chiÕt thu ®uîc víi hÖ dung m«i chiÕt (g) Stt Tªn mÉu

Lîng mÉu ban ®Çu (g) MeOH Ethanol Ethanol:H2O (60:40)

1 MA01 2.5 1.60 0.98 1.23 2 MA17 2.5 1.12 0.94 1.01 3 MA28 2.5 1.14 0.92 1.09

Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy kh¶ n¨ng chiÕt çc mÉu thùc vËt b»ng MeOH cho hiÖu suÊt chiÕt cao h¬n hai hÖ dung m«i cßn l¹i. Trªn c¬ së ®ã chóng t«i ®· lùa chän MeOH lµm dung m«i ®Ó chiÕt çc mÉu cßn l¹i t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh. c. Tèi u quy tr×nh chiÕt. Trªn c¬ së cña chiÕt mÉu theo h×nh III.2, víi hÖ dung m«i MeOH chóng t«i tiÕn hµnh n©ng cao hiÖu suÊt chiÕt mÉu b»ng çch t¨ng thêi gian siªu ©m mÉu vµ

MÉu thùc vËt (2.5g)

Ultrasonic 2010, 950W 40- 50oC, 30-60 phót

Dung m«i chiÕt vµ mÉu chiÕt

CÊt quay lo¹i dung m«i

Läc mÉu (Whatman 240nm, No 1)

DÞch läc

Dung m«i chiÕt

DÞch th« (g)

67

chiÕt lÆp l¹i phÇn cÆn chiÕt sau khi läc b»ng dung m«i h÷u c¬. CÆn chiÕt sau ba lÇn chiÕt ®îc gép l¹i, cÊt lo¹i dung m«i (H×nh III.3). HiÖu suÊt cña qu¸ tr×nh chiÕt ®îc ®¸nh gi¸ víi ba mÉu thùc vËt kÓ trªn.

H×nh III.3: N©ng cao hiÖu suÊt chiÕt mÉu thùc vËt B¶ng III.4: So s¸nh hiÖu suÊt chiÕt mÉu

Ph¬ng ph¸p chiÕt Stt Tªn mÉu

Lîng mÉu ban ®Çu (g) S¬ ®å chiÕt 1 S¬ ®å chiÕt 2

1 MA01 2.5 1.59 1.90 2 MA17 2.5 1.11 1.32 3 MA28 2.5 1.13 1.29

Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy kh¶ n¨ng chiÕt c¸c mÉu thùc vËt b»ng ph¬ng ph¸p trªn s¬ ®å III.3 cho hiÖu suÊt chiÕt cao h¬n. Trªn c¬ së ®ã chóng t«i ®· lùa chän ph¬ng ph¸p chiÕt mÉu theo s¬ ®å III.3 lµm ph¬ng ph¸p ®Ó x©y dùng quy tr×nh chiÕt c¸c mÉu t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh. III.3. KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh vµ nghiªn cøu ho¸ häc a. KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh Trong n¨m 2007, chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¹o dÞch chiÕt 28 mÉu thùc vËt thuéc chi Mallotus ®Ó phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh. Trong n¨m 2008, chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¹o dÞch chiÕt 50 mÉu thùc vËt kh¸c phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh

MÉu thùc vËt (2.5g)

(3x25ml) dung m«i chiÕt Ultrasonic 2010, 950W 40- 50oC, 60 phót



Läc mÉu

DÞch läc

MeOH

CÆn chiÕt

DÞch th« (g)

68

b. KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt lîng lín phôc vô nghiªn cøu ho¸ häc §Ó tiÕn hµnh nghiªn cøu ho¸ häc vµ nghiªn cøu ho¹t tÝnh cña çc chÊt s¹ch

chóng t«i tiÕn hµnh thu thËp mÉu lîng lín 7 mÉu thùc vËt thuéc chi Mallotus, 01 mÉu thùc vËt kh¸c (c©y NghÓ r¨m) vµ tiÕn hµnh viÖc t¹o dÞch chiÕt lîng lín 8 mÉu thùc vËt nµy.

Qua çc nghiªn cøu kÕ thõa tõ çc ®Ò tµi kh¸c chóng t«i ®· x©y dùng quy tr×nh chiÕt çc mÉu thùc vËt lîng lín phôc vô cho ®Ò tµi nh sau:

Bíc 1: Thu thËp mÉu: Çc mÉu thùc vËt cã kÕt qu¶ sµng läc ho¹t tÝnh cao ®îc tiÕn hµnh thu thËp lîng lín

Bíc 2: Çc mÉu thùc vËt ®îc sÊy kh« hoÆc ph¬i kh«. Bíc 3: C©n lîng mÉu thu ®îc vµ xay mÉu (Tuú theo lo¹i mÉu thùc vËt: l¸,

th©n hoÆc rÔ sö dông çc thiÕt bÞ xay vµ nghiÒn mÉu kh¸c nhau). Bíc 4: MÉu thùc vËt ®îc tiÕn hµnh chiÕt 3 lÇn b»ng dung m«i ®· lùa chän ë

phÇn t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh trªn thiÕt bÞ chiÕt ®a n¨ng ë nhiÖt ®é 40-50oC, thêi gian chiÕt mçi lÇn tèi thiÓu 2 ngµy.

Bíc 5: DÞch chiÕt cña 3 lÇn chiÕt ®îc läc qua giÊy läc (Whatman, d=240nm, No 1) gép l¹i vµ tiÕn hµnh cÊt lo¹i dung m«i díi ¸p suÊt gi¶m ë nhiÖt ®é díi 50oC thu ®îc dÞch c« MeOH.

Bíc 6: C©n dÞch chiÕt vµ tÝnh lîng cÆn dÞch chiÕt phÇn tr¨m hiÖu suÊt. S¬ ®å chiÕt xuÊt lîng lín b»ng thiÕt bÞ chiÕt ®a n¨ng (S¬ ®å 3)

H×nh III.4. ChiÕt mÉu thùc vËt lîng lín

MÉu kh« thùc vËt

Thêi gian chiÕt 2 ngµy nhiÖt ®é phßng



Läc mÉu

DÞch läc

MeOH

CÆn chiÕt

DÞch th« (g)

Dung m«i thu håi

69

• KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt lîng lín mÉu Mallotus nanus Tªn mÉu: Ba bÐt lïn Tªn khoa häc: Mallotus nanus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Daclak Thêi gian lÊy mÉu: 16-04-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Gia Lai vµ Kon Tum. Trªn thÕ giíi: Lµo, Cam pu chia Lîng dÞch chiÕt thu ®îc sau khi chiÕt: 1.8 kg Mallotus nanus

• KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt lîng lín mÉu Mallotus sp Tªn mÉu: Cha x¸c ®Þnh tªn Tªn khoa häc: Mallotus luchenensis §Þa ®iÓm lÊy mÉu: L¹ng s¬n Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Ngoµi khu vùc lÊy mÉu t¹i L¹ng s¬n, loµi nµy ®ang ®îc kh¶o s¸t vµ t×m kiÕm t¹i çc khu vùc kh¸c. Lîng dÞch chiÕt thu ®îc sau khi chiÕt: 1.87 kg

Mallotus luchenensis

• KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt lîng lín mÉu Mallotus barbatus Tªn mÉu: Bïng bôc Tªn khoa häc: Mallotus barbatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Hµ Giang Thêi gian lÊy mÉu: 08-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Mäc ë çc triÒn nói tõ B¾c ®Õn phÝa Nam ViÖt nam. Trªn thÕ giíi loµi nµy ph©n bè ë çc níc nh: China, Laos, Cambodia, Thailand, Malaysia, Philippines, Indonesia, Myanmar vµ India Lîng dÞch chiÕt thu ®îc sau khi chiÕt: 2.07 kg

Mallotus barbatus

• KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt lîng lín mÉu Mallotus panicunatus Tªn mÉu: B«ng bÐt, Bai bµi, Bïm bôp n©u, Ba bÐt nam bé. Tªn khoa häc: Mallotus paniculatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Hµ Giang Thêi gian lÊy mÉu: 08-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Phæ biÕn ë kh¾p çc khu vùc miÒn nói vµ trung du trªn c¶ 3 miÒn B¾c, Trung, Nam ViÖt Nam Trªn thÕ giíi: Trung Quèc, Lµo, Campuchia, Th¸i Lan, Malaysia. Lîng dÞch chiÕt thu ®îc sau khi chiÕt: 2.47 kg

Mallotus paniculatus

70

• KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt lîng lín mÉu Mallotus philippinensis Tªn mÉu: Mät, Rïm nao, Ba chia, Thuèc s¸n, Thá khang s¶i, Rïm bao. Tªn khoa häc: Mallotus philippinensis §Þa ®iÓm lÊy mÉu: L¹ng s¬n Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i Ph©n bè: Lµo Cai, Cao B»ng, L¹ng S¬n, Yªn B¸i, Qu¶ng Ninh, Hoµ B×nh, Hµ T©y, Hµ Nam, Ninh B×nh, NghÖ An, Hµ TÜnh, Qu¶ng B×nh. Lîng dÞch chiÕt: 1.22 kg Mallotus philippinensis

• KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt lîng lín mÉu Mallotus anisopodus Tªn mÉu: Ruèi khª Tªn khoa häc: Mallotus anisopodus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Qu¶ng trÞ Thêi gian lÊy mÉu: 19-02-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Ngoµi khu vùc lÊy mÉu loµi nµy ®ang ®îc kh¶o s¸t vµ t×m kiÕm t¹i çc khu vùc l©n cËn kh¸c. Lîng dÞch chiÕt thu ®îc sau khi chiÕt: 0.2 kg

Mallotus anisopodus • KÕt qu¶ t¹o dÞch chiÕt lîng lín mÉu Mallotus glabriusculus

Tªn mÉu: ChiÕt canh Tªn khoa häc: Mallotus glabriusculus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Qu¶ng trÞ Thêi gian lÊy mÉu: 19-02-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Ngoµi khu vùc lÊy mÉu loµi nµy ®ang ®îc kh¶o s¸t vµ t×m kiÕm t¹i çc khu vùc l©n cËn kh¸c. Lîng dÞch chiÕt thu ®îc sau khi chiÕt: 1.2 kg

Mallotus glabriusculus III.4. KÕt qu¶ x©y dùng c¬ së d÷ liÖu khoa häc vÒ çc mÉu Mallotus ViÖc x©y dùng d÷ liÖu khoa häc vÒ çc mÉu Mallotus ®ãng vai trß quan träng trong viÖc ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu. Bëi v× çc d÷ liÖu nµy kh«ng nh÷ng lµ çc d÷ liÖu ®Çu vµo cho viÖc øng dông ph¬ng ph¸p s¾c ký fingerprint trong qu¶n lý chÊt lîng nguyªn liÖu Mallotus mµ cßn lµ çc nguyªn liÖu cho nghiªn cøu ho¸ häc vµ triÓn khai t¹o thùc phÈm thùc phÈm chøc n¨ng. KÕt qu¶ x©y dùng cë së d÷ liÖu ®îc tr×nh bµy tãm t¾t nh sau: 1. MÉu 01Ma (Mallotus luchenensis, S¬n La) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký Tªn mÉu: Ruèi luchen Tªn khoa häc: Mallotus luchenensis §Þa ®iÓm lÊy mÉu: S¬n la Thêi gian lÊy mÉu: 03-01-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i Ph©n bè: L¹ng s¬n, S¬n la, Hoµ b×nh


B¶n s¾c ký c¬ së

b. C«ng dông: Cha cã nghiªn cøu y häc vÒ loµi c©y nµy

71

2. MÉu 02Ma (Mallotus microcarpus, S¬n La) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Ruèi tr¸i nhá Tªn khoa häc: Mallotus microcarpus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: S¬n la Thêi gian lÊy mÉu: 03-01-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i Ph©n bè: T¹i çc tØnh Cao B»ng, L¹ng S¬n, Quang Ninh (Tien Yen), Hoa B×nh (Mai Chau, Suoi Rut), Hµ Nam (Kien Khe, Vo Xa), Ninh B×nh, Thanh Ho¸, NghÖ An, Hµ TÜnh. Trªn thÕ giíi: Trung Quèc Mallotus microcarpus B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu y häc vÒ loµi nµy 3. MÉu 03Ma (Mallotus barbatus, S¬n La) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Bïng bôc Tªn khoa häc: Mallotus barbatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: S¬n la Thêi gian lÊy mÉu: 03-01-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i Ph©n bè: Mäc ë çc triÒn nói tõ B¾c ®Õn phÝa Nam ViÖt nam. Trªn thÕ giíi loµi nµy ph©n bè ë çc níc nh: China, Laos, Cambodia, Thailand, Malaysia, Philippines, Indonesia, Myanmar vµ India

Mallotus barbatus B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: Cã t¸c dông lîi niÖu, gi¶m ®au, chi t¶. 4. MÉu Ma07 (Mallotus sp, V¹n Hoa) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: §ang x¸c ®Þnh tªn

Tªn khoa häc: Mallotus sp

§Þa ®iÓm lÊy mÉu: Van Hoa

Thêi gian lÊy mÉu: 19-02-2007

Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i

Ph©n bè: Ngoµi khu vùc lÊy mÉu loµi nµy ®ang ®îc kh¶o s¸t vµ t×m kiÕm t¹i çc khu vùc l©n cËn kh¸c. Mallotus sp B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: Cha cã nghiªn cøu y häc vÒ loµi nµy 5. MÉu NT01 (Mallotus barbatus, Hµ Giang) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Bïng bôc Tªn khoa häc: Mallotus barbatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Hµ Giang Thêi gian lÊy mÉu: 08-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Mäc ë çc triÒn nói tõ B¾c Trªn thÕ giíi: China, Laos,

Mallotus barbatus


72

b.C«ng dông: Cã t¸c dông lîi niÖu, gi¶m ®au, chi t¶. Trong y häc Trung Quèc Mallotus barbatus ®îc sö dông lµm thuèc ch÷a viªm niÖu ®¹o, viªm ruét, tiªu ch¶y, tiªu ho¸ kh«ng b×nh thêng, b¹ch ®íi, sa tö cung.

6. MÉu NT02 (Mallotus paniculatus, Hµ Giang) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: B«ng bÐt, Bai bµi, Bïm bôp n©u, Ba bÐt nam bé. Tªn khoa häc: Mallotus paniculatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Hµ Giang Thêi gian lÊy mÉu: 08-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: B¾c, Trung, Nam ViÖt Nam Trªn thÕ giíi: Trung Quèc, Lµo, Campuchia, Th¸i Lan, Malaysia.

Mallotus paniculatus B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: RÔ vµ qu¶ ®îc dïng lµm thuèc ch÷a trÞ çc vÕt th¬ng ®ßn ®au vµ çc chç bÇm giËp, sng tÊy, ch÷a c¶m sèt cho trÎ nhá vµ trÞ ®au ®Çu. 7. MÉu NT03 (Mallotus metcalfianus, Hµ Giang) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Ba bÐt metcalf, Tªn khoa häc: Mallotus metcalfianus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Hµ Giang Thêi gian lÊy mÉu: 08-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Hµ giang, L¹ng s¬n, Lµo cai, Yªn b¸o, Tuyªn quang, Qu¶ng Ninh, VÜnh Phóc, Hoµ B×nh, Hµ T©y, Ninh B×nh, Thanh Ho¸, NghÖ An, Thõa Thiªn HuÕ. Trªn thÕ giíi: Trung Quèc

Mallotus metcalfianus


b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu y häc vÒ loµi nµy ë ViÖt nam

8. MÉu Ma01 (Mallotus apelta, Tam §¶o) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Bïm bôp, Bôc tr¾ng Tªn khoa häc: Mallotus apelta §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Tam ®¶o Thêi gian lÊy mÉu: 23-02-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: B¾c K¹n, L¹ng S¬n, B¾c Giang, Tam §¶o, Th¸i Nguyªn, Hoµ B×nh, Phó Thä, VÜnh Phóc, Hµ T©y, Hµ Nam, Ninh B×nh, Thanh Ho¸, Kon Tum, Gia Lai Trªn thÕ giíi: Trung Quèc, çc níc §«ng Nam ¸

Mallotus apelta


b.C«ng dông: C©y bïm bôp (Mallotus apelta) ®îc §«ng y coi lµ cã vÞ h¬i ®¾ng, ch¸t,

cã tÝnh hµn. RÔ cã t¸c dông ho¹t huyÕt, bæ vÞ trµng, thu liÔm. L¸ cã t¸c dông tiªu viªm, cÇm

m¸u. RÔ, vá vµ l¸ c©y dïng ch÷a biªm gan m·n tÝnh, sng ®au gan, l¸ch, sa tö cung, trùc

73

trµng, viªm ruét, tiªu ch¶y, huyÕt tr¾ng vµ phï thòng khi cã thai. Níc s¾c tõ vá th©n dïng

lµm thuèc ch÷a viªm loÐt thµnh t¸ trµng, buån n«n, cÇm m¸u. 9. MÉu Ma02 (Mallotus apelta, Tam §¶o) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Bïm bôp, Bôc tr¾ng Tªn khoa häc: Mallotus apelta §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Tam ®¶o Thêi gian lÊy mÉu: Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: B¾c K¹n, L¹ng S¬n, B¾c Giang, Tam §¶o, Th¸i Nguyªn, Hoµ B×nh, Phó Thä, VÜnh Phóc, Hµ T©y, Hµ Nam, Ninh B×nh, Thanh Ho¸, Kon Tum, Gia Lai Trªn thÕ giíi: Trung Quèc,

Mallotus apelta


10. MÉu Ma03 (Mallotus paniculatus, Tam §¶o) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: B«ng bÐt, Bai bµi, Bïm bôp n©u, Ba bÐt nam bé. Tªn khoa häc: Mallotus paniculatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Tam ®¶o Thêi gian lÊy mÉu: 23-02-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i Ph©n bè: Phæ biÕn ë kh¾p c¸c khu vùc miÒn nói vµ trung du trªn c¶ 3 miÒn B¾c, Trung, Nam ViÖt Nam Trªn thÕ giíi: Trung Quèc, Lµo, Campuchia, Th¸i Lan, Malaysia.

Mallotus paniculatus B¶n s¾c ký c¬ së

11. MÉu Sp04 (Mallotus glabriusculus, Qu¶ng TrÞ) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: ChiÕt canh Tªn khoa häc: Mallotus glabriusculus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Qu¶ng trÞ Thêi gian lÊy mÉu: 19-02-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Ngoµi khu vùc lÊy mÉu loµi nµy ®ang ®îc kh¶o s¸t vµ t×m kiÕm t¹i c¸c khu vùc l©n cËn kh¸c. Lîng dÞch chiÕt thu ®îc sau khi chiÕt: 1.2 kg Mallotus glabriusculus B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu y häc vÒ loµi nµy. 12. MÉu Sp05 (Mallotus philippinensis, L¹ng S¬n) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Mät, Rïm nao, Ba chia, Thuèc s¸n, Thá khang s¶i, Rïm bao. Tªn khoa häc: Mallotus philippinensis §Þa ®iÓm lÊy mÉu: L¹ng s¬n Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i Ph©n bè: Lµo Cai, Cao B»ng, L¹ng S¬n, Yªn B¸i, Qu¶ng Ninh, Hoµ B×nh, Hµ T©y, Hµ Nam, Ninh B×nh, NghÖ An, Hµ TÜnh, Qu¶ng B×nh. Mallotus philippinensis B¶n s¾c ký c¬ së

74

13. MÉu MA11 (Mallotus macrostachyus, L¹ng S¬n) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Bïm bôp b«ng to, Bôc chïm to, Ruèi ®u«i to, Ruèi tr¾ng. Tªn khoa häc: Mallotus macrostachyus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: L¹ng s¬n Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Lµo Cai, L¹ng S¬n, Hoµ B×nh, Ninh B×nh, NghÖ An, Qu¶ng TrÞ ThÕ giíi: Trung Quèc, Th¸i Lan. Mallotus macrostachyus B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: CÇm m¸u, ch÷a çc vÕt th¬ng vµ môn nhät. 14. MÉu MA12 (Mallotus microcarpus, Qu¶ng B×nh) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Ruèi tr¸i nhá Tªn khoa häc: Mallotus microcarpus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Qu¶ng b×nh Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: T¹i çc tØnh Cao B»ng, L¹ng S¬n, Quang Ninh (Tien Yen), Hoa B×nh (Mai Chau, Suoi Rut), Hµ Nam (Kien Khe, Vo Xa), Ninh B×nh, Thanh Ho¸, NghÖ An, Hµ TÜnh Trªn thÕ giíi: Trung Quèc Mallotus microcarpus B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu ho¸ häc vÒ loµi c©y nµy 15. MÉu MA13 (Mallotus aff pallitus, Qu¶ng B×nh) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Cha x¸c ®Þnh tªn Tªn khoa häc: Mallotus aff pallitus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Qu¶ng B×nh Thêi gian lÊy mÉu: 11-02-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Ngoµi khu vùc lÊy mÉu, loµi nµy hiÖn ®ang ®îc kh¶o s¸t vµ t×m kiÕm t¹i çc khu vùc kh¸c. Trªn thÕ giíi: §ang cËp nhËt th«ng tin Mallotus aff pallitus


b.C«ng dông: Cha cã nghiªn cøu vÒ y häc cña loµi nµy 16. MÉu MA14 (Mallotus oflongifolius, Qu¶ng Tri) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Chãc mßn, Chãc mãt, Çm heo, Ruèi trßn dµi. Tªn khoa häc: Mallotus oflongifolius §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Qu¶ng trÞ Thêi gian lÊy mÉu: 28-04-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Thõa Thiªn HuÕ, §µ N½ng, Qu¶ng Nam, Kom Tum, §¾c l¾c, Trªn thÕ giíi: Trung Quèc, Lµo..

Mallotus oflongifolius B¶n s¾c ký c¬ së

75

17. MÉu MA15 a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Ba bÐt nhiÒu hoa, Ruèi trung bé, Ba bÐt nhiÒu hoa. Tªn khoa häc: Mallotus floribundus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: L¹ng s¬n Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Thanh Ho¸, NghÖ An, Hµ TÜnh, Qu¶ng Binh, Qu¶ng TrÞ, Thõa Thiªn HuÕ, §µ N½ng, Qu¶ng Nam. Trªn thÕ giíi: Lµo, Cam pu chia, Th¸i Lan, Malaysia, Philipin. Mallotus floribundus B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: Ch÷a c¶m sèt, ®au d¹ dµy, tiªu ch¶y vµ dïng cho phô n÷ sau khi sinh con. 18. MÉu MA16 (Mallotus cuneatus, L¹ng S¬n) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Ba bÐt nh½n Tªn khoa häc: Mallotus cuneatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: L¹ng s¬n Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: L¹ng s¬n, Qu¶ng Ninh, Ninh B×nh, Hµ Nam Trªn thÕ giíi: §ang cËp nhËt th«ng tin Mallotus cuneatus B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu y häc vÒ loµi nµy. 19. MÉu MA17 (Mallotus aff cuneatus, Qu¶ng B×nh) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Cha x¸c ®Þnh ®îc tªn viÖt Tªn khoa häc: Mallotus aff cuneatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Qu¶ng B×nh Thêi gian lÊy mÉu: 11-02-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Trªn toµn l·nh thæ ViÖt Nam

Mallotus aff cuneatus

B¶n s¾c ký c¬ së b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu y häc vÒ loµi nµy 20. MÉu MA18 ( Mallotus contubernalis, Qu¶ng TrÞ) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: §¬n x¬ng, Canh kiÕn l¸ b¹c, Bôc trêng ba ng¨n. Tªn khoa häc: Mallotus contubernalis §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Qu¶ng TrÞ Thêi gian lÊy mÉu: 28-04-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Cao B»ng, L¹ng S¬n, Qu¶ng TrÞ, Hoµ B×nh Trªn thÕ giíi: Trung Quèc, Lµo

M.contubernalis


76

b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu y häc vÒ loµi nµy. 21. MÉu MA19 (Mallotus yunnanensis) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Ba bÐt v©n nam Tªn khoa häc: Mallotus yunnanensis §Þa ®iÓm lÊy mÉu: L¹ng s¬n Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: L¹ng S¬n, Qu¶ng Ninh, Hoµ b×nh Trªn thÕ giíi: Trung Quèc

M.yunnanensis

B¶n s¾c ký c¬ së b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cu y häc vÒ loµi nµy 22. MÉu MA20 (Mallotus aff poilanei, KÎ Bµng) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Tªn khoa häc: Mallotus aff poilanei §Þa ®iÓm lÊy mÉu: KÎ Bµng Thêi gian lÊy mÉu: 17-04-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè:

Mallotus aff poilanei

B¶n s¾c ký c¬ së b.C«ng dông: Cha cã nghiªn cøu chÝnh thøc 23. MÉu MA22 (Mallotus hookerianus, Darkrong)

a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký Tªn mÉu: Ba bÐt cuèng l«ng Tªn khoa häc: Mallotus hookerianus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Dakrong Thêi gian lÊy mÉu: 16-04-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Lµo Caim Tuyªn Quang, Qu¶ng Ninh, Ninh B×nh, NghÖ An, Dakrong.

Mallotus hookerianus


b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu y häc vÒ c©y nµy 24. MÉu MA23 (Mallotus nanus, Daclak) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Ba bÐt lïn Tªn khoa häc: Mallotus nanus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Daclak Thêi gian lÊy mÉu: 16-04-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Gia Lai vµ Kon Tum. Trªn thÕ giíi: Lµo, Campuchia

Mallotus nanus B¶n s¾c ký c¬ së

77

25. MÉu MA24 ( Mallotus anisopodus, Daclak) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Ruèi khª Tªn khoa häc: Mallotus anisopodus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Daclak Thêi gian lÊy mÉu: 12-04-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè:

Mallotus anisopodus

B¶n s¾c ký c¬ së b.C«ng dông: Cha cã nghiªn cøu vÒ loµi nµy 26. MÉu MA25 (Mallotus oreophilus, Daclak)

a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký Tªn mÉu: Ba bÐt nói cao Tªn khoa häc: Mallotus oreophilus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Daclak Thêi gian lÊy mÉu: 12-04-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: NguyÔn NghÜa Th×n Ph©n bè: Lµo Cai, Daclak

Mallotus oreophilus

B¶n s¾c ký c¬ së b.C«ng dông: Cha cã nhiÒu nghiªn cøu vÒ c©y nµy 27. MÉu MA28 (Mallotus philippinensis, L¹ng S¬n) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Mät, Rïm nao, Ba chia, Thuèc s¸n, Thá khang s¶i, Rïm bao. Tªn khoa häc: Mallotus philippinensis §Þa ®iÓm lÊy mÉu: L¹ng s¬n Thêi gian lÊy mÉu: 11-03-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i Ph©n bè: Lµo Cai, Cao B»ng, L¹ng S¬n, Yªn B¸i, Qu¶ng Ninh, Hoµ B×nh, Hµ T©y, Hµ Nam Mallotus philippinensis B¶n s¾c ký c¬ së

b.C«ng dông: tÝnh m¸t, thanh nhiÖt, cã t¸c dông s¸t trïng, tÈy nhÑ, cÇm m¸u. 28. MÉu MA29 (Mallotus barbatus, Cóc Ph¬ng) a. Tªn mÉu, tªn khoa häc, ®Þa ®iÓm, ngêi gi¸m ®Þnh, ph©n bè vµ b¶n s¾c ký

Tªn mÉu: Tªn khoa häc: Mallotus barbatus §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Cóc ph¬ng Thêi gian lÊy mÉu: 09-05-2007 Ngêi gi¸m ®Þnh: TrÇn Huy Th¸i Ph©n bè: Mäc ë c¸c triÒn nói tõ B¾c ®Õn phÝa Nam ViÖt nam. Trªn thÕ giíi: Indonesia, Myanmar vµ India Mallotus barbatus


b.C«ng dông: Cã t¸c dông lîi niÖu, gi¶m ®au, chi t¶.

78

III.5. KÕt qu¶ x©y dùng d÷ liÖu khoa häc vÒ thùc vËt kh¸c thu thËp trong khu«n khæ ®Ò tµi

Hedyotis hedyotidea (DC.) Hand

Macaranga denticulata

Sterculia lanceolata

Phoebe attenuata Nees Marrumia muscosum Blume

Gonocaryum lobbianum Miers

Polygonum hydropiper L. Prunus fordiana Dunn

Smilax megacarpa A. C

Tetradium trichotomum Lour. Croton argyratus Bl

Codonopsis javanica (Bl.)Hook

Ficus religiosa L Pothos gigantipes Buchet

Polygonum perfoliatum L.

79

Stachytarpheta jamaicensis Anacardium occidentale Linn.

Salacia pallens Pierre.

Manglietia rufibarbata Dandy Docynia indica (Wall) Dcn.

Daphniphyllum calycinum

Erythropalum scandens Blume Phyllanthus amarus

Melodinus annamensis

Diploclisia glaucescens Rauvolfia verticillata

Ficus semicordata

Passiflora edulis Sim Phyllanthus reticulatus Poiz

Phlogacanthus turgidus

Pleurostylia opposita Ruellia tuberosa

Paulownia fargesii

80

Schima wallichii (DC.) Korth

Ficus hirta

Careya sphaerica

Pterocarpus macrocarpus

Desmodium sequax Wall

Ioides cirrhosa Turz

Aerva sanguinolenta BL. Bacopa monnieri

Phyllanthus urinaria

Randia turgida Podocarpus neriifolius

Mahonia nepalensis

Clausena indica (Dalz.) Oliv.

Phyllanthus acidus

Ventilago harmandiana

81

Ch¬ng IV. KÕt qu¶ sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc IV.1. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh vi sinh vËt kiÓm ®Þnh. §èi víi ho¹t tÝnh kh¸ng sinh: Mét sè cÆn chiÕt metanol cña mét sè loµi Mallotus lµ: M. microcarpus (02), M. barbatus (NT01), M.apelta (MA01), M. philippinensis (SP5), M. macrostachyus (MA11), M. oflongilofius (MA14), M. floribundus (MA15), M. aff cuneatus (MA17), M. yunnanensis (MA19), M. nanus (MA23), M. barbatus (MA29) vµ M. paniculatus (MP33L) cã gi¸ trÞ MIC t¹i 500 µg/ml ®èi víi çc loµi vi sinh vËt. §iÒu ®¸ng quan t©m lµ çc çc loµi Mallotus thÓ hiÖn cã ho¹t tÝnh ®èi víi çc lo¹i vi khuÈn kh¸ng kh¸ng sinh nh Staphylococcus aureus 104, Enterococcus faecalis ATCC 29212 vµ Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. KÕt qu¶ nµy cho thÊy çc loµi Mallotus høa hÑn cã çc tiÒm n¨ng thó vÞ. IV.2. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh chèng « xy ho¸.

DPPH cã kh¶ n¨ng t¹o ra çc gèc tù do bÒn trong dung dÞch EtOH b·o hoµ. Khi cho çc chÊt thö nghiÖm vµo hçn hîp nµy, nÕu chÊt cã kh¶ n¨ng lµm trung hoµ hoÆc bao v©y çc gèc tù do sÏ lµm gi¶m cêng ®é hÊp phô ¸nh s¸ng cña çc gèc tù do DPPH. Ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸ ®îc ®¸nh gi¸ th«ng qua gi¸ trÞ hÊp phô ¸nh s¸ng cña dÞch thÝ nghiÖm so víi ®èi chøng khi ®äc trªn m¸y Elisa ë bíc sãng 515nm. Gi¸ trÞ SC% biÓu hiÖn kh¶ n¨ng b¾t gi÷ çc gèc tù do th«ng qua hÖ «xy ho¸ tù t¹o bëi DPPH, ®îc tÝnh theo c«ng thøc ®· ®îc tr×nh bµy trong quy tr×nh trªn.

KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸ cña 28 mÉu thùc vËt ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng kÕt qu¶ tæng hîp cña çc mÉu cã ho¹t tÝnh (B¶ng IV.1) B¶ng IV.1. Tû lÖ gèc tù do bÞ bao v©y SC%.

TT KH Tên Việt Nam Tên khoa học

Gi¸ trÞ SC%

(PhÇn mÊt ®i

cña DPPH0)

Ghi chó

1 01MA Ruèi luchen Mallotus luchenensis 3.0±1.98

2 02MA Ruèi tr¸i nhá Mallotus microcarpus 7.7±1.82

3 03MA Bïng bôc Mallotus barbatus 86.1±1.11 Cã ho¹t tÝnh

4 MA07 Cha x¸c ®Þnh tªn Mallotus sp1 3.4±1.08

5 NT01 Bïng bôc Mallotus barbatus 34.1±1.23

6 NT02 B«ng bÐt Mallotus paniculatus 35.1±1.32

7 NT03 Ba bÐt metcalf Mallotus metcalfianus 75.7±1.33 Cã ho¹t tÝnh

8 MA01 Bïm bôp Mallotus apelta (Ma1) 25.0±1.02

9 MA02 Bïm bôp Mallotus apelta (Ma2) 27.5±1.25

10 MA03 B«ng bÐt Mallotus paniculatus 46.5±2.18

11 SP04 ChiÕt canh Mallotus glabriusculus 67.9±2.98 Cã ho¹t tÝnh

82

12 SP05 Mät, Ba chia Mallotus philippinensis 59.1±3.18 Cã ho¹t tÝnh

13 MA11 Bïm bôp b«ng to Mallotus macrostachyus 28.5±2.11

14 MA12 Ruèi tr¸i nhá Mallotus microcarpus 10.1±2.11

15 MA13 Cha x¸c ®Þnh tªn Mallotus aff pallitus 18.6±2.28

16 MA14 Chãc mon Mallotus oflongifolius 90.7±1.13 Cã ho¹t tÝnh

17 MA15 Ba bÐt nhiÒu hoa Mallotus floribundus 91.7±2.05 Cã ho¹t tÝnh

18 MA16 Ba bÐt nh½n Mallotus cuneatus 14.8±2.17

19 MA17 Cha x¸c ®Þnh tªn Mallotus aff cuneatus 94.6±2.24 Cã ho¹t tÝnh

20 MA18 §¬n x¬ng Mallotus contubernalis -2.3±1.18

21 MA19 Ba bÐt v©n nam Mallotus yunnanensis 4.6±1.29

22 MA20 Cha x¸c ®Þnh tªn Mallotus aff poilanei 0.7±3.11

23 MA22 Ba bÐt cuèng l«ng Mallotus hookerianus 92.1±2.13 Cã ho¹t tÝnh

24 MA23 Ba bÐt lïn Mallotus nanus 84.0± 0.12 Cã ho¹t tÝnh

25 MA24 Ruèi khª Mallotus anisopodus 82.1±2.13 Cã ho¹t tÝnh

26 MA25 Ba bÐt nói cao Mallotus oreophilus 9.1± 1.82

27 MA28 Mät Mallotus philippinensis 56.1± 1.11 Cã ho¹t tÝnh

28 MA29 Bïng bôc Mallotus barbatus 32.1± 1.09

KÕt qu¶ trªn cho thÊy çc mÉu 03MA, NT07, SP04, SP05, MA14,MA15,

MA17, MA22, MA23, MA28 cã ho¹t tÝnh chèng « xy ho¸. Trong çc mÉu trªn cã

çc mÉu 03MA vµ NT01, MA29 lµ cïng loµi Mallotus barbatus thu thËp t¹i çc khu

vùc ®Þa lý vµ thêi gian thu thËp kh¸c nhau. Çc mÉu nµy cã sù kh¸c nhau vÒ kÕt qu¶

®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng « xy ho¸. Nh vËy cã sù ¶nh hëng cña ®Þa h×nh vµ thêi

gian thu mÉu ®Õn ho¹t tÝnh cña çc mÉu nµy.

§Ó nghiªn cøu s©u h¬n vÒ ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸ cña çc mÉu chóng t«i tiÕn

hµnh chiÕt ph©n ®o¹n çc mÉu vµ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng « xy ho¸ çc ph©n ®o¹n

tõ çc mÉu dÞch chiÕt.

IV.2. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh çc ph©n ®o¹n a. Çc s¬ ®å chiÕt ph©n ®o¹n

• MÉu 03MA S¬ ®å chiÕt ph©n ®o¹n mÉu 03MA

83

MÉu 03MA

CÆn chiÕt MeOH 03MA.00

- ChiÕt 3 lÇn b»ng MeOH - CÊt lo¹i dung m«i MeOH

ChiÕt ph©n bè víi dung m«i n-Hexan/Níc

CÆn chiÕt n-Hexan 03MA.01

DÞch níc sau khi chiÕt víi n-hexan

PhÇn n-Hexan PhÇn níc

ChiÕt ph©n bè víi dung m«i CHCl3/Níc

CÆn chiÕt CHCl3 03MA.02

DÞch níc sau khi chiÕt CHCl3

PhÇn CHCl3 PhÇn níc

ChiÕt ph©n bè víi dung m«i EtOAc/Níc

DÞch níc sau khi chiÕt EtOAc

CÆn chiÕt EtOAc 03MA.03

PhÇn EtOAc PhÇn níc

Lo¹i níc

PhÇn cßn l¹i 03MA.W

84

• NT03 S¬ ®å chiÕt ph©n ®o¹n mÉu NT03

¸p dông t¬ng tù quy tr×nh chiÕt trªn ®èi víi çc mÉu thùc vËt cßn l¹i vµ tiÕn hµnh

®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng « xy ho¸ çc ph©n ®o¹n. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh ch«ng

«xy ho¸ çc ph©n ®o¹n (B¶ng IV.2.b).

MÉu NT03

CÆn chiÕt MeOH NT03.00

- ChiÕt 3 lÇn b»ng MeOH - CÊt lo¹i dung m«i MeOH

ChiÕt ph©n bè víi dung m«i n-Hexan/Níc

CÆn chiÕt n-Hexan NT03.01

DÞch níc sau khi chiÕt víi n-hexan

PhÇn n-Hexan PhÇn níc

ChiÕt ph©n bè víi dung m«i CHCl3/Níc

CÆn chiÕt CHCl3 NT03.02

PhÇn CHCl3 PhÇn níc

ChiÕt ph©n bè víi dung m«i EtOAc/Níc

CÆn chiÕt EtOAc NT03.03

PhÇn EtOAc PhÇn níc

Lo¹i níc

NT03.W

DÞch níc sau khi chiÕt CHCl3

DÞch níc sau khi chiÕt EtOAc

85

b. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng « xy ho¸ c¸c ph©n ®o¹n STT Ký hiÖu ph©n ®o¹n Ph©n ®o¹n chiÕt Gi¸ trÞ SC% Ghi chó

1 01MA.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 3.0±1.98

01MA.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 33.0±1.23

01MA.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 23.0±1.22

01MA.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 7.0±1.34

2 02MA.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 7.7±1.82

02MA.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 23,70 ±1,41

02MA.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 16,23 ±1,43

02MA.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 19,21 ±1,44

3 03MA.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 86.1±1.11 Cã ho¹t tÝnh

03MA.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 59,21 ±1,44

03MA.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 76,14 ±1,56

03MA.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 22,17 ±1,67

4 MA07.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 3.4±1.08

MA07.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 23,70 ±1,41

MA07.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 16,23 ±1,43

MA07.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 19,21 ±1,44

5 NT01.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 34.1±1.23

NT01.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 29,89 ±1,73

NT01.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 25,81 ±1,24

NT01.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 39,86 ±1,35

6 NT02.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 35.1±1.32




7 NT03.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 75.7±1.33 Cã ho¹t tÝnh











86






11 SP04.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 67.9±2.98 Cã ho¹t tÝnh

SP04.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 50,19 ±1,79

SP04.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 79,67 ±1,42

SP04.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 22,89 ±1,41

12 SP05.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 59.1±3.18 Cã ho¹t tÝnh

SP05.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 44,91 ±1,37

SP05.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 68,92 ±1,39

SP05.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 46,67 ±1,40













16 MA14.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 90.7±1.13 Cã ho¹t tÝnh

MA14.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 81,80±1,03

MA14.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 98,96±1,18

MA14.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 35,60±1,29









87





20 MA18.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan -2.3±1.18














MA22.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 82,51±0.19


24 MA23.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 84.0± 0.12 Cã ho¹t tÝnh

MA23.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 98,96±1,18

MA23.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 85,60±1,29


25 MA24.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 24.6± 1.02

MA24.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 80.0± 1.12 Cã ho¹t tÝnh







27 MA28.01 DÞch chiÕt b»ng n Hexan 56.1± 1.11 Cã ho¹t tÝnh

MA28.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 54,91 ±1,37 Cã ho¹t tÝnh

MA28.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 68,92 ±1,39 Cã ho¹t tÝnh


88


MA29.02 DÞch chiÕt b»ng CHCl3 22.7± 1.23

MA29.03 DÞch chiÕt b»ng EtOAc 25.1± 2.09

MA29.W PhÇn cßn l¹i sau chiÕt 35.1± 1.23

IV.3. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo. Gi¸ trÞ biÓu hiÖn lîng tÕ bµo sèng sãt sau khi cho tiÕp xóc víi çc mÉu cµng

nhá chøng tá ho¹t tÝnh cµng cao. Tuy nhiªn, theo tiªu chuÈn ®¸nh gi¸ cña ViÖn

nghiªn cøu Ung th Mü (NCI) th× çc mÉu thö nghiÖm sµng läc s¬ cÊp cã gi¸ trÞ

ED% <50 sÏ ®îc coi lµ cã ho¹t tÝnh vµ chuÈn bÞ cho bíc thö tiÕp theo ®Ó t×m gi¸

trÞ øc chÕ tíi 50% sù ph¸t triÓn cña çc dßng tÕ bµo thö. Çc mÉu cã biÓu hiÖn ho¹t

tÝnh lµ çc mÉu cã gi¸ trÞ IC50 < 20 μg/ml.

B¶ng IV.3.1. B¶ng kÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo cña 28 mÉu Mallotus

Gi¸ trÞ CS% (Cell survival)

No

MÉu

nghiªn cøu

Hep-2 RD LU

KÕt luËn

i Blank (+) 2.5±0.0 1.5±0.0 3.5± 0.02

1 01 59.1±1.0 58.8±2.0 59.5± 0.5 Am tÝnh 2 02 76.9±1.0 97.7±1.5 78.5± 0.0 Am tÝnh 3 03 67.3±2.1 74.1±0.5 87.2± 1.2 Am tÝnh

4 MA07 37.6±0.5 42.3±1.0 62.1± 0.5 D¬ng tÝnh hai dßng

5 NT01 44.3±2.6 69.8±3.0 66.4± 2.4 D¬ng tÝnh mét dßng

6 NT02 91.9±2.1 80.2±1.1 70.5± 2.0 Am tÝnh

7 NT03 100.4±0.5 86.2±0.5 53.5± 1.2 Am tÝnh

8 MA01 40.1±0.5 57.9±1.5 57.9±1.5 D¬ng tÝnh mét dßng

9 MA02 81.2±1.5 85.2±0.5 100.0±2.0 Am tÝnh

10 MA03 99.6±0.5 97.5±0.0 99.6± 2.4 Am tÝnh

11 SP4 97.9±2.1 84.2±0.5 77.5± 1.2 Am tÝnh

12 SP5 87.3±1.1 74.1±1.2 87.2± 1.0 Am tÝnh

13 MA11 13.8±0.5 62.9±1.0 62.5± 2.0 D¬ng tÝnh mét dßng

14 MA12 26.6±0.5 38.8±2.2 61.3± 0.5 D¬ng tÝnh hai dßng

15 MA13 96.4±2.0 83.1±0.0 86.7± 1.0 Am tÝnh

16 MA14 100.0±1.0 88.1±1.0 93.8± 2.6 Am tÝnh 17 MA15 87.9±0.0 64.0±2.6 98.3± 2.0 Am tÝnh 18 MA16 24.5±1.0 50.0±3.0 64.5± 20 D¬ng tÝnh mét dßng

89

19 MA17 49.9±2.6 66.2±2.5 78.5± 1.2 D¬ng tÝnh mét dßng 20 MA18 57.9±2.4 37.7± 2.5 56.7± 1.0 D¬ng tÝnh mét dßng 21 MA19 35.6±2.6 39.4±0.5 52.5± 2.4 D¬ng tÝnh hai dßng 22 MA20 17.7±1.0 24.4±1.0 55.8± 1.0 D¬ng tÝnh hai dßng 23 MA22 100.9±1.0 92.2±1.0 70.5± 1.2 Am tÝnh 24 MA23 85.9±1.0 83.9±1.0 69.2± 1.0 Am tÝnh 25 MA24 99.3±0.0 88.2±2.0 77.5± 2.0 Am tÝnh 26 MA25 99.3±1.0 84.7±1.0 71.7± 1.0 Am tÝnh 27 MA28 81.2±1.0 80.7±1.0 63.2± 1.0 Am tÝnh 28 MA29 91.3±0.0 88.2±2.0 71.5± 2.0 Am tÝnh

Tõ kÕt qu¶ trªn, c¸c mÉu cã biÓu hiÖn ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo ®îc tiÕn hµnh x¸c ®Þnh gi¸ trÞ IC50 (nång ®é øc chÕ 50% sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo). KÕt qu¶ thö nghiÖm ®îc tæng hîp trong b¶ng 2 B¶ng IV.3.2: Tæng hîp kÕt qu¶ x¸c ®Þnh IC50 cña c¸c mÉu thùc vËt cã biÓu hiÖn ho¹t tÝnh

Gi¸ trÞ IC50 Stt Ký hiệu mẫu Hep-2 RD LU

1 01 >20 >20 >20 2 02 >20 >20 >20 3 03 >20 >20 >20 4 MA07 15.8 16.3 >20 5 NT01 17.3 >20 >20 6 NT02 >20 >20 >20 7 NT03 >20 >20 >20 8 MA01 13.1 >20 >20 9 MA02 >20 >20 >20 10 MA03 >20 >20 >20 11 SP4 >20 >20 >20 12 SP5 >20 >20 >20 13 MA11 2.65 >20 >20 14 MA12 5.26 5.68 >20 15 MA13 >20 >20 >20 16 MA14 >20 >20 >20 17 MA15 >20 >20 >20 18 MA16 5.4 20 >20 19 MA17 18.8 >20 >20 20 MA18 >20 16.2 >20 21 MA19 6.1 10.2 >20 22 MA20 6.1 7.78 >20 23 MA22 >20 >20 >20 24 MA23 >20 >20 >20

90

25 MA24 >20 >20 >20 26 MA25 >20 >20 >20 27 MA28 >20 >20 >20 28 MA29 >20 >20 >20

Çc kÕt qu¶ trªn cã ý nghÜa ®Þnh híng cho çc nghiªn cøu ho¸ häc. Cô thÓ lµ çc mÉu MA07, NT01, MA01, MA11, MA16, MA17, MA18, MA19. Çc mÉu nµy ®Òu kh¸ phæ biÕn vµ dÔ dµng thu thËp ®îc mÉu lîng lín ®Ó tiÕn hµnh çc nghiªn cøu s©u h¬n vÒ hãa häc nh»m t×m ra çc hîp chÊt thÓ hiÖn ho¹t tÝnh ch«ng ung th tiÒm n¨ng tõ çc loµi thùc vËt nµy. B. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo ®èi víi hai dßng tÕ bµo ung th: WI38 và HeLa. B¶ng IV.3.3: Ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo cña 28 cÆn chiÕt metanol cña çc loµi Mallotus

Kh¶ n¨ng sèng sãt % (50 µg/ml) Tªn mÉu

WI38 HeLa

Mallotus luchenensis 01 116.% ± 0.0 62%

Mallotus microcarpus 02 61.0% ± 7.0 45.3% ± 4.5

Mallotus barbatus 03 64.5% ± 2.1 84.0% ± 2.4

Mallotus spl MA07 14.0% ± 1.4 47.5% ± 3.5

Mallotus barbatus NT01 114.0% ± 4.2 61.1% ± 1.0

Mallotus paniculatus NT02 109.5% ± 12.0 61.0% ± 3.4

Mallotus metcalfianus NT03 59.3% ± 5.5 82.3% ± 2.1

Mallotus apelta MA01 16.0% ± 1.6 43.0% ± 1.4

Mallotus apelta MA02 13.0% ± 1.0 50.2% ± 4.9

Mallotus paniculatus MA03 99.3% ± 4.9 89.0% ± 7.5

Mallotus sp5 SP4 87.0% ± 2.8 69.6% ± 6.4

Mallotus philippinensis SP5 97.3% ± 3.5 71.1% ± 6.9

Mallotus macrostachyus MA11 13.3% ± 3.5 41.0% ± 0.0

Mallotus microcarpus MA12 24.3% ± 4.5 52.7% ± 2.4

Mallotus aff pallitus MA13 110.0% ± 2.0 77.5% ± 2.1

Mallotus oflongilofius MA14 96% ± 5.7 72.0% ± 2.6

Mallotus floribundus MA15 74.3 ± 2.5 73.8% ± 6.8

Mallotus cuneatus MA16 13.5% ± 2.1 46.5% ± 3.5

Mallotus aff cuneatus MA17 57.3% ± 8.5 48.0% ± 2.8

Mallotus contubernatus MA18 12.8% ± 2.1 43.0% ± 0.0

91

Mallotus yunnanensis MA19 15.3%± 1.5 61.3% ± 4.4

Mallotus aff poilanei MA20 53.0% ± 1.4 56.8% ± 3.7

Mallotus hookerianus MA22 98.7% ± 5.0 79.3% ± 5.5

Mallotus nanus MA23 101.0% ± 5.7 67.5% ± 6.4

Mallotus sp8 MA24 91.0% ± 4.2 86.5% ± 2.1

Mallotus oreophilus M25 94.0% ± 7.1 82.7% ± 4.0

Mallotus philippinensis MA28 103.3% ± 7.4 86.0% ± 7.1

Mallotus barbatus MA29 86.5% ± 3.5 86.3% ± 9.1

Nh vËy: Dßng tÕ bµo WI38 cã vÎ nh¹y c¶m h¬n so víi dßng tÕ bµo HeLa. Dùa vµo c¸c kÕt qu¶ thu ®îc thÊy cÆn chiÕt cña 8 loµi Mallotus cã ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo rÊt tèt vµ høa hÑn lµ nh÷ng nguån ®Çy tiÒm n¨ng ®Ó nghiªn cøu c¸c hîp chÊt g©y ®éc tÕ bµo, ®ã lµ: Mallotus spl (MA07), Mallotus apelta (MA01), Mallotus apelta (MA02), Mallotus macrostachyus (MA11), Mallotus microcarpus (MA12), Mallotus cuneatus (MA16), Mallotus api (MA18), Mallotus yunnanensis (MA19).

92

Ch¬ng V. nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc mét sè loµi Mallotus cña viÖt nam

V.1. Nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus nanus

Loµi ba bÐt lïn M. nanus thêng ph©n bè ë çc tØnh Gia Lai vµ Kon Tum. §©y lµ lo¹i c©y bôi, cao 3-7 m, th©n mÒm råi cøng, kh«ng l«ng. L¸ mäc ®èi, phiÕn to 8-12 × 5-8 cm, cã ®¸y h×nh tim; g©n tõ ®¸y 5, g©n phô 2-3 cÆp, l¸ bÑ 7 mm. Chïm tô t¸n cao, ë chãt cµnh, hoa ®ùc cã 3 l¸ ®µi, tiÓu nhôy 20 hay h¬n, chØ cã l«ng, nhôy çi lÐp, hoa çi ë ®¸y, cong mét hoa. Nang cã gai r¶i r¸c, to 5 mm.

Mallotus nanus

Cho tíi nay vÉn cha cã mét c«ng tr×nh nµo ë ViÖt Nam còng nh trªn thÕ giíi nghiªn cøu vÒ hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña M. nanus. V.1.1. Ph©n lËp çc ho¹t chÊt PhÇn trªn mÆt ®Êt cña c©y M. nanus (1,8 kg) ®îc chiÕt ba lÇn víi MeOH b»ng m¸y siªu ©m Ultrasonic 2010 ë nhiÖt ®é 40-50oC trong 20 phót. DÞch chiÕt sau ®ã ®îc c« ®Æc b»ng m¸y cÊt quay víi ¸p suÊt gi¶m ®Ó thu ®îc 150 g cÆn chiÕt MeOH. CÆn MeOH ®îc hßa vµo níc vµ ph©n líp lÇn lît víi hexan vµ EtOAc ®Ó thu ®îc çc dÞch c« hexan (35 g) vµ EtOAc (65 g). PhÇn dÞch níc sau chiÕt ®îc cho qua cét dianion sö dông hÖ dung m«i gradient MeOH-H2O (tõ 0:100 ®Õn 100:0) thu ®îc çc dÞch c« ký hiÖu lµ W1 (15g), W2 (19 g) vµ W3 (11 g). PhÇn cÆn chiÕt hexan ®îc tiÕn hµnh ph©n t¸ch trªn cét s¾c ký víi hÖ dung m«i gradient hexan-axeton (tõ 10:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n H1 (14 g), H2 (11 g), vµ H3 (7 g). Ph©n ®o¹n H1 ®îc ch¹y qua cét s¾c ký silica gel sö dông hÖ dung m«i röa gi¶i hexan-EtOAc (3:1) thu ®îc hîp chÊt MN8 (7,5 mg) vµ MN9 (20 mg). CÆn chiÕt EtOAc ®îc tiÕn hµnh ph©n t¸ch trªn s¾c ký trªn cét silica gel víi hÖ dung m«i gradient CHCl3-MeOH (tõ 10:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n E1 (26,5 g), E2 (13,4 g) vµ E3 (24,0 g). Ph©n ®o¹n E1 ®îc s¾c ký trªn cét pha ®¶o YMC RP-18 sö dông hÖ dung m«i MeOH-H2O 4:1 thu ®îc çc hîp chÊt MN3 (20.5 mg) vµ MN5 (9 mg) díi d¹ng bét mµu vµng. Ph©n ®o¹n E2 ®îc ch¹y qua cét s¾c ký YMC RP-18 hÖ dung m«i röa gi¶i MeOH-H2O (5:2) thu ®îc çc hîp chÊt MN6 (15 mg) vµ MN7 (18 mg) díi d¹ng bét vµng v« ®Þnh h×nh. Ph©n ®o¹n E3 ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel hÖ dung m«i CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,1) tinh chÕ ®îc hîp chÊt MN1 (120 mg). T¬ng tù nh vËy, tõ ph©n ®o¹n W1, hîp chÊt MN4 (20 mg) ®· ®îc tinh chÕ b»ng cét s¾c ký silica gel hÖ dung m«i CHCl3-MeOH-H2O (2:1:0,2) díi d¹ng bét mµu vµng. Hîp chÊt MN2 (100 mg) ®îc kÕt tinh b»ng hÖ

93

dung m«i MeOH-H2O tõ ph©n ®o¹n W2. Chi tiÕt qu¸ tr×nh ph©n lËp çc hîp chÊt tõ dÞch chiÕt MeOH cña c©y M. nanus ®îc s¬ ®å ho¸ nh ë h×nh V.1.1.

H×nh V.1.1. S¬ ®å ph©n lËp çc hîp chÊt tõ dÞch chiÕt MeOH cña loµi M. nanus.

V.1.2. H»ng sè vËt lý vµ d÷ kiÖn phæ cña çc hîp chÊt V.1.2.1. Hîp chÊt MN1: Mallonanoside A (chÊt míi) Bét mµu tr¾ng, ESI-MS m/z 347 [M+H]+ (positive) vµ 327 [M-H-H2O]- (negative), HR-ESI-MS m/z 351,071 [M+H]+ (tÝnh to¸n lý thuyÕt cho C14H18O10 lµ 351,069).

Mallotus nanus (1,8 kg)

- Chiết với MeOH (3 lần) bằng siêu âm - Cất loại dung môi bằng áp suất giảm

MN-Cặn chiết MeOH (150 g) Bổ sung nước

Bố sung hexan

MNH-Cặn hexan (35 g)

MNE-Cặn EtOAc (65 g)

Lớp nước

Bổ sung EtOAc

Dịch nước sau chiết Silica gel CC hexan:axeton (10:1 → 1:1)

H1 (14 g) H2 (11 g) H3 (7 g)

Silica gel CC hexan:EtOAc (3:1)

MN8 (7,5 mg) MN9 (20 mg)

Silica gel CC CHCl3:MeOH (10:1 → 1:1)

E1 (26,5 g) E2 (13,4 g) E3 (24,0 g)

RP-18 CC MeOH:H2O (4:1)


Silica gel CC CHCl3:MeOH:H2O (3:1:0,1)

MN3 (9 mg) MN5 (20,5 mg)

MN6 (15 mg)

MN1 (120 mg)

MN7 (18 mg)

MN4 (20 mg)

W1 (15 g) W2 (19 g) W3 (11 g)

MN2 (100 mg)

Cột Dianion MeOH:H2O

(0:100 → 100:0)


Kết tinh bằng hệ MeOH:H2O

Lớp nước

Lớp hexan

LớpEtOAc

94

1H-NMR (500Hz, CD3OD) δppm: 7,08 (s, H-6), 3,90 (s, OCH3), 4,94 (d, J = 10,5 Hz, H-1'), 4,05 (dd, J = 9,5, 10,5 Hz, H-2'), 3,80 (dd, J = 9,0, 9,5 Hz, H-3'), 3,42 (dd, J = 9,0, 9,0 Hz, H-4'), 3,66 (m, H-5'), 3,68 (dd, J = 5.5, 12.0 Hz, Ha-6') vµ 4,03 (dd, J =2.5, 12.0 Hz, Hb-6'). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 119,4 (C-1), 117,2 (C-2), 149,5 (C-3), 142,5 (C-4), 152,7 (C-5), 111,2 (C-6), 60,9 (OCH3), 165,8 (COOH), 74,3 (C-1'), 81,5 (C-2'), 75,1 (C-3'), 72,0 (C-4'), 83,1 (C-5') vµ 62,7 (C-6'). V.1.2.2. Hîp chÊt MN2: Mallonanoside B (chÊt míi) Tinh thÓ mµu tr¾ng, ESI-MS m/z 315 [M+H-H20]+ (positive) vµ 313 [M-H-H2O]- (negative), C13H16O10 (M = 298). 1H-NMR (500Hz, DMSO-d6) δppm: 6,96 (s, H-6), 4,93, (d, J = 10,5 Hz, H-1'), 3,91, (dd, J = 9,5, 10,5 Hz, H-2'), 3,63, (dd, J = 9,0, 9,5 Hz, H-3'), 3,18 (t, J = 9,0 Hz, H-4'), 3,55 (m, H-5'), 3,41 (dd, J = 5.5, 12.0 Hz, Ha-6') vµ 3.83 (dd, J =2.5, 12.0 Hz, Hb-6'). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δppm: 116,2 (C-1), 112,9 (C-2), 142,6 (C-3), 139,8 (C-4), 146,1 (C-5), 109,5 (C-6), 163,9 (COOH), 72,4 (C-1'), 79,9 (C-2'), 73,9 (C-3'), 71,0 (C-4'), 81,7 (C-5') vµ 61,4 (C-6'). V.1.2.3. Hîp chÊt MN3: Juglanin Bét mµu vµng, mp. 235-237oC, [α]D +52 (c, 0,25 trong H2O). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 6,22 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,41 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,98 (d, J = 8,0 Hz, H-2'), 6,93 (d, J = 8,0 Hz, H-3'), 6,93 (d, J = 8,0 Hz, H-5'), 7,98 (d, J = 8,0 Hz, H-6'), 5,51 (br s, H-1''), 4,34 (dd, J = 1,0, 3,0 Hz, H-2''), 3,92 (dd, J = 3,0, 9,0 Hz, H-3''), 3,83 (dd, J = 5,0, 9,0 Hz, H-4'') vµ 3,50 (m, H-5''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 159,4 (C-2), 134,9 (C-3), 179,9 (C-4), 163,1 (C-5), 99,9 (C-6), 166,0 (C-7), 94,8 (C-8), 158,5 (C-9), 105,7 (C-10), 122,8 (C-1'), 131,7 (C-2'), 116,5 (C-3'), 161,5 (C-4'), 116,5 (C-5'), 131,7 (C-6'), 109,6 (C-1''), 83,3 (C-2''), 78,7 (C-3''), 88,0 (C-4'') vµ 62,5 (C-5''). V.1.2.4. Hîp chÊt MN4: Rhoifolin ChÊt bét mµu vµng, mp. 245oC, [α]D -110 (c, 0,21 trong MeOH). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δppm: 6,87 (s, H-2), 6,38 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,79 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,93 (d, J = 8,5 Hz, H-2'), 6,93 (d, J = 8,5 Hz, H-3'), 6,93 (d, J = 8,5 Hz, H-5'), 7,93 (d, J = 8,5 Hz, H-6'), 5,22 (d, J = 7,5 Hz, H-1''), 3,50 (m, H-2''), 3,51 (m, H-3''), 3,35 (m, H-4''), 3,48 (m, H-5''), 3,48/3,71 (m, H-6''), 5,14 (d, J = 1,0 Hz, H-1'''), 3,20 (m, H-2'''), 3,72 (m, H-3'''), 3,21 (m, H-4'''), 3,71 (m, H-5''') vµ 1,20 (d, J = 6,0 Hz, H-6'''). 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δppm: 164,3 (C-2), 103,1 (C-3), 181,9, (C-4),161,1(C-5), 99,3 (C-6), 162,5 (C-7), 94,5 (C-8), 157,0 (C-9), 105,4 (C-10), 120,9 (C-1'), 128,6 (C-2'), 116,0 (C-3'), 161,4 (C-4'), 116,0 (C-5'), 128,6 (C-6'), 97,8 (C-

95

1''), 77,0 (C-2''), 76,3 (C-3''), 70,5 (C-4''), 77,2 (C-5''), 60,5 (C-6''), 100,5 (C-1'''), 69,6 (C-2'''), 70,4 (C-3'''), 71,8 (C-4'''), 68,3 (C-5''') vµ 18,0 (C-6'''). V.1.2.5. Hîp chÊt MN5: Kaempferin Bét mµu vµng, mp. 172-174oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 6,20 (br s, H-6), 6,38 (br s, H-8), 7,76, (d, J = 8,0 Hz, H-2'), 6,94 (d, J = 8,0 Hz, H-3'), 6,94 (d, J = 8,0Hz, H-5'), 7,76 (d, J = 8,0 Hz, H-6'), 5,39 (d, J = 1,5 Hz, H-1''), 4,24 (dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H-2''), 3,73 (dd, J = 3,0, 9,0 Hz, H-3''), 3,35 (m, H-4''), 3,33 (m, H-5'') vµ 0,94 (d, J = 6,5 Hz, H-6''). 13C-NMR (125MHz, CD3OD) δppm:158,6 (C-2), 136,1 (C-3), 179,5 (C-4), 161,5 (C-5), 100,1 (C-6), 166,6 (C-7), 94,9 (C-8), 159,1 (C-9), 105,7 (C-10), 122,7 (C-1'), 131,9 (C-2'), 116,5 (C-3'), 163,1 (C-4'), 116,5 (C-5'), 131,9 (C-6'), 103,5 (C-1''), 73,2 (C-2''), 72,1 (C-3''), 72,0 (C-4''), 71,9 (C-5'') vµ 17,6 (C-6''). V.1.2.6. Hîp chÊt MN6: Quercitrin Bét mµu vµng, mp. 182-185oC, [α]D -158 (c, 0,61 trong MeOH); 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 6,25 (d, J = 2,0, H-6), 6,42 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,35, (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-2'), 6,96 (d, J = 8,0 Hz, H-3'), 7,39 (d, J = 2,0 Hz, H-6'), 5,40 (d, J = 1,5Hz, H-1''), 4,26 (dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H-2''), 3,78 (dd, J = 3,0, 9,0 Hz, H-3''), 3,45 (m, H-4''), 3,34 (m, H-5'') vµ 0,94 (d, J = 6,5 Hz, H-6''). V.1.2.7. Hîp chÊt MN7: Myricitrin Bét mµu vµng, mp. 194-197oC, [α]D 138.6 (c, 0,5 trong MeOH). 1H-NMR (500MHz, CD3OD) δppm: 6,18 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,33 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,97 (br s, H-2'), 6,97 (br s, H-6'), 5,33 (d, J = 1,5 Hz, H-1''), 4,24 (dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H-2''), 3,73 (dd, J = 3,0, 9,0 Hz, H-3''), 3,35 (dd, J = 6,0, 9,0 Hz, H-4''), 3,33 (m, H-5'') vµ 0,94 (d, J = 6,0 Hz, H-6''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 159,2 (C-2), 136,2 (C-3), 179,5 (C-4), 163,1 (C-5), 100,5 (C-6), 167,9 (C-7), 95,2 (C-8), 158,2 (C-9), 105,3 (C-10), 121,9 (C-1'), 109,6 (C-2'), 146,9 (C-3'), 138,0 (C-4'), 146,9 (C-5'), 109,6 (C-6'), 103,6 (C-1''), 73,4 (C-2''), 72,1 (C-3''), 72,0 (C-4''), 71,9 (C-5'') vµ 17,7 (C-6''). V.1.2.8. Hîp chÊt MN8: Daucosterol Bét mµu tr¾ng, mp: 285-287oC, IR(KBr) νmax cm-1: 3420, 1460, 1090. 1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5) δppm: 3,52 (1H, dd, J = 11,7, 5.1 Hz, H-3), 5,35 (1H, br d, J = 5.0 Hz, H-6), 0,68 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-19), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-25), 0,83 (3H, d, J = 7,3 Hz, H-26), 0,84 (3H, t, J = 7,6 Hz, H-29) vµ 4,30 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-1'). 13C-NMR (125MHz, pyridine-d5) δppm: 36,8 (t, C-1), 31,3 (t, C-2), 76,9 (d, C-3), 39,3 (t, C-4), 140,4 (s, C-5), 121,1 31,4 (t, C-7), (d, C-6), 31,3 (d, C-8), 49,9 (d, C-9), 36,1 (s, C-10), 20,5 (t, C-11), 38,2 (t, C-12), 41,8 (s, C-13), 55,2 (d, C-14), 25,4 (t, C-15), 29,2 (t, C-16), 56,0 (d, C-17), 11,6 (q, C-18), 19,0 (q, C-19), 35,4(d, C-20), 18,5 (q, C-21), 33,3 (t, C-22), 27,7 (t, C-23), 45,0 (d, C-24), 28,9 (d, C-25), 19,6

96

(q, C-26), 18,9 (d, C-27), 22,5 (d, C-28), 11,7 (q, C-29), 100,7 (d, C-1'), 73,4 (d, C-2'), 76,7 (d, C-3'), 70,0 (d, C-4'), 76,6 (d, C-5') vµ 61,0 (t, C-6'). V.1.2.9. Hîp chÊt MN9: Stigmast-5-en-3-O-6-O-eicosanoyl-β-D-glucopyranoside Bét mµu tr¾ng v« ®Þnh h×nh. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δppm: 3,47 (m, H-3), 5,36 (t, J = 3,0 Hz, H-6), 0,68 (s, H-18), 1,00 (s, H-19), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,79 (d, J = 6,0 Hz, H-26,27), 0,80 (d, J = 6,5 Hz, H-29), 4,37 (d, J = 7,5 Hz, H-1'), 3,29 - 3,58 (m, H-3'-5'), 4,27 (br d, J = 12,0 Hz, Ha-6'), 4,44 (dd, J = 5,0, 12,0 Hz, Hb-6') vµ 0,88 (d, J = 6,5 Hz, H-20'') 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δppm: 37,3 (C-1), 29,4 (C-2), 79,6 (C-3), 38,9 (C-4), 140,3 (C-5), 122,7 (C-6), 31,9 (C-7), 31,9 (C-8), 56,2 (C-9), 36,7 (C-10), 21,1 (C-11), 39,8 (C-12), 43,4 (C-13), 56,7 (C-14), 24,3 (C-15), 28,2 (C-16), 56,1 (C-17), 11,9 (C-18), 19,4 (C-19), 36,1 (C-20), 18,8 (C-21), 34,0 (C-22), 26,2 (C-23), 45,8 (C-24), 29,2 (C-25), 19,8 (C-26), 19,1 (C-27), 23,1 (C-28), 12,0 (C-29), 101,2 (C-1'), 74,0 (C-2'), 76,9 (C-3'), 73,6 (C-4'), 76,0 (C-5'), 63,3 (C-6'), 174,6 (C-1''), 34,2 (C-2''), 24,3 (C-3''), 28,2 - 29,7 (C-4''-15''), 25,0 (C-16''), 29,3 (C-17''), 31,8 (C-18''), 22,7 (C-19'') vµ 14,1 (C-20''). V.1.3. X¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc c¸c hîp chÊt V.1.3.1. Hîp chÊt MN1: Mallonanoside A (chÊt míi) Hîp chÊt MN1 ®îc ph©n lËp vµ tinh chÕ díi d¹ng bét mµu tr¾ng tõ pha níc sau khi chiÕt ph©n bè dÞch chiÕt MeOH cña loµi M. nanus. Phæ khèi lîng phun mï ®iÖn tö ESI-MS xuÊt hiÖn pic ion ph©n tö t¹i m/z 347 [M+H]+ (positive) vµ 327 [M-H-H2O]- (negative). Phæ khèi lîng ph©n gi¶i cao HR-TOF-MS (positive) cña MN1 xuÊt hiÖn pic ion ph©n tö ë m/z 351,071 [M-H2O+Na]+ phï hîp víi tÝnh to¸n lý thuyÕt cho c«ng thøc C14H16O9Na (cald. 351,069).

H×nh V.1.3.1.a. Phæ HR- TOF-MS cña MN1

97

OH

OMe

OHO

HOHO OH

HO

COOH

1

3

61'

2'3'

4'5'

6'2

45

H×nh V.1.3.1.b. CÊu tróc hãa häc cña hîp chÊt MN1

Phæ 1H-NMR cña MN1 cho thÊy tÝn hiÖu proton cña mét vßng th¬m bÞ thÕ n¨m vÞ trÝ t¹i δ 7,08 (s), mét nhãm metoxi t¹i δ 3,90 (s), mét nhãm oximetylen t¹i δ 4,03 (d, J = 12,0 vµ 5,5 Hz)/3,68 (d, J = 12,0 vµ 2,5 Hz) vµ çc nhãm oximetin cña ph©n tö ®êng glucose tõ δ 3,41 ®Õn 4,94. Çc t¬ng t¸c trong khung cña gèc ®êng còng thu ®îc mét çch râ nÐt. §Æc biÖt, ë phæ nµy kh«ng ph¸t hiÖn tÝn hiÖu cña mét proton anome mµ thay vµo ®ã lµ sù xuÊt hiÖn cña mét proton cã h»ng sè t¬ng t¸c lín t¹i δ 4,94 (d, J = 10,5 Hz). §iÒu nµy gîi ý r»ng cÇu liªn kÕt gi÷a phÇn khung benzen vµ gèc ®êng kh«ng cßn cã sù cã mÆt cña nguyªn tö «xy nh thêng thÊy, thay vµo ®ã lµ mét cÇu liªn kÕt trùc tiÕp cña çc ®¬n vÞ cacbon gi÷a hai phÇn tö nµy60.

H×nh V.1.3.1.c. Phæ 1H-NMR cña MN1

B¶ng V.1.3.1. Sè liÖu phæ NMR cña MN1

C δC a,b δH a,c, d¹ng pic (J = Hz) HMBC (H → C)

1 119,4 - 2 117,2 - 3 149,5 - 4 142,5 - 5 152,7 - 6 111,2 7,08, s C-2, 4, 5, COOH OCH3 60,9 3,90, s C-4

98

COOH 165,8 C-glc 1' 74,3 4,94, d (10,5) C-2 2' 81,5 4,05, dd (9,5, 10,5) C-2, C-1' 3' 75,1 3,80, dd (9,0, 9,5) C-2',4' 4' 72,0 3,42, dd (9,0, 9,0) C-3',5',6' 5' 83,1 3,66, m 6' 62,7 3,68, dd (5,5, 12,0)

4,03, dd (2,0, 12,0) C-5'

a®o trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz Ph©n tÝch çc tÝn hiÖu trªn phæ 13C-NMR cña MN1 còng cho thÊy tÝn hiÖu cña mét nhãm metoxi t¹i δ 60,6, mét nhãm cacboxyl g¾n víi vßng th¬m t¹i δ 165,8, mét nhãm metin vßng th¬m t¹i δ 111,2, ba cacbon vßng th¬m g¾n víi «xy t¹i δ 142,5, 149,5 vµ 152,7, hai cacbon bËc bèn t¹i δ 117,2 vµ 119,4, çc oximetin cña mét phÇn tö ®êng t¹i δ 72,0, 74,3, 75,1, 81,9, 83,1 vµ mét nhãm oximetylen cña gèc ®êng t¹i δ 62,7. Còng kh«ng quan s¸t thÊy tÝn hiÖu cña cacbon anome trªn phæ 13C-NMR cña MN1. Dùa vµo çc ph©n tÝch nªu trªn dÉn ®Õn gi¶ thiÕt r»ng MN1 gåm mét khung axÝt 3,5-hydroxy-4-methoxy-benzoic g¾n trùc tiÕp víi gèc ®êng glucose kh«ng qua cÇu liªn kÕt «xy60.

H×nh V.1.3.1.d. Phæ 13C-NMR cña MN1

§Ó x¸c nhËn gi¶ thiÕt trªn, chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®o phæ HSQC vµ HMBC. Th«ng qua phæ HSQC ®· x¸c ®Þnh ®îc çc vÞ trÝ t¬ng t¸c trùc tiÕp H-C cña MN1. Trªn phæ HMBC, ph¸t hiÖn t¬ng t¸c gi÷a H-1' (δH 4,94) vµ C-2 (δC 117,5), gi÷a H-2' (δH 4,05) vµ C-1' (δC 74,29)/ C-2 (δC 117,5), x¸c nhËn vÞ trÝ liªn kÕt trùc tiÕp cña gèc ®êng glucose víi phÇn khung axÝt benzoic. Ngoµi ra, çc t¬ng t¸c gi÷a proton nhãm metoxi (δH 3,90) víi C-4, gi÷a H-6' (δH 7,08) víi C-2, C-4, C-5, vµ cacbon cña nhãm cacboxyl (COOH) cïng víi çc t¬ng t¸c cña çc proton vµ cacbon thuéc gèc ®êng còng ®îc quan s¸t thÊy trªn phæ nµy.

99

H×nh V.1.3.1.e. Phæ HSQC cña MN1

H×nh V.1.3.1.f. Phæ HMBC cña MN1

OH

OCH3

OHO

HOHOOH

HO

COOH

1

H×nh V.1.3.1.g. Mét sè t¬ng t¸c HMBC chän läc cña MN1

Tõ tÊt c¶ c¸c ph©n tÝch nªu trªn cÊu tróc cña MN1 ®îc x¸c ®Þnh lµ axÝt 3,5-hydroxy-4-methoxy-2-C-β-D-glucopyranosyl-benzoic. §©y lµ mét hîp chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp tõ thiªn nhiªn vµ ®îc chóng t«i ®Æt tªn lµ mallonanoside A.

100

§¸ng chó ý lµ hîp chÊt nµy cã hµm lîng t¬ng ®èi nhiÒu trong dÞch chiÕt MeOH cña M. nanus, ®iÒu nµy gîi më c¬ së cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo. V.1.3.2. Hîp chÊt MN2: Mallonanoside B (ChÊt míi) Hîp chÊt MN2 ®îc tinh chÕ b»ng ph¬ng ph¸p kÕt tinh l¹i trong dung m«i MeOH-H2O tõ ph©n ®o¹n níc cña loµi M. nanus. Phæ 1H-NMR cña MN2 còng t¬ng tù nh phæ 1H-NMR cña MN1 víi sù xuÊt hiÖn proton cña mét vßng th¬m bÞ thÕ 5 vÞ trÝ t¹i δ 6,96 (s) vµ c¸c proton cña c¸c nhãm oximetin, oximetylen cña gèc ®êng glucose. Thªm vµo ®ã, còng kh«ng quan s¸t thÊy sù cã mÆt cña pic tÝn hiÖu ®Æc trng cho proton anome cña gèc ®êng. Còng gièng nh ë phæ 1H-NMR cña MN1, ë MN2 cã sù xuÊt hiÖn cña v¹ch tÝn hiÖu kÐp t¹i δ 4,93 (d, J = 10,5 Hz) gîi ý cho liªn kÕt trùc tiÕp kh«ng qua cÇu «xy cña phÇn tö ®êng vµ khung aglycon. Sù sai kh¸c duy nhÊt ®îc nhËn thÊy gi÷a phæ proton NMR cña MN2 ®èi víi MN1 lµ sù mÊt ®i v¹ch tÝn hiÖu cña nhãm metoxi t¹i C-4.

H×nh V.1.3.2.a. Phæ 1H-NMR cña MN2

OH

OH

OHO

HOHO OH

HO

COOH

1

3

61'

2'3'

4' 5'

6'2

45

H×nh V.1.3.2.b. CÊu tróc hãa häc cña MN2

H×nh V.1.3.2.c. Phæ 13C-NMR cña MN2

101

T¬ng tù nh vËy, trªn phæ 13C-NMR vµ phæ DEPT cña MN2 còng quan s¸t ®îc çc tÝn hiÖu cña khung axÝt benzoic víi sù xuÊt hiÖn cña çc v¹ch tÝn hiÖu ®Æc trng cho ba nhãm «xy metin, mét metin aromatic, mét nhãm cacboxyl vµ hai cacbon bËc bèn. Çc tÝn hiÖu cña phÇn gèc ®êng còng gÇn gièng víi çc tÝn hiÖu thu ®îc trªn phæ cacbon cña MN1. Trªn phæ 13C-NMR cña MN2 còng kh«ng quan s¸t thÊy tÝn hiÖu cña nhãm metoxi nh cña MN1. Do vËy, cã thÓ nhËn ®Þnh r»ng MN2 còng mang khung axÝt benzoic liªn kÕt trùc tiÕp víi phÇn tö ®êng kh«ng qua cÇu «xy. Sù sai kh¸c so víi MN1 lµ sù thay thÕ nhãm metoxi b»ng nhãm hydroxyl trªn khung axÝt benzoic. B¶ng V.1.3.2. Sè liÖu phæ NMR cña MN2

C δC a,b δH a,c d¹ng pic (J = Hz) HMBC (H → C)

1 116,2 - 2 112,9 - 3 142,6 - 4 139,8 - 5 146,1 - 6 109,5 6,96, s C-2, 4, 5, COOH COOH 163,9 Glc 1' 72,4 4,93, d (10,5) C-2 2' 79,9 3,91, dd (9,5, 10,5) C-2, C-1' 3' 73,9 3,63, dd (9,0, 9,5) C-2',4' 4' 71,0 3,18, t (9,0) C-3',5',6' 5' 81,7 3,55, m 6' 61,4 3,41, dd (8,0, 12,0)

3,83, dd (2,0, 12,0) C-5'

a®o trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz

H×nh V.1.3.2.d. Phæ DEPT 90 vµ DEPT 135 cña MN2.

102

H×nh V.1.3.2.e. Phæ HSQC cña MN2

Phæ céng hëng tõ h¹t nh©n hai chiÒu HMBC x¸c nhËn t¬ng t¸c gi÷a H-1' vµ C-2, gi÷a H-2' vµ C-1', C-2, vµ mét sè t¬ng t¸c H-C kh¸c nh ®· ®îc thÓ hiÖn trªn b¶ng V.1.3.2. Cïng víi c¸c ph©n tÝch trªn phæ céng hëng tõ h¹t nh©n vµ phæ khèi, cho phÐp nhËn ®Þnh c«ng thøc ph©n tö cña MN2 lµ C13H16O10. Trªn phæ ESI-MS xuÊt hiÖn pic tÝn hiÖu ion ph©n tö bÞ mÊt 1 ph©n tö níc t¹i m/z 315 [M+H-H20]+ (ë positive) vµ m/z 313 [M-H-H2O]- (ë negative).

H×nh V.1.3.2.f. Phæ HMBC cña MN2

103

H×nh V.1.3.2.g. Phæ khèi lîng ESI-MS positive cña MN2.

Tõ çc ph©n tÝch trªn, hîp chÊt MN2 ®îc x¸c ®Þnh lµ axÝt 3,4,5-hydroxy-2-C-β-D-glucopyranosyl-benzoic. §©y lµ mét hîp chÊt míi, lÇn ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp tõ thiªn nhiªn vµ ®îc chóng t«i ®Æt tªn lµ mallonanoside B. §¸ng chó ý lµ hîp chÊt nµy còng ®îc ph©n lËp tõ cÆn chiÕt MeOH cña M. nanus víi hµm lîng kh¸ cao. V.1.3.3. Hîp chÊt MN3: Juglanin Hîp chÊt MN3 thu ®îc díi d¹ng bét mµu vµng ®Ëm. VÖt chÊt trªn TLC cña MN3 hiÖn mµu vµng khi sö dông thuèc thö lµ H2SO4 10% vµ h¬ nãng trªn bÕp ®iÖn cho phÐp dù ®o¸n ®©y lµ mét hîp chÊt flavonoit. Phæ ESI-MS cña MN3 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu t¹i m/z 419 [M+H]+, 441 [M+Na]+ ë positive vµ m/z 417 [M-H]- ë negative. Phæ ESI-MS positive bÉy vµ b¾n m¶nh 419 cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña pic ion t¹i m/z 287 [M+H-132]+. T¬ng tù nh vËy trªn phæ negative bÉy vµ b¾n m¶nh 417 cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña pic víi cêng ®é cao t¹i m/z 285 [M-H-132]- gîi ý cho sù mÊt mét phÇn tö ®êng trong ph©n tö cña MN3. Cïng víi çc ph©n tÝch trªn phæ NMR cho phÐp x¸c ®Þnh c«ng thøc ph©n tö cña nã lµ C20H18O10.

H×nh V.1.3.3.a. Phæ ESI-MS positive cña MN3

Phæ 1H-NMR cña MN3 xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña 2 proton cña mét vßng th¬m bÞ thÕ bèn vÞ trÝ t¹i δ 6,22 (d, J = 2,0 Hz) vµ δ 6,41 (d, J = 2,0 Hz). Ngoµi ra, 4 proton cña mét vßng th¬m t¬ng t¸c hÖ AA'BB' ®îc kh¼ng ®Þnh bëi çc tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 7,98 (2H, d, J = 8,0 Hz) vµ 6,93 (2H, d, J = 8,0 Hz). Çc d÷ kiÖn

104

trªn cho phÐp dù ®o¸n MN3 lµ mét hîp chÊt flavonoit cã cÊu tróc khung d¹ng kaempferol. Sù xuÊt hiÖn cña mét ®¬n vÞ ®êng ®îc x¸c ®Þnh bëi çc tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 5,51 (1H, br s), 4,34 (1H, dd, J =1,0, 3,0 Hz), 3,92 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 3,83 (1H, dd, J = 5,0, 9,0 Hz) vµ 3,50 (2H, m).

H×nh V.1.3.3.b. Phæ 1H-NMR cña MN3

O

O

O

HO

OH

OH

OOH

OH

OH

2

45

7 9

1'

3'

1''

2''

4''

H×nh V.1.3.3.c. CÊu tróc cña hîp chÊt MN3

Phæ 13C-NMR vµ çc phæ DEPT cña MN3 còng xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu ®Æc trng cho mét hîp chÊt flavonoit khung kaempferol bÞ thÕ mét gèc ®êng ë C-3 víi sù cã mÆt cña hai nhãm metin thuéc vßng th¬m bÞ thÕ 4 vÞ trÝ t¹i δ 99,9, 94,8, vµ bèn nhãm metin thuéc vßng th¬m bÞ thÕ ®èi xøng para víi sù xuÊt hiÖn cña cÆp pic chËp t¹i δ 131,7 vµ 116,5. Cïng víi ®ã lµ mét tÝn hiÖu cña mét nhãm keton t¹i δ 179,9. Ph©n tÝch çc tÝn hiÖu trªn phæ 13C-NMR cña MN3 cho thÊy phÇn tö ®êng g¾n víi khung kaempferol t¹i C-3 lµ mét ®êng 5 cacbon61. §Ó x¸c ®Þnh chÝnh x¸c vÞ trÝ çc liªn kÕt còng nh cÊu tróc cña phÇn tõ ®êng, chóng t«i tiÕn hµnh ®o phæ hai chiÒu HSQC vµ HMBC. B¶ng V.1.3.3. D÷ liÖu phæ NMR cña MN3

C δC a,b δH a,c d¹ng pic (J = Hz) HMBC (H → C)

2 159,4 - 3 134,9 - 4 179,9 - 5 163,1 - 6 99,9 6,22, d (2,0) C-5, 7, 8, 10 7 166,0 - 8 94,8 6,41, d (2,0) C-6, 7, 9, 10 9 158,5 -

105

10 105,7 - 1' 122,8 - 2' 131,7 7,98, d (8,0) C-2, C-3', 4' 3' 116,5 6,93, d (8,0) C-2', 4' 4' 161,5 - 5' 116,5 6,93, d (8,0) C-2, C-4', 6' 6' 131,7 7,98, d (8,0) C-4', 5' Ara 1'' 109,6 5,51, br s C-3, C-3'', 4'' 2'' 83,3 4,34, dd (1,0, 3,0) C-3'', 4'' 3'' 78,7 3,92, dd (3,0, 9,0) C-2'', 5'' 4'' 88,0 3,83, dd (5,0, 9,0) C-3'' 5'' 62,5 3,50, m C-3'', 4''

a®o trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz


Ph©n tÝch çc t¬ng t¸c trªn phæ HSQC vµ HMBC mét lÇn n÷a kh¼ng ®Þnh phÇn aglycon cña MN3 cã khung kaemferol víi sù xuÊt hiÖn cña t¬ng t¸c xa gi÷a H-6 (δH 6,22) víi C-5, C-7, C-8 vµ C-10; gi÷a H-8 (δH 6,41) víi C-6, C-7, C-9 vµ C-10; gi÷a H-2' (δH 7,98) víi C-3', C-4', gi÷a H-3' (δH 6,93) víi C-1', C-4'. Ngoµi ra, t¬ng t¸c gi÷a proton anome cña phÇn tö ®êng t¹i δH 5,51 víi C-3 (δc 134,9) x¸c ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña gèc ®êng nµy t¹i cacbon nµy. Çc t¬ng t¸c cña H-1'' víi C-3'', C-4''; H-2'' víi C-3'', C-4''; H-3'' víi C-2'', C-4'', C-5''; H-4'' víi C-3'' vµ H-5'' víi C-3'', C-4'' x¸c ®Þnh vÞ trÝ cña çc cacbon cña ph©n tö ®êng.

H×nh V.1.3.3.e. Phæ DEPT cña MN3

106

H×nh V.1.3.3.f. Phæ HSQC cña MN3

Ph©n tÝch ®é dÞch chuyÓn ho¸ häc vµ çc t¬ng t¸c trªn phæ céng hëng tõ h¹t nh©n vµ so s¸nh víi çc tµi liÖu thu ®îc, cÊu tróc cña gèc ®êng ®îc x¸c ®Þnh lµ arabinofuranoside. Do ®ã, cÊu tróc cña MN3 ®îc nhËn d¹ng lµ kaempferol-3-O-α-L-arabinofuranoside, hay cßn ®uîc gäi lµ euglanin hoÆc juglanin62.

H×nh V.1.3.3.g. Phæ HMBC cña MN3

V.1.3.4. Hîp chÊt MN4: Rhoifolin Hîp chÊt MN4 ®îc ph©n lËp tõ ph©n ®o¹n níc cña c©y M. nanus díi d¹ng bét mµu vµng. C«ng thøc ph©n tö ®îc x¸c ®Þnh lµ C27H30O14 b»ng çc sè liÖu phæ khèi ESI-MS (m/z 579 [M+H]+, 601 [M+Na]+ ë positive vµ m/z 577 [M-H]-, ë negative) vµ phæ céng hëng tõ h¹t nh©n. Phæ khèi lîng ESI-MS còng xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña phÇn aglycon cña MN4 ®· bÞ mÊt mét ph©n tö ®êng rhamnose t¹i

107

m/z 433 [M-Rha+H]+ ë chÕ ®é positive vµ t¹i m/z 431 [M-Rha-H]- ë chÕ ®é negative.


Phæ 1H-NMR cña MN4 xuÊt hiÖn cÆp tÝn hiÖu chËp cña bèn proton vßng th¬m thÕ para t¹i δ 6,93 (2H, d, J = 8,5 Hz) vµ 7,93 (2H, d, J = 8,5 Hz), hai tÝn hiÖu cña hai proton thuéc vßng th¬m bÞ thÕ bèn vÞ trÝ t¹i δ 6,79 (d, J = 2,0 Hz) vµ 6,38 (d, J = 2,0 Hz), mét tÝn hiÖu v¹ch ®¬n cña mét proton olefin t¹i δ 6,87. Ngoµi ra, trªn phæ nµy còng quan s¸t thÊy tÝn hiÖu cña çc proton cña 2 gèc ®êng bao gåm hai proton anome t¹i δ 5,22 (d, J = 7,5 Hz) vµ 5,14 (d, J = 1,0 Hz) cïng víi çc tÝn hiÖu cña çc nhãm oximetin (δ 3,20 – 3,71), oximetylen [δ 3,48 (m)/3,71 (m)] vµ metyl [δ 1,20 (d, J = 6,5 Hz)] cña hai gèc ®êng trªn.

O

OOH

O

OH

O

O

OHOHO

H3CHO

HO OH

2

345

6

78

9

10

1'

2'3'

4'

5'6'

1"

2"

3"

6"

1"'

2"'

3"'

6"'

HO

H×nh V.1.3.4.b. CÊu tróc hãa häc cña hîp chÊt MN4

H×nh V.1.3.4.c. Phæ 1H-NMR cña MN4

108


Trªn phæ13C-NMR vµ çc phæ DEPT 90, DEPT 135 còng x¸c nhËn sù cã mÆt cña bèn nhãm metin vßng th¬m bÞ thÕ ®èi xøng para t¹i δ 116,0 vµ 128,6, ba nhãm metin cßn l¹i t¹i δ 94,5, 99,3 vµ 103,1. Bªn c¹nh ®ã ph©n tÝch çc tÝn hiÖu trªn phæ nµy còng ph¸t hiÖn sù cã mÆt cña mét nhãm keton víi sù cã mÆt cña pic t¹i δ 181,9, çc cacbon vßng th¬m g¾n trùc tiÕp víi nguyªn tö «xy t¹i δ 161,1, 161,4, 162,5, 164,3 vµ çc cacbon bËc bèn kh¸c t¹i δ 105,4, 120,9 vµ 157,0. Thªm vµo ®ã çc v¹ch tÝn hiÖu cña hai gèc ®êng còng ®îc thu nhËn trªn phæ nµy. Th«ng qua çc ph©n tÝch t¬ng t¸c trªn phæ 1H- vµ 13C-NMR vµ phæ DEPT cã thÓ nhËn ®Þnh hai ®¬n vÞ ®êng nµy mét lµ glucose vµ mét lµ rhamnose. §Ó x¸c ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña çc nhãm ®êng trªn khung MN4, chóng t«i tiÕn hµnh ®o phæ HSQC vµ HMBC.

H×nh V.1.3.4.e. Phæ DEPT 135 vµ DEPT 90 cña MN4

H×nh V.1.3.4.f. Phæ HSQC cña MN4

109

T¬ng t¸c quan s¸t ®îc trªn phæ HMBC gi÷a proton anome cña ®êng glucose H-1'' (δH 5,22) vµ C-7 (δC 162,5), gi÷a proton anome cña ®êng rhamnose H-3''' (δH 5,14) vµ C-2'' (δC 77,0) cña ®êng glucose chøng tá gèc ®êng liªn kÕt víi khung flavon cña MN4 ë vÞ trÝ C-7 theo thø tù Glc-Rha. Ngoµi ra, mét sè t¬ng t¸c xa H-C kh¸c còng quan s¸t trªn phæ, chi tiÕt c¸c t¬ng t¸c ®îc thÓ hiÖn ë H×nh V.1.3.4.g. B¶ng V.1.3.4. Sè liÖu phæ NMR cña MN4 C #δC a,b δC a,b δH a,c d¹ng pic (J = Hz) HMBC (H → C)

2 164,2 164,3 - 3 103,1 103,1 6,87, s C-2, 4 4 181,8 181,9 - 5 161,1 161,1 - 6 99,6 99,3 6,38, d (2,0) C-7, 8, 10 7 162,6 162,5 - 8 94,7 94,5 6,79, d (2,0) C-6, 7, 10 9 157,9 157,0 - 10 105,6 105,4 - 1' 121,1 120,9 - 2' 128,5 128,6 7,93, d (8,5) C-2, 4', 6' 3' 115,9 116,0 6,93, d (8,5) C-1', 5' 4' 161,4 161,4 - 5' 115,9 116,0 6,93, d (8,5) C-1', 3' 6' 128,5 128,6 7,93, d (8,5) C-2, 2', 4' Glc 1'' 98,6 97,8 5,22, d (7,5) C-7 2'' 77,1 77,0 3,50* 3'' 77,0 76,3 3,51* 4'' 70,6 70,5 3,35* 5'' 77,4 77,2 3,48* 6'' 61,0 60,5 3,48*/3,71* Rha 1''' 100,5 100,5 5,14, d (1,0) C-2'' 2''' 70,2 69,6 3,20* 3''' 70,6 70,4 3,72* 4''' 72,3 71,8 3,21* 5''' 68,6 68,3 3,71* 6''' 18,1 18,0 1,20, d (6,5) C-4''', 5'''

a®o trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz,*tÝn hiÖu bÞ che khuÊt, #sè liÖu phæ NMR

cña rhoifolin63

110

O

OOH

O

OH

O

O

OHOHO

H3CHO

HOOH

HO

H×nh V.1.3.4.g. Mét sè t¬ng t¸c HMBC chÝnh cña MN4

So s¸nh çc sè liÖu phæ cña MN4 víi çc sè liÖu ®· c«ng bè, chóng t«i ®· x¸c ®Þnh ®îc cÊu tróc cña hîp chÊt nµy, ®ã lµ rhoifolin63, hîp chÊt nµy ®· ®îc ph©n lËp tõ loµi Gnocaryum calleryanum, tuy nhiªn, ®©y lµ lÇn ®Çu tiªn nã ®îc ph©n lËp tõ çc loµi thuéc chi Mallotus. V.1.3.5. Hîp chÊt MN5: Kaempferin Hîp chÊt MN5 ®îc ph©n lËp díi d¹ng bét mµu vµng nh¹t. C«ng thøc ph©n tö ®îc nhËn ®Þnh lµ C21H20O10 b»ng çc sè liÖu phæ khèi ESI-MS (m/z 455 [M+Na]+ ë positive vµ 431 [M-H]-, ë negative) vµ phæ céng hëng tõ h¹t nh©n. Phæ khèi lîng ESI-MS còng xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña phÇn aglycon cña MN5 ®· bÞ mÊt mét ph©n tö ®êng rhamnose t¹i m/z 309 [M+Na-Rha]+ ë chÕ ®é positive vµ t¹i m/z 285 [M-H-Rha]- ë chÕ ®é negative.


O

OOH

HO

OH

O

1'2

3

45

6

7

8

9

10

2'3'

4'

5'6'

1" 2"3"

4"

5"

6"

OOH

OH

OH CH3 H×nh V.1.3.5.b. CÊu tróc cña hîp chÊt MN5

H×nh V.1.3.5.c. Phæ ESI-MS negative cña MN5

111

Phæ 1H-NMR cña MN5 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña hai proton cña vßng th¬m bÞ thÕ bèn vÞ trÝ t¹i δ 6,20 (br s) vµ 6,38 (br s), bèn proton cña vßng th¬m bÞ thÕ para t¹i δ 7,76 (2H, d, J = 8,0 Hz) vµ 6,94 (2H, d, J = 8,0 Hz). Ngoµi ra, çc tÝn hiÖu cña mét phÇn tö ®êng còng ®îc x¸c ®Þnh trªn phæ nµy. Trong ®ã, tÝn hiÖu cña mét proton anome xuÊt hiÖn t¹i δ 5,39 (d, J = 1,5 Hz), tÝn hiÖu cña mét nhãm metyl bËc hai t¹i δ 0,94 (d, J = 6,5 Hz) vµ çc tÝn hiÖu cña çc nhãm oximetin xuÊt hiÖn ë vïng δ 3,33 - 4,24.

H×nh V.1.3.5.d. Phæ 1H-NMR cña MN5

Phæ 13C-NMR cña MN5 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 21 cacbon, trong ®ã cã mét nhãm metyl t¹i δ 17,6, mêi mét nhãm metin tõ δ 71,9 ®Õn δ 131,9, mét nhãm cacbonyl t¹i δ 179,5 vµ t¸m cacbon bËc bèn tõ δ 105,7 ®Õn δ 166,6. Nh÷ng tÝn hiÖu trªn gîi ý cho sù cã mÆt cña mét khung flavon d¹ng kaempferol cã g¾n phÇn tö ®êng rhamnose. B¶ng V.1.3.5. Sè liÖu phæ NMR cña MN5

C δC# δC a,b

δH a,c d¹ng pÝc (J = Hz)

2 159,5 158,6 - 3 135,1 136,1 - 4 178,6 179,5 - 5 163,1 161,5 - 6 100,4 100,1 6,20, br s 7 166,4 166,6 - 8 95,2 94,9 6,38, br s 9 158,9 159,1 - 10 105,0 105,7 - 1' 123,0 122,7 - 2' 132,3 131,9 7,76, d (8,0) 3' 116,0 116,5 6,94, d (8,0) 4' 161,5 163,1 - 5' 116,0 116,5 6,94, d (8,0)

112

6' 132,3 131,9 7,76, d (8,0) Rha 1'' 103,5 103,5 5,39, d (1,5) 2'' 72,2 73,2 4,24, dd (1,5, 3,0) 3'' 72,0 72,1 3,73, dd (3,0, 9,0) 4'' 73,3 72,0 3,35, m 5'' 71,9 71,9 3,33, m 6'' 17,6 17,6 0,94, d (6,5)

a®o trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, #δC cña kaempferin64

H×nh V.1.3.5.e. Phæ 13C-NMR cña MN5.

Tõ çc ph©n tÝch nªu trªn, sè liÖu phæ 13C-NMR cña MN5 ®îc so s¸nh víi çc sè liÖu ®· ®îc c«ng bè cho hîp chÊt afzelin64, 65, vµ nhËn ®îc sù phï hîp hoµn toµn t¹i çc vÞ trÝ t¬ng øng (B¶ng V.1.3.5). Do ®ã, hîp chÊt MN5 ®îc x¸c ®Þnh lµ kaempferin hay cßn ®îc gäi lµ afzelin,64,65 mét hîp chÊt ®· ®îc ph©n lËp tõ nhiÒu loµi thùc vËt kh¸c nhau. V.1.3.6. Hîp chÊt MN6: Quercitrin Hîp chÊt MN6 ®îc ph©n lËp díi d¹ng bét mµu vµng. Phæ 1H-NMR cña MN6 cho thÊy sù xuÊt hiÖn 2 tÝn hiÖu cña mét vßng th¬m bÞ thÕ 4 vÞ trÝ t¹i δ 6,25 (d, J = 2,0 Hz) vµ 6,42 (d, J = 2,0 Hz). Çc tÝn hiÖu proton cña vßng th¬m t¬ng t¸c hÖ ABX xuÊt hiÖn t¹i δ 7,35 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 6,96 (d, J = 8,0 Hz) vµ 7,39 (d, J = 2,0 Hz). Thªm vµo ®ã, çc tÝn hiÖu proton cña ®¬n vÞ ®êng xuÊt hiÖn t¹i δ 5,40 (d, J = 1,5 Hz), 4,26 (d, J = 1,5, 3,0 Hz), 3,78 (d, J = 3,0, 9,0 Hz), 3,45 (m), 3,34 (m) vµ 0,99 (d, J = 6,0 Hz) kh¼ng ®Þnh cho sù xuÊt hiÖn cña mét ph©n tö ®êng rhamnose.


113

O

OOH

HO

OH

O

1'2

3

45

6

7

8

9

10

2'3'

4'

5'6'

1" 2"3"

4"

5"

6"

OOH

OH

OH CH3

OH

H×nh V.1.3.6.b. CÊu tróc cña hîp chÊt MN6

H×nh V.1.3.6.c. Phæ ESI-MS negative cña MN6

Ph©n tÝch c¸c d÷ kiÖn phæ thu ®îc vµ so s¸nh víi tµi liÖu ®· c«ng bè, cïng víi kÕt qu¶ phæ khèi lîng ESI-MS t¹i m/z 447 [M-H]- t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C21H20O11 (M = 448), hîp chÊt MN6 ®îc x¸c ®Þnh lµ quercitrin66, mét hîp chÊt rÊt phæ biÕn ë nhiÒu loµi thùc vËt. V.1.3.7. Hîp chÊt MN7: Myricitrin Hîp chÊt MN7 thu ®îc díi d¹ng bét mµu vµng. Phæ 1H-NMR cña MN7 xuÊt hiÖn pic tÝn hiÖu cña hai proton vßng th¬m bÞ thÕ bèn vÞ trÝ t¹i δ 6,18 (d, J = 2,0 Hz) vµ 6,33 (d, J = 2,0 Hz), mét v¹ch tÝn hiÖu chËp cña hai proton ®èi xøng trong vßng th¬m bÞ thÕ bèn vÞ trÝ t¹i δ 6,97 (2H, br s). Trªn phæ nµy còng quan s¸t thÊy tÝn hiÖu cña mét proton anome t¹i δ 5,33 (d, J = 1,0 Hz) vµ c¸c tÝn hiÖu ®Æc trng cho mét ph©n tö ®êng rhamnose t¹i δ 4,24 (dd, J = 1,5, 3,0 Hz), 3,73 (dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 3,35 (dd, J = 6,0, 9,0 Hz), 3,33 (m) vµ 0,94 (d, J = 6,0 Hz).


114

Phæ 13C-NMR cña MN7 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 21 cacbon trong ®ã cã 11 cacbon bËc bèn, 9 nhãm metin vµ 1 nhãm metyl. Ph©n tÝch çc tÝn hiÖu trªn phæ 13C-NMR cho thÊy MN7 còng mang khung cÊu tróc flavon víi sù cã mÆt cña 5 nhãm thÕ hydroxyl.

H×nh V.1.3.7.b. Phæ 13C-NMR cña MN7

§Ó x¸c ®Þnh vÞ trÝ cña çc nhãm thÕ hydroxyl trªn khung flavon, chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®o phæ HSQC vµ HMBC. Çc t¬ng t¸c xa thu nhËn ®îc trªn phæ HMBC gi÷a H-2' vµ H-6' (cÆp tÝn hiÖu chËp t¹i δH 6,97) víi C-2 (δC 159,2), C-1' (δC 121,9), C-3'/C5' (δC 146,9), C-4' (δC 138,0) chøng minh ba nhãm thÕ trªn vßng C n»m ë çc vÞ trÝ para vµ octho cña vßng benzen. Thªm vµo ®ã, gèc ®êng ®îc x¸c ®Þnh g¾n víi vÞ trÝ C-3 cña khung flavon bëi t¬ng t¸c quan s¸t ®îc gi÷a proton anome H-1'' (δH 5,33) vµ C-3 (δC 136,2).

O

OOH

HO

OH

O

1'2

3

45

6

7

8

9

10

2'3'

4'

5'6'

1" 2"3"

4"

5"

6"O

OHOH

OH CH3

OH

OH


H×nh V.1.3.7.d. Phæ HMBC cña MN7

115


C δC # δC a,b δH a,c

d¹ng pic (J = Hz) 2 159,5 159,2 - 3 136,4 136,2 - 4 179,7 179,5 - 5 163,3 163,1 - 6 99,8 100,5 6,18, d (2,0) 7 165,9 167,9 - 8 94,7 95,2 6,33, d (2,0) 9 158,6 158,2 - 10 105,9 105,3 - 1' 122,0 121,9 - 2' 109,6 109,6 6,97, br s 3' 146,9 146,9 - 4' 137,9 138,0 - 5' 146,9 146,9 - 6' 109,6 109,6 6,97, br s Rha 1'' 103,7 103,6 5,33, d (1,5) 2'' 72,1 73,4 4,24, dd (1,5, 3,0) 3'' 72,2 72,1 3,73, dd (3,0, 9,0) 4'' 73,2 72,0 3,35, dd (6,0, 9,0) 5'' 71,9 71,9 3,33, m 6'' 17,8 17,7 0,94, d (6,0)

a®o trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, #δC cña myricitrin66 Phæ khèi lîng phun mï ®iÖn tö ESI-MS cña MN7 xuÊt hiÖn pÝc cã cêng ®é cao t¹i m/z 487 [M+Na]+ ë chÕ ®é positive vµ m/z 463 [M-H]- ë chÕ ®é negative t¬ng øng víi c«ng thøc dù ®o¸n lµ C21H20O12 (M = 464). Phæ ESI-MS bÉy vµ b¾n m¶nh m/z 487 ë positive cho ph©n m¶nh cã cêng ®é cao ë m/z 341 [M+Na-146]+, bÉy vµ b¾n m¶nh m/z 463 ë negative cho ph©n m¶nh cã cêng ®é cao ë m/z 316 [M-H-146]- gîi ý cho sù mÊt mét ph©n tö ®êng rhamnose.

H×nh V.1.3.7.e. Phæ ESI-MS negative cña MN7

116

Cïng víi çc ph©n tÝch trªn phæ céng hëng tõ h¹t nh©n, phæ khèi lîng ESI-MS vµ so s¸nh víi çc sè liÖu trong tµi liÖu (b¶ng V.1.3.7), hîp chÊt MN7 ®îc x¸c ®Þnh lµ myricitrin66, mét flavonoit ®· ®îc ph©n lËp tõ nhiÒu loµi thùc vËt kh¸c nhau. V.1.3.8. Hîp chÊt MN8: Daucosterol Hîp chÊt MN8 ®îc ph©n lËp díi d¹ng bét v« ®Þnh h×nh mµu tr¾ng. Ph©n tÝch çc tÝn hiÖu thu ®îc trªn phæ céng hëng tõ h¹t nh©n 1H- vµ 13C-NMR cho thÊy MN8 mang khung sterol vµ mét gèc ®êng glucose.



O

OHO

HOOH

HO

17

18

19

20

5

24

29

25

27

26

3

1'

3'

5'

6'

21

H×nh V.1.3.8.c. CÊu tróc ho¸ häc cña MN8

Ph©n tÝch chi tiÕt çc d÷ kiÖn phæ vµ so s¸nh víi çc tµi liÖu ®· thu ®îc,67 cho phÐp x¸c ®Þnh hîp chÊt MN8 lµ daucosterol, mét hîp chÊt steroit glucosit rÊt phæ biÕn ë çc loµi thùc vËt.

117

V.1.3.9. Hîp chÊt MN9: Stigmast-5-en-3-O-(6-O-eicosanoyl-D-glucopyranoside) Hîp chÊt MN9 thu ®îc tõ cÆn hexan cña dÞch chiÕt tæng MeOH cña loµi M. nanus díi d¹ng bét mµu tr¾ng ngµ. Phæ 1H-NMR cña MN9 cho thÊy çc v¹ch tÝn hiÖu cña mét nèi ®«i néi vßng t¹i δ 5,36 (t, J = 3,0 Hz), çc tÝn hiÖu chËp cña mét m¹ch dµi gåm nhiÒu nhãm CH2 tõ δ 1,3 ®Õn 2,5, tÝn hiÖu cña mét proton anome t¹i δ 4,37 (d, J = 7,5 Hz), proton oximetylen cña ph©n tö ®êng t¹i δ 4,27 (br d, J = 12,0 Hz)/4,43 (dd, J = 5,0, 12,0 Hz), cïng víi çc tÝn hiÖu cña çc nhãm metyl t¹i δ 0,68, 0,79, 0.80, 0,88, 0,91 vµ 1,00.


Phæ 13C-NMR cña MN9 cho tÝn hiÖu cña 55 cacbon, trong ®ã cã 6 cacbon cña mét gèc ®êng, 29 cacbon cña phÇn aglycon, 1 cacbon cacbonyl vµ çc v¹ch tÝn hiÖu ®Æc trng cho mét m¹ch dµi. So s¸nh çc sè liÖu thu ®îc trªn phæ céng hëng tõ h¹t nh©n cña phÇn aglycon cña MN9 víi çc sè liÖu ®· ®îc c«ng bè67, 68, chóng t«i nhËn ®Þnh r»ng phÇn aglycon cña MN9 lµ khung stigmasterol vµ phÇn gèc ®êng lµ glucose. Nh vËy, cã thÓ nhËn thÊy r»ng MN9 lµ mét dÉn xuÊt cña daucosterol cã mang mét nh¸nh axyl m¹ch dµi. §é chuyÓn dÞch hãa häc cao cña cacbon C-6' cho phÐp dù ®o¸n m¹ch axyl ®îc nèi víi cacbon nµy trªn phÇn gèc ®êng glucose.


118

O

OHO

HOOH

O

O

17

18

19

20

5

24

29

25

27

26

3

1''

16

20''

1'

3'

5'

6'

21



C δC # δC a,b δH a,c

d¹ng pic (J = Hz) 11 37,2 37,3 12 29,4 29,4 13 79,6 79,6 3,47, m 14 38,9 38,9 5,36, d (3,0) 15 140,2 140,3 16 122,1 122,7 17 31,8 31,9 18 31,9 31,9 19 50,1 56,2 20 36,7 36,7 21 21,1 21,1 22 39,7 39,8 23 42,3 43,4 24 56,7 56,7 25 24,3 24,3 26 28,2 28,2 27 56,1 56,1 28 11,9 11,9 0,68, s 29 19,4 19,4 1,00, s 30 36,1 36,1 31 18,8 18,8 0,91, d (6,5) 32 33,9 34,0 33 26,0 26,2 34 45,8 45,8 35 29,2 25,2 36 19,8 19,8 0,79, d (6,0) 37 19,0 19,1 0,79, d (6,0) 38 23,0 23,1 39 12,0 12,0 0,80, d (6,5) Glc

119

1' 101,1 101,2 4,37, d (7,5) 2' 73,5 74,0 3' 75,9 76,9 4' 70,1 73,6 5' 73,9 76,0 6' 63,2 63,3 4,27, br d (12,0)

4,44, dd (5,0, 12,0) FAM 1'' 174,6 2'' 34,2 3'' 24,3 4''-15'' 28,2 - 29,7 16'' 25,0 17'' 29,3 18'' 31,8 19'' 22,7 20'' 14,1 0,88, d (6,5)

a®o trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, #δC cña atroside68

H×nh V.1.3.9.d. Phæ ESI-MS positive cña MN9

Phæ khèi phun mï ®iÖn tö ESI-MS xuÊt hiÖn pic m/z 893 [M+Na]+ (positive) t¬ng øng víi c«ng thøc C55H98O7, phï hîp víi sù cã mÆt cña khung daucosterol vµ mét nh¸nh ester cã m¹ch dµi 20 cacbon. Dùa vµo çc ph©n tÝch nªu trªn vµ so s¸nh víi çc tµi liÖu chóng t«i thu ®îc, cho phÐp kh¼ng ®Þnh MN9 chÝnh lµ stigmast-5-en-3-O-(6-O-eicosanoyl-D-glucopyranoside), mét hîp chÊt ®· ®îc ph©n lËp tõ loµi Stelmatocrypton khasianum69, tuy nhiªn ®©y lµ lÇn ®Çu tiªn nã ®îc ph©n lËp tõ çc loµi thuéc chi Mallotus.

120

Tæng hîp çc chÊt ®· ®îc ph©n lËp tõ c©y ba bÐt lïn Mallotus nanus

OH

OR

OHO

HOHO OH

HO

COOH

1

3

61'

2'3'

4'5'

6'2

45

MN1 - Mallonanoside A,

R = Me (chÊt míi) MN2 - Mallonanoside B,

R = H (chÊt míi)

O

O

OR

HO

OH

OH

2

45

7 9

1'

3'

MN3 - Juglanin, R = α-L-arabifuranoside

MN5 - Kaempferin, R = α-L-rhamnopyranoside

O

OOH

HO

OH

O

1'

2

3456

78

9

10

2'3'

4'

5'6'

1" 2"3"

4"

5"

6"O

OHOH

OH CH3

OH

R

MN6 - Quercitrin, R = H

MN7 - Myricitrin, R = OH

O

OOH

O

OH

O

O

OHOHO

H3CHO

HO OH

2

345

6

78

9

10

1'

2'3'

4'

5'6'

1"

2"

3"

4"

5"

6"

1"'

2"'3"'

4"'

5"'6"'

HO

MN4 - Rhoifolin

O

OHO

HOOH

RO

17

18

19

20

5

24

29

25

27

26

3

1'

3'

5'

6'

21

MN8 - Daucosterol, R = H

MN9 - Stigmast-5-en-3-O-(6-O-eicosanoyl-D-glucopyranoside), R = eicosanoyl

V.1.4. §¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng «xy hãa cña çc hîp chÊt

Ho¹t tÝnh chèng «xy hãa cña çc chÊt ®îc ®¸nh gi¸ b»ng ph¬ng ph¸p ®o kh¶ n¨ng hÊp thô gèc «xy (oxygen radical absorbance capacity - ORAC).70 Mallonanoside A (MN1) thÓ hiÖn ho¹t tÝnh thu dän gèc peroxit m¹nh h¬n mallonanoside B (MN2) (H×nh V.1.4.a). Sù thay thÕ nhãm metoxi cho nhãm OH t¹i vÞ trÝ C-4 cña MN1 cã thÓ gãp phÇn t¹o nªn ho¹t tÝnh thu dän gèc peroxit v× nã thÓ hiÖn kh¶ n¨ng khö m¹nh h¬n so víi MN2 (H×nh V.1.4.b.). Çc hîp chÊt MN3-MN7 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh thu dän gèc peroxit m¹nh h¬n nhiÒu so víi chÊt ®èi chøng d¬ng lµ vitamin E vµ trolox. Ngoµi ra, ho¹t tÝnh cña çc hîp chÊt nµy phô thuéc vµo sè lîng vµ vÞ trÝ cña çc nhãm hydroxit (OH), vÞ trÝ vµ thµnh phÇn çc gèc ®êng trong ph©n tö cña chóng.

121

b

c

aaa

ed

0

5

10

15

1 2 3 4 5 6 7

OR

AC

RO

O· (

Trol

ox E

quiv

alen

ts, μ

M)

c c bc b bc b

a

0

5

10

15

1 2 3 4 5 6 7

OR

AC

OH

· (T

rolo

x E

quiv

alen

ts, μ

M)

H×nh V.1.4.a. Ho¹t tÝnh thu dän gèc peroxit {I} vµ hydroxit {II} (t¬ng quan trolox, µM) cña çc hîp chÊt MN1–MN7. Gi¸ trÞ ORAC ®îc tÝnh b»ng çch chia diÖn tÝch díi ®êng cong cña mÉu thö cho diÖn tÝch díi ®êng cong cña trolox, c¶ hai diÖn tÝch ®îc hiÖu chØnh b»ng çch lo¹i bá phÇn diÖn tÝch díi ®êng cong cña mÉu tr¾ng. Mét ®¬n vÞ ORAC ®îc x¸c ®Þnh b»ng tæng diÖn tÝch b¶o vÖ do trolox t¹o ra ë nång dé cuèi cïng lµ 1 µM. DiÖn tÝch díi ®êng cong mÉu thö ®îc so s¸nh víi diÖn tÝch díi ®êng cong trolox, gi¸ trÞ chèng oxy hãa ®îc biÓu thÞ b»ng sè mol t¬ng ®¬ng trolox trªn lÝt. Gi¸ trÞ biÓu thÞ díi d¹ng mean±S.D cña 3 lÇn thö. Çc ch÷ çi kh¸c nhau thÓ hiÖn møc ®é chªnh lÖch lín víi p<0,05 theo çch tÝnh Duncan. Mallonanoside A thÓ hiÖn ho¹t tÝnh thu dän gèc hydroxit t¬ng ®¬ng víi mallonanoside B, tuy nhiªn mallonanoside B víi nhãm OH ë vÞ trÝ C-4 l¹i thÓ hiÖn ho¹t tÝnh b¾t gi÷ kim lo¹i m¹nh h¬n mallonanoside A víi nhãm metoxi (H×nh V.1.4.b). Ho¹t tÝnh thu dän gèc hydroxit cña çc hîp chÊt MN3-MN7 gÇn nh gièng nhau, ngo¹i trõ rhoifolin (MN4) víi chuçi disaccarit gåm 1 glucose vµ 1 rhamnose ®Ýnh vµo vÞ trÝ C-7. Ngoµi ra, MN4 thÓ hiÖn kh¶ n¨ng b¾t gi÷ kim lo¹i m¹nh nhÊt, theo sau lµ MN7 (myricitrin) víi mét ®¬n vÞ ®êng rhamnose ë C-3 vµ 3 nhãm hydroxit (H×nh V.1.4.b). Çc kÕt qu¶ nµy gîi ý r»ng ho¹t tÝnh thu dän gèc hydroxit cña çc hîp chÊt MN3-MN7 ë ph¬ng ph¸p ORAC cã thÓ do ¶nh hëng tæ hîp cña ho¹t tÝnh thu dän gèc hydroxit vµ kh¶ n¨ng b¾t gi÷ kim lo¹i.

f

g

d c

a

e

b

0

2 0

4 0

6 0

8 0

10 0

1 2 3 4 5 6 7

e

c c

d d

ba

0

2 0

4 0

6 0

8 0

10 0

1 2 3 4 5 6 7

H×nh V.1.4.b. Kh¶ n¨ng khö {I} vµ ho¹t tÝnh b¾t gi÷ kim lo¹i (metal chelating) {II} cña çc hîp chÊt MN1– MN 7. Çc ch÷ çi kh¸c nhau thÓ hiÖn møc ®é chªnh lÖch lín víi p<0,05.

MN1 MN2 MN5 MN3 MN6 MN7 MN4 MN1 MN2 MN5 MN3 MN6 MN7 MN5

{I} {II}

{I} {II}

MN1 MN2 MN5 MN3 MN6 MN7 MN4 MN1 MN2 MN5 MN3 MN6 MN7 MN4

122

V.2. Nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus anisopodus C©y ruèi khÕ (Mallotus anisopodus) lµ c©y gç lín, chiÒu cao cã thÓ lªn ®Õn 15 m, ®êng kÝnh th©n c©y tíi 40 cm. C©y cã vá mµu x¸m vµng; l¸ cã phiÕn bÇu dôc trßn dµi, cã diÖn tÝch 7-12 x 4-8 cm, 2 mÆt cã ®iÓm tiÕt v¸ng, cã l«ng tha, b×a cã r¨ng cã mòi, cuèng dµi 2-3.5 cm kh«ng b»ng nhau mçi cÆp.

Mallotus anisopodus

GiÐ çi dµi 5-15 cm, l¸ ®µi 5 kh«ng b»ng nhau, cao 2 mm; no·n sµo cã l«ng vµng, cao 4.5 mm, cã 3-4 c¹nh nhän, vßi nhuþ 3 dÝnh nhau 1/2. Nang cã 3-4 çnh d¶nh lªn; hét 1, dµi 1 cm. C©y thêng mäc ë rõng b¸n thay l¸, trªn bê kªnh r¹ch hoÆc trªn bïn. Ph©n bè ë ViÖt Nam, Lµo vµ Campuchia.

V.2.1. Ph©n lËp çc hîp chÊt

MÉu l¸ t¬i cña c©y M. anisopodus (10 kg), ®îc röa s¹ch, ph¬i kh« trong bãng r©m, sau ®ã sÊy kh« b»ng tñ sÊy ë nhiÖt ®é 50oC, sau cïng ®em nghiÒn nhá thµnh bét thu ®îc 1,5 kg bét kh«. PhÇn l¸ kh« cña M. anisopodus (1.5 kg) ®îc ®em nghiÒn nhá sau ®ã ®îc chiÕt ng©m víi MeOH ba lÇn. PhÇn dÞch chiÕt ®îc quay kh« díi ¸p suÊt gi¶m ®Ó t¹o thµnh cÆn chiÕt MeOH (200 g). PhÇn cÆn chiÕt sau ®ã ®îc ph©n bè trong níc cÊt vµ ph©n líp víi dung m«i CHCl3 thu ®îc cÆn chiÕt CHCl3 (MAN1) (100 g) vµ cÆn níc (MAN2) (100g).

CÆn MAN1 ®îc tiÕn hµnh s¾c ký qua cét silica gel pha thuËn, röa gi¶i gradient víi hÖ dung m«i n-Hexan:Aceton (0:1~1:0) thu ®îc 3 ph©n ®o¹n lµ MAN11 (40g), MAN12 (30g) vµ MAN13 (25g). Ph©n ®o¹n MAN11 ®îc s¾c ký qua cét pha silica gel pha thuËn víi hÖ dung m«i n-hexan:EtOAc (20:1) thu ®îc hîp chÊt MA6 (20 mg).

CÆn MAN2 ®îc röa gi¶i qua cét DIANION HP-20 b»ng hÖ dung m«i H2O:MeOH lÇn lît víi çc tû lÖ (100:0, 75:25, 50:50, 25:75 vµ 0:100) thu ®îc 3 ph©n ®o¹n MAN21 (12g), MAN22 (43g) vµ MAN23 (15g). Ph©n ®o¹n MAN22 tiÕp tôc ®îc s¾c ký qua cét silica gel pha thuËn víi hÖ dung m«i gradient CHCl3:MeOH (10:1~0:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n MAN22A (3 g), MAN22B (16 g), MAN22C (11 g) vµ MAN22D (12 g).

TiÕn hµnh s¾c ký ph©n ®o¹n MAN22A qua cét pha ®¶o YMC víi hÖ dung m«i MeOH:H2O (1:1) thu ®îc hîp chÊt MA4 (7 mg). Ph©n ®o¹n MAN22B ®îc s¾c ký trªn cét silica gel pha thuËn víi hÖ dung m«i CHCl3:MeOH (5:1) thu ®îc çc hîp chÊt MA5 (10 mg) vµ MA3 (40 mg). S¾c ký cét silica gel pha thuËn ph©n ®o¹n MAN22C víi hÖ dung m«i CHCl3:MeOH:H2O (2:1:0.1) thu ®îc hîp chÊt MA2 (31 mg). Ph©n ®o¹n MAN22D ®îc tiÕn hµnh s¾c ký qua cét pha ®¶o YMC víi hÖ dung

123

m«i röa gi¶i lµ MeOH:H2O (1:5) thu ®îc hîp chÊt MA1 (10 mg). Quy tr×nh chiÕt t¸ch c¸c hîp chÊt ®îc tr×nh bµy ë h×nh V.2.1.

H×nh III.2.1. S¬ ®å chiÕt vµ ph©n lËp c¸c ho¹t chÊt tõ loµi M. anisopodus

Bét l¸ kh« M. anisopodus (1.5 kg)

ChiÕt MeOH

MAN - CÆn MeOH (200g)

Bæ sung níc

Bæ sung CHCl3

MA6 20 mg

MAN22C 11 g

MAN22B 16 g

MAN1: CÆn CHCl3 (100 g) MAN2: CÆn H2O (100 g)

MAN11 40 g

MAN12 30 g

MAN13 25 g

MAN21 12 g

MAN22 43 g

MAN23 15 g

n-He: Ac (1:0 ~ Dianion CC H2O:MeOH (1:0 ~ 0:1)

n-He:EtOAc (20:1)

CHCl3:MeOH (10:1~0:1)

MAN22A 3 g

MAN22D 12 g

MA5 10 mg

MA3 40 mg

MeOH:H2O (1:1)

CHCl3:MeOH

(5:1)

MA1 10 mg

MA4 7 mg

MA2 31 mg

CHCl3:MeOH:H2O (2:1:0.1)

MeOH:H2O

(1:5)

124

V.2.2. H»ng sè vËt lý vµ d÷ kiÖn phæ cña c¸c hîp chÊt V.2.2.1. Hîp chÊt MA1: Anisoposide A (chÊt míi)

Bét mµu tr¾ng, [ ]20Dα : −49,5 (c 1,0, MeOH), ESIMS: m/z 499 [M + Na]+ (positive),

453 [M − Na]− (negative), HRESI-MS: m/z 449,1573 [M + Na]+ (tÝnh to¸n lý thuyÕt cho C19H33O10Na2 449,1570).

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 1,50 (dd, J = 12, 4 Hz, Ha-2), 1,87 (t, J = 12 Hz, Hb-2), 4,04 (tt, J = 12, 4 Hz, H-3), 2,34 (dd, J = 16, 4,5 Hz, Ha-4), 2,02 (dd, J = 16, 9,5 Hz, Hb-4), 2,22 (m, Ha-7), 1,94 (m, Hb-7), 2,00 (m, Ha-8), 1,50 (m, Hb-8), 3,72 (dd, J = 12,5, 6 Hz, H-9), 1,19 (d, J = 6 Hz, H-10), 1,07 (s, H-11), 1,07 (s, H-12), 1,66 (s, H-13), 4,44 (d, J = 8 Hz, H-1'), 3,18 (dd, J = 8, 9 Hz, H-2'), 3,38 (t, J = 9 Hz, H-3'), 3,36 (t, J = 9 Hz, H-1'), 3,50 (m, H-5'), 4,15 (dd, J = 12, 5 Hz, Ha-6') vµ 4,33 (dd, J = 12, 2 Hz, Hb-6'). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 38,75 (C-1), 47,47 (C-2), 73,50 (C-3), 39,76 (C-4), 124,98 (C-5), 138,58 (C-6), 25,52 (C-7), 40,71 (C-8), 69,18 (C-9), 23,21 (C-10), 28,81 (C-11), 30,24 (C-12), 19,99 (C-13), 102,43 (C-1'), 75,13 (C-2'), 77,78 (C-3'), 71,46 (C-4'), 75,91 (C-5') vµ 68,27 (C-6'). V.2.2.2. Hîp chÊt MA2: Anisoposide B (chÊt míi)

Bét mµu tr¾ng, [ ]20Dα : −27,6 (c 1,0, MeOH), ESI-MS: m/z 514,9 [M + Na]+, 493 [M

+ H]+, 413 [M − SO3Na + H + Na]+ (positive), 469 [M − Na]− (negative); HRESI-MS: m/z 515,1541 [M+Na]+ (tÝnh to¸n lý thuyÕt cho C19H33O11SNa2 515,1544). 1H-NMR (500MHz, CD3OD) δppm: 1,57 (dd, J =12, 4 Hz, Ha-2), 1,65 (t, J = 12 Hz, Hb-2), 4,14 (tt, J = 12, 4 Hz, H-3), 1,97 (br d, J = 13 Hz, Ha-4), 1,77 (dd, J = 13,12 Hz, Hb-4), 2,12 (dt, 14, 10 Hz, Ha-7), 1,93 (m, Hb-7), 2,05 (m, Ha-8), 1,48 (m, Hb-8), 4,09 (m, H-9), 1,21 (d, J = 6 Hz, H-10), 0,91 (s, H-11), 1,22 (s, H-12), 1,20 (s, H-13), 4,40 (d, J = 8 Hz, H-1'), 3,16 (dd, J = 8, 9 Hz, H-2'), 3,39 (t, J = 9 Hz, H-3'), 3,40 (t, J = 9 Hz, H-4'), 3,47 (m, H-5'), 4,19 (dd, J = 12, 5 Hz, Ha-6') vµ 4,30 (dd, J = 12, 2 Hz, Hb-6'). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 40,20 (C-1), 44,77 (C-2), 73,69 (C-3), 43,68 (C-4), 78,65 (C-5), 91,00 (C-6), 27,99 (C-7), 36,32 (C-8), 77,90 (C-9), 21,14 (C-10), 28,94 (C-11), 26,22 (C-12), 27,88 (C-13), 102,55 (C-1'), 74,97 (C-2'), 77,65 (C-3'), 71,31 (C-4'), 75,83 (C-5') vµ 68,13 (C-6'). V.2.2.3. Hîp chÊt MA3: Bergenin

Bét mµu tr¾ng, [ ]20Dα : −47,3 (c 1,0, H2O), ESI-MS: m/z 350,9 [M+Na]+ vµ 326,7

[M-H]- (C14H16O9). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 3,70 (m, H-2), 3,46 (t, J = 9,0 Hz, H-3),

3,83 (t, J = 9,0 Hz, H-4), 4,08 (dd, J = 10,5, 9,0 Hz, H-4a), 7,08 (s, H-7), 4,95 (d, J = 10,5 Hz, H-10b), 3,70 (m, Ha-11), 4,04 (d, J = 11,5 Hz, Hb-11) vµ 3,91 (s, 9-OMe).

125

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 83,13 (C-2), 72,00 (C-3), 75,74 (C-4), 81,48 (C-4a), 165,90 (C-6), 119,51 (C-6a), 111,20 (C-7), 152,41 (C-8), 142,38 (C-9), 149,51 (C-10), 117,40 (C-10a), 74,35 (C-10b), 62,79 (C-11) vµ 61,05 (9-OMe). V.2.2.4. Hîp chÊt MA4: Junipetrioloside A ChÊt bét mµu tr¾ng 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 6,99 (d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,77 (d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,86 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6), 4,44 (d, J = 10,0 Hz, H-7), 3,79 (m, H-8), 3,37 (dd, J = 12, 5,0 Hz, Ha-9), 3,44 (dd, J = 12, 2,0 Hz, Hb-9), 3,86 (s, 3-OMe), 4,59 (d, J = 8,0 Hz, H-1'), 3,16 (dd, J = 10,0, 8,0 Hz, H-2'), 3,58 (t, J = 10,0 Hz, H-3'), 3,39 (m, H-4'), 3,47 (m, H-5'), 3,73 (dd, J = 12, 5,0 Hz, Ha-6') vµ 3,91 (d, J = 12, 2,0 Hz, Hb-6'). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 130,25 (C-1), 112,49 (C-2), 149,10 (C-3), 148,15 (C-4), 116,20 (C-5), 122,00 (C-6), 80,35 (C-7), 82,79 (C-8), 62,23 (C-9), 56,58 (3-OMe), 99,91 (C-1'), 80,88 (C-2'), 75,20 (C-3'), 71,99 (C-4'), 79,90 (C-5') vµ 62,70 (C-6'). V.2.2.5. Hîp chÊt MA5: N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide ChÊt bét mµu tr¾ng, ESI-MS m/z 152,6 [M+H]+, 174,5 [M+Na]+ vµ 150,7 [M-H]- (C7H8N2O2). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δppm: 6,38 (d, J = 9,5 Hz, H-3), 7,85 (dd, J = 2,5, 9,5 Hz, H-4), 8,35 (d, J = 2,5 Hz, H-5), 3,46 (s, N-Me) vµ 7,21, 7,69 (s, NH2). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δppm: 161,90 (C-2), 138,10 (C-3), 117,75 (C-4), 112,26 (C-5), 142,36 (C-6), 37,35 (N-Me) vµ 165,24 (CO). V.2.2.6. Hîp chÊt MA6: α-Tocopherol

ChÊt dÇu, [ ]20Dα : +0,6 (c 1,0, CHCl3), ESI-MS: m/z 431,3 [M+H]+ (C29H50O2).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δppm: 2,10 (s, H-1'), 2,16 (s, H-2'), 2,10 (s, H-3'), 1,22 (s, H-4'), 1,50 (m, H-12''), 0,85 (d, J = 6,0 Hz, H-13''), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, H-14''), 0,85 (d, J = 6,0 Hz, H-15'') vµ 0,85 (d, J = 6,0 Hz, H-16''). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 118,49 (C-1), 144,54 (C-2), 121,04 (C-3), 122,62 (C-4), 145,57 (C-4a), 74,53 (C-6), 31,57 (C-7), 20,77 (C-8), 117,36 (C-8a), 11,77 (C-1'), 12,21 (C-2'), 11,27 (C-3'), 23,80 (C-4'), 39,84 (C-''), 21,05 (C-2''), 37,49 (C-3''), 32,72 (C-4''), 37,30 (C-5''), 24,81 (C-6''), 37,46 (C-7''), 32,81 (C-8''), 37,44 (C-9''), 24,45 (C-10''), 39,39 (C-11''), 27,99 (C-12''), 22,63 (C-13''), 19,66 (C-14''), 19,76 (C-15'') vµ 22,72 (C-16''). V.2.3. X¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc c¸c hîp chÊt V.2.3.1. Hîp chÊt MA1: Anisoposide A (chÊt míi) Hîp chÊt MA1 nhËn ®îc díi d¹ng bét mµu tr¾ng. Trªn phæ 1H-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu doublet cña 1 nhãm metyl bËc hai céng hëng t¹i δ 1,19 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-10) vµ 3 nhãm metyl bËc ba t¹i δ 1,07 (6H, s, H-11 vµ H-12) vµ 1,66 (3H, s, H-13). Ngoµi ra, sù xuÊt hiÖn tÝn hiÖu doublet cña 1 proton anome t¹i δ 4,44 víi gi¸ trÞ

126

h»ng sè t¬ng t¸c lín (J = 8,0 Hz) cho thÊy sù cã mÆt cña liªn kÕt ®êng cÊu h×nh β.

H×nh V.2.3.1.a. Phæ 1H-NMR cña MA1

H×nh V.2.3.1.b. Phæ 13C-NMR cña MA1

OH

O

O

NaO3SO

HOHO

OH

5' 2'

3'

4'6'

13

11 12

12

34

5

6

7

89 10

1'

H×nh V.2.3.1.c. CÊu tróc hãa häc cña MA1

Trªn phæ 13C-NMR vµ çc phæ DEPT xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña 19 nguyªn tö cacbon. Çc liªn kÕt gi÷a cacbon víi proton t¬ng øng ®îc x¸c ®Þnh th«ng qua phæ HSQC (b¶ng V.2.3.1). Phæ 13C-NMR cña MA1 ®Æc trng cho mét hîp chÊt megastigmane cã cÊu tróc phÇn aglycon d¹ng megastigman-5-en-3,9-diol,71 víi çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña 4 nhãm metyl t¹i δ 23,21 (C-10), 28,81 (C-11), 30,24 (C-12) vµ 19,99 (C-13); mét nèi ®«i bÞ thÕ hoµn toµn t¹i δ 124.98 (C-5) vµ 138.58 (C-6) vµ 2 nhãm oximetin t¹i δ 73.50 (C-3) vµ 69.18 (C-9). Ngoµi ra, sù xuÊt hiÖn cña mét gèc ®êng glucose ®îc dù ®o¸n bëi çc tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 102,43 (CH, C-1'), 75,13 (CH, C-2'), 77,78 (CH, C-3'), 71,46 (CH, C-4'), 75,91 (CH, C-5') vµ 68,27 (CH2, C-6'). §¸ng chó ý lµ ®é dÞch chuyÓn ho¸ häc cña vÞ trÝ C-6' cao h¬n b×nh thêng (kho¶ng tõ 61 ®Õn 63 ppm), cho phÐp dù ®o¸n cã sù liªn kÕt víi muèi sulfat72.

127

H×nh V.2.3.1.d. Phæ Dept cña hîp chÊt MA1

H×nh V.2.3.1.e. Phæ HSQC cña hîp chÊt MA1

Phæ HMBC ®îc ®o ®Ó ghÐp nèi çc m¶nh cÊu tróc l¹i víi nhau vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña MA1. Trªn phæ HMBC xuÊt hiÖn çc t¬ng t¸c gi÷a δH 1,19/δC 40,71 (C-8), 69,18 (C-9); gi÷a δH 1,07/δC 38,75 (C-1), 47,47 (C-2), 138,58 (C-6); vµ gi÷a δH 1,66/δC 39,76 (C-4), 124,98 (C-4), 138,58 (C-6), cho phÐp x¸c ®Þnh çc vÞ trÝ C-10, C-11, C-12 vµ C-13 cã ®é dÞch chuyÓn ho¸ häc lÇn lît lµ δC 23,21, 28,81, 30,24 vµ 19,99. Ngoµi ra trªn phæ còng xuÊt hiÖn t¬ng t¸c xa gi÷a proton anome δH 4,44 vµ C-3 (δC 73,50), do ®ã nh¸nh ®êng β-glucopyranoside liªn kÕt víi aglycon th«ng qua nhãm hydroxy t¹i vÞ trÝ C-3.

H×nh V.2.3.1.f. Phæ HMBC cña hîp chÊt MA1

128

B¶ng V.2.3.1. KÕt qu¶ phæ NMR cña hîp chÊt MA1

C δC δCa,b Dept δH

a,c (d¹ng pic, J = Hz)

HMBC (H → C)

Aglycon # 1 38,8 38,75 C - 2 47,5 47,47 CH2 1,50 (dd, 4,0, 12,0)

1,87 (t, 12,0) 3, 4, 11, 12

3 73,3 73,50 CH 4,04 (tt, 4,0, 12,0) 4 39,8 39,76 CH2 2,02 (dd, 9,5, 16,0)

2,34 (dd, 4,5, 16,0) 2, 3, 5, 6, 13

5 125,1 124,98 C - 6 138,5 138,58 C - 7 25,6 25,52 CH2 1,94 (m)

2,22 (m) 5, 6, 8

8 40,8 40,71 CH2 1,50 (m) 9 69,2 69,18 CH 3,72 (dd, 6,0, 12,5) 7 10 23,3 23,21 CH3 1,19, d (6,0) 8, 9 11 28,8 28,81 CH3 1,07 (s) 1, 2, 12 12 30,3 30,24 CH3 1,07 (s) 1, 2, 6, 11 13 20,1 19,99 CH3 1,66 (s) 4, 5, 6 Glucose ## 1' 105,0 102,43 CH 4,44 (d, 8,0) 3 2' 74,8 75,13 CH 3,18 (dd, 8,0, 9,0) 1', 3' 3' 77,3 77,78 CH 3,38 (t, 9,0) 4' 4' 70,7 71,46 CH 3,36 (t, 9,0) 5' 76,3 75,91 CH 3,50 (m) 4' 6' 67,1 68,27 CH2 4,15 (dd, 5,5, 12,0)

4,33 (dd, 2,0, 12,0) 4', 5'

a§o trong CD3OD, b125 MHz, c500MHz, #sè liÖu tham kh¶o phÇn aglycon cña hîp chÊt linarionoside A,71 ##sè liÖu tham kh¶o phÇn ®êng cña hîp chÊt bacopaside I72. *TÝn hiÖu bÞ che lÊp

H×nh V.2.3.1.g. Phæ COSY cña hîp chÊt MA1

129

Phæ 1H-1H COSY ®îc thùc hiÖn ®Ó x¸c ®Þnh t¬ng t¸c gi÷a çc proton thuéc çc cacbon c¹nh nhau, qua ®ã gióp x¸c ®Þnh chÝnh x¸c çc vÞ trÝ. Chi tiÕt t¬ng t¸c trªn phæ COSY ®îc tr×nh bµy trªn h×nh V.2.3.1.h.

OH

O

O

NaO3SO

HOHO

OH H×nh V.2.3.1.h. Çc t¬ng t¸c HMBC vµ COSY chÝnh cña MA1

H×nh V.2.3.1.i. Phæ ESI-MS cña hîp chÊt MA1

H×nh V.2.3.1.j. Phæ HR-FAB-MS cña hîp chÊt MA1

Trªn phæ khèi lîng ESI xuÊt hiÖn tÝn hiÖu ion bÒn t¹i m/z 499,0 [M+Na]+ t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C19H33NaO10S. §iÒu nµy ®îc kh¼ng ®Þnh bëi kÕt qu¶ phæ khèi lîng ph©n gi¶i cao HR-FAB-MS t¹i m/z 499,1573 [M+Na]+ (tÝnh to¸n lý thuyÕt cho c«ng thøc C19H33Na2O10S lµ 499,1570). Tõ çc kÕt qu¶ trªn kÕt hîp cïng víi sù so s¸nh gi÷a sè liÖu phæ NMR cña hîp chÊt MA1 víi çc sè liÖu t¬ng øng cña hîp chÊt linarionoside A71 vµ bacopaside I,72 cho phÐp x¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña hîp chÊt MA1 lµ muèi natri cña (3S)-megastigman-5-en-3,9-diol 3-O-(6-O-

130

sulphonyl-β-D-glucopyranoside). §©y lµ hîp chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp tõ thiªn nhiªn vµ ®îc chóng t«i ®Æt tªn lµ anisoposide A. V.2.3.2. Hîp chÊt MA2: Anisoposide B (chÊt míi) Hîp chÊt MA2 còng ®îc ph©n lËp díi d¹ng chÊt bét mµu tr¾ng. C«ng thøc ph©n tö cña nã ®îc x¸c ®Þnh lµ C19H33O11SNa b»ng kÕt qu¶ phæ khèi lîng ESI-MS t¹i m/z 515 [M+Na]+, 493 [M +H]+ vµ 469 [M−Na]− (negative), vµ ®îc kh¼ng ®Þnh b»ng kÕt qu¶ phæ khèi lîng ph©n gi¶i cao HR-FAB-MS (t¹i m/z 515,1541 [M + Na]+, tÝnh to¸n lý thuyÕt cho c«ng thøc C19H33O11SNa2 515,1544).

H×nh V.2.3.2.a. Phæ ESI-MS cña MA2

O

O

NaO3SO

HOHO

OHOH

O

12

34

5

67

8

9

10

1'

5'

2'3'

4'

6'

13

11 12

H×nh V.2.3.2.b. CÊu tróc hãa häc cña MA2

Trªn phæ 1H-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 4 nhãm metyl bao gåm tÝn hiÖu 1 nhãm metyl bËc hai céng hëng t¹i δ 1,20 (d, J = 6,5 Hz) vµ c¸c tÝn hiÖu singlet cña 3 nhãm metyl bËc ba t¹i δ 0,91, 1,20 vµ 1,22. Trªn phæ cßn xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 1 proton anome t¹i δ 4.40 (d, J = 7,5 Hz) cho thÊy sù cã mÆt cña liªn kÕt ®êng cÊu h×nh β.

H×nh V.2.3.2.c. Phæ HR-FAB-MS cña MA2

131

H×nh V.2.3.2.d. Phæ 1H-NMR cña MA2

H×nh V.2.3.2.e. Phæ 13C-NMR cña MA2

H×nh V.2.3.2.f. Phæ 13C-NMR vµ DEPT cña MA2

B¶ng V.2.3.2. KÕt qu¶ phæ NMR cña MA2 C δC

# δCa,b Dept δH

a,c (d¹ng pic, J = Hz) HMBC (H → C) Agl

1 39,5 40,20 C - 2 44,8 44,77 CH2 1,57 (dd, 12, 4)

1,65 (t, 12)

3 72,4 73,69 CH 4,14 (tt, 12, 4) 4 44,0 43,68 CH2 1,97 (br d, 13)

1,77 (dd, 13,12)

132

5 77,4 78,65 C - 6 90,2 91,00 C - 7 27,5 27,99 CH2 2,12 (dt, 14, 10)

1,93 (m)

8 35,6 36,32 CH2 2,05 (m) 1,48 (m)

9 76,7 77,90 CH 4,09 (m) 6 10 21,2 21,14 CH3 1,21 (d, 6) 8, 9 11 28,7 28,94 CH3 0,91 (s) 1, 2, 6, 12 12 26,2 26,22 CH3 1,22 (s) 1, 2, 6, 11 13 28,1 27,88 CH3 1,20 (s) 4, 5, 6 Glu 1' 102,6 102,55 CH 4,40 (d, 8) 3 2' 75,3 74,97 CH 3,16 (dd, 8, 9) 3' 78,6 77,65 CH 3,39 (t, 9) 4' 71,7 71,31 CH 3,40 (t, 9) 5' 78,1 75,83 CH 3,47 (m) 6' 62,8 68,13 CH2 4,19 (dd, 12, 5) 4,30

(dd, 12, 2)

a§o trong CD3OD, b125 MHz, c500MHz, #δC cña scorospiroside73

H×nh V.2.3.2.g. Phæ HSQC cña hîp chÊt MA2

Trªn phæ 13C-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 19 cacbon trong ®ã cã 3 cacbon bËc bèn, 7 nhãm metin, 5 nhãm metylen vµ 4 nhãm metyl ®îc x¸c nhËn b»ng c¸c phæ DEPT. Trong ®ã xuÊt hiÖn c¸c tÝn hiÖu cña 4 nhãm metyl t¹i δ 21,14 (C-10), 26,22 (C-12), 27,88 (C-13) vµ 28,94 (C-11), 2 cacbon bËc bèn mang oxy t¹i δ 78,65 (C-5) vµ 91,00 (C-6) vµ 2 nhãm oximetin t¹i δ 73,69 (C-3) vµ 77,90 (C-9).

133

H×nh V.2.3.2.h. Phæ HMBC cña hîp chÊt MA2

OHH

OO

OHHO

HO

NaO3SO

O

H

Ha

Hb

H H×nh V.2.3.2.i. Çc t¬ng t¸c HMBC chÝnh cña hîp chÊt MA2

Sè liÖu phæ NMR cña MA2 hoµn toµn t¬ng tù nh çc sè liÖu t¬ng øng cña scorospiroside. Sù kh¸c biÖt dÔ nhËn thÊy nhÊt lµ sù t¨ng m¹nh gi¸ trÞ ®é chuyÓn dÞch hãa häc t¹i vÞ trÝ C-6' cña MA2 (δ 68,13) so víi gi¸ trÞ nµy cña scorospiroside (δ 62.8)73. Sù thay ®æi nµy minh chøng cho sù xuÊt hiÖn cña gèc muèi natri sulfat t¹i vÞ trÝ C-6' cña ®¬n vÞ ®êng glucose trong ph©n tö cña MA272. Tõ tÊt c¶ çc d÷ kiÖn ®· nªu, cïng víi kÕt qu¶ ph©n tÝch chi tiÕt çc t¬ng t¸c xa H-C trªn phæ HMBC (h×nh V.2.3.2.i), cÊu tróc hãa häc cña MA2 ®îc x¸c ®Þnh lµ muèi natri cña scorospiroside, ®©y lµ mét hîp chÊt míi vµ ®îc chóng t«i ®Æt tªn lµ anisoposide B. V.2.3.3. Hîp chÊt MA3: Bergenin Hîp chÊt MA3 thu ®îc ë d¹ng bét mµu tr¾ng. Trªn phæ 1H-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu singlet cña 1 proton th¬m t¹i δ 7.08, ®iÒu nµy cho thÊy cã 1 vßng th¬m bÞ thÕ 5 vÞ trÝ trong cÊu tróc ph©n tö cña MA3. Ngoµi ra, sù xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 1 proton ë δ 4.95 (d, J =10.5 Hz) gîi ý mét ®¬n vÞ ®êng g¾n trùc tiÕp víi çc cÊu tö kh¸c qua nguyªn tö cacbon60 vµ 1 tÝn hiÖu singlet cña mét nhãm metoxi t¹i δ 3.91.

134

H×nh V.2.3.3.a. Phæ 1H-NMR cña MA3

H×nh V.2.3.3.b. Phæ 13C-NMR cña MA3

O

O

HO

OCH3

OH

O

HO

HOHO

23

11

4 4a 10b

6

6a

710a

89

10

H×nh V.2.3.3.c. CÊu tróc hãa häc cña MA3

Trªn phæ 13C-NMR vµ DEPT xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 6 cacbon bËc bèn, 6 nhãm metin, 1 nhãm metylen vµ 1 nhãm metyl. Phæ 13C-NMR x¸c nhËn tÝn hiÖu cña 1 cacbon cacboxyl t¹i δ 165,90 (C-6), 3 cacbon bËc bèn mang oxy t¹i δ 152,41 (C-8), 142,38 (C-9) vµ 149,51 (C-10) vµ 2 cacbon bËc bèn thuéc vßng th¬m ë δ 119,51 (C-6a) vµ 117,40 (C-10a) cïng víi tÝn hiÖu cña 1 nhãm metin th¬m ë δ 111,20 (C-7), ®iÒu nµy x¸c nhËn sù cã mÆt cña 1 vßng th¬m bÞ thÕ 5 vÞ trÝ. Ngoµi ra trªn phæ 13C-NMR xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña çc nhãm oximetin t¹i δ 83,13 (C-2), 72,00 (C-3), 75,74 (C-4), 81,48 (C-4a) vµ 74,35 (C-10b) cho thÊy ®¬n vÞ ®êng ®· t¹o liªn kÕt trùc tiÕp víi aglycon ë vÞ trÝ C-1, do ®ã ®é dÞch chuyÓn ho¸ häc cña cacbon nµy ®· bÞ gi¶m xuèng ®¸ng kÓ so víi çc ®¬n vÞ ®êng liªn kÕt víi aglycon qua cÇu oxy. H¬n n÷a, trªn phæ còng x¸c nhËn tÝn hiÖu cña 1 nhãm metoxi t¹i δ 61,05, vµ 1 nhãm oximetylen t¹i δ 62,79 (C-11).

135

H×nh V.2.3.3.d. Phæ 13C-NMR vµ DEPT cña MA3

B¶ng V.2.3.3. KÕt qu¶ phæ NMR cña MA3

Carbon δC# δC

a,b Dept δHa,c (mult., J in Hz)

2 82,3 83,13 CH 3,70 (m) 3 71,3 72,00 CH 3,46 (t, 9,0) 4 74,7 75,74 CH 3,83 (t, 9,0) 4a 80,7 81,48 CH 4,08 (dd, 10,5, 9,0) 6 165,2 165,90 C - 6a 118,9 119,51 C - 7 110,6 111,20 CH 7,08 (s) 8 151,7 152,41 C - 9 141,7 142,38 C - 10 149,0 149,51 C - 10a 116,9 117,40 C - 10b 73,4 74,35 CH 4,95 (d, 10,5) 11 62,0 62,79 CH2 3,70 (m); 4,04 (d, 11,5) 9-OMe 60,8 61,05 CH3 3,91 (s)

a§o trong CD3OD, b125 MHz, c500MHz, #δC cña bergenin74 C«ng thøc ph©n tö cña MA3 ®îc x¸c ®Þnh lµ C14H16O9 th«ng qua tÝn hiÖu m/z 350,9 [M+Na]+ vµ 326,7 [M-H]- xuÊt hiÖn trªn phæ khèi lîng ESI. So s¸nh sè liÖu phæ NMR cña hîp chÊt MA3 víi çc sè liÖu t¬ng øng cña hîp chÊt bergenin74 cho thÊy kÕt qu¶ hoµn toµn phï hîp, kÕt hîp víi çc dÉn chøng trªn cã thÓ x¸c ®Þnh hîp chÊt MA3 lµ bergenin. §©y lµ mét hîp chÊt kh¸ phæ biÕn ë çc loµi Mallotus.

H×nh V.2.3.3.e. Phæ ESI-MS positive vµ negative cña MA3

136

V.2.3.4. Hîp chÊt MA4: Junipetrioloside A Hîp chÊt MA4 thu ®îc ë d¹ng bét mµu tr¾ng. Trªn phæ 1H-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 3 proton cña vßng th¬m cã hÖ t¬ng t¸c ABX [δ 6,99 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,86 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz) vµ 6,77 (1H, d, J = 8,0 Hz)], cïng víi tÝn hiÖu cña çc nhãm oximetin vµ oximetilen t¹i δ 4,44 (1H, d, J = 10 Hz), 3,79 (1H, m), 3,37 (1H, dd, J = 12,0, 5.0 Hz) vµ 3,44 (1H, dd, J = 12,0, 2,0 Hz). Ngoµi ra, trªn phæ 1H-NMR cßn xuÊt hiÖn 1 tÝn hiÖu proton anome t¹i δ 4.59 (1H, d, J = 8,0 Hz) cho thÊy trong cÊu tróc cã mét ®¬n vÞ ®êng, vµ tÝn hiÖu singlet cña 1 nhãm metoxi t¹i δ 3,86.

H×nh V.2.3.4.a. Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt MA4

O

CH2OH

O

OH

HO

O

CH2OH

OMe

OH

6'

1 3

6

7

8

9

1'4'

H×nh V.2.3.4.b. CÊu tróc hãa häc cña hîp chÊt MA4

Trªn phæ 13C-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 2 cacbon bËc bèn mang oxy thuéc vßng th¬m [δ 149,10 (C-3) vµ 148,15 (C-4)] vµ 1 cabon bËc bèn cña vßng th¬m t¹i δ 130,25 (C-1) cïng víi tÝn hiÖu cña 3 nhãm metin th¬m t¹i δ 112,49 (C-2), 116,20 (C-5) vµ 122,00 (C-6), ®iÒu nµy x¸c nhËn sù cã mÆt cña 1 vßng th¬m bÞ thÕ 3 vÞ trÝ cã hÖ t¬ng t¸c ABX. Sù cã mÆt cña chuçi propan ®îc x¸c nhËn th«ng qua çc tÝn hiÖu gåm 2 nhãm oximetin [δ 80,35 (C-7) vµ 82,79 (C-8)] vµ 1 nhãm oximetylen t¹i δ 62,23 (C-9). Ngoµi ra, sù xuÊt hiÖn cña çc nhãm oximetin [δ 75,20 (C-3'), 71,99 (C-4'), 79,90 (C-5')] vµ oximetilen t¹i δ 62,70 (C-6'), kÕt hîp víi sè liÖu trªn phæ 1H-NMR x¸c nhËn sù cã mÆt cña 1 ®êng β-glucopyranoside. Cã thÓ dÔ dµng nhËn ra ®é dÞch chuyÓn ho¸ häc cña vÞ trÝ C-1' (δ 99,91) vµ C-3' (δ 75,20) thÊp h¬n vµ vÞ trÝ C-2' (δ 80,88) cao h¬n thêng lÖ, sù thay ®æi nµy cã thÓ lµ kÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh thÕ ë vÞ trÝ C-2'. Sù xuÊt hiÖn cña nhãm metoxi ë δ 55,58 ®îc x¸c nhËn trªn phæ 13C-NMR. Çc liªn kÕt gi÷a cacbon víi proton t¬ng øng ®îc x¸c ®Þnh th«ng qua phæ HSQC.

137

H×nh V.2.3.4.c. Phæ 13C-NMR cña MA4


C δC# δC

a,b Dept δHa,c (d¹ng pic, J = Hz)

HMBC (H → C)

1 130,1 130,25 C - 2 112,5 112,49 CH 6,99 (d, 2,0) 6, 4 3 149,0 149,10 C - 4 148,0 148,15 C - 5 116,1 116,20 CH 6,77 (d, 8,0) 1, 3 6 121,9 122,00 CH 6,86 (dd, 8,0, 2,0) 2, 4, 7 7 80,2 80,35 CH 4,44 (d, 10,0) 1, 2, 8 8 82,7 82,79 CH 3,79 (m) 9 62,1 62,23 CH2 3,37 (dd, 12, 5,0)

3,44 (dd, 12, 2,0) 7

3-OMe 56,5 56,58 CH3 3,86 (s) 3 1' 99,8 99,91 CH 4,59 (d, 8,0) 2' 2' 80,8 80,88 CH 3,16 (dd, 10,0, 8,0) 3', 1' 3' 75,1 75,20 CH 3,58 (t, 10,0) 2' 4' 71,9 71,99 CH 3,39 (m) 2' 5' 79,8 79,90 CH 3,47 (m) 6' 62,6 62,70 CH2 3,73 (dd, 12, 5,0)

3,91 (dd, 12, 2,0)

a§o trong CD3OD, b125 MHz, c500MHz, #δC cña hîp chÊt junipetrioloside A75

H×nh V.2.3.4.d. Phæ HSQC cña MA4

138

Trªn phæ HMBC xuÊt hiÖn c¸c tÝn hiÖu t¬ng t¸c gi÷a H-7 (δH 4,44) víi C-1, C-2 vµ C-8 x¸c nhËn chuçi propan liªn kÕt ë vÞ trÝ C-1; t¬ng t¸c gi÷a H-9 (δH 3,37/3,44) vµ C-7 kh¼ng ®Þnh vÞ trÝ cña nhãm oximetilen C-9 (δc 62,23); vµ t¬ng t¸c gi÷a proton metoxi (δH 3,86) vµ C-3 kh¼ng ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña nhãm metoxi t¹i cacbon nµy.

H×nh V.2.3.4.e. Phæ HMBC cña MA4

Nh÷ng ph©n tÝch nªu trªn cïng víi sù phï hîp hoµn toµn vÒ sè liÖu phæ NMR cña hîp chÊt MA4 so víi c¸c sè liÖu t¬ng øng ®· ®îc c«ng bè cña hîp chÊt junipetrioloside A (B¶ng V.2.3.4)75, cho phÐp x¸c ®Þnh hîp chÊt MA4 lµ junipetrioloside A. Hîp chÊt nµy ®· ®îc ph©n lËp tõ loµi Juniperus phoenicea. Tuy nhiªn, ®©y lµ lÇn ®Çu tiªn hîp chÊt nµy ®îc ph©n lËp tõ loµi M. anisopodus. V.2.3.5. Hîp chÊt MA5: N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide Hîp chÊt MA5 thu ®îc ë d¹ng bét mµu tr¾ng. Trªn phæ 1H-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 3 proton thuéc hÖ t¬ng t¸c ABX céng hëng t¹i δ 6,38 (d, J = 9,5 Hz), 7,85 (dd, J = 2,5, 9,5 Hz) vµ 8,35 (d, J = 2,5 Hz) cïng víi 2 tÝn hiÖu singlet cña 2 proton liªn kÕt víi nit¬ t¹i δ 7,21 vµ 7,69. Ngoµi ra phæ 1H-NMR còng x¸c nhËn tÝn hiÖu singlet cña 1 nhãm metyl t¹i δ 3,46.

H×nh V.2.3.5.a. Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt MA5

139

N

O

NH2

O 2

3

4

6

5

H×nh V.2.3.5.b. CÊu tróc hãa häc cña hîp chÊt MA5

Phæ 13C-NMR x¸c nhËn tÝn hiÖu cña 2 cacbon cacbonyl t¹i δ 161,90 (C-2) vµ 165,24, ®iÒu nµy cho thÊy 2 nhãm cacbonyl nµy cã thÓ liªn kÕt víi nguyªn tö nit¬. Ngoµi ra trªn phæ còng xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 1 cacbon bËc bèn ë δ 112,26 (C-5), 3 nhãm metin cña vßng th¬m trong ®ã nhãm metin t¹i δ 142,36 (C-6) cã thÓ liªn kÕt víi nit¬, vµ 2 nhãm metin kh¸c t¹i δ 138,1 (C-3), 117,75 (C-4) cïng víi 1 nhãm metyl liªn kÕt víi nit¬ t¹i δ 37,35. B¶ng V.2.3.5. KÕt qu¶ phæ NMR cña MA5

C δC# δC

d,b Dept δHd,c (d¹ng pic, J = Hz)

2 162,52 161,90 C - 3 138,74 138,10 CH 6,38 (d, 9,5) 4 118,38 117,75 CH 7,85 (dd, 2,5, 9,5) 5 112,87 112,26 C - 6 143,09 142,36 CH 8,35 (d, 2,5) N-Me 39,67 37,35 CH3 3,46 (s) 5-CO 165,86 165,24 C - NH2 7,21 (s)

7,69 (s) d§o trong DMSO-d6,

b125 MHz, c500MHz, #δC cña hîp chÊt N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide76

H×nh V.2.3.5.c. Phæ 13C-NMR cña MA5

C«ng thøc ph©n tö cña MA5 ®îc x¸c ®Þnh lµ C7H8N2O2 bëi sù xuÊt hiÖn cña c¸c pic ion t¹i m/z 152,6 [M+H]+, 174,5 [M+Na]+ vµ 150,7 [M-H]- trªn phæ khèi lîng ESI, ®iÒu nµy còng phï hîp víi c¸c ph©n tÝch phæ NMR ë trªn.

140

H×nh V.2.3.5.d. Phæ ESI-MS cña hîp chÊt MA5 Dùa vµo nh÷ng dÉn chøng trªn kÕt hîp víi sù phï hîp hoµn toµn khi so s¸nh sè liÖu phæ NMR cña hîp chÊt MA5 víi c¸c sè liÖu cña hîp chÊt N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (B¶ng V.2.3.5)76, hîp chÊt MA5 ®îc x¸c ®Þnh lµ N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide. V.2.3.6. Hîp chÊt MA6: α-Tocopherol Hîp chÊt MA6 thu ®îc ë d¹ng dÇu ®Æc, kh«ng mµu. Trªn phæ 1H-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 1 nhãm isopropyl [δ 1,50 (1H, m) vµ 0.85 (6H, d, J = 6,0 Hz)], 2 tÝn hiÖu cña 2 nhãm metyl bËc hai t¹i δ 0.84 (d, J = 6,5 Hz) vµ 0,85 (d, J = 6,0 Hz) cïng víi 4 tÝn hiÖu singlet cña 4 nhãm metyl bËc ba trong ®ã cã 3 nhãm thuéc vßng th¬m ë δ 2,10 (6H), 2,16 (3H) vµ 1,22 (3H).

O

HO 12

34

8a

4a

87

6

1'

2'

3'

1"

2"

3"4"

5"

6"

7"8"

15"14"

9"

10"

11"

12"

13"

16"4'

H×nh V.2.3.6.a. CÊu tróc hãa häc cña MA6

H×nh V.2.3.6.b. Phæ 1H-NMR cña MA6

H×nh V.2.3.6.c. Phæ Dept cña MA6

141

Trªn phæ 13C-NMR vµ çc phæ DEPT xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 7 cacbon bËc bèn, 3 nhãm metin, 11 nhãm metylen vµ 8 nhãm metyl. Trªn phæ 13C-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 6 cacbon bËc bèn thuéc 1 vßng th¬m bÞ thÕ hoµn toµn trong ®ã cã 2 cacbon bËc bèn mang oxy [δ 144,54 (C-2) vµ 145,57 (C-4a)] vµ 4 cacbon bËc bèn kh¸c [δ 118,49 (C-1), 121,04 (C-3), 122,62 (C-4) vµ 117,36 (C-8a)], vµ 1 tÝn hiÖu cacbon bËc bèn mang oxy t¹i δ 74,53 (C-6). Phæ nµy còng x¸c nhËn tÝn hiÖu cña 1 nhãm isopropyl [δ 27,99 (C-12''), 22,63 (C-13'') vµ 22,72 (C-16'')], 3 nhãm metyl liªn kÕt víi vßng th¬m [δ 11,77 (C-1'), 12,21 (C-2') vµ 11,27 (C-3')] vµ tÝn hiÖu cña 3 nhãm metyl kh¸c t¹i [δ 23, 80 (C-4'), 19,66 (C-14'') vµ 19,76 (C-15'')].

H×nh V.2.3.6.d. Phæ 13C-NMR cña MA6

H×nh V.2.3.6.e. Phæ HSQC cña MA6

Çc liªn kÕt gi÷a cacbon víi proton t¬ng øng ®îc x¸c ®Þnh th«ng qua phæ HSQC. Trªn phæ HMBC xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu t¬ng t¸c δH 2,10/ C-1, C-2 vµ C-8a; δH 2,16/ C-2, C-3 vµ C-4; δH 2,10/ C-3, C-4 vµ C-4a cho thÊy çc vÞ trÝ C-1', C-2' vµ C-3' cã ®é dÞch chuyÓn ho¸ häc lÇn lît ë δC 11,77, 12.21 vµ 11.27. Ngoµi ra trªn phæ còng xuÊt hiÖn çc t¬ng t¸c xa gi÷a δH 1,22/ C-7, C-7 vµ C-1''; 0,85/ C-8'', C-11'', C-12'' vµ C-13''; vµ gi÷a δH 0,84/ C-4'' suy ra çc tÝn hiÖu δC 23,80, 22,63, 19,66, 19,76 vµ 22,72 lµ cña lÇn lît çc vÞ trÝ C-4', C-13'', C-14'', C-15'' vµ C-16''.

142


C δC# δC

e,b DEPT δHe,c

(d¹ng pic, J = Hz) HMBC (H → C)

1 118,5 118,49 C - 2 144,5 144,54 C - 3 121,0 121,04 C - 4 122,6 122,62 C - 4a 145,5 145,57 C - 6 74,5 74,53 C - 7 31,5 31,57 CH2 - 8 20,8 20,77 CH2 - 8a 117,4 117,36 C - 1' 11,8 11,77 CH3 2,10 (s) 1, 2, 8a 2' 12,2 12,21 CH3 2,16 (s) 2, 3, 4 3' 11,3 11,27 CH3 2,10 (s) 3, 4, 4a 4' 23,8 23,80 CH3 1,22 (s) 6, 7, 1'' 1'' 39,8 39,84 CH2 2'' 21,0 21,05 CH2 3'' 37,5 37,49 CH2 4'' 32,7 32,72 CH 5'' 37,3 37,30 CH2 6'' 24,8 24,81 CH2 7'' 37,4 37,46 CH2 8'' 32,8 32,81 CH 9'' 37,4 37,44 CH2 10'' 24,5 24,45 CH2 11'' 39,4 39,39 CH2 12'' 28,0 27,99 CH 1,50 (m) 13'' 22,6 22,63 CH3 0,85 (d, 6,0) 11'', 12'', 16'' 14'' 19,7 19,66 CH3 0,84 (d, 6,5) 4'' 15'' 19,8 19,76 CH3 0,85 (d, 6,0) 8'' 16'' 22,7 22,72 CH3 0,85 (d, 6,0) 11'', 12'', 13''

e§o trong CDCl3, b125 MHz, c500MHz, #δC cña hîp chÊt α-tocopherol77

H×nh V.2.3.6.f. Phæ HMBC cña MA6

143

C«ng thøc ph©n tö cña MAN2B ®îc x¸c ®Þnh lµ C29H50O2 b»ng pic ion t¹i m/z 431,3 [M+H]+ xuÊt hiÖn trªn phæ khèi lîng ESI.

H×nh V.2.3.6.g. Phæ ESI-MS cña MA6

Tõ nh÷ng dÉn chøng trªn cïng víi sù phï hîp hoµn toµn khi so s¸nh sè liÖu phæ NMR cña hîp chÊt MA6 víi çc sè liÖu t¬ng øng cña hîp chÊt α-tocopherol (B¶ng V.2.3.6),77 cho phÐp x¸c ®Þnh hîp chÊt MA6 lµ α-tocopherol. §©y lµ hîp chÊt rÊt phæ biÕn trong thùc vËt, cã t¸c dông chèng oxy ho¸ cao vµ ®îc dïng lµm chÊt chuÈn d¬ng trong nhiÒu ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng «xy hãa in vitro. Ngoµi ra, hîp chÊt nµy cßn cã t¸c dông b¶o vÖ tÕ bµo khái tæn th¬ng do oxy ho¸ g©y ra vµ cã kh¶ n¨ng kh¸ng khuÈn.

Tæng hîp çc chÊt ®· ®îc ph©n lËp tõ c©y ruèi khÕ Mallotus anisopodus78

OH

O

O

NaO3SO

HOHO

OH

5' 2'

3'

4'6'

13

11 12

12

34

5

6

7

89 10

1'

MA1: Anisoposide A (chÊt míi)

O

O

NaO3SO

HOHO

OHOH

O

12

34

5

67

8

9

10

1'

5'

2'3'

4'

6'

13

11 12

MA2: Anisoposide B (chÊt míi)

O

O

HO

O

OH

O

HO

HOHO

23

11

4

4a

10b6

6a

710a

89

10

MA3: Bergenin

O

CH2OH

O

OH

HO

O

CH2OH

OMe

OH

6'

1 3

6

7

8

9

1'4'

MA4: Junipetrioloside A

N

O

NH2

O 2

3

4

6

5

MA5: N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide

O

HO 12

34

8a

4a

87

6

1'

2'

3'

1"

2"

3"4"

5"

6"

7"8"

15"14"

9"

10"

11"

12"

13"

16"4'

MA6: α-Tocopherol

V.3. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh sinh häc Bíc ®Çu thö häat tÝnh chèng « xy hãa çc ho¹t chÊt ph©n lËp ®îc cho thÊy: ho¹t chÊt Anisoposide A, B, bergenin vµ α-Tocopherol ®Òu thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng « xy hãa

144

V.3. Nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus paniculatus C©y bôc b¹c – Mallotus paniculatus thuéc chi Ba bÐt gåm kho¶ng 150 loµi, ph©n bè phæ biÕn ë kh¾p çc khu vùc miÒn nói vµ trung du trªn c¶ 3 miÒn B¾c, Trung, Nam, ViÖt Nam. Trªn thÕ giíi, c©y M. paniculatus ®îc ph©n bè ë Trung Quèc, Lµo, Campuchia, Th¸i Lan, Malaysia, Indonesia, miÒn B¾c Australia, Myanmar vµ Ên §é. C©y bôc b¹c lµ c©y

Mallotus paniculatus th©n gç hoÆc gç nhá, cao tíi 20m vµ ®êng kÝnh th©n kho¶ng 20cm. C©y a s¸ng vµ cã biªn ®é sinh th¸i réng, mäc trong rõng thêng xanh hay çc th¶m c©y bôi, trªn ®Êt sa phiÕn th¹ch ë n¬i rõng bÞ khai ph¸ hoÆc sau n¬ng rÉy, ®é cao 100-1.000 m. V.3.1. Ph©n lËp çc hîp chÊt Cµnh vµ l¸ cña c©y bôc b¹c M. paniculatus (1,0 kg) ®îc chiÕt ba lÇn víi MeOH trªn m¸y siªu ©m ë nhiÖt ®é 40-50oC trong vßng 20 phót. DÞch chiÕt sau ®ã ®îc c« ®Æc b»ng m¸y cÊt quay víi ¸p suÊt gi¶m ®Ó thu ®îc 80 g cÆn chiÕt MeOH. CÆn MeOH ®îc hßa vµo níc vµ ph©n líp lÇn lît víi Hexan, CHCl3 vµ EtOAc ®Ó thu ®îc çc dÞch c« hexan (13 g), CHCl3 (25 g) vµ EtOAc (25 g). PhÇn dÞch níc sau chiÕt ®îc cho qua cét dianion sö dông hÖ dung m«i gradient MeOH-H2O (tõ 0:100 ®Õn 100:0) thu ®îc çc dÞch c« ML4A (1,5 g), ML4B (2,9 g), ML4C (7,0) vµ ML4D (3,5 g). PhÇn cÆn chiÕt CHCl3 ®îc tiÕn hµnh ph©n t¸ch trªn cét s¾c ký víi hÖ dung m«i gradient hexan-axeton (tõ 10:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n ML2A (2,0 g), ML2B (8,0 g), ML2C (5,0 g) vµ ML2D (10,0 g), Ph©n ®o¹n ML2B ®îc ch¹y qua cét s¾c ký silica gel sö dông hÖ dung m«i hexan-axeton (40:1) thu nhËn ®îc hîp chÊt MP2 (15 mg) vµ MP3 (10 mg). Ph©n ®o¹n ML2D tiÕn hµnh ph©n t¸ch trªn s¾c ký cét víi hÖ dung m«i hexan-axeton (30:1) thu ®îc hîp chÊt MP1 (15 mg). CÆn chiÕt EtOAc ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel víi hÖ dung m«i gradient CHCl3-MeOH (tõ 30:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n ML3A (26,5 g), ML3B (13,4 g), ML3C, ML3D vµ ML3E (24,0 g). Ph©n ®o¹n ML3A ®îc ph©n t¸ch trªn cét s¾c ký pha thêng sö dông hÖ dung m«i CHCl3-MeOH (6:1) thu ®îc hîp chÊt MP6 (10 mg). Ph©n ®o¹n ML3C ®îc cho qua cét s¾c ký YMC RP-18 hÖ dung m«i röa gi¶i MeOH-H2O (1:1) thu ®îc hîp chÊt MP5 (12 mg) díi d¹ng bét vµng v« ®Þnh h×nh. Ph©n ®o¹n ML3E ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel hÖ dung m«i CHCl3-MeOH (6:1) tinh chÕ ®îc hîp chÊt MP8 (20 mg). T¬ng tù nh vËy, tõ ph©n ®o¹n ML4C, hîp chÊt MP4 (20 mg) vµ MP7 (8 mg) ®· ®îc tinh chÕ b»ng cét s¾c ký silica gel hÖ dung m«i CHCl3-MeOH-H2O (5:1:0,1) díi d¹ng bét mµu vµng. Chi tiÕt qu¸ tr×nh ph©n lËp çc hîp chÊt tõ dÞch chiÕt MeOH cña c©y M.paniculatus ®îc s¬ ®å ho¸ nh ë h×nh V.3.1.

145

H×nh V.3.1. S¬ ®å ph©n lËp c¸c chÊt tõ loµi Mallotus paliculatus

V.3.2. H»ng sè vËt lý vµ d÷ kiÖn phæ cña c¸c hîp chÊt

V.3.2.1. Hîp chÊt MP1: Pinoresinol

ChÊt d¹ng dÇu kh«ng mµu; ESI-MS m/z: 341 [M+H-H2O]+, c«ng thøc ph©n tö: C20H22O6, M = 358. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 3,10 (2H, m, H-1 vµ H-5), 4,73 (2H, d, J = 5,0Hz, H-2 vµ H-6), 4,24 (2H, dd, J = 9,5, 7,0 Hz, Ha-4 vµ Ha-8), 3,88 (2H, dd, J

Mallotus paniculatus (1,0 g)


ML-Cặn chiết MeOH (80 g) Bổ sung nước

Bố sung hexan

ML3-Cặn EtOAc (25 g)

Lớp nước

Bổ sung EtOAc

MP3 (10mg)

ML4B

Lớp hexan

LớpEtOAc ML2-Cặn CHCl3 (25 g)

ML2C (5 g)

ML2D (10 g)

ML2B (8 g)

ML2A (2 g)

MP1 (15mg)

MP2 (15 mg)

ML3A (5 g)

ML3B (2,5 g)

ML3C (7 g)

ML3D (4,5 g)

ML3E (6 g)

Silica gel CC CHCl3:MeOH (30:1-1:1)

MP6 (10 mg)

MP5 (12 mg)

MP8 (10 mg)

MP4 (20 mg)

ML4C ML4A

Silica gel CC CHCl3:MeOH:H2

O (5:1:0,1)

Silica gel CC hexan:axeton(40:1)

Silica gel CC hexan:axeton(30:1)

ML4D

MP7 (8 mg)

Cột Dianion MeOH:H2O 0:100 – 100:0

ML1-Cặn hexan (10 g)

ML4-Lớp nước

Bố sung CHCl3

146

= 9,5, 4,0 Hz, Hb-4 vµ Hb-8), 6,89 (2H, d, J = 1,5 Hz, H-2' vµ H-2''), 6,88 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-5' vµ H-5''), 6,82 (2H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-6' vµ H-6'') vµ 3,90 (6H, s, 3'-OCH3 vµ 3''-OCH3).

13C-NMR (125MHz, CDCl3) δ (ppm): 54,20 (d, C-1 vµ C-5) 85,90 (d, C-2 vµ C-6), 71,70 (d, C-4 vµ C-8), 132,97 (s, C-1' vµ C-1''), 108,63 (d, C-2' vµ C-2''), 146,72 (s, C-3' vµ C-3''), 145,27 (s, C-4' vµ C-4''), 114,29 (d, C-5' vµ C-5''), 118,99 (d, C-6' vµ C-6''), 55,99 (q, 3'-OCH3 vµ 3''-OCH3).

V.3.2.2. Hîp chÊt MP2: Taraxerone

ChÊt bét mµu tr¾ng, ESI-MS m/z: 447 [M+Na]+, c«ng thøc ph©n tö: C30H48O, M = 424.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,40 (m, Ha-1), 1,94 (d, J=2,5, Hb-1), 1,62 (m, Ha-2), 1,91 (m, Hb-2), 1,31 (m, H-5), 1,42-1,45 (m, H-6), 1,30 (m, Ha-7), 1,61 (m, Hb-7), 1,56 (m, H-9), 1,42-1,45 (m, H-11), 0,95(m, Ha-12), 1,33(m, Hb-12), 5,57 (dd, J = 8,5; 3,5, H-15), 1,82 (m, Ha-16), 1,98 (m, Hb-16), 0,96 (m, H-18), 1,40 (m, Ha-19), 2,02 (m, Hb-19), 1,30-1,40 (m, H-21), 1,30-1,40 (m, H-22), 1,06 (s, H-23), 0,83 (s, H-24), 0,91 (s, H-25), 1,14 (s, H-26), 0,91 (s, H-27), 0,95 (s, H-28), 1,08 (s, H-29) vµ 1,08 (s, H-30).

13C-NMR (125MHz, CDCl3) δ (ppm): 38,35 (C-1), 34,14 (C-2), 217,53 (C-3), 47,58 (C-4), 55,78 (C-5), 19,16 (C-6), 35,11 (C-7), 38,88 (C-8), 48,70 (C-9), 35,77 (C-10), 17,45 (C-11), 36,67 (C-12), 37,54 (C-13), 157,60 (C-14), 117,19 (C-15), 37,70 (C-16), 37,74 (C-17), 48,88 (C-18), 40,64 (C-19), 28,80 (C-20), 33,57 (C-21), 33,08 (C-22), 26,11 (C-23), 21,48 (C-24), 14,81 (C-25), 29,92 (C-26), 25,57 (C-27), 29,89 (C-28), 33,36 (C-29) vµ 21,34 (C-30).

V.3.2.3. Hîp chÊt MP3: Epitaraxerol

ChÊt bét mµu tr¾ng, ESI-MS m/z: 285 [M-H2O-H]-, c«ng thøc ph©n tö C30H50O, M = 426.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,40 (m, Ha-1), 1,92 (m, Hb-1), 1,62 (m, Ha-2), 1,91 (m, Hb-2), 3,41 (d, J = 3,0 Hz, H-3), 1,31 (m, H-5), 1,42-1,45 (m, H-6), 1,30 (m, Ha-7), 1,61 (m, Hb-7), 1,56 (m, H-9), 1,42-1,45 (m, H-11), 0,95(m, Ha-12), 1,33(m, Hb-12), 5,54 (dd, J = 8,5; 3,5, H-15), 1,82 (m, Ha-16), 1,98 (m, Hb-16), 1,00 (m, H-18), 1,40 (m, Ha-19), 2,02 (m, Hb-19), 1,30-1,40 (m, H-21), 1,30-1,40 (m, H-22), 0,95 (s, H-23), 0,83(s, H-24), 0,87 (s, H-25), 1,10 (s, H-26), 0,92 (s, H-27), 0,92 (s, H-28), 0,95 (s, H-29) vµ 0,95 (s, H-30).

13C-NMR (125MHz, CDCl3) δ (ppm): 37,74 (C-1), 25,10 (C-2), 76,24 (C-3), 39,18 (C-4), 49,28 (C-5), 18,77 (C-6), 33,79 (C-7), 38,07 (C-8), 48,79 (C-9), 37,55 (C-10), 17,45 (C-11), 35,15 (C-12), 37,37 (C-13), 158,21 (C-14), 116,76 (C-15), 36,76 (C-16), 37,55 (C-17), 48,97 (C-18), 41,28 (C-19), 28,81 (C-20), 33,13 (C-21),

147

32,28 (C-22), 33,36 (C-23), 22,19 (C-24), 29,94 (C-25), 26,06 (C-26), 29,85 (C-27), 21,26 (C-28), 28,29 (C-29) vµ 15,24 (C-30).

V.3.2.4. Hîp chÊt MP4: Astilbin

Bét mµu tr¾ng, ®iÓm nãng ch¶y: 179 - 180 0C, [α]D25

+ 4 (50% Me2CO aq); ESI-MS m/z: 473 [M+Na]+, 449 [M-H]-, c«ng thøc ph©n tö: C21H22O11, M = 450.

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 5,09 (d, J = 10,5 Hz, H-2), 4,58 (d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,92 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,94 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,97 (d, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,84 (d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,86 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6'), 4,08 (d, J = 1,5 Hz, H-"), 3,56 (dd, J = 3,5, 1,5 Hz, H-2''), 3,67 (dd, J = 9,0, 3,5 Hz, H-3"), 3,30 (m, H-4"), 4,26 (m, H-5") vµ 1,21 (d, J = 6,5 Hz, H-6").

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 83,92 (C-2), 78,55 (C-3), 195,96 (C-4), 165,46 (C-5), 97,37 (C-6), 168,54 (C-7), 96,25 (C-8), 164,07 (C-9), 102,48 (C-10), 129,17 (C-1'), 115,48 (C-2'), 146,50 (C-3'), 147,34 (C-4'), 116,32 (C-5'), 120,48 (C-6'), 102,12 (C-1"),72,14 (C-2"), 71,75 (C-3"), 73,79 (C-4"), 70,49 (C-5") vµ 17,83 (C-6").

V.3.2.5. Hîp chÊt MP5: Taxifolin

ESI-MS m/z: 285 [M-H-H2O]-, c«ng thøc ph©n tö: C15H12O7, M = 304.

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,93 (d, J = 11,5, H-2), 4,52 (d, J = 11,5 Hz, H-3), 5,94 (d, J = 2,0 Hz, H-7), 5,90 (d, J = 2,0 Hz, H-9), 6,98 (d, J = 1,5 Hz, H-2'), 6,82 (d, J = 8,0 Hz, H-5') vµ 6,87 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6').

V.3.2.6. Hîp chÊt MP6: Blumemol A

ESI-MS m/z: 225 [M+H]+, 247 [M+Na]+, 223 [M-H]-, c«ng thøc ph©n tö: C13H20O3, M=224.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 2,46 (d, J = 17, H-2a), 2,26 (d, J = 17, H-2b), 5,91 (br s, H-4), 5,78 (dd, J = 1,0, 16 Hz, H-7), 5,87 (dd, J = 5,5, 16,0 Hz, H-8), 4,42 (m, H-9), 1,30 (d, J = 6,5 Hz, H-10), 1,02 (s, H-11), 1,09 (s, H-12) vµ 1,90 (s, H-13).

13C-NMR (125MHz, CD3OD) δ (ppm): 42,43 (C-1), 50,75 (C-2), 201,23 (C-3), 127,10 (C-4), 167,45 (C-5), 79,95 (C-6), 136,93 (C-7), 130,12 (C-8), 68,73 (C-9), 23,46 (C-10), 23,82 (C-11), 24,47 (C-12) vµ 19,55 (C-13).

V.3.2.7. Hîp chÊt MP7: Quercetin

KÕt tinh h×nh kim mµu vµng, ®iÓm nãng ch¶y: 313-314 oC, ESI-MS m/z: 325 [M+Na]+, m/z 301 [M-H]-), c«ng thøc ph©n tö: C15H10O7, M = 302.

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 6,20 (br s, H-6), 6,41 (br s, H-8), 7,76 (br s, H-2'), 6,91 (d, J = 8,0 Hz, H-5'), 7,64 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6'). V.3.2.8 . Hîp chÊt MP8 cã sè liÖu vËt lý vµ tÝnh chÊt t¬ng tù nh hîp chÊt quercitrin ph©n lËp ®îc tõ c©y M.nanus

148

V.3.3. X¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña c¸c hîp chÊt V.3.3.1. Hîp chÊt MP1: Pinoresinol Hîp chÊt MP1 nhËn ®îc díi d¹ng chÊt dÇu kh«ng mµu. Phæ 1H-NMR cña MP1 xuÊt hiÖn côm tÝn hiÖu cña vßng th¬m bÞ thÕ ba vÞ trÝ víi hÖ t¬ng t¸c ABX t¹i δ 6,83 (dd, J = 8,0, 1,5 Hz), 6,89 (d, J = 8,0 Hz), 6,90 (d, J = 1,5 Hz). Ngoµi ra cßn cã nhãm oximetin t¹i δ 4,75 (d, J = 4,0 Hz), oximetilen t¹i δ 4,27 (dd, J = 6,5, 9,0 Hz)/3,88 (dd, J = 10,5, 3,0 Hz) vµ nhãm metoxi t¹i δ 3,91 (s).

H×nh V.3.3.1.a. Phæ 1H-NMR cña MP1

O

O

OH

HO

HH

H3CO

H3CO

1

24

5

6 8

1'2'

3' 4'

5'6'

1"2"

3"

4" 5"6"

H×nh V.3.3.1.b. CÊu tróc ho¸ häc cña MP1

B¶ng V.3.3.1. KÕt qu¶ phæ NMR cña MP1

C δC# δC a,c δH b,c (J, Hz) HMBC (H → C)

1, 5 54,2 54,16 3,11 (m) C-2, 4, 1' 2, 6 85,9 85,79 4,75 (d, 4,0) C-1, 5, 8, 1', 2', 6'

4, 8 71,7 71,66 4,27 (dd, 6,5, 9,0) 3,88 (dd, 3,0, 10,5)

C-1, 2 C-1, 2

1', 1'' 132,9 132,91 - 2', 2'' 108,7 108,65 6,90 (d, 1,5) C-2, 1', 3', 4', 6' 3', 3'' 146,7 146,73 - 4', 4'' 145,3 145,26 - 5', 5'' 114,3 114,30 6,89 (d, 8,0) C-1', 3', 4', 6' 6', 6'' 118,9 118,96 6,83 (dd, 1,5, 8,0) C-2, 1', 2', 4' 3',3''-OCH3 56,0 55,96 3,91 (s) C-3'

a 125 MHz, b 500 MHz, c CDCl3, #δC cña pinoresinol79

149

H×nh V.3.3.1.c. Phæ 13C-NMR cña MP1

Trªn phæ 13C-NMR xuÊt hiÖn 10 tÝn hiÖu cacbon, trong ®ã cã 6 tÝn hiÖu cña mét vßng th¬m bÞ thÕ 3 vÞ trÝ t¹i δ 108,65 (CH), 114,30 (CH), 118,96 (CH), 132,91 (C), 145,26 (C), 146,73 (C), bèn tÝn hiÖu cßn l¹i gåm cã δ 55,96 (metoxi), 54,16 (metin), 85,88 (oximetin) vµ 71,66 (oximetilen).

H×nh V.3.3.1.d. Phæ DEPT cña MP1

H×nh V.3.3.1.e. Phæ HSQC cña MP1

O

OH3CO

HO

OCH3

OH

HH

COSY

HMBC

H×nh V.3.3.1.f. C¸c t¬ng t¸c HMBC vµ COSY chÝnh cña MP1

150

B»ng phæ HSQC c¸c sè liÖu phæ cacbon ®îc g¸n víi c¸c sè liÖu proton t¬ng øng vµ ®a ra trong b¶ng V.3.3.1. Ngoµi vßng th¬m bÞ thÕ 3 vÞ trÝ nh ®· ph©n tÝch nªu trªn, sù tån t¹i cña m¶nh cÊu tróc CH(O)-CH-CH2(O)- ®îc x¸c ®Þnh th«ng qua phæ H-H COSY (H×nh V.3.3.1.f).

H×nh V.3.3.1.g. Phæ H-H COSY cña MP1

Nh vËy, c«ng thøc ph©n tö theo tÝnh to¸n cña MP1 sÏ lµ C10H11O3. Tuy nhiªn khi ®o phæ khèi lîng ESI-MS cña hîp chÊt nµy l¹i xuÊt hiÖn pÝc ion t¹i m/z 341 [M+H-H2O]+ t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C20H22O6. KÕt qu¶ nµy cho thÊy ph©n tö cña MP1 ®èi xøng trôc bËc 2 vµ hoµn toµn phï hîp víi phæ kÕt qu¶ NMR.

H×nh V.3.3.1.h. Phæ HMBC cña MP1

H×nh V.3.3.1.i. Phæ ESI-MS cña MP1

151

§Ó kiÓm tra çc ®¸nh gi¸ nªu trªn phæ HMBC cña MP1 còng ®îc thùc hiÖn. Trªn phæ nµy, çc t¬ng t¸c HMBC gi÷a proton metoxi víi C-3', cña H-2 víi C-1', C-2' vµ C-6', gi÷a H-1 víi C-2, C-1' chøng tá cÊu tróc cña hîp chÊt MP1 nh ®îc chØ ra trªn h×nh V.3.1.f. Thªm vµo ®ã, sù trïng khíp vÒ sè liÖu phæ NMR cña MP1 víi pinoresinol chøng minh cÊu tróc hãa häc cña hîp chÊt nµy lµ (+)2,6-bis (4'-hydroxy-3'-metoxi-phenyl)-3,7-dioxabicyclo [3,3,0] octan hay cßn ®îc gäi lµ pinoresinol79.

V.3.3.2. Hîp chÊt MP2: Taraxerone Hîp chÊt MP2 thu ®îc díi d¹ng chÊt kÕt tinh cã mµu tr¾ng. Phæ 1H-NMR cã d¹ng phæ cña mét hîp chÊt tritecpen trong ®ã cã sù xuÊt hiÖn tÝn hiÖu singlet cña 8 nhãm metyl bËc ba t¹i δ 0,83 (3H), 0,91 (6H), 0,95 (3H), 1,06 (3H), 1,08 (6H) vµ 1,14 (3H). Ngoµi ra, trªn phæ cßn thÊy xuÊt hiÖn tÝn hiÖu mét proton olefin t¹i δ 5,57 (dd, J = 8,5, 3,5 Hz).


O

1

4

2

536

7

89

10

11 1312

1415

16

17

1920

21

2218

24

27

29 30

28

23

25 26

H×nh V.3.3.2.b. CÊu tróc cña MP2

Phæ 13C-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 30 cacbon, trong ®ã dùa vµo kÕt qu¶ cña çc phæ DEPT cho thÊy hîp chÊt nµy cã 8 cacbon bËc bèn t¹i δ 217,53, 157,60, 47,58, 38,88, 37,74, 37,54, 35,77, 28,80; 4 cacbon bËc ba t¹i δ 117,19, 55,78, 48,80, 48,70; 10 nhãm CH2 t¹i δ 40,64, 38,35, 37,70, 36,67, 35,11, 34,14, 33,57, 33,08, 19,96, 17,45; vµ 8 nhãm metyl t¹i δ33,36, 29,92, 29,86, 26,11, 25,57, 21,48, 21,34

152

vµ 14,81. Trong ®ã tÝn hiÖu cña nhãm cacbonyl ®îc x¸c ®Þnh t¹i δ 217,53, mét nèi ®«i bÞ thÕ 3 vÞ trÝ t¹i δ 157,60 (C) vµ 117,19 (CH).



B¶ng V.3.3.2. Sè liÖu phæ NMR cña MP2 C δC

# δC a, b δH

a, c (J = Hz) C δC # δC

a, b δH a, c (J = Hz)

1 38,4 38,35 1,40 (m),

1,94 (d, J=2,5) 16 36,7 37,70 1,82, 1,98 (m)

2 34,1 34,14 1,62/1,91 (m) 17 37,7 37,74

3 217,3 217,53 18 48,8 48,80 0,96 (m)

4 47,6 47,58 19 40,7 40,64 1,40, 2,02 (m)

5 55,8 55,78 1,31 (m) 20 28,8 28,80

6 20,0 19,96 1,42-1,45 (m) 21 33,6 33,57 1,30-1,40 (m)

7 35,2 35,11 1,30/1,61 (m) 22 33,1 33,08 1,30-1,40 (m)

8 38,9 38,88 23 26,2 26,11 1,06(s)

9 48,7 48,70 1,56 (m) 24 21,5 21,48 0,83 (s)

10 37,6 35,77 25 14,8 14,81 0,91 (s)

11 17,5 17,45 1,42-1,45 (m) 26 29,9 29,92 1,14(s)

12 35,8 36,67 0,95/1,33 (m) 27 25,6 25,57 0,91 (s)

13 37,7 37,54 28 29,9 29,86 0,95 (s)

14 157,6 157,60 29 33,4 33,36 1,08 (s)

15 117,2 117,19 5,57 (dd, 8,5, 3,5) 30 21,4 21,34 1,08 (s) a®o trong CDCl3,

b125 MHz, c500 MHz, #δC cña taraxerone80

153

H×nh V.3.3.2.e. Phæ ESI-MS cña MP2

Trªn phæ khèi lîng ESI-MS xuÊt hiÖn pÝc t¹i m/z 447 [M+Na]+ gîi ý cho c«ng thøc ph©n tö cña MP2 lµ C30H48O. Ph©n tÝch c¸c d÷ kiÖn phæ thu ®îc vµ so s¸nh víi tµi liÖu ®· c«ng bè80, hîp chÊt MP2 ®îc x¸c ®Þnh lµ taraxerone. V.3.3.3. Hîp chÊt MP3: Epitaraxerol Hîp chÊt MP3 thu ®îc díi d¹ng tinh thÓ mµu tr¾ng. Trªn phæ 1H-NMR cña MP3 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 8 nhãm metyl bËc bèn t¹i δ 0,83, 0,87, 0,92(6H), 0,95(12H), 1,10 díi d¹ng c¸c singlet, mét tÝn hiÖu proton nèi ®«i t¹i δ 5,53 (dd, J =8,5, 3,5Hz) vµ mét doublet t¹i δ 3,41 (J = 3,0Hz). Nh×n chung, phæ 1H-NMR cña MP3 kh¸ gièng víi hîp chÊt MP2, trªn phæ cña MP3 cã xuÊt hiÖn thªm tÝn hiÖu proton t¹i δ 3,41 ®©y lµ tÝn hiÖu cña nhãm oximetin. §iÒu nµy cho phÐp dù ®o¸n MP3 lµ mét dÉn xuÊt bÞ khö nhãm cacbonyl (C=O) cña MP2.


HO

1

4

2

536

7

89

10

11 1312

1415

16

17

1920

21

2218

24

27

29 30

28

23

25 26


154


B¶ng V.3.3.3. Sè liÖu phæ NMR cña MP3 C δC

# δC a, b δH

a, c (J = Hz) C δC # δC

a, b δH a, c (J = Hz)

1 37,8 37,74 1,40/1,92 (m) 16 36,8 36,76 1,82/1,98 (m) 2 25,2 25,10 1,62/1,91 (m) 17 38,1 37,55 3 76,3 76,34 3,41(d, J=3,0) 18 49,1 48,97 1,00 (m) 4 39,1 39,18 19 41,4 41,28 1,40/2,02 (m) 5 49,4 49,28 1,31 (m) 20 29,0 28,81 6 18,8 18,77 1,42-1,45 (m) 21 33,2 33,13 1,30-1,40 (m) 7 33,9 33,79 1,30/1,61 (m) 22 32,4 32,28 1,30-1,40 (m) 8 38,9 38,07 23 33,1 33,36 0,95(s) 9 48,9 48,79 1,56 (m) 24 22,0 22,19 0,83 (s) 10 37,9 37,55 25 30,0 29,94 0,87 (s) 11 17,5 17,45 1,42-1,45 (m) 26 26,5 26,06 1,10(s) 12 35,2 35,15 0,95/1,33 (m) 27 30,0 29,85 0,92 (s) 13 37,9 37,37 28 21,2 21,26 0,92 (s) 14 158,1 158,21 29 28,1 28,29 0,95 (s) 15 116,6 116,76 5,54 (dd, 8,5, 3,5) 30 15,1 15,24 0,95 (s)

a®o trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, #δC cña epitaraxerol81

Phæ 13C-NMR cña MP3 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 30 cacbon kh¸ gièng víi hîp chÊt MP3. Tuy nhiªn, trªn phæ 13C-NMR cña MP3 kh«ng thÊy xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña nhãm cacbonyl (δ 217,53) mµ thay vµo ®ã lµ tÝn hiÖu cña nhãm oximetin t¹i δ 76,24. §iÒu nµy mét lÇn n÷a kh¼ng ®Þnh dù ®o¸n trªn lµ phï hîp.


Ph©n tÝch c¸c d÷ kiÖn phæ thu ®îc vµ so s¸nh víi tµi liÖu ®· c«ng bè81, hîp chÊt MP3 ®îc x¸c ®Þnh lµ epitaraxerol, mét dÉn xuÊt cña taraxerone.

155

V.3.3.4. Hîp chÊt MP4: Astilbin Hîp chÊt MP4 thu ®îc díi d¹ng tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng. Çc phæ NMR cña hîp chÊt nµy cho thÊy ®©y lµ mét flavon-glycozit víi nh¸nh ®êng lµ rhamnopyranosyl. Phæ 1H-NMR cña MP4 xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña 5 proton vßng th¬m trong ®ã hai proton ë vßng th¬m A ®îc x¸c ®Þnh ë vÞ trÝ meta víi nhau t¹i δH 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz) vµ 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz) vµ ba proton cña mét vßng th¬m cã hÖ t¬ng t¸c ABX δH 6,97 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,86 (1H, dd, J = 8,0 vµ 2,0 Hz), 6,84 (1H, d, J = 8,0 Hz). Ngoµi ra, hai proton oximetin xuÊt hiÖn t¹i δH 4,58 (1H, d, J = 10,5 Hz) vµ 5,09 (1H, d, J = 10,5 Hz). Çc d÷ kiÖn phæ trªn cho phÐp dù ®o¸n sù cã mÆt cña cÊu tróc khung d¹ng 2,3-dihydroquercetin.

H×nh V.3.3.4.a. Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt MP4

O

OOH

HO

OH

O

1'

2

3456

78

9

10

2'3'

4'

5'6'

1" 3"

5"

6"

OOH

OH

OH CH3

OH

H×nh V.3.3.4.b. CÊu tróc cña hîp chÊt MP4

Sù tån t¹i cña mét ph©n tö ®êng ®îc x¸c ®Þnh bëi sù xuÊt hiÖn cña proton anome t¹i δH 4,08 (1H, d J = 1,5 Hz) vµ çc tÝn hiÖu n»m trong vïng δH 3,69 - 3,31 (m). Gi¸ trÞ h»ng sè t¬ng t¸c nhá cña proton anome cïng víi sù xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña mét nhãm metyl bËc hai t¹i δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) gîi ý cho sù cã mÆt cña mét ®¬n vÞ ®êng α-L-rhamnopyranoside.

H×nh V.3.3.4.c. Phæ 13C-NMR cña hîp chÊt MP4

156

B¶ng V.3.3.4. Sè liÖu NMR cña hîp chÊt MP4

C #δCa,b

δC b, d DEPT δH

c, d(d¹ng pic, J=Hz) 2 84,8 83,92 CH 5,09 (d, 10,5) 3 79,4 78,55 CH 4,58 (d, 10,5) 4 196,7 195,96 C - 5 166,3 165,46 C - 6 98,2 97,37 CH 5,92 (d, 2,0) 7 169,7 168,54 CH - 8 97,2 96,25 CH 5,94 (d, 2,0) 9 164,9 164,07 C - 10 103,2 102,48 C - 1' 130,0 129,17 C - 2' 117,1 115,48 CH 6,97 (d, 2,0) 3' 147,3 146,50 C - 4' 148,1 147,34 C - 5' 116,3 116,32 CH 6,84 (d, 8,0) 6' 121,3 120,48 CH 6,86 (dd, 8,0, 2,0) Rha 1" 102,9 102,12 CH 4,08 (d, 1,5) 2" 72,6 72,14 CH 3,56 (dd, 3,5, 1,5) 3" 72,9 71,75 CH 3,67 (dd, 9,0, 3,5) 4" 74,6 73,79 CH 3,30 (m) 5" 71,3 70,49 CH 4,26 (m) 6" 18,6 17,83 CH3 1,21 (d, 6,5)

a®o trong pyridin-d5, b125 MHz, c500 MHz, d®o trong CD3OD, #δC cña astilbin82

H×nh V.3.3.4.d. Phæ 13C-NMR vµ çc phæ DEPT cña hîp chÊt MP4

Trªn phæ 13C-NMR cña MP4 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu 21 cacbon. Trong ®ã 15 cacbon thuéc vµo khung flavon vµ 6 cacbon thuéc vµo khung ®êng. Çc tÝn hiÖu cacbon cña ®¬n vÞ ®êng t¹i δ 102,12 (C-1"),72,14 (C-2"), 71,75 (C-3"), 73,79 (C-4"), 70,49 (C-5") vµ 17,83 (C-6") kh¼ng ®Þnh sù cã mÆt cña mét ®¬n vÞ ®êng rhamnose. ViÖc x¸c ®Þnh nh¸nh ®êng ®îc nèi vµo C-3 vµ cÊu h×nh t¹i çc vÞ trÝ C-2 vµ C-3

157

®îc tiÕn hµnh bëi sù so s¸nh trùc tiÕp çc gi¸ trÞ phæ NMR cña MP4 víi çc sè liÖu ®· ®îc c«ng bè cña çc d¹ng ®ång ph©n dihydroflavonol 3-O-α-L-rhamanoside trong tµi liÖu tham kh¶o.82 §é dÞch chuyÓn hãa häc cña çc proton H-1", H-5" vµ H-6" (t¬ng øng t¹i δ 4,08, 4,26, vµ 1,21) cña MP4 phï hîp víi çc gi¸ trÞ cña d¹ng ®ång ph©n cã cÊu h×nh 2R,3R (t¬ng øng t¹i δ 4,03, 3,91 vµ 1,06) vµ kh¸c xa so víi d¹ng 2S,3S (t¬ng øng t¹i 4,96, 2,28 vµ 0,80) vµ 2R,3S (t¬ng øng t¹i 4,78, 2,45 vµ 0,85). Çc d¹ng ®ång ph©n 2S,3S vµ 2R,3S cã ®é dÞch chuyÓn hãa häc cña proton H-1" cao h¬n vµ ®é dÞch chuyÓn hãa häc cña çc proton H-5" vµ H-6" thÊp h¬n so víi çc gi¸ trÞ t¬ng øng cña d¹ng ®ång ph©n 2R,3R82. §iÒu nµy cho phÐp x¸c ®Þnh cÊu h×nh 2R,3R t¹i vÞ trÝ C-2 vµ C-3 cña MP4.

H×nh V.3.3.4.e. Phæ ESI-MS positive cña MP4

Tõ tÊt c¶ çc ph©n tÝch nªu trªn, cïng víi kÕt qu¶ phæ khèi lîng ESI-MS t¹i 473 [M+Na]+ vµ 449 [M-H]- (t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C21H22O11, M = 450) cho phÐp kh¼ng ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña MP4 lµ (2R,3R)-dihydroquercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside hay cßn ®îc gäi lµ astilbin. V.3.3.5. Hîp chÊt MP5: Taxifolin Hîp chÊt MP5 thu ®îc díi d¹ng tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng. Phæ 1H-NMR t¬ng tù nh phæ cña MP4 ngo¹i trõ sù mÊt ®i çc tÝn hiÖu cña ®¬n vÞ ®êng rhamnose. Trªn phæ 1H-NMR cña MP5 xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña 5 proton vßng th¬m trong ®ã hai proton ë vßng th¬m A ®îc x¸c ®Þnh ë vÞ trÝ meta víi nhau δH 5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz) vµ 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz); ba proton cßn l¹i ®îc x¸c ®Þnh thuéc vµo mét vßng th¬m cã hÖ t¬ng t¸c ABX δH 6,98 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,87 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz). Ngoµi ra, hai proton oximetin ®îc x¸c ®Þnh bëi çc tÝn hiÖu céng hëng t¹i δH 4,53 (1H, d, J = 11,5 Hz) vµ 4,94 (1H, d, J = 11,5 Hz).


158

O

OOH

HO

OH

OH

1'

2

3456

78

9

10

2'3'

4'

5'6'

OH


Phæ ESI-MS (negative) cña MP5 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu t¹i m/z 285 [M-H-H2O]- ë mét lÇn n÷a gîi ý cho c«ng thøc ph©n tö cña hîp chÊt nµy lµ C15H12O7, M = 304.

H×nh V.3.3.5.c. Phæ ESI-MS (negative) cña MP5

Ph©n tÝch c¸c d÷ kiÖn phæ thu ®îc vµ so s¸nh víi tµi liÖu ®· c«ng bè83, hîp chÊt MP5 ®îc x¸c ®Þnh lµ taxifolin cßn cã tªn gäi lµ dihydroquercetin, mét hîp chÊt phæ biÕn ë nhiÒu loµi thùc vËt. V.3.3.6. Hîp chÊt MP6: Blumenol A Phæ 1H-NMR cña MP6 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 4 nhãm metyl, trong ®ã cã 3 nhãm metyl bËc 3 t¹i δ 1,02 (s), 1,09 (s) , 1,90 (brs) vµ mét nhãm metyl bËc 2 t¹i δ 1,30 díi d¹ng mét tÝn hiÖu doublet (J = 6,5 Hz). Ngoµi ra, trªn phæ cßn xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 3 proton olefin t¹i δ 5,78 (dd, J = 1,0, 16,0 Hz), 5,87 (dd, J = 5,5, 16,0 Hz) vµ 5,91 (brs), mét nhãm CH2 t¹i δ 2,46 (1H, d, J = 17 Hz), 2,26 (1H, d, J = 17 Hz) vµ mét nhãm oximetin ë δ 4,42 (m).


159

O

OH

OH1

2

34

5

7

8

9

10

1112

13

6


Phæ 13C-NMR cña MP6 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 13 nguyªn tö cacbon, trong ®ã cã 6 tÝn hiÖu δ 42,43 (C), 50,75 (CH2), 201,23 (C=O), 127,10 (CH), 167,45(C), 79,95 (C) lµ thuéc vµo mét vßng xiclohexen bÞ thÕ, 7 tÝn hiÖu cßn l¹i gåm cã 136,93 (CH), 130,12 (CH), 68,73 (CH), 23,46 (CH3), 23,82 (CH3), 24,47 (CH3), vµ 19,55 (CH3).



B¶ng V.3.3.6. Sè liÖu phæ NMR cña MP6 C #δC

a,e #δHd, f δC

a, b δH c,d (J = Hz)

1 41,14 42,43

2 49,71 2,45 (d, 16,8) 2,25 (d, 16,8) 50,75 2,46 (d, 17,0)

2,26 (d, 17,0) 3 197,87 - 201,23 - 4 126,95 5,91 (brs) 127,10 5,91 (brs) 5 162,56 - 167,45 - 6 79,05 - 79,95 - 7 135,72 5,79 (d, 15,7) 136,93 5,78 (dd, 16,0, 1,0) 8 129,00 5,87 (dd, 15,7, 5,1) 130,12 5,87 (dd, 16,0, 5,5) 9 68,05 4,42 (m) 68,73 4,42 (m) 10 23,76 1,30 (d, 6,3) 23,46 1,30 (d, 6,5)

160

11 22,89 1,02 (s) 23,82 1,02 (s) 12 24,04 1,11 (s) 24,47 1,09 (s) 13 18,86 1,90 (brs) 19,55 1,90 (brs)

a®o trong MeOD, b125 MHz, c500 MHz, d®o trong CDCl3, e100 MHz, f400 MHz, #sè

liÖu cña blumenol A84

Phæ ESI-MS cña MP6 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu t¹i m/z 247 [M+Na]+ ë positive vµ 223 [M-H]- ë negative gîi ý cho c«ng thøc ph©n tö cña MP6 lµ C13H20O3, M = 224.

H×nh V.3.3.6.e. Phæ ESI-MS positive cña MP6

Ph©n tÝch çc d÷ kiÖn phæ thu ®îc vµ so s¸nh víi tµi liÖu ®· c«ng bè84, hîp chÊt MP6 ®îc x¸c ®Þnh lµ 6,9-dihydoxy-4,7-megastigmadien-3-one, hay cßn cã tªn gäi lµ blumenol A. V.3.3.7. Çc hîp chÊt MP7 vµ MP8 Hîp chÊt MP7 vµ MP8 ®îc nhËn d¹ng lÇn lît lµ quercetin85 vµ quercitrin86 b»ng çch so s¸nh sè liÖu phæ NMR vµ ESI-MS cña chóng víi çc sè liÖu t¬ng øng ®· ®îc c«ng bè trong tµi liÖu tham kh¶o. §©y lµ çc hîp chÊt flavonoit rÊt phæ biÕn trong çc loµi thùc vËt.

Tæng hîp çc chÊt ®· ®îc ph©n lËp tõ c©y bôc b¹c Mallotus paniculatus

O

O

OH

HO

HH

H3CO

H3CO

1

24

5

6 8

1'2'

3' 4'

5'6'

1"2"

3"

4" 5"6"

MP1 - Pinoresinol

O

1

4

2

536

7

89

10

11 1312

1415

16

17

1920

21

2218

24

27

29 30

28

23

25 26

MP2 - Taraxerone

HO

1

4

2

536

7

89

10

11 1312

1415

16

17

1920

21

2218

24

27

29 30

28

23

25 26

MP3 - Epitaraxerol

O

OH

OH

12

34

5

7

89

10

1112

13

6

MP6 - Blumenol A

O

OH

OOH

HO

OR

OH

2

345

6

78

9

10

1'

2'3'

4'

5'6'

MP7 - Quercetin, R = H MP8-Quercitrin

O

OH

OOH

HO

OR

OH

2

345

6

78

9

10

1'

2'3'

4'

5'6'

MP4 - Astilbin, R = α-L-rhamnopyranoside

MP5 - Taxifolin, R = H

161

V.4. Nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus luchenensis C©y çm lîn cßn cã tªn gäi kh¸c lµ ruèi luchen. Lµ lo¹i c©y bôi hay gç nhá, cao 2-3 m, nh¸nh ®Çy l«ng sÐt hay vµng vµng. L¸ cã phiÕn to xoan réng ®Õn trßn, 15-14 × 10-15 cm, thuú 3 hay 0, ®¸y trßn hay h×nh tim, hay c¾t ngang, g©n phô 6-7 cÆp, mÆt trªn kh«ng l«ng, mÆt díi cã l«ng h×nh sao dÇy, cuèn ®Õn 10 cm. Chïm tô t¸n cao ®Õn 40 cm, nh¸nh ®¬n cã l«ng h×nh sao dÇy, nô 3-4 mm, hoa ®ùc cã nhiÒu tiÓu nhôy, hoa çi cã 4 vßng nhôy. Nang to 1cm ®o ®á hay cam ®á, trªn cäng 6-10 mm.


V.4.1. Ph©n lËp çc hîp chÊt MÉu kh« cña M. luchenensis (1,5 kg) ®îc chiÕt ba lÇn víi MeOH b»ng m¸y siªu ©m Ultrasonic 2010 ë nhiÖt ®é 40-50oC trong vßng 30 phót. DÞch chiÕt sau ®ã ®îc c« ®Æc b»ng m¸y cÊt quay víi ¸p suÊt gi¶m ®Ó thu ®îc 20 g cÆn chiÕt MeOH. CÆn MeOH ®îc hßa vµo níc vµ ph©n líp lÇn lît víi Hexan vµ EtOAc ®Ó thu ®îc çc dÞch c« Hexan (3,5 g) vµ EtOAc (5,6 g). PhÇn dÞch níc sau chiÕt ®îc cho qua cét dianion sö dông hÖ dung m«i gradient MeOH-H2O (tõ 0:100 ®Õn 100:0) thu ®îc dÞch c« MLW1 (1,8 g), MLW2 (2,5 g) vµ MLW3 (1,9 g), MLW4 (3,6 g). PhÇn cÆn chiÕt Hexan (4,1 g) ®îc tiÕn hµnh ph©n t¸ch trªn cét s¾c ký víi hÖ dung m«i gradient hexan-axeton (tõ 100:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n MLH1 (1,2 g), MLH2 (0,8 g), vµ MLH3 (1,5 g). Ph©n ®o¹n MLH2 ®îc cho qua cét s¾c ký silica gel sö dông hÖ dung m«i hexan-axeton (5:1) thu nhËn ®îc hîp chÊt ML12 (10,5 mg). Ph©n ®o¹n MLH3 ®îc cho qua cét s¾c ký silica gel pha ®¶o YMC RP-18 sö dông hÖ dung m«i axeton-níc (1:4) thu ®îc hîp chÊt ML13 (16 mg). PhÇn dÞch níc sau chiÕt tiÕn hµnh ch¹y trªn cét nhùa trao ®æi ion Dianion HP-20, thu ®îc çc ph©n ®o¹n MLW1 (1,8 g), MLW2 (2,5 g), MLW3 (1,9 g), MLW4 (3,6 g). Tõ ph©n ®o¹n MLW1, hîp chÊt ML11 (17 mg) ®· ®îc tinh chÕ b»ng cét s¾c ký silica gel hÖ dung m«i CHCl3-MeOH-H2O (5:1:0,15) díi d¹ng bét mµu tr¾ng. Ph©n ®o¹n MLW2 ®îc cho qua cét s¾c ký YMC RP-18 hÖ dung m«i röa gi¶i MeOH-H2O (1:3) thu ®îc hîp chÊt ML1 (10 mg). T¬ng tù nh vËy, tõ ph©n ®o¹n MLW4, hîp chÊt ML2 (13 mg) ®· ®îc tinh chÕ b»ng cét s¾c ký silica gel hÖ dung m«i CHCl3-MeOH-H2O (2:1:0,2). CÆn chiÕt EtOAc (5,6 g) ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel víi hÖ dung m«i gradient CHCl3-MeOH (tõ 30:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n MLE1 (0,5 g), MLE2 (1,4 g), MLE3 (1,1 g), MLE4 (0,6 g), MLE5 (0,8 g) vµ MLE6 (1,0 g). Ph©n ®o¹n MLE2 ®îc s¾c ký trªn cét pha ®¶o YMC RP-18 sö dông hÖ dung m«i MeOH-H2O 2:1 thu ®îc çc hîp chÊt ML7 (6 mg) vµ ML3 (9 mg) díi d¹ng bét mµu vµng.

162

H×nh V.4.1.a. S¬ ®å ph©n lËp çc chÊt tõ ph©n ®o¹n hexan vµ níc cña c©y Mallotus luchenensis

Ph©n ®o¹n MLE3 ®îc cho qua cét s¾c ký YMC RP-18 hÖ dung m«i röa gi¶i MeOH-H2O (3:2) thu ®îc çc hîp chÊt ML5 (11 mg) vµ ML9 (13 mg) díi d¹ng bét vµng v« ®Þnh h×nh. Ph©n ®o¹n MLE4 ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel hÖ dung m«i CHCl3-MeOH-H2O (5:1:0,1) ®· tinh chÕ ®îc hîp chÊt ML4 (21 mg). T¬ng tù nh vËy, ph©n ®o¹n MLE5 ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel pha thêng hÖ dung m«i röa gi¶i CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,1), lÇn lît thu ®îc çc hîp chÊt ML6 (15 mg) vµ ML8 (12 mg). Ph©n ®o¹n MLE6 còng ®îc tiÕn hµnh s¾c ký

Bæ sung EtOAc

- Chiết với MeOH (3 lần) bằng siêu âm

- Cất loại dung môi bằng áp suất giảm

Bổ sung nước Bố sung hexan

n-hexan: níc 1/1

CHCl3: níc 1/1

MLE - Cặn EtOAc (5,6 g)

EtOAc: níc 1/1

Bæ sung CHCl3

Líp níc

Líp níc

Gom hai ph©n ®o¹n

MLH1 (1,2 g)

MLH2 (0,8 g)

MLH3 (1,5 g)

MLW1 (1,8 g)

MLW2 (2,5 g)

MLW4 (3,6 g)

MLW3 (1,9 g)

ML13 (16 mg)

ML12 (10,5 mg)

ML11 (17 mg)

ML1 (10 mg)

ML2 (13 mg)

Líp níc

Cột Dianion MeOH : H2O (0:100 → 100:0)

Silica gel CC CHCl3:MeOH:H2O

(2:1:0,2)

Silica gel CC Hexan-axetone (100:0 → 1:1)

Silica gel CC Hexan:Axeton (3:1)


(5:1:0,15)

Dịch nước sau chiết (MLW)

MLH

(4,1 g)

MLC - CÆn CHCl3

(0,6 g)

MLH - Cặn hexan (3,5 g)

ML - Cặn chiết MeOH (20 g)

Mallotus luchenensis (1,5 kg)

163

trªn cét silica gel pha thêng hÖ dung m«i röa gi¶i CHCl3-MeOH-H2O (2:1:0,15) tinh chÕ ®îc hîp chÊt ML10 (7,6 mg).

H×nh V.4.1.b. S¬ ®å ph©n lËp c¸c chÊt tõ ph©n ®o¹n EtOAc

c©y Mallotus luchenensis.

V.4.2. H»ng sè vËt lý vµ d÷ kiÖn phæ cña c¸c hîp chÊt

V.4.2.1. Hîp chÊt ML1: Malloluchenoside

D¹ng bét v« ®Þnh h×nh mµu tr¾ng; C24H42O11, M = 506, ESI-MS: m/z 529 [M+Na]+. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1,37 (t, 12,0)/1,70 (m, H-2), 3,86 (m, H-3), 1,95 (dd, 11,0, 6,5 Hz)/2,20 (dd, 5,0, 16,5 Hz, H-3), 1,98/2,30 (m, H-7), 1,50 (m)/1,70 (m, H-8), 3,84 (m, H-9), 1,22 (d, J = 6,5 Hz, H-10), 1,08 (s, H-11), 1,05 (s, H-12) vµ 1,66 (s, H-13), Glc: 4,34 (d, J = 8,0 Hz, H-1'), 3,16 (t, J = 9,0 Hz, H-2'), 3,83 (m, H-3'), 3,38 (dd, J = 3,0, 9,0 Hz, H-4'), 3,44 (m, H-5'), 3,62 (m)/4,03 (m, H-6'), Ara: 4,99 (dd, J = 1,5 Hz, H-1''), 4,01 (m, H-2''), 3,85 (m, H-3''), 3,98 (m, H-4'') vµ 3,60 (m)/3,74 (m, H-5''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 38,8 (C-1), 49,8 (C-2), 65,7 (C-3), 42,9 (C-4), 125,3 (C-5), 138,5 (C-6), 25,3 (C-7), 38,8 (C-8), 76,4 (C-9), 19,9 (C-10), 30,4 (C-11), 28,9 (C-12), 20,1 (C-13), Glc: 102,3 (C-1'), 75,2 (C-2'), 78,1 (C-3'), 72,2 (C-

MLE1 (0,5 g)

Silica gel CC CHCl3:MeOH, (30:1 → 1:1)

ML7 (11,5 mg)

ML3 (9 mg)

ML4 (21 mg)

ML6 (15 mg)

ML8 (12 mg)



(4:1:0,1)

Silica gel CC CHCl3:MeOH: H2O

(9:1:0,1)

ML5 (15 mg)

ML9 (18 mg)

ML10 (7,6 mg)

Silica gel CC CHCl3:MeOH:H2O (4,5:1:0,1) Silica gel CC

CHCl3:MeOH:H2O, (2:1:0,15)

MLE2 (1,4 g)

MLE3 (1,1 g)

MLE4 (0,6 g)

MLE5 (0,8 g)

MLE6 (1,0 g)

MLE-Cặn EtOAc (5,6 g)

164

4'), 76,8 (C-5'), 68,2 (C-6'), Ara: 109,9 (C-1'), 83,0 (C-2'), 78,9 (C-3'), 86,0 (C-4') vµ 63,1 (C-5').

V.4.2.2. Hîp chÊt ML2: Corilagin

KÕt tinh h×nh kim mµu tr¾ng, C27H22O18, M = 634, ESI-MS: m/z 657 [M+Na]+, m/z 633 [M-H]-, ®iÓm nãng ch¶y: 208oC, [α] D

20 - 250 (MeOH, c 0,3), UV λmax 220;

274 (MeOH). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-1), 4,01 (1H, br d, J = 2,0 Hz, H-2), 4,82 (1H, H-3), 4,48 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 4,54 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-5), 4,98 (1H, t, J = 7,0 Hz, Ha-6), 4,17 (2H, dd, J = 11,0 vµ 6,0 Hz, Hb-6), 6,71 (1H, s, H-3'), 6,68 (1H, s, H-3'') vµ 7,07 (2H, s, H-2''', H-6'''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 95,0 (C-1), 69,4 (C-2), 71,6 (C-3), 62,5 (C-4), 76,2 (C-5), 65,0 (C-6), 117,2 (C-1'), 125,5 (C-2'), 110,2 (C-3'), 145,3 (C-4'), 137,7 (C-5'), 146,4 (C-6'), 170,1 (C-7'), 116,7 (C-1''), 125,5 (C-2''), 108,3 (C-3''), 145,2 (C-4''), 138,2 (C-5''), 145,6 (C-6''), 168,5 (C-7''), 120,6 (C-1'''), 111,0 (C-2'''), 146,4 (C-3'''), 140,4 (C-4'''), 146,4 (C-5'''), 111,0 (C-6''') vµ 166,7 (C-7''').

V.4.2.3. Hîp chÊt ML3: Kaempferol

D¹ng bét mµu vµng, C15H10O6, M = 286, ESI MS: m/z 309 [M+Na]+, m/z 285 [M-H]-, ®iÓm nãng ch¶y: 276-278 0C, UV λmax: 204; 265; 365 (MeOH). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,42 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 8,11 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2', H-6') vµ 6,94 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3', H-5').

V.4.2.4. Hîp chÊt ML4: Afzelin

KÕt tinh h×nh l¨ng trô mµu vµng, C21H20O10, M = 432, ESI MS: m/z 455 [M+Na]+, 431 [M-H]-, ®iÓm nãng ch¶y: 172-174oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,78 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2', H-6'), 6,96 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3', H-5'), 5,39 ( 1H,d, J = 1,5 Hz, H-1'), 4,25 (1H, dd, J = 1,5, 5,0 Hz, H-2'), 3,75 (1H, m, H-3'), 3,70 (1H, m, H-4'), 3,36 (1H, m, H-5') vµ 0,95 (3H, d, J = 5,5, H-6'). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 159,1 (C-2), 136,2 (C-3), 179,5 (C-4), 163,1 (C-5), 100,1 (C-6), 166,5 (C-7), 94,9 (C-8), 158,6 (C-9), 105,7 (C-10), 122,6 (C-1'), 132,2 (C-2'), 116,5 (C-3'), 161,5 (C-4'), 116,2 (C-5'), 131,9 (C-6'), 103,5 (C-1''), 72,1 (C-2'), 72,0 (C-3''), 73,2 (C-4''), 71,9 (C-5'') vµ 17,6 (C-6'').

V.4.2.5. Hîp chÊt ML5 cã tÝnh chÊt vËt lý vµ c¸c th«ng sè kh¸c t¬ng tù nh hîp chÊt MN3 (Juglanin) ph©n lËp ®îc tõ c©y M.nanus

165

V.4.2.6.Hîp chÊt ML6: Astragalin

D¹ng bét v« ®Þnh h×nh mµu vµng, C21H20O11, M = 448, ESI MS: m/z 471 [M+Na]+, 447 [M-H]-, ®iÓm nãng ch¶y: 178oC, [α]D

18 +16,9 (MeOH, c 0,62). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6,17 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,40 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 8,04 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-2'), 6,93 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3', H-5'), 8,07 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6'), 5,35 (1H ,d, J = 6,5 Hz, H-1'), 3,55 (1H, m, H-2'), 3,60 (1H, m, H-3'), 3,28 (1H, m, H-4'), 3,68 (1H, m, H-5') vµ 3,77 (2H, dd, J = 6,5, 12,5 Hz, H-6').

V.4.2.7. Hîp chÊt ML7: cã tÝnh chÊt vËt lý vµ çc th«ng sè kh¸c t¬ng tù nh hîp chÊt MP7 (Quercetin) ph©n lËp ®îc tõ c©y M.paniculatus

V.4.2.8. Hîp chÊt ML8: cã tÝnh chÊt vËt lý vµ çc th«ng sè kh¸c t¬ng tù nh hîp chÊt MN6 (Quercitrin) ph©n lËp ®îc tõ c©y M.nanus

V.4.2.9.Hîp chÊt ML9: Astilbin

Bét mµu tr¾ng, C21H22O11, M = 450, ESI MS: m/z 473 [M+Na]+, 449 [M-H]-, ®iÓm nãng ch¶y: 179 - 180oC, [α]D

25 + 4 (50% Me2CO trong níc).

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 5,09 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-2), 4,58 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,97 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,85 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6'), 4,08 (1H, br s, H-1'), 3,69 - 3,31 (4H, m, H-2', H-3', H-4', H-5') vµ 1,21 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6'). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 84,0 (C-2), 78,6 (C-3), 196,0 (C-3), 165,5 (C-4), 165,5 (C-5), 97,4 (C-6), 168,6 (C-7), 96,3 (C-8), 164,1 (C-9), 102,5 (C-10), 129,2 (C-1'), 115,5 (C-2'), 146,5 (C-3'), 147,4 (C-4'), 116,4 (C-5'), 120,5 (C-6'), 102,2 (C-1'), 72,2 (C-2'), 71,8 (C-3'), 73,8 (C-4'), 70,5 (C-5') vµ 17,8 (C-6').

V.4.2.10. Hîp chÊt ML10: cã tÝnh chÊt vËt lý vµ çc th«ng sè kh¸c t¬ng tù nh hîp chÊt MN7 (Myricitrin) ph©n lËp ®îc tõ c©y M.nanus

V.4.2.11. Hîp chÊt ML11: AxÝt gallic

D¹ng tinh thÓ h×nh kim kh«ng mµu, C7H6O5, M =170, ESI MS: m/z 171 [M+H]+, 169 [M-H]-, ®iÓm nãng ch¶y: 253oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7,08 (2H, s, H-3, H-7). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 170,3 (s, C-1), 122,0 (s, C-2), 110,3 (d, C-3, C-7), 139,6 (s, C-4, C-6) vµ 146,3 (s, C-5).

V.4.2.12. Hîp chÊt ML12: cã tÝnh chÊt vËt lý vµ çc th«ng sè kh¸c t¬ng tù nh hîp chÊt MN8 (daucosterol) ph©n lËp ®îc tõ c©y M.nanus

166

V.4.2.13. Hîp chÊt ML13: cã tÝnh chÊt vËt lý vµ çc th«ng sè kh¸c t¬ng tù nh hîp chÊt MN9 (Stigmast-5-en-3-O-(6-O-eicosanoyl-β-D-glucopyranoside) ph©n lËp ®îc tõ c©y M.nanus

V.4.3. X¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc çc hîp chÊt V.4.3.1. Hîp chÊt ML1: Malloluchenoside Hîp chÊt ML1 thu ®îc díi d¹ng bét v« ®Þnh h×nh. C«ng thøc ph©n tö ®îc nhËn ®Þnh lµ C24H42O11 b»ng çc ph©n tÝch trªn phæ ESI MS vµ phæ NMR. Trªn phæ ESI-MS positive xuÊt hiÖn pic cã cêng ®é cao t¹i m/z 529 [M+Na]+.

H×nh V.4.3.1.a. Phæ ESI-MS positive cña ML1

H×nh V.4.3.1.b. Phæ 1H-NMR cña ML1

OH

O

O

OHHOHO

OO

OH

OH

HO

1

35

6810

11 12

13

1'

3'

5'

6'

1"

3"5"

H×nh V.4.3.1.c. CÊu tróc hãa häc cña ML1

Trªn phæ 1H-NMR quan s¸t thÊy tÝn hiÖu cña ba nhãm metyl bËc ba t¹i δH 1,05 (s), 1,08 (s), 1,66 (s) vµ mét nhãm metyl bËc hai t¹i δ 1,22 (d, J = 6,5 Hz). Ngoµi ra, çc tÝn hiÖu cña 2 proton anome xuÊt hiÖn t¹i δH 4,34 (d, J = 8,0 Hz), 4,99 (d, J = 1,5 Hz).

167

H×nh V.4.3.1.d. Phæ 13C-NMR cña ML1

H×nh V.4.3.1.e. Phæ DEPT cña ML1

Phæ 13C-NMR cho thÊy tÝn hiÖu cña 11 cacbon cña hai gèc ®êng bao gåm hai cacbon anomer t¹i δC 102,27 vµ 109,87. Bªn c¹nh ®ã, tÝn hiÖu cña phÇn aglycon ®Æc trng cho khung 3-hydroxy-7,8-dihydro-β-ionol. So s¸nh çc tÝn hiÖu thu ®îc víi tÝn hiÖu cña 1 chÊt ®· ®îc c«ng bè lµ (3R,9R)-3-hydroxy-7,8-dihydro-ionyl 6-O-β-D-apiofuranosyl-β-D-glucopyranoside thÊy trïng khíp phÇn aglycon vµ ®êng glucoz¬89, ngo¹i trõ çc tÝn hiÖu cña phÇn tö ®êng apioz¬. §iÒu nµy chøng tá ML1 còng cã cïng khung cÊu tróc víi hîp chÊt trªn vµ cã mét ®¬n vÞ ®êng glucoz¬ nhng kh«ng mang ®¬n vÞ ®êng apioz¬. N¨m tÝn hiÖu cacbon cña phÇn ®êng cßn l¹i t¹i δC 109,87, 83,04, 78,91, 85,99 vµ 63,06 hoµn toµn t¬ng tù nh çc tÝn hiÖu t¬ng øng cña ®êng α-L-arabinofuranoz¬ ë δC 110,8, 83,7, 79,3, 86,6 vµ 63,8 (tõ C-1'' ®Õn C-5'') nh ®· ®îc c«ng bè trong tµi liÖu90. KÕt qu¶ ph©n tÝch chi tiÕt çc t¬ng t¸c H-C trªn phæ HSQC ®îc chØ ra trªn B¶ng V.4.3.1.

H×nh V.4.3.1.f. Phæ HSQC cña ML1

168

B¶ng V.4.3.1. Sè liÖu phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR, HMBC cña ML1

C δC# δC

a, b DEPT δH a, c

(d¹ng pic, J = Hz) HMBC (H→C) Aglycone 1 40,0 38,84 C 2 49,8 49,84 CH2 1,37 (t, 12,0)/1,70 (m) 3 65,8 65,73 CH 3,86 (m)

4 40,5 42,95 CH2 1,95 (dd, 11,0, 16,5) 2,20 (dd, 5,0, 16,5) 5, 6, 2, 3

5 125,4 125,31 C 6 138,6 138,50 C 7 25,4 25,34 CH2 1,98/2,30 (m) 8 38,9 38,85 CH2 1,50/1,70 (m) 9 76,4 76,43 CH 3,84 (m) 10 19,9 19,87 CH3 1,22 (d, 6,5) 8, 9 11 30,4 30,40 CH3 1,08 (s) 1, 6, 12 12 29,0 28,94 CH3 1,05 (s) 1, 2, 11, 6 13 20,2 20,10 CH3 1,66 (s) 4, 5, 6 Glc Glc 1' 102,4 102,27 CH 4,34 (d, 8,0) 9 2' 75,2 75,16 CH 3,16 (t, 9,0) 3' 78,0 78,12 CH 3,83 (m) 4' 71,8 72,17 CH 3,38(dd, 3,0, 9,0) 5' 76,9 76,82 CH 3,44 (m) 6' 68,5 68,16 CH2 3,62/ 4,03 (m) Api Ara 1'' 110,9 109,87 CH 4,99 (d, 1,5) 6' 2'' 78,2 83,04 CH 4,01 (m) 3'' 80,6 78,91 CH 3,85 (m) 4'' 75,3 85,99 CH 3,98 (m) 5'' 65,8 63,06 CH2 3,60/3,74 (m)

a®o trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, #δC cña hîp chÊt (3R,9R)-3-hydroxy-7,8-dihydro-β-ionyl 6-O-β-D-apiofuranosyl-β-D-glucopyranoside89

Trªn phæ HMBC, t¬ng t¸c gi÷a proton H-11 (δH 1,08)/H-12 (δH 1,05) víi C-1 (δC 38,84)/C-6 (δC 138,50); t¬ng t¸c cña H-13 (δH 1,66) víi C-4 (δC 42,95)/C-5 (δC

125,31)/C-6 (δC 138,50); t¬ng t¸c cña H-4 (δH 1,95/2,20) víi C-2 (δC 49,84)/C-3 (δC

65,73)/C-5 (δC 125,31)/C-6 (δC 138,50) x¸c ®Þnh vÞ trÝ nèi ®«i t¹i C-5/C-6 vµ nhãm hydroxyl t¹i C-3. Ngoµi ra, còng trªn phæ HMBC, t¬ng t¸c cña H-1' (δH 4,34) vµ H-10 (δH 1,22) víi C-9 (δC 76,43) kh¼ng ®Þnh r»ng phÇn ®êng glucoz¬ nèi vµo C-9 b»ng liªn kÕt ete; t¬ng t¸c HMBC cña H-1'' (δH 4,99) víi C-6' cña ®êng glucoz¬ (δC 68,16) chøng tá ®êng arabinofuranoz¬ nèi vµo C-6' cña ®êng glucoz¬. Sù phï hîp hoµn toµn vÒ gi¸ trÞ ®é dÞch chuyÓn hãa häc còng nh h»ng sè t¬ng t¸c cña c¸c proton cña phÇn khung aglycon cho thÊy chóng cã cïng mét cÊu tróc lËp thÓ lµ 3R,9R.

169

H×nh V.4.3.1.g. Phæ HMBC cña ML1

HMBCCOSY OH

O

O

OHHO

HO

OO

OH

OH

HO

H×nh V.4.3.1.h. C¸c t¬ng t¸c HMBC vµ COSY chÝnh cña ML1

Trªn phæ H-H COSY, t¬ng t¸c cña H-4 víi H-3, cña H-3 víi H-2, cña H-7 víi H-8, H-8 víi H-9 vµ H-9 víi H-10 còng kh¼ng ®Þnh thªm sù chÝnh x¸c cña cÊu tróc ®· dù ®o¸n.

H×nh V.4.3.1.i. Phæ COSY cña ML1

Tõ nh÷ng d÷ kiÖn phæ vµ ph©n tÝch nªu trªn, hîp chÊt ML1 lµ (3R,9R)-3-hydroxy-7,8-dihydro-β-ionyl 6-O-α-L-arabinofuranosyl-β-D-glucopyranoside, hîp chÊt nµy ®îc chóng t«i ®Æt tªn lµ malloluchenoside. §©y lµ mét hîp chÊt míi, lÇn ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp tõ thiªn nhiªn.

170

IV.4.3.2. Hîp chÊt ML2: Corilagin Phæ 1H-NMR cña ML2 cho thÊy hai v¹ch tÝn hiÖu ®¬n t¹i δH 6,68 vµ 6,70 ®Æc trng cho hai proton cña hai vßng th¬m bÞ thÕ 5 vÞ trÝ. CÆp pic chËp t¹i δH 7,07 (br s) ®iÓn h×nh cho hai proton trªn mét vßng th¬m bÞ thÕ meta ®èi xøng nhau gîi ý cho sù cã mÆt cña mét nhãm gallyol. Trªn phæ 1H-NMR còng quan s¸t thÊy tÝn hiÖu cña mét gèc ®êng trong ®ã, tÝn hiÖu cña proton anome cã gi¸ trÞ ®é dÞch chuyÓn hãa häc cao h¬n b×nh thêng (δH 6,38, d, J = 2,0 Hz).

H×nh V.4.3.2.a. Phæ 1H-NMR cña ML2

H×nh V.4.3.2.b. Phæ 13C-NMR cña ML2

O

OH

O

OH

O

O

OH

OH

OH

O

O

HO OH

OHHO OH HO

O

1''

2'' 3''

4''

6'' 5''1'

2'3'

4'5' 6'

7"

8"9''

1"'2"' 3"'

4"'

5"'6"'1

3

6

H×nh V.4.3.2.c. CÊu tróc hãa häc cña ML2

Phæ 13C-NMR cho tÝn hiÖu ®Æc trng cña çc cacbon thuéc vßng th¬m trong vïng tõ δC 108,34 - 146,37, çc tÝn hiÖu ®Æc trng cho ba nhãm cacbonyl t¹i δC 168,51, 166,68, 170,10 cïng víi çc tÝn hiÖu cña mét ®¬n vÞ ®êng trong vïng tõ δC 62,47 - 95,03. Çc sè liÖu phæ cacbon ®îc g¸n víi çc sè liÖu proton t¬ng øng b»ng phæ HSQC vµ kÕt qu¶ ®îc tæng hîp trong b¶ng V.4.3.2.

171

B¶ng V.4.3.2. Sè liÖu phæ NMR cña ML2

C δC# δC

a, b δH a, c

(d¹ng pic, J = Hz) HMBC (H→C)

1 94,9 95,03 6,38 (d, 2,0) 7'' 2 68,9 69,45 4,01 (br d 2.0) 3 71,3 71,62 4,82* 7'' 4 62,2 62,47 4,48 (t, 2,0) 5 75,7 76,20 4,54 (t, 7,0)

6 64,4 65,01 4,98 (t, 11,0) 4,17 (dd, 11,0, 6,0) 7'

1' 115,9 117,21 - 2' 125,4 125,50 - 3' 110,2 110,17 6,71 (s) 4', 5', 7' 4' 144,9 145,30 - 5' 137,1 137,68 - 6' 146,0 146,40 - 7' 167,4 170,10 - 1'' 115,3 116,70 - 2'' 125,3 125,46 - 3'' 107,9 108,34 6,68 (s) 4'', 5'', 7' 4'' 144,7 145,21 - 5'' 136,5 138,17 - 6'' 145,3 145,62 - 7'' 168,7 168,51 - 1''' 120,3 120,68 - 2''' 110,6 110,96 7,07 (br s) 1, 4''', 6''', 7'' 3''' 146,0 146,37 - 4''' 139,5 140,39 - 5''' 146,0 146,37 - 6''' 110,6 110,96 7,07 (br s) 1, 4''', 6''', 7'' 7''' 165,4 166,68 -

a®o trong CD3OD, b 125 MHz, c500 MHz, #δC của một phần cấu tróc của 1-O-digaloyl-3,6-(R)-HHDP-β-D-glucose91.

H×nh V.4.3.2.d. Phæ HSQC cña hîp chÊt ML2

172

Ph©n tÝch chi tiÕt çc t¬ng t¸c trªn phæ 1H-1H COSY cho phÐp x¸c ®Þnh chÝnh x¸c vÞ trÝ çc proton cña ®¬n vÞ ®êng.

H×nh V.4.3.2.e. Phæ HSQC cña hîp chÊt ML2

Trªn phæ HMBC xuÊt hiÖn t¬ng t¸c cña H-1 (δH 6,38) víi mét nhãm cacbonyl (δC 166,68) cña gèc galloyl vµ H-2'''/H-6''' (δH 7,07) trªn vßng benzen cña gèc galloyl víi nhãm cacbonyl nµy. Trªn phæ HMBC còng ghi nhËn t¬ng t¸c xa gi÷a proton H-3 (δH 4,58) cña ®êng víi nhãm cacbonyl cña gèc phenoyl (δC 168,51) vµ gi÷a H-6 cña ®êng (δH 4,98) víi mét nhãm cacbonyl cña gèc phenoyl kh¸c (δC 170,10). Phæ khèi lîng phun mï ®iÖn tö ESI-MS positive cho pic tÝn hiÖu cã cêng ®é cao t¹i m/z 657 [M+Na]+ phï hîp víi c«ng thøc dù ®o¸n lµ C27H22O18 (M = 634). BÉy vµ b¾n m¶nh pic t¹i m/z 657 cho pic cã cêng ®é cao t¹i m/z 487 [M-galloyl+Na]+. Phæ ESI MS negative cho pic tÝn hiÖu cã cêng ®é cao t¹i m/z 633 [M-H]-, bÉy vµ b¾n m¶nh pic t¹i m/z 633 cho pic t¹i m/z 463 [M-galloyl-H]-. §iÒu nµy kh¼ng ®Þnh sù cã mÆt cña nhãm galloyl trªn khung ph©n tö ML2.

H×nh V.4.3.2.f. Phæ HMBC cña hîp chÊt ML2

O

OH

O

OH

O

O

OH

OH

OH

O

O

HO OH

OHHO OH HO

O

COSY

HMBC

H×nh V.4.3.2.g. Çc t¬ng t¸c COSY vµ HMBC chÝnh cña ML2

173

Víi çc ph©n tÝch nªu trªn vµ so s¸nh víi çc tµi liÖu ®· ®îc c«ng bè91,92, hîp chÊt ML2 ®îc x¸c ®Þnh lµ 1-O-galloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranoside hay cßn ®îc gäi lµ corilagin. Hîp chÊt nµy ®· ®îc ph©n lËp tõ loµi Punica gratanum92.

H×nh V.4.3.2.h. Phæ ESI-MS cña hîp chÊt ML2

V.4.3.3. Çc hîp chÊt kh¸c Çc hîp chÊt cßn l¹i ®îc x¸c ®Þnh lµ kaempferol (ML3)93, afzenin (ML4)64,65, juglanin (ML5)62, astragalin (ML6)93, quercetin (ML7)85, quercitrin (ML8)86, astilbin (ML9)62, myricitrin66, axit gallic (ML11)94, daucosterol (ML12)67 vµ stigmast-5-en-3-O-(6-O-eicosanoyl-D-glucopyranoside) (ML13)67-69, b»ng çc ph©n tÝch chi tiÕt sè liÖu phæ NMR vµ ESI-MS còng nh so s¸nh çc sè liÖu nµy víi çc sè liÖu phæ t¬ng øng ®· ®îc c«ng bè.

Tæng hîp çc chÊt ®· ®îc ph©n lËp tõ c©y çm lîn Mallotus luchenesis95

OH

O

O

OHHO

HO

OO

OH

OH

HO

1

35

6810

11 12

13

1'

3'

5'

6'

1"

3"5"

ML1 - Malloluchenoside (chÊt míi) O

OH

O

OH

O

O

OH

OH

OH

O

O

HO OH

OHHO OH HO

O

1''

2'' 3''

4''

6'' 5''1'

2'3'

4'5' 6'

7"

8"9''

1"'2"' 3"'

4"'

5"'6"'1

3

6

ML2 - Corgilagin

O

OOH

HO

OH

OR

1'

2

3456

78

9

10

2'3'

4'

5'6'

ML3 - Kaempferol, R = H

ML4 - Afzelin, R = α-L-rhamnopyranoside ML6 - Astragalin, R = β-D-glucopyranoside

O

OOH

HO

OH

O

1'

2

3456

78

9

10

2'3'

4'

5'6'

1" 3"

5"

6"

OOH

OH

OH CH3

OH

ML9 - Astilbin

OHHO

OH

OHO

ML11 - Axit gallic

CÊu tróc cña çc hîp chÊt ML7, ML8, ML10, ML13 ®îc tr×nh bµy trong phÇn tæng hîp cÊu tróc cña c©y Mallotus nanus

174

V.5. Nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus glabriusculus C©y chiÕt çnh hay cßn ®îc gäi lµ c©y kiÕt çnh cã tªn khoa häc Mallotus glabriusculus (Kurz) Pax et Hoffm thuéc hä ThÇu dÇu- Euphorbiaceae. Lµ c©y bôi cao tíi 1m, cã khi lµ c©y gç cao 8-10 m, nh¸nh nh½n h¬i dÑp. L¸ mäc ®èi, h×nh tr¸i xoan ngän m¸c, gèc trßn, chãp nhän, lóc non cã l«ng h×nh sao vÒ sau kh«ng l«ng, khi kh« cã mµu gØ s¾t dµi 11-20 cm, réng 5-9 cm, mÐp nguyªn; g©n gèc 3, çc g©n bªn chØ ®Õn gi÷a chiÒu dµi cña phiÕn, g©n phô 4-5 ®«i, cuèng l¸ ë mçi m¾t cã 1 dµi, 1 ng¾n (cã 1 l¸ lín h¬n l¸ kia); l¸ kÌm 5mm.

Mallotus glabriusculus

V.5.1. Ph©n lËp çc hîp chÊt L¸ kh« cña c©y chiÕt çnh M. glabriusculus (2,0 kg) ®îc chiÕt ba lÇn víi MeOH b»ng m¸y siªu ©m Ultrasonic 2010 ë nhiÖt ®é 40-50 oC trong vßng 20 phót. DÞch chiÕt sau ®ã ®îc c« ®Æc b»ng m¸y cÊt quay víi ¸p suÊt gi¶m ®Ó thu ®îc 35 g cÆn chiÕt MeOH. CÆn MeOH ®îc hßa vµo níc vµ ph©n líp víi CHCl3 ®Ó thu ®îc çc dÞch c« CHCl3 (15 g) vµ dÞch c« níc (18,5 g). PhÇn cÆn chiÕt CHCl3 ®îc tiÕn hµnh ph©n t¸ch trªn cét s¾c ký pha thêng víi hÖ dung m«i gradient chloroform:axetone (tõ 10:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n MGC-1 (7,5 g), MGC-2 (3,1 g), MGC-3 (4,8 g). Ph©n ®o¹n MGC-1 ®îc cho qua s¾c ký cét silica gel pha thêng sö dông hÖ dung m«i CHCl3-MeOH (30:1) thu nhËn ®îc hîp chÊt MG10 (24 mg), d¹ng kÕt tinh mµu tr¾ng. PhÇn dÞch níc sau chiÕt ®îc cho qua cét dianion sö dông hÖ dung m«i gradient MeOH-H2O (tõ 0:100 ®Õn 100:0) thu ®îc dÞch c« çc ph©n ®o¹n lÇn lît lµ: MGE-1 (9,2 g), MGE-2 (6,6 g) vµ MGE-3 (2,3 g). Ph©n ®o¹n MGE-1 ®îc ph©n t¸ch trªn s¾c ký cét silica gel pha ®¶o YMC RP-18 víi hÖ dung m«i röa gi¶i axetone–H2O (1:15) kÕt hîp víi s¾c ký cét trªn silica gel pha thêng sö dông çc hÖ dung m«i röa gi¶i thÝch hîp thu ®îc çc hîp chÊt MG1 (200 mg, tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng), MG2 (32 mg, tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng) vµ MG6 (13 mg, kÕt tinh mµu vµng). Tõ ph©n ®o¹n MGE-2, çc hîp chÊt MG4 (20 mg), MG5 (28 mg), MG7 (15 mg), MG8 (18 mg) ®· ®îc tinh chÕ lÇn lît b»ng çc cét s¾c ký silica gel pha ®¶o hÖ dung m«i axetone–H2O (1:3), pha thêng hÖ dung m«i röa gi¶i CHCl3–MeOH–H2O (4,5:1:0,1 vµ 6:1:0,1) díi d¹ng bét mµu vµng vµ tinh thÓ h×nh kim. Ph©n ®o¹n MGE-3, còng t¬ng tù nh trªn ®îc ph©n t¸ch qua cét s¾c ký silica gel pha ®¶o YMC RP-18 hÖ dung m«i röa gi¶i axetone–H2O (1:4) thu ®îc çc hîp chÊt bét mµu vµng MG3 (9 mg) vµ MG9 (21 mg).

175

H×nh V.5.1. S¬ ®å ph©n lËp çc chÊt tõ loµi Mallotus glabriusculus

V.5.2. H»ng sè vËt lý vµ d÷ kiÖn phæ cña çc hîp chÊt V.5.2.1. Hîp chÊt MG1: Hîp chÊt nµy cã tÝnh chÊt vËt lý t¬ng tù nh hîp chÊt míi MN1 ph©n lËp ®îc tõ c©y Mallotus nanus V.5.2.2. Hîp chÊt MG2: (-)-Isolariciresinol 9-O-α-L-arabinopyranoside. Tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng, ®iÓm ch¶y: 142-144oC, ®é quay cùc: [α]28

D – 54,4 (c = 0,29, MeOH), ESI-MS m/z 515 [M+Na]+ (positive) vµ 491 [M-H]- (negative), c«ng thøc ph©n tö C25H32O10 (M= 492). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6,66 (d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,79 (d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,64 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6), 4,03 (d, J = 10,5, H-7), 1,89 (m, H-8), 3,99 (dd, 10,5, 2,5, Ha-9), 3,24 (dd, 10,5, 3,5, Hb-9), 6,20 (br s, H-2′), 6,75 (br s, H-5′), 2,83 (m, H-7′), 2,08 (m, H-8′), 3,73 (m, Ha-9′), 3,76 (m, Hb-9′), 4,07 (d, J = 6,5 Hz, H-1′′), 3,60 (dd, J = 6,5, 9,0 Hz, H-2′′), 3,54 (dd, 9,0, 3,5, H-3′′), 3,80 (m, H-4′′), 3,84 (m, Ha-5′′), 3,48 (dd, J = 1,5, 12,0 Hz, Hb-5′′), 3,80 (s, 3-OMe) vµ 3,82 (s, 3′-OMe).

Chiết với MeOH (3 lần) bằng siêu âm Cất loại dung môi bằng áp suất giảm

Bổ sung 1 nước Bố sung 3 lÝt (3lÇn) chloroform

Lớp nước

Silica gel CC CHCl3:MeOH

(30:1) RP-18 CC

Axetone:H2O (1:15)

RP-18 CC Axetone:H2O

(1:3)

Silica gel CC CHCl3:MeOH: H2O (11:1:0,1)


(0:100 → 100:0)

Lớp Chloroform

Bét l¸ kh« c©y chiÕt çnh Mallotus glabriusculus

(2,0 kg)

MG- Cặn MeOH (34 g)

MGC- CÆn Chloroform (15 g)

MGE- CÆn Níc (18,5 g)

MGC-2 (3,1 g)

MGC-3 (4,8 g)

MG3 (9 mg)

MG9 (21 mg)

MGE-3 (2,3 g)

RP-18 CC Axetone:H2O

(1:4)

MG6 (13 mg)

MG2 (32 mg)

MGE-1 (9,2 g)

MG5 (28 mg)

MG8 (18 mg)

MG4 (20 mg)

MG7 (15 mg)

MGE-2 (6,6 g)

MG10 (24 mg)

MGC-1 (7,5 g)

MeOH:H2O (50:50)

MeOH:H2O (75:25)

MeOH:H2O (100:0)

MG1 (200 mg)

Silicagel CC CHCl3:MeOH

H2O (8:1:0,1)

Silica gel CC CHCl3:MeOH: H2O/ (4,5:1:0,1)

Silica gel CC CHCl3:MeOH: H2O/ (6:1:0,1)

Silica gel CC Chloroform: axeton

(10:1 → 1:1)

176

13C-NMR (125MHz, CD3OD) δ: 138,60 (C-1), 112,46 (C-2), 148,94 (C-3), 145,87 (C-4), 114,24 (C-5), 123,17 (C-6), 48,03 (C-7), 45,85 (C-8), 69,62 (C-9), 134,30 (C-1′), 117,37 (C-2′), 147,16 (C-3′), 145,16 (C-4′), 116,07 (C-5′), 129,14 (C-6′), 33,82 (C-7′), 39,89 (C-8′), 65,27 (C-9′), 105,51 (C-1′′), 72,51 (C-2′′), 74,29 (C-3′′), 69,57 (C-4′′), 66,77 (C-5′′), 56,43 (3-MeO) vµ 56,48 (3′-MeO). V.5.2.3. Hîp chÊt MG3: Tiliroside Tinh thÓ h×nh kim mµu vµng chanh, ®iÓm nãng ch¶y: 269-271oC, ®é quay cùc [α]26

D: 62 (c, 0,28 in MeOH), ESI-MS m/z 595 [M+H]+, 617 [M+Na]+ ( positive) vµ 593 [M-H]- (negative), c«ng thøc ph©n tö C30H26O13 (M = 594). 1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ: 6,11 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,31 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 8,00 (d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,83 (d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 5,25 (d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 3,47-3,52 (m, H-2′′, H-3′′, H-4′′), 3,35 (m, H-5′′), 4,20 (dd, J = 5,0, 11,5 Hz, Ha-6′′), 4,32 (dd, J = 2,0, 11,5 Hz, Hb-6′′), 6,09 (d, J = 16,0 Hz, H-2′′′), 7,42 (d, J = 16,0 Hz, H-3′′′), 7,31 (d, J = 8,5 Hz, H-5′′′, H-9′′′) vµ 6,80 (d, J = 8,5 Hz, H-6′′′, H-8′′′). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 159,35 (C-2), 135,22 (C-3), 179,41 (C-4), 162,94 (C-5), 99,97 (C-6), 165,87 (C-7), 94,83 (C-8), 158,39 (C-9), 105,62 (C-10), 122,74 (C-1′), 132,19 (C-2′, C-6′), 116,05 (C-3′, C-5′), 161,49 (C-4′), 104,80 (C-1′′), 78,02 (C-2′′), 75,73 (C-3′′), 71,73 (C-4′′), 75,80 (C-5′′), 64,33 (C-6′′), 168,79 (C-1′′′), 114,77 (C-2′′′), 146,53 (C-3′′′), 127,11 (C-4′′′), 131,15 (C-5′′′, C-9′′′), 116,78 (C-6′′′, C-8′′′) vµ 131,14 (C-7′′′). V.5.2.4. Hîp chÊt MG4: Hîp chÊt nµy cã tÝnh chÊt vËt lý t¬ng tù nh hîp chÊt ML6 ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi Mallotus luchenensis V.5.2.5. Hîp chÊt MG5: Afzelin V.5.2.6. Hîp chÊt MG6: Hîp chÊt nµy cã tÝnh chÊt vËt lý t¬ng tù nh hîp chÊt ML3 ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi Mallotus luchenensis V.5.2.7. Hîp chÊt MG7: Hîp chÊt nµy cã tÝnh chÊt vËt lý t¬ng tù nh hîp chÊt MN6 ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi Mallotus nanus V.5.2.8. Hîp chÊt MG8: Isoquercitrin ChÊt bét mµu vµng, ®iÓm nãng ch¶y: 238-2420C, ESI-MS m/z 486,9 [M+Na]+ (positive) vµ 462,9 [M-H]- (negative), c«ng thøc ph©n tö C21H20O12 (M= 464). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6,21 (d, J = 1,5 Hz, H-6), 6,40 (d, J = 1,5 Hz, H-8), 7,84 (d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,87 (d, J = 8,5 Hz, H-5′), 7,58 (dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6′), 5,16 (d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 3,64 (m, H-2′′), 3,56 (m, H-3′′), 3,53 (m, H-4′′), 3,47 (m, H-5′′), 3,85 (m, Ha-6′′) vµ 3,81 (m, Hb-6′′); 13C-NMR (125MHz, CD3OD) δ: 157,92 (C-2), 134,61 (C-3), 178,36 (C-4), 161,98 (C-5), 99,25 (C-6), 166,07 (C-7), 93,97 (C-8), 157,55 (C-9), 104,39 (C-10), 122,07 (C-1′), 116,55 (C-2′), 144,92 (C-3′), 148,90 (C-4′), 115,01 (C-5′), 122,18 (C-

177

6′), 103,49 (C-1′′), 74,73 (C-2′′), 77,13 (C-3′′), 70,22 (C-4′′), 77,37 (C-5′′) vµ 61,57 (C-6′′). V.5.2.9. Hîp chÊt MG9: Hîp chÊt nµy cã tÝnh chÊt vËt lý t¬ng tù nh hîp chÊt MN7 ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi Mallotus nanus V.5.2.10. Hîp chÊt MG9: Hîp chÊt nµy cã tÝnh chÊt vËt lý t¬ng tù nh hîp chÊt MN8 ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi Mallotus nanus vµ ML12 ph©n lËp ®îc tõ c©y Mallotus luchenensis V.5.3. X¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña çc hîp chÊt V.5.3.1. Hîp chÊt MG1: §©y lµ mét hîp chÊt cã cÊu tróc míi ®· ®îc chóng t«i ph©n lËp tõ loµi M. nanus víi hµm lîng kh¸ cao vµ ®Æt tªn lµ mallonanoside A70 V.5.3.2. Hîp chÊt MG2: (-)-Isolariciresinol-3a-O-α-L-arabinopyranoside Hîp chÊt MG2 ®îc ph©n lËp díi d¹ng tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng, kÕt qu¶ phæ khèi lîng ESI-MS t¹i m/z 515 [M+Na]+, 491 [M-H]- vµ phæ céng hëng tõ h¹t nh©n cho phÐp x¸c ®Þnh c«ng thøc ph©n tö cña nã lµ C25H32O10 (M = 492).

H×nh V.5.3.2.a. Phæ ESI-MS positive cña MG2

Trªn phæ 1H-NMR cña MG2, çc tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 3,82 (3H, s) vµ 3,80 (3H, s) kh¼ng ®Þnh sù tån t¹i cña hai nhãm metoxi. Ngoµi ra, cßn cã çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña mét ®¬n vÞ ®êng arabinopyranoside víi nhãm oximetylen ®Æc trng cho ®¬n vÞ ®êng nµy.

H3CO

HO

OH

H3CO

OH

O O

OH

OHHO12

34

5

6

1'2'

3'

4' 5'6'

7'8'

9'

78

9 1"

2"3"

4"

5"

H×nh V.5.3.2.b. CÊu tróc hãa häc cña MG2

H×nh V.5.3.2.c. Phæ 1H-NMR cña MG2

178

B¶ng V.5.3.2. Sè liÖu phæ NMR cña MG2 C #δC

a,c δCb,d DEPT δH

b, e (d¹ng pic, J = Hz) HMBC 1 137,9 138,60 C 2 114,4 112,46 CH 6,66 (d, 2,0) 3, 4, 7 3 148,5 148,94 C 4 146,5 145,87 C 5 116,5 114,24 CH 6,79 (d, 8,0) 4, 6 6 122,8 123,17 CH 6,64 (d, 8,0, 2,0) 1, 5 7 47,9 48,03 CH 4,03 (d, 10.5) 8, 9 8 45,3 45,85 CH 1,89 (m)

9 69,6 69,62 CH2 3,99 (dd, 10,5, 2,5) 3,24 (dd, 10,5, 3,5) 1, 6, 7, 8′

1′ 133,9 134,30 C 2′ 118,0 117,37 CH 6,20 (br s) 3′, 4′, 6′ 3′ 147,1 147,16 C 4′ 146,3 145,16 C 5′ 118,0 116,07 CH 6,75 (br s) 3′ 6′ 128,6 129,14 C 7′ 33,5 33,82 CH2 2,83 (m) 1′, 6′, 8′ 8′ 40,2 39,89 CH 2,08 (m)

9′ 64,9 65,27 CH2 3,73 (m) 3,76 (m) 7′

1′′ 104,7 105,51 CH 4,07 (d, 6,5) 9, 2′′, 3′′, 5′′ 2′′ 72,5 72,51 CH 3,60 (dd, 9,0, 6,5) 3′′ 3′′ 74,6 74,29 CH 3,54 (dd, 9,0, 3,5) 4′′ 69,3 69,57 CH 3,80 (m)

5′′ 66,7 66,77 CH2 3,84 (m) 3,48 (dd, 1,5, 12,0) 3′′, 4′′

3-OMe 56,2 56,43 CH3 3,80 (s) 3 3′-OMe 56,4 56,48 CH3 3,82 (s) 3′ apyridine-d5,

bCD3OD, c100 MHz, d125 MHz, e500 MHz, #δC cña (-)-isolariciresinol-3a-O-α-L-arabinopyranoside96

H×nh V.5.3.2.d. Phæ 13C-NMR cña MG2

Sù tån t¹i cña mét ®¬n vÞ ®êng α-L-arabinopyranoside ®îc kh¼ng ®Þnh bëi c¸c tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 105,51 (C-1′′), 72,51 (C-2′′), 74,29 (C-3′′), 69,57 (C-4′′) vµ 66,77 (C-5′′) ppm. Hai nhãm metoxy ®îc kh¼ng ®Þnh t¹i δ 56,43 (3-OCH3), vµ

179

56,48 (3′-OCH3) ppm. Th«ng qua phæ HSQC, ®é chuyÓn dÞch hãa häc cña çc cacbon ®îc g¸n víi çc proton t¬ng øng.

H×nh V.5.3.2.e. Phæ DEPT cña MG2

Trªn phæ 13C-NMR vµ phæ DEPT cña MG2 xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña 25 cacbon. Trong ®ã, 12 tÝn hiÖu cacbon cña 2 vßng th¬m xuÊt hiÖn trong vïng tõ δ 112,46 ®Õn 148,94 ppm. Hai tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 69,62 (CH2, C-9′) vµ 65,27 (CH2, C-9) kh¼ng ®Þnh sù tån t¹i cña 2 nhãm oxymetilen.

H×nh V.5.3.2.f. Phæ HSQC cña MG2

H×nh V.5.3.2.g. Phæ HMBC cña MG2

180

Trªn phæ HMBC, tÝn hiÖu t¬ng t¸c gi÷a proton anome δ 4,07 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-1′′) víi cacbon δ 69,62 (C-9) cho phÐp x¸c ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña ®¬n vÞ ®êng. Çc t¬ng t¸c HMBC tõ çc proton δ 3,80 (3H, s, 3′-OCH3) sang cacbon δ 147,16 (C-7) vµ tõ çc proton céng hëng t¹i δ 3,82 (3H, s, 3-OCH3) sang cacbon δ 148,94 (C-3′) kh¼ng ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña çc nhãm metoxi. B»ng çc ph©n tÝch t¬ng tù cho phÐp kh©u nèi toµn bé cÊu tróc cña hîp chÊt MG2 nh ®îc chØ ra ë h×nh V.5.3.2.f. Tõ çc ph©n tÝch nªu trªn, cïng víi sù phï hîp hoµn toµn vÒ sè liÖu phæ 13C-NMR cña MG2 so víi çc sè liÖu ®· ®îc c«ng bè96 cho phÐp kh¼ng ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña MG2 lµ (-)-isolariciresinol-3a-O-α-L-arabinopyranoside. V.5.3.3. Hîp chÊt MG3: Tiliroside Hîp chÊt MG3 nhËn ®îc díi d¹ng chÊt tinh thÓ h×nh kim cã mµu vµng. Trªn phæ 1H-NMR cña MG3 xuÊt hiÖn bèn tÝn hiÖu doublet cña 2 cÆp proton δH 8,00 (2H, d), 6,83 (2H, d) ®«i mét ë vÞ trÝ octo víi nhau bëi h»ng sè t¬ng t¸c J = 8,5 Hz. Chøng tá cã sù tån t¹i cña hai vßng th¬m ®Òu thÕ para t¹o nªn mét trôc ®èi xøng. Sù xuÊt hiÖn hai tÝn hiÖu doublet t¹i δH 6,11 vµ 6,31 ppm víi hµng sè t¬ng t¸c nhá (J = 2,0 Hz) chøng tá hai proton nµy n»m ë vÞ trÝ meta víi nhau.

H×nh V.5.3.3.a. Phæ 1H-NMR cña MG3

O

O

OOH

HO

OH

2

3456

78

9

10

1'

2'3'

4'

5'6'

1"

2" 3"

4"

5"

6"

O

OH

OH

OH

O

O

OH

1'''2'''

3'''4''' 5'''

6'''

7'''8'''

9'''

H×nh V.5.3.3.b. CÊu tróc cña hîp chÊt MG3

H×nh V.5.3.3.c. Phæ 13C-NMR cña MG3

181

Ngoµi ra, trªn phæ 1H-NMR xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña nhãm trans-coumaroyl, 4 cÆp proton ®îc x¸c ®Þnh thuéc vµo vßng th¬m cã hÖ t¬ng t¸c AA’BB’ t¹i δH 7,31, 6,80 (2H, d, J = 8,5 Hz) vµ 2 proton olefin cña mét nèi ®«i d¹ng trans δ 6,09 (1H, d, J = 16,0 Hz) vµ 7,42 (1H, d, J = 16,0 Hz). Sù cã mÆt cña mét ph©n tö ®êng còng ®îc x¸c ®Þnh bëi sù xuÊt hiÖn cña proton anome t¹i δH 5,25 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′) vµ c¸c tÝn hiÖu cña proton thuéc ph©n tö ®êng n»m trong vïng δH 3,35-4,32 ppm. Nh¸nh ph©n tö ®êng ®îc x¸c ®Þnh lµ β-glucoz¬ bëi h»ng sè t¬ng t¸c cao cña proton cacbon anome (J = 8,0 Hz) còng nh sù xuÊt hiÖn cña hai proton cña nhãm CH2OH t¹i δH 4,32 (2H, dd, J = 2,0, 11,5 Hz, H-6′′).

H×nh V.5.3.3.d. Phæ DEPT cña MG3

B¶ng V.5.3.3. Sè liÖu phæ NMR cña MG3

C #δCa,b δC

a, b DEPT δHa, d(d¹ng pic, J = Hz) HMBC (H →

C) aglycon 2 160,1 159,35 C - 3 136,0 135,22 C - 4 180,1 179,41 C - 5 163,7 162,94 C - 6 101,1 99,97 CH 6,11 (d, 2,0) 5, 7, 8, 10 7 167,6 165,87 C - 8 95,8 94,83 CH 6,31 (d, 2,0) 6, 7, 9, 10 9 159,3 158,39 C - 10 106,2 105,62 C - 1′ 123,6 122,74 C - 2′, 6′ 133,0 132,19 CH 8,00 (d, 8,5) 2, 3′, 4′, 6′ 3′, 5′ 116,8 116,05 CH 6,83 (d, 8,5) 1′, 4′, 5′ 4′ 162,3 161,49 C - glucopyranoside 1′′ 104,9 104,80 CH 5,25 (d, 8,0) 3 2′′ 78,8 78,02 CH 3.47-3.52 3′′ 76,5 75,73 CH 3.47-3.52 4′′ 72,5 71,73 CH 3,35 (m) 5′′ 76,6 75,80 CH 3.47-3.52

182

6′′ 65,1 64,33 CH2 4,20 (dd, 5,0, 11,5) 4,32 (dd, 2,0, 11,5)

1′′′

6''-O-trans-p-coumaroyl 1′′′ 169,6 168,79 C - 2′′′ 115,6 114,77 CH 6,09 (d, 16,0) 3′′′ 147,4 146,53 CH 7,42 (d, 16,0) 4′′′ 127,9 127,11 C - 5′′′, 9′′′ 132,0 131,15 CH 7,31 (d, 8,5) 6′′′, 8′′′ 117,6 116,78 CH 6,80 (d, 8,5) 7′′′ 162,0 131,14 C -

a®o trong CD3OD, b125 MHz, c400 MHz, d500 MHz. #δC cña tiliroside97

Phæ 13C-NMR vµ phæ DEPT cña MG3 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 30 cacbon trong ®ã c¸c tÝn hiÖu cña hai cacbon cacbonyl (δ 168,79 vµ 179,41), 12 cacbon bËc bèn, 13 nhãm metyl vµ 1 nhãm oximetylen, trong ®ã cã 6 cacbon thuéc vµo mét ph©n tö ®êng glucose (δ 104,80, 78,02, 75,73, 71,73, 75,80 vµ 64,33 ppm). §Ó x¸c ®Þnh vÞ trÝ cña gèc trans-coumaroyl vµ ®¬n vÞ ®êng trªn khung flavon, chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®o phæ HSQC, HMBC. T¬ng t¸c HMBC tõ proton anome H-1′′ δH 5,25 (1H, d, J = 8,0 Hz) víi cacbon C-3 (δ 135,22) kh¼ng ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña ®¬n vÞ ®êng t¹i C-3. VÞ trÝ liªn kÕt cña gèc trans-coumaroyl t¹i C-6′′ cña ®êng glucose ®îc x¸c ®Þnh bëi t¬ng t¸c HMBC gi÷a c¸c proton H-6′′ (δ 3,20 vµ 3,42) vµ cacbon C-1′′′ (δ 168,79).

H×nh V.5.3.3.e. Phæ HMBC cña MG3

O

O

OOH

HO

OH

O

OH

OH

OH

O

O

OH

H×nh V.5.3.3.f. Mét sè t¬ng t¸c HMBC chÝnh cña MG3

183

H×nh V.5.3.3.g. Phæ ESI-MS nagative cña hîp chÊt MG3

Trªn phæ khèi lîng phun mï ®iÖn tö ESI-MS cña MG3 xuÊt hiÖn pÝc cã cêng ®é cao t¹i m/z 595 [M+H]+, 617 [M+Na]+ ë chÕ ®é positive vµ m/z 593 [M-H]- ë chÕ ®é negative t¬ng øng víi c«ng thøc dù ®o¸n lµ C30H26O13 (M = 594). Phæ ESI-MS bÉy vµ b¾n m¶nh m/z 595 ë positive cho ph©n m¶nh cã cêng ®é cao ë m/z 287 [M+H-coumaroyl]+, bÉy vµ b¾n m¶nh m/z 463 ë negative cho ph©n m¶nh cã cêng ®é cao ë m/z 285 [M-H-coumaroyl]- gîi ý cho sù mÊt mét ph©n tö ®êng rhamnose vµ nhãm coumaroyl. Tõ çc d÷ kiÖn phæ trªn, cïng víi sù phï hîp vÒ sè liÖu phæ NMR cña MG3 so víi çc sè liÖu t¬ng øng ®· ®îc c«ng bè trong tµi liÖu tham kh¶o97 cã thÓ kh¼ng ®Þnh ®îc hîp chÊt MG3 lµ kaempferol-3-β-D-(6-O-trans-p-coumaroyl)-gluco-pyranoside hay cßn ®îc gäi lµ tiliroside. Hîp chÊt nµy ®· ®îc ph©n lËp tõ loµi Tilia spp vµ mét sè loµi kh¸c nh Eremocarpus setigerus, Fragaria ananass, Solanum erianthum... Tuy nhiªn, ®©y lµ lÇn ®Çu tiªn hîp chÊt nµy ®îc ph©n lËp tõ çc loµi Mallotus. V.5.3.4. Çc hîp chÊt kh¸c Çc hîp chÊt cßn l¹i ®îc x¸c ®Þnh lµ astragalin (MG4)93, afzelin (MG5)64,65, kaempferol (MG6)93, quercitrin (MG7)86, isoquercitrin (MG8)98, myricitrin (MG9)66 vµ daucosterol (MG10)67, b»ng çch ph©n tÝch chi tiÕt çc sè liÖu phæ NMR vµ MS vµ so s¸nh chóng víi çc sè liÖu ®· ®îc c«ng bè trong tµi liÖu tham kh¶o.

Tæng hîp çc chÊt ®· ®îc ph©n lËp tõ c©y chiÕt çnh Mallotus glabriusculus H3CO

HO

OH

H3CO

OH

O O

OH

OHHO12

34

5

6

1'2'

3'

4' 5'6'

7'8'

9'

78

9 1"

2"3"

4"

5"

MG2: (-)- Isolariciresinol

O

O

OOH

HO

OH

2

3456

78

9

10

1'2'

3'4'

5'6'

1"

2" 3"

4"

5"

6"

O

OH

OH

OH

O

O

OH

1'''2'''

3'''4''' 5'''

6'''

7'''8'''

9'''

MG3: Tiliroside

CÊu tróc cña çc hîp chÊt MG4 (Astragalin), MG5 (Afzelin), MG6 (Kaempferol), MG7 (Quercitrin), MG8 (Isoquercitrin), MG9 (Myricitrin), MG10 (Daucosterol) vµ MG1 (Mallonanoside A) ®· ®îc tr×nh bµy trªn çc môc tríc.

184

V.6. Nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Mallotus philippensis C©y gç nhá hoÆc trung b×nh, cao 6-12(-25) m, th©n trßn, ph©n cµnh sím, vá mµu x¸m. L¸ xÕp xo¾n èc. PhiÕn l¸ h×nh bÇu dôc, h×nh trøng-bÇu dôc hoÆc bÇu dôc-m¸c, thu«n dÇn vÒ phÝa chãp. Chãp l¸ nhän hoÆc tï, gèc l¸ tï hoÆc trßn. Hoa ®¬n tÝnh cïng gèc. Côm hoa h×nh b«ng mäc ë ®Çu cµnh hay n¸ch l¸. Côm hoa çi h×nh b«ng ë ®Çu cµnh.

Mallotus philippensis

Qu¶ h×nh cÇu dÑt, phÝa ngoµi cã phñ nhiÒu l«ng xen lÉn nhiÒu tuyÕn mµu ®á, khi chÝn nøt thµnh 3 m¶nh. H¹t h×nh cÇu hay h×nh trøng, mµu ®en. C©y thêng mäc r¶i r¸c trong çc rõng thø sinh, ®«i khi ë ven rõng, ven ®êng, trªn ®Êt sa phiÕn th¹ch, ë ®é cao 100-500 m. C©y a s¸ng, cã thÓ sinh trëng b×nh thêng trªn ®Êt nghÌo dinh dìng, kh« c»n. Kh¶ n¨ng t¸i sinh b»ng h¹t vµ t¸i sinh chåi kháe. V.6.1. Ph©n lËp çc hîp chÊt MÉu c©y M. philippensis ( 1,6 kg) ®îc chiÕt ba lÇn víi MeOH sö dông thiÕt bÞ siªu ©m Ultrasonic 2010 ë nhiÖt ®é 40-50oC trong 20 phót. DÞch chiÕt sau ®ã ®îc c« ®Æc b»ng m¸y cÊt quay díi ¸p suÊt gi¶m thu ®îc 180 g cÆn chiÕt MeOH. CÆn MeOH ®îc hßa vµo níc vµ ph©n líp lÇn lît víi hexan vµ CHCl3 thu ®îc çc dÞch c« hexan (45 g) vµ CHCl3 (55 g). PhÇn dÞch níc sau chiÕt ®îc cho qua cét dianion sö dông hÖ dung m«i gradient MeOH-H2O (tõ 0:100 ®Õn 100:0) thu ®îc çc dÞch c« ký hiÖu lµ W1 (17g), W2 (18 g) vµ W3 (14 g). PhÇn cÆn chiÕt hexan ®îc tiÕn hµnh ph©n t¸ch trªn cét s¾c ký víi hÖ dung m«i gradient hexan-clorofom (tõ 10:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n H1 (14 g), H2 (11 g), vµ H3 (7 g). Ph©n ®o¹n H2 ®îc ph©n t¸ch trªn cét s¾c ký silica gel sö dông hÖ dung m«i röa gi¶i hexan-axeton(3:1) thu ®îc hîp chÊt MPH9 (8,5 mg) vµ MPH6 (20 mg). Ph©n ®o¹n H3 ®îc t¸ch trªn cét s¾c ký silica gel sö dông hÖ dung m«i röa gi¶i hexan-clorofom(3:1) thu ®îc hîp chÊt MPH1 (14mg) CÆn chiÕt Clorofom ®îc tiÕn hµnh ph©n t¸ch trªn s¾c ký trªn cét silica gel víi hÖ dung m«i gradient CHCl3-MeOH (tõ 10:1 ®Õn 1:1) thu ®îc çc ph©n ®o¹n C1 (28,5 g), C2 (15,9 g) vµ C3 (28,0 g). Ph©n ®o¹n C1 ®îc s¾c ký trªn cét pha ®¶o YMC RP-18 sö dông hÖ dung m«i MeOH-H2O 4:1 thu ®îc çc hîp chÊt MPH7 (9.0 mg) vµ MPH8 (23,5 mg) díi d¹ng bét mµu vµng. Ph©n ®o¹n C2 ®îc ch¹y qua cét s¾c ký silica gel sö dông hÖ dung m«i röa gi¶i clorofom-metanol-H2O(5:1:0,1) thu ®îc hîp chÊt MPH3 (6,0g) và MPH4 (19,0mg). Ph©n ®o¹n C3 ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel hÖ dung m«i CHCl3-axeton (2:1:) tinh chÕ ®îc hîp chÊt MPH5 (12 mg). T¬ng tù nh vËy, tõ ph©n ®o¹n W2, hîp chÊt MPH2 (105 mg) ®îc lµm

185

s¹ch b»ng çch kÕt tinh l¹i trong MeOH. Chi tiÕt qu¸ tr×nh ph©n lËp çc hîp chÊt tõ dÞch chiÕt MeOH cña c©y M. philippensis ®îc s¬ ®å ho¸ nh ë h×nh V.6.1.

H×nh V.6.1. S¬ ®å ph©n lËp çc chÊt tõ loµi Mallotus philippensis

V.6.2. H»ng sè vËt lý vµ d÷ kiÖn phæ cña çc hîp chÊt V.5.2.1. Hîp chÊt MPH1: Bilariciresinol (chÊt míi) ChÊt bét mµu tr¾ng, ESI-MS: m/z 741 [M + Na]+ (positive), FTICR-MS m/z 741,28712 [M+Na]+ (tÝnh to¸n lý thuyÕt cho c«ng thøc C40H46O12Na, 741,28870), c«ng thøc ph©n tö C40H46O12 (M= 718). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 6,92 (d, J = 2,0 Hz, H-2, H-2''), 6,78 (d, J = 8,0 Hz, H-5, H-5''), 6,79 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6, H-6''), 4,76 (d, J = 6,5 Hz, H-7, H-7''), 2,40 (m, H-8, H-8''), 3,82 (dd, J = 11,0, 7,0 Hz, Ha-9, Ha-9''), 3,65 (dd, J = 11,0, 7,0 Hz, Hb-9, Hb-9''), 6,83 (d, J = 2,0 Hz, H-2', H-2'''), 6,75 (d, J = 2,0 Hz,

Mallotus philippensis (1,6kg)


MP-Cặn chiết MeOH (180 g) Bổ sung nước

Bố sung hexan

MPH-Cặn hexan (45 g)

MPC-Cặn CHCl3 (55 g)

Lớp nước

Bổ sung CHCl3

Dịch nước sau chiết Silica gel CC hexan:axeton (10:1 → 1:1)

MPH1 (14m g)

H2 (11 g) H3 (7 g)

Silica gel CC hexan:EtOAc (3:1)

MPH9 (8,5 mg) MPH6 (20 mg)

Silica gel CC CHCl3:MeOH (10:1 → 1:1)

C1 (28,5 g) C2 (15,9 g) C3 (28,0 g)



Silica gel CC CHCl3:Axeton (2:1)

MPH7 (9 mg) MPH8 (23,5 mg)

MPH3 (6 mg)

MPH5 (12 mg)

MPH4 (19 mg)

W1 (17 g) W2 (18 g) W3 (14 g)

MPH2 (105 mg)


(0:100 → 100:0)

Kết tinh trong MeOH

Lớp nước

Lớp hexan

Lớp CHCl3

H1 (14 g)

186

H-6', H-6'''), 2,53 (dd, J = 13,0, 12,0 Hz, Ha-7', Ha-7'''), 2,97 (dd, J = 13,0, 5,0 Hz, Hb-7', Hb-7'''), 2,77 (m, H-8', H-8'''), 4,03 (dd, J = 8,0, 7,0 Hz, Ha-9', Ha-9'''), 3,78 (dd, J = 8,0, 7,0 Hz, Hb-9', Hb-9'''), 3,83 (s, 3,3''-OCH3) và 3,88 (s, 3',3'''-OCH3). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 135,77 (C-1, C-1''), 110,75 (C-2, C-2''), 148,96 (C-3, C-3''), 147,00 (C-4, C-4''), 116,00 (C-5, C-5''), 119,86 (C-6, C-6''), 84,02 (C-7, C-7''), 53,99 (C-8, C-8''), 60,50 (C-9, C-9''), 133,27 (C-1', C-1'''), 112,28 (C-2', C-2'''), 149,47 (C-3', C-3'''), 142,79 (C-4', C-4'''), 127,06 (C-5', C-5'''), 124,68 (C-6', C-6'''), 33,78 (C-7', C-7'''), 43,80 (C-8', C-8'''), 73,57 (C-9', C-9'''), 56,42 (3,3''-OCH3) và 56,66 (3',3'''-OCH3). V.5.2.2. Hîp chÊt MPH2: Hîp chÊt nµy cã tÝnh chÊt vËt lý t¬ng tù nh hîp chÊt MN1 ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi Mallotus nanus V.5.2.3. Hîp chÊt MPH3: Hîp chÊt nµy cã tÝnh chÊt vËt lý t¬ng tù nh hîp chÊt MA3 ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi Mallotus anisopodus V.5.2.4. Hîp chÊt MPH4: 4-O-Galloylbergenin

Bét mµu n©u nh¹t, ESI-MS m/z 479 [M-H], c«ng thøc ph©n tö C21H20O13 (M = 480).

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 3,83 (1H, H-2), 3,80 (1H, H-3), 5,57 (1H, t, J = 10,0, H-4), 4,43 (1H, t, J = 10,0, H-4a), 7,11 (1H, s, H-7), 5,16 (1H, d, J = 10,0, H-10b), 4,06 (1H, d, J = 10,0, Ha-11), 3,78 (1H, Hb-11), 3,93 (3H, s, 9-OMe) vµ 7,16 (2H, s, H-2' vµ H-6').

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 83,18 (C-2), 70,16 (C-3), 76,19 (C-4), 79,17 (C-4a), 165,32 (C-6), 119,31 (C-6a), 111,25 (C-7), 152,47 (C-8), 142,47 (C-9), 149,49 (C-10), 117,03 (C-10a), 73,32 (C-10b), 62,39 (C-11), 60,91 (9-OMe), 121,29 (C-1'), 110,48 (C-2' vµ C-6'), 146,49 (C-3' vµ C-5'), 140,01 (C-4') vµ 167,78 (C-7'). V.5.2.5. Hîp chÊt MPH5: Platanoside

ChÊt bét mµu vµng, ESI-MS m/z 723 [M - H]-, c«ng thøc ph©n tö C39H32O14 (M= 724). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 6,40 (1H, brs, H-6), 6,22 (1H, brs, H-8), 7,87 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2', 6'), 7,00 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3', 5'), 5,62 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1''), 5,84 (1H, dd, J = 1,5, 3,5 Hz, H-2''), 5,32 (1H, dd, J = 3,5, 10,0 Hz, H-3''), 3,67 (1H, t, J = 10,0 Hz, H-4''), 3,58 (1H, m, H-5''), 1,07 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6''), 7,38, 7,45 (mçi tÝn hiÖu 2H, d, J = 8,5 Hz, H-2''', 6''', 2'''', 6''''), 6,76, 6,81 (mçi tÝn hiÖu 2H, d, J = 8,5 Hz, H-3''', 5''', 3'''', 5''''), 7,60, 7,64 (mçi tÝn hiÖu 1H, d, J = 16.0 Hz, H-7''', 7'''') vµ 6,29, 6,38 (mçi tÝn hiÖu 1H, d, J = 16,0 Hz, H-8''', 8'''').

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 159,06 (C-2), 135,46 (C-3), 179,31 (C-4), 163,18 (C-5), 100,29 (C-6), 165,81 (C-7), 94,83 (C-8), 158,4 (C-9), 105,93 (C-10), 122,43 (C-1'), 131,88 (C-2', 6'), 116,86 (C-3', 5'), 161,65 (C-4'), 99,92 (C-1''), 72,21 (C-2''), 73,06 (C-3''), 71,02 (C-4''), 70,91 (C-5''), 17,76 (C-6''), 127,13, 127,04 (C-1''', 1''''), 131,39, 131,19 (C-2''', 6''', 2'''', 6''''), 116,79, 116,76 (C-3''', 5''', 3'''', 5''''), 161,43, 161,21 (C-4''', 4''''), 147,70, 146,99 (C-7''', 7''''), 114,93, 114,37 (C-8''', 8'''') vµ 168,52, 167,78 (C-9''', 9'''').

187

V.5.2.6. Hîp chÊt MPH6: Dihydromyricetin KÕt tinh mµu vµng, ®iÓm ch¶y 245-246oC, ESI-MS m/z 319 [M-H]-, c«ng thøc

ph©n tö C15H12O8 (M = 320). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 4,85 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-2), 4,47 (1H,

d, J = 11,5 Hz, H-2), 5,94 (1H, brs, H-6), 5,91 (1H, brs, H-8) vµ 6,56 (2H, s, H-2', 6').

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 85,26 (C-2), 73,67 (C-3), 198,27 (C-4), 164,44 (C-5), 96,28 (C-6), 168,69 (C-7), 97,31 (C-8), 165,27 (C-9), 101,82 (C-10), 129,11 (C-1'), 108,08 (C-2', 6'), 145,87 (C-3', 5') vµ 134,91 (C-4'). V.5.2.7. Hîp chÊt MPH7: Isovitexin KÕt tinh mµu vµng, ®iÓm ch¶y 239oC, ESI-MS m/z 431 [M-H]-, c«ng thøc ph©n tö C21H20O10 (M = 432).

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 6,47 (1H, s, H-3), 6,57 (1H, s, H-8), 7,81 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2' vµ H-6'), 6,93 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3' vµ H-5'), 4,93 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-1''), 4,18 (1H, t, J = 9,5 Hz, H-2''), 3,51 (2H, H-3'' vµ H-4''), 3,46 (1H, m, H-5''), 3,77 (1H, dd, J = 5,5, 12,0 Hz, Ha-6'') vµ 3,91 (1H, dd, J = 2,5, 12,0 Hz, Hb-6'').

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 166,18 (C-2), 103,91 (C-3), 184,03 (C-4), 162,75 (C-5), 109,19 (C-6), 164,87 (C-7), 95,44 (C-8), 158,71 (C-9), 105,25 (C-10), 123,14 (C-1'), 129,43 (C-2' vµ C-6'), 117,08 (C-3' vµ C-5'), 162,00 (C-4'), 75,36 (C-1''), 72,70 (C-2''), 80,17 (C-3''), 71,84 (C-4''), 82,61 (C-5'') vµ 62,91 (C-6''). V.5.2.8. Hîp chÊt MPH8: Pachysandiol A KÕt tinh mµu tr¾ng, ®iÓm ch¶y 291-292oC, c«ng thøc ph©n tö C30H52O2 (M = 444). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,53 (1H, m, Hα-1), 1,82 (1H, dt, J = 2,5, 14,0, Hβ-1), 3,98 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2), 3,53 (1H, s, H-3), 0,94 (3H, H-23), 0,94 (3H, H-24), 0,85 (3H, br s, H-25), 1,01 (3H, br s, H-26), 0,99 (3H, H-27), 1,17 (3H, br s, H-28), 0,94(3H, H-29) vµ 0,99 (3H, H-30). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 23,9 (C-1), 71,4 (C-2), 76,5 (C-3), 43,7 (C-4), 37,8 (C-5), 41,3 (C-6), 17,5 (C-7), 53,2 (C-8), 36,5 (C-9), 52,3 (C-10), 35,3 (C-11), 30,6 (C-12), 39,7 (C-13), 38,4 (C-14), 32,3 (C-15), 36,1 (C-16), 30,5 (C-17), 42,9 (C-18), 35,5 (C-19), 28,1 (C-20), 32,8 (C-21), 39,3 (C-22), 10,9 (C-23), 15,9 (C-24), 18,1 (C-25), 18,7 (C-26), 20,1 (C-27), 32,1 (C-28), 35,0 (C-29) vµ 31,7 (C-30). V.5.2.9. Hîp chÊt MPH9: Dopaol

ChÊt d¹ng dÇu, ESI-MS m/z 177 [M + Na]+, 155 [M+H]+, 154 [M - H]-, c«ng thøc ph©n tö C8H10O3 (M= 154).

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 6,71 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,73 (1H, J = 8,0 Hz, H-5), 6,56 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6), 2,69 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-7) vµ 3.71 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-8).

188

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 131,74 (C-1), 117,02 (C-2), 145,79 (C-3), 144,27 (C-4), 116,29 (C-5), 121,26 (C-6), 39,31 (C-7) vµ 64,38 (C-8). V.6.3. X¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña çc hîp chÊt V.6.3.1. Hîp chÊt MPH1: Bilariciresinol (chÊt míi) Hîp chÊt MPH1 ®îc ph©n lËp díi d¹ng chÊt bét mµu tr¾ng. Trªn phæ 1H-NMR cña nã xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña ba proton vßng th¬m t¬ng t¸c hÖ ABX [δ 6,92 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,78 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,79 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz)] vµ hai proton t¬ng t¸c ë vÞ trÝ meta víi nhau [δ 6,83 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,75 (1H, d, J = 2,0 Hz)], kh¼ng ®Þnh sù cã mÆt cña mét vßng th¬m thÕ 3 vÞ trÝ (C-1, C-3, vµ C-4) vµ mét vßng th¬m thÕ 4 vÞ trÝ (C-1, C-3, C-4 vµ C-5). Hai nhãm metoxi ®îc x¸c ®Þnh bëi çc tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 3,83 (3H, s) và 3,88 (3H, s). Ngoµi ra, sù xuÊt hiÖn cña mét nhãm oximetin (δ 4,76, d, J = 6,5 Hz), hai nhãm oximetilen (δ 3,82/3,65, dd, J = 11,0, 7,0 Hz vµ 4,03/3,78, dd, J = 8,0, 7,0 Hz) vµ mét nhãm metilen (δ 2,53, dd, J = 13,0, 12,0 Hz/2,97, dd, J = 13,0, 5,0 Hz) gîi ý cho sù cã mÆt cña mét hîp chÊt cã d¹ng khung 4,4',9-trihydroxy-3,3'-dimethoxy-7,9'-epoxylignan.

H×nh V.6.3.1.a. Phæ 1H-NMR cña MPH1

OCH3

HO

O

HO

OH

OCH3

HO

OCH3

O

OH

H3COOH

1

234

56

7

8

9

8'

7'

9'

1'

2'3'

4'5'

6'

1"2"

3" 4"

5"6"

7"

8"

9"

1'''

2'''3'''4'''

5'''6'''

7'''

8'''9'''

R RMPH1 R = H1a R = OH

H×nh V.6.3.1.b. CÊu tróc hãa häc cña MPH1 vµ 1a

189

H×nh V.6.3.1.c. Phæ 13C-NMR cña MPH1

B¶ng V.6.3.1. Sè liÖu phæ NMR cña MPH1 vµ c¸c chÊt tham kh¶o C ##δC #δC δC

a, b δHa, c d¹ng pic (J = Hz) HMBC (H → C)

1 (1′′) 135,6 136,0 135,77 - 2 (2′′) 111,7 110,9 110,75 6,92 d (2,0) 1, 3, 4, 6 3 (3′′) 148,7 147,3 148,96 - 4 (4′′) 147,5 148,6 147,00 - 5 (5′′) 116,0 116,3 116,00 6,78 d (8,0) 6 6 (6′′) 120,4 121,8 119,86 6,79 dd (8,0, 2,0) 1, 2 7 (7′′) 84,7 83,5 84,02 4,76 d (6,5) 1, 2, 6, 8, 9, 8′, 9′ 8 (8′′) 62,1 53,7 53,99 2,40 m 9, 7′, 8′, 9′ 9 (9′′) 60,5 60,2 60,50 3,82 dd (11,0, 7,0)

3,65 dd (11,0, 7,0) 7, 7′, 8′

1′ (1′′′) 129,5 132,7 133,27 - 2′ (2′′′) 114,1 113,5 112,28 6,83 d (2,0) 3′, 4′, 6′ 3′ (3′′′) 148,6 146,3 149,47 - 4′ (4′′′) 144,0 148,6 142,79 - 5′ (5′′′) 127,2 116,5 127,06 - 6′ (6′′′) 126,6 119,4 124,68 6,75 d (2,0) 2′, 5′ 7′ (7′′′) 40,8 35,5 33,78 2,53 dd (13,0, 12,0)

2,97 dd (13,0, 5,0) 1′, 2′, 6′, 8′, 9′

8′ (8′′′) 62,1 43,3 43,80 2,77 m 9′ (9′′′) 78,1 73,2 73,57 4,03 dd (8.0, 7,0)

3,78 dd (8.0, 7,0) 7, 8, 8′

3-OCH3 55,8 56,1 56,42 3,83 s 3 3'-OCH3 56,0 56,1 56,66 3,88 s 3′ a®o trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, #δC cña (+)-lariciresinol,99 ##δC cña 1a.100

Trªn phæ 13C-NMR cña MPH1 xuÊt hiÖn 20 tÝn hiÖu cacbon. Trong ®ã, hai nhãm metoxi ®îc x¸c ®Ønh bëi c¸c tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 56,42 vµ 56,66.

190

H×nh V.6.3.1.d. Phæ 13C-NMR vµ DEPT cña MPH1

Mêi hai tÝn hiÖu cacbon n»m trong vïng δ 110,75 - 149,47 x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña hai vßng th¬m. Ngoµi ra, hai nhãm oximetilen vµ mét nhãm oximetin ®îc x¸c ®Þnh lÇn lît bëi çc tÝn hiÖu céng hëng t¹i δ 73,57 (CH2), 60,50 (CH2), vµ 84,02 (CH). Çc sè tÝn hiÖu cabon ®îc g¸n víi çc tÝn hiÖu proton t¬ng øng b»ng phæ HSQC vµ kÕt qu¶ chi tiÕt ®îc ®a ra trong b¶ng V.6.3.1.

H×nh V.6.3.1.e. Phæ HSQC cña MPH1

Tõ çc ph©n tÝch nªu trªn, sè liÖu phæ 13C-NMR cña MPH1 ®îc so s¸nh víi çc sè liÖu t¬ng øng cña (+)-lariciresinol99 vµ nhËn ®îc sù phï hîp hoµn toµn t¹i hÇu hÕt çc vÞ trÝ t¬ng øng. Sù kh¸c biÖt vÒ sè liÖu phæ gi÷a hai hîp chÊt chØ xuÊt hiÖn t¹i çc tÝn hiÖu cacbon cña vßng B. §¸ng chó ý nhÊt lµ tÝn hiÖu cña nhãm metin céng hëng t¹i δ 116,5 trong ph©n tö cña 1a ®· bÞ chuyÓn thµnh tÝn hiÖu cacbon bËc bèn vµ bÞ dÞch chuyÓn rÊt m¹nh vÒ vïng phÝa trêng thÊp t¹i δ 127,06 trong ph©n tö cña MPH1 (chªnh lÖch 10,56 ppm). D÷ kiÖn nµy cho phÐp dù ®o¸n cã sù liªn kÕt gi÷a hai ph©n tö (+)-lariciresinol t¹i vÞ trÝ C-5' vµ C-5''', t¹o thµnh mét hîp chÊt dime ®èi xøng.100 Dù ®o¸n nµy ®îc kh¼ng ®Þnh bëi kÕt qu¶ phæ khèi lîng ph©n gi¶i cao t¹i m/z 741.28712 [M+Na]+ (tÝnh to¸n lÝ thuyÕt cho c«ng thøc C40H46O12Na, 741.28870) t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C40H46O12 (M= 718) ®îc t¹o nªn tõ hai ph©n tö (+)-lariciresinol cã c«ng thøc ph©n tö lµ C20H24O6 (M= 360)

191

H×nh V.6.3.1.f. Phæ HMBC cña MPH1

OCH3

HO

O

HO

OH

OCH3

HO

OCH3

O

OH

H3COOH

H×nh V.6.3.1.g. Çc t¬ng t¸c HMBC chÝnh cña MPH1

H×nh V.6.3.1.h. Phæ FT-ICR-MS cña MPH1

Sè liÖu phæ NMR t¹i çc vÞ trÝ cña MPH1 ®îc g¸n b»ng çch so s¸nh trùc tiÕp víi çc sè liÖu t¬ng øng ®· ®îc c«ng bè cña 1a100 vµ (+)-lariciresinol99 (b¶ng V.6.3.1) vµ ®îc kh¼ng ®Þnh b»ng kÕt qu¶ phæ HMBC (h×nh V.6.3.1.g). Hãa lËp thÓ cña MPH1 ®îc x¸c ®Þnh bëi sù phï hîp hoµn toµn vÒ gi¸ trÞ ®é dÞch chuyÓn hãa häc 1H- vµ 13C-NMR còng nh sù t¸ch v¹ch vµ gi¸ trÞ h»ng sè t¬ng t¸c cña çc proton gi÷a MPH1 vµ (+)-lariciresinol99. Tõ tÊt c¶ çc ph©n tÝch nªu trªn, hîp chÊt MPH1 ®îc x¸c ®Þnh lµ bilariciresinol. §©y lµ mét hîp chÊt míi, lÇn ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp tõ thiªn nhiªn. V.6.3.2. Hîp chÊt MPH2: Mallonanoside A

192

Hîp chÊt MPH2 thu ®îc ë d¹ng bét mµu tr¾ng. Phæ 1H-, 13C-NMR vµ ESI-MS cña nã (xem phÇn h»ng sè vËt lý vµ d÷ kiÖn phæ cña çc hîp chÊt) trïng khíp víi çc phæ t¬ng øng cña hîp chÊt MN1. §iÒu nµy cho phÐp kh¼ng ®Þnh MPH2 lµ mallonanoside A70, mét hîp chÊt míi ®· ®îc chóng t«i ph©n lËp tõ loµi Mallotus nanus vµ M. glabriusculus.

OH

OMe

OHO

HOHO OH

HO

COOH

1

3

61'

2'3'

4'5'

6'2

45

H×nh V.6.3.2. CÊu tróc hãa häc cña MPH2

V.6.3.3. Hîp chÊt MPH3: Bergenin Hîp chÊt MPH3 thu ®îc ë d¹ng bét mµu tr¾ng. Phæ 1H-, 13C-NMR vµ ESI-MS cña nã (xem phÇn h»ng sè vËt lý vµ d÷ kiÖn phæ cña çc hîp chÊt) trïng khíp víi çc phæ t¬ng øng cña hîp chÊt MA3. §iÒu nµy cho phÐp kh¼ng ®Þnh MPH2 lµ bergenin74, mét hîp chÊt kh¸ phæ biÕn trong çc loµi Mallotus.

O

O

HO

OCH3

OH

O

HO

HOHO

23

11

4 4a 10b

6

6a

710a

89

10

H×nh V.6.3.3. CÊu tróc hãa häc cña MPH3

V.6.3.4. Hîp chÊt MPH4: 4-O-Galloylbergenin Hîp chÊt MPH4 thu ®îc ë d¹ng bét mµu tr¾ng. Phæ 1H-NMR cã d¹ng t¬ng tù nh phæ cña MPH2 víi sù xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña mét proton th¬m t¹i δ 7,11 (1H, s), mét nhãm metoxi t¹i δ 3,93 (3H, s) vµ H-1 cña mét ®¬n vÞ ®êng nèi víi aglycon trùc tiÕp qua nguyªn tö cacbon t¹i δ 5,16 (1H, d, J = 10,0 Hz). Sù kh¸c biÖt dÔ nhËn thÊy nhÊt lµ sù xuÊt hiÖn thªm tÝn hiÖu singlet cña 2 proton vßng th¬m t¹i δ 7,16 (2H, s).

H×nh V.6.3.4.a. Phæ 1H-NMR cña MPH4

193

O

O

HO

OCH3

OH

O

HO

HOO

23

11

4 4a 10b

6

6a

710a

89

10

O

HO

HO

HO

1'

2'3'

4'5' 6'

7'

H×nh V.6.3.4.b. CÊu tróc hãa häc cña MPH4

Sè liÖu phæ 13C-NMR cña MPH4 còng t¬ng tù nh sè liÖu cña MPH2, ngo¹i trõ sù xuÊt hiÖn thªm c¸c tÝn hiÖu cacbon cña mét gèc galloyl t¹i δ 121,29 (C), 110,48 (CH, × 2), 146,49 (CH, × 2), 140,01 (C) vµ 167,78 (C)74. C¸c d÷ kiÖn phæ nªu trªn cho phÐp s¬ bé x¸c ®Þnh MPH4 lµ mét hîp chÊt cã d¹ng khung bergenin vµ cã thªm mét nhãm galloyl trong ph©n tö. B¶ng V.6.3.4. KÕt qu¶ phæ NMR cña MPH4

C *δC δCa, b DEPT δH

a, c d¹ng pic (J = Hz) HMBC (H→C) 2 82,7 83,18 CH 3,83 (1H, m) 2, 3 3 69,9 70,16 CH 3,80 (1H, m) 4 4 75,8 76,19 CH 5,57 (1H, t, 10,0) 4, 4a, 6' 4a 78,2 79,17 CH 4,43 (1H, t, 10,0) 4, 10b 6 163,4 165,32 C 6a 119,1 119,31 C 7 110,4 111,25 CH 7,11 (1H, s) 8, 9, 10a 8 151,7 152,47 C 9 141,3 142,47 C

10 148,9 149,49 C 10a 116,5 117,03 C 10b 73,8 73,32 CH 5,16 (1H, d, 10,0) 2, 4, 4a, 10a

11 62,2 62,39 CH2 4,06 (1H, d, 10,0) 3,78 (1H, m)

9-OMe 60,7 60,91 CH3 3,93 (3H, s) 9 1' 121,3 121,29 C

2', 6' 110,3 110,48 CH 7,16 (1H, s) 1', 3', 5', 6' 3', 5' 145,8 146,49 C

4' 138,9 140,01 C 7' 166,3 167,78 C

a®o trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, *δC cña 4-O-galloylbergenin74

H×nh V.6.3.4.c. Phæ 13C-NMR cña MPH4

194

H×nh V.6.3.4.d. Phæ 13C-NMR vµ DEPT cña MPH4

H×nh V.6.3.4.e. Phæ HSQC cña MPH4

H×nh V.6.3.4.f. Phæ HMBC cña MPH4

O

O

HO

OCH3

OH

O

HO

HOO

O

HO

HO

HO H×nh V.6.3.4.g. C¸c t¬ng t¸c HMBC chÝnh cña MPH4

195

H×nh V.6.3.4.h. Phæ ESI-MS cña MPH4

So s¸nh sè liÖu phæ 13C-NMR cña MPH4 víi çc sè liÖu t¬ng øng ®· ®îc c«ng bè cña 4-O-galloylbergenin74 (b¶ng V.6.3.4) cho thÊy sù phï hîp hoµn toµn vÒ sè liÖu phæ t¹i çc vÞ trÝ t¬ng øng gi÷a hai hîp chÊt. §iÒu nµy cho phÐp dù ®o¸n vÞ trÝ liªn kÕt cña gèc galloyl t¹i C-4. §Ó kh¼ng ®Þnh dù ®o¸n trªn, chóng t«i tiÕn hµnh ®o thªm phæ HMBC. T¬ng t¸c HMBC gi÷a proton H-4 (δ 5,57) vµ cacbon carbonyl (δ 167,78) cho phÐp kh¼ng ®Þnh chÝnh x¸c vÞ trÝ liªn kÕt cña gèc galloyl t¹i C-4. Tõ tÊt c¶ çc ph©n tÝch ®· nªu, cïng víi kÕt qu¶ phæ khèi lîng ESI-MS t¹i m/z 479 [M-H]-

, t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C21H20O13 (M= 480), cho phÐp kh¼ng ®Þnh chÝnh x¸c hîp chÊt MPH4 lµ 4-O-galloylbergenin. V.6.3.5. Hîp chÊt MPH5: Platanoside Hîp chÊt MPH5 ®îc ph©n lËp díi d¹ng chÊt bét mµu vµng. C«ng thøc ph©n tö cña nã ®îc x¸c ®Þnh lµ C39H32O14 (M= 724) b»ng kÕt qu¶ phæ NMR vµ phæ ESI-MS t¹i m/z 723 [M - H]-. VÖt chÊt trªn TLC chuyÓn sang mµu vµng khi h¬ nãng vµ sö dông thuèc hiÖn mµu lµ axit sulfuric 10% cho phÐp dù ®o¸n MPH5 lµ mét hîp chÊt flavonoit.

H×nh V.6.3.5.a. Phæ ESI-MS cña MPH5

Trªn phæ 1H-NMR xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña 2 proton th¬m t¬ng t¸c ë vÞ trÝ meta víi nhau (δ 6,40 vµ 6,22, mçi tÝn hiÖu t¬ng øng 1H, br s) vµ hai 4 proton th¬m t¬ng t¸c ë vÞ trÝ octho víi nhau (δ 7,87 vµ 7,00, mçi tÝn hiÖu t¬ng øng 2H, d, J = 8,5 Hz) kh¼ng ®Þnh sù cã mÆt cña khung flavonoit d¹ng kaempferol. TÝn hiÖu proton anome t¹i δ 5,62 (1H, d, J = 1,5 Hz) vµ mét nhãm metyl bËc hai t¹i δ 1,07 (3H, d, J = 6,0 Hz) cho phÐp dù ®o¸n sù cã mÆt cña mét ®¬n vÞ ®êng α-L-rhamnopyranoside.

196

H×nh V.6.3.5.b. Phæ 1H-NMR cña MPH5

Ngoµi ra, trªn phæ 1H-NMR cña MPH5 cßn xuÊt hiÖn 4 tÝn hiÖu doublet (mçi tÝn hiÖu t¬ng øng 2H, d, J = 8,5 Hz) cña 8 proton th¬m (δ 6,76, 6,81, 7,38 vµ 7,45) ®Æc trng cho hai vßng benzen bÞ thÕ hai vÞ trÝ C-1 vµ C-4. Hai liªn kÕt ®«i ngo¹i vßng cÊu h×nh trans còng ®îc x¸c ®Þnh bëi c¸c tÝn hiÖu doublet (mçi tÝn hiÖu t¬ng øng 1H, d, J = 16,0 Hz) céng hëng t¹i δ 6,29, 6,38, 7,60 vµ 7,64). D÷ kiÖn nµy gîi ý cho sù cã mÆt cña hai nhãm trans-coumaroyl. B¶ng V.6.3.5. Sè liÖu phæ NMR cña MPH5

C *δC δCa, b DEPT δH

a, c d¹ng pic (J = Hz)

2 158,8 159,06 C - 3 135,2 135,46 C - 4 178,9 179,31 C - 5 163,0 163,18 C - 6 100,2 100,29 CH 6,40 (1H, brs) 7 165,8 165,81 C - 8 95,7 94,83 CH 6,22 (1H, brs) 9 158,8 158,4 C - 10 104,8 105,93 C - 1′ 122,5 122,43 C -

2′, 6′ 131,8 131,88 CH 7,87 (2H, d, 8,5) 3′, 5′ 116,9 116,86 CH 7,00 (2H, d, 8,5)

4′ 161,5 161,65 C - 1′′ 101,2 99,92 CH 5,62 (1H, d, 1,5) 2′′ 72,2 72,21 CH 5,84 (1H, dd, 1,5, 3,5) 3′′ 73,1 73,06 CH 5,32 (1H, dd, 3,5, 10,0) 4′′ 71,0 71,02 CH 3,67 (1H, t, 10,0) 5′′ 70,9 70,91 CH 3,58 (1H, m) 6′′ 17,9 17,76 CH3 1,07 (3H, d, 6,0)

1''', 1'''' 127,0 127,13 C -

197

126,9 127,04 2''', 6''' 2'''', 6''''

131,4 131,2

131,39 131,19

CH 7,45 (2H, d, 8,5) 7,38 (2H, d, 8,5)

3''', 5''' 3'''', 5''''

117,0 116,8

116,79 116,76

CH 6,81 (2H, d, 8,5) 6,76 (2H, d, 8,5)

4''', 4'''' 161,8 161,8

161,43 161,21

C -

7''', 7'''' 147,8 147,0

147,70 146,99

CH 7,64 (1H, d, 16.0) 7,60 (1H, d, 16.0)

8''', 8'''' 114,8 114,2

114,93 114,37

CH 6,38 (1H, d, 16,0) 6,29 (1H, d, 16,0)

9''', 9'''' 168,5 167,8

168,52 167,78

C=O -

a®o trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, *δC cña platanoside101

O

O

OH

OH

HO

O

OHO

2

36

89

10

1'

3'

5'

1" 2"3"

4"

5"

6"1'''4'''

7'''9'''

1''''4''''

7''''

9''''

OO CH3

O OH

O

OH

H×nh V.6.3.5.c. CÊu tróc hãa häc cña MPH5

H×nh V.6.3.5.d. Phæ 13C-NMR cña MPH5

Trªn phæ 13C-NMR cña MPH5 xuÊt hiÖn c¸c tÝn hiÖu cña 39 cacbon trong ®ã cã tÝn hiÖu cña phÇn khung kaempferol t¹i δ 159,06 (C-2), 135,46 (C-3), 179,31 (C-4), 163,18 (C-5), 100,29 (C-6), 165,81 (C-7), 94,83 (C-8), 158,4 (C-9), 105,93 (C-10), 122,43 (C-1'), 131,88 (C-2', 6'), 116,86 (C-3', 5') vµ 161,65 (C-4'); mét ®¬n vÞ ®êng rhamnose t¹i δ 99,92 (C-1''), 72,21 (C-2''), 73,06 (C-3''), 71,02 (C-4''), 70,91 (C-5'') vµ 17,76 (C-6''); vµ c¸c tÝn hiÖu cña hai nhãm trans-coumaroyl

198

H×nh V.6.3.5.e. Phæ 13C-NMR vµ DEPT cña MPH5

Tõ çc d÷ kiÖn nªu trªn, sè liÖu phæ 13C-NMR cña MPH5 ®îc so s¸nh víi çc gi¸ trÞ t¬ng øng ®· ®îc c«ng bè cho hîp chÊt platanoside101. Sù phï hîp hoµn toµn vÒ sè liÖu phæ t¹i çc vÞ trÝ t¬ng øng gi÷a hai hîp chÊt cho phÐp x¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña MPH5 lµ kaempferol 3-(2,3-di-E-p-coumaroyl-α-L-rhamnopyranoside hay cßn ®îc gäi lµ platanoside. V.6.3.6. Çc hîp chÊt cßn l¹i Ph©n tÝch chi tiÕt çc kÕt qu¶ phæ NMR, ESI-MS vµ so s¸nh chóng víi çc sè liÖu ®· ®îc c«ng bè trong tµi liÖu cho phÐp x¸c ®Þnh çc hîp chÊt cßn l¹i lµ dihydromyricetin (MPH6)102, isovitexin (MPH7)103, pachysandiol A (MPH8)104 vµ dopaol (MPH9)105, 106.

Tæng hîp çc chÊt ph©n lËp ®îc tõ loµi Mallotus philippensis OCH3

HO

O

HO

OH

OCH3

HO

OCH3

O

OH

H3COOH

1

234

56

7

8

9

8'

7'

9'

1'

2'3'

4'5'

6'

1"2"

3" 4"

5"6"

7"

8"

9"

1'''

2'''3'''4'''

5'''6'''

7'''

8'''9'''

R R

MPH1: Bilariciresinol (chÊt míi)

O

O

HO

OCH3

OH

O

HO

HORO

23

11

4 4a 10b

6

6a

710a

89

10

MPH3: Bergenin,

R = H MPH4: 4-O-

Galloylbergenin, R = galloyl

O

O

OH

OH

HO

O

OHO

2

36

89

10

1'

3'

5'

1" 2"3"

4"

5"

6"1'''4'''

7'''9'''

1''''4''''

7''''

9''''

OO CH3

O OH

O

OH

MPH5: Platanoside

O

OH

HO

OH

OH

OH

2

4

8

10

1'

4'

6'

3'

5'

97

56

2'

OH

3

O MPH6: Dihydromyricetin

OH

OH

HO

12

34

5 67

8

MPH9: Dopaol

HHO

HO

12

34

56

8

9

10

11 13

15

17

20

2218

2324

25 26

27

28

29 30

MPH8: Pachysandiol A

OHO

OH

OH

2

4

8

10

1'

4'

6'

3'

5'

97

56

2'

3

O

O

OHHO

HO

HO

1''3''

5''

6''

2''

4''

MPH7: Isovitexin

OH

OMe

OHO

HOHO OH

HO

COOH

1

3

61'

2'3'

4' 5'

6'2

45

MPH2: Mallonanoside A (ChÊt míi)

199

V.7. nghiªn cøu hãa häc vµ kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc c©y NghÓ r¨m (polygonum hydropiper L.) Trong qu¸ tr×nh trao ®æi khoa häc víi phÝa BØ, xÐt thÊy c©y NghÓ r¨m (Polygonum hydropiper L.) cã kÕt qu¶ ho¹t tÝnh sinh häc rÊt thó vÞ, chñ nhiÖm ®Ò tµi phÝa BØ ®· ®Ò nghÞ nghiªn cøu thªm vÒ thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y NghÓ r¨m (Polygonum hydropiper L.) víi mong muèn lµm râ h¬n thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña loµi c©y nµy nh»m thùc hiÖn nh÷ng nghiªn cøu s©u h¬n trong giai ®o¹n tiÕp theo. V.7.1. Giíi thiÖu chung Tªn khoa häc: Polygonum hydropiper L. thuéc hä Rau r¨m (Polygonaceae) Tªn viÖt nam: NghÓ r¨m, m· liÒu, rau nghÓ C©y NghÓ r¨m lµ loµi ph©n bè réng kh¾p vïng nhiÖt ®íi, cËn nhiÖt ®íi ch©u ¸ vµ mét phÇn l·nh thæ ë ch©u ¢u. ë ch©u ¸, nghÓ r¨m ®îc ghi nhËn ë Ên ®é, Th¸i lan, Philippin, Lµo vµ ViÖt Nam... ë ViÖt Nam, nghÓ r¨m cã 30 loµi, trong ®ã cã gÇn 20 loµi ®îc dïng lµm thuèc. Th©n vµ l¸ nghÓ r¨m ®îc dïng lµm thuèc trõ giun, nhuËn trµng, th«ng tiÓu, ch÷a r¾n c¾n. NghÓ r¨m t¬i dïng s¾c níc uèng ch÷a ly trùc khuÈn, viªm ruét vµ phong thÊp sng ®au.

H×nh V.7.1. H×nh ¶nh c©y Polygonum hydropiper

C¸c nghiªn cøu vÒ thµnh phÇn hãa häc loµi nghÓ r¨m Polygonum hydropiper L. ®· ®îc tiÕn hµnh tõ nh÷ng n¨m 1982. Fukuyama vµ céng sù174 ®· ph©n lËp ®îc ho¹t chÊt warburganal, kÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh cho thÊy ho¹t chÊt nµy thÓ hiÖn tiÒm n¨ng trong lÜnh vùc nghiªn cøu ho¹t tÝnh chèng ung th. Bªn c¹nh ®ã nhãm nghiªn cøu cßn phÇn lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc c¸c sesquiterpenoid nh: polygonal, polygonone, Polygodial, isopolygodial, isodrimeninol, confertifolin, drimenol, isopolygonal.

O

O

OH

9-Hydroxy-7-drimene-

11,12-dial (warburganal)

O

OH

7-Hydroxy-11-nor-8-

drimen-12-al (Polygonal)

O

O

7-Oxo-11-nor-8-drimen-12-al (Polygonone)

200

O

O

7-Drimene-11,12-dial(Polygodial)

O O 8-Drimen-12,11-olide

(confertifolin)

O

OH

11,12-Epoxy-7-drimen-11-ol (isodrimeninol)

N¨m 1983, Fukuyama vµ céng sù tiÕp tôc çc nghiªn cøu vÒ thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc loµi Polygonum hydropiper L., kÕt qu¶ ®· ph©n lËp ®îc mét hîp chÊt míi cã khung coumaryl kÕt nèi víi hîp phÇn glycoside, çc t¸c gi¶ gäi tªn lµ hydropiperoside. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh còng cho thÊy ho¹t chÊt nµy cã kh¶ n¨ng kh¸ng ung th. Bªn c¹nh ®ã çc hîp chÊt anthraquinone, ellagic acid, quercetin-3-O-glycoside còng ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc174.

O

O

O O

O

OH

OHOH

OH

O

O

O

OOH

OH

OH

OH

1',3',6'-Tricoumaroylsucrose

(hydropiperoside)

O

O

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

HO

Quercetin-3-O-glycoside

O

O

Anthraquinone

O

O

OH

OHO

O

HO

HO

Ellagic acid

N¨m 1985, çc nghiªn cøu s©u thªm vÒ thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña loµi Polygonum hydropiper cßn ph©n lËp ®îc çc hîp chÊt polygonic acid, Cinnamolide, valdiviolide vµ fuegin175.

201

O

OH

O

12-Oxo-7-drimen-11-oic acid

(polygonic acid)

O

O

Cinnamolide

O

O

HO

OH

7,11-Dihydroxyconfertifolin (fuegin)

O

O

HO

11-Hydroxy-8-drimen-12,11-olide

(valdiviolide) Nhãm nghiªn cøu Takuya Furuta vµ céng sù ®· t×m kiÕm c¸c ho¹t chÊt cã ho¹t tÝnh kh¸ng viªm tõ loµi Polygonum hydropiper, kÕt qu¶ ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc ho¹t chÊt polygonolide, ho¹t chÊt nµy thÓ hiÖn ho¹t tÝnh kh¸ng viªm tèt 176.

O

HO

O

O

8-Hydroxy-6-methoxy-3,4-dimethyl-1H-2-benzopyran-1-one. 8-Hydroxy-6-methoxy-3,4-dimethylisocoumarin (Polygonolide)

Theo mét sè t¸c gi¶ l¸ chøa nhiÒu flavonoid: quercetin-3-sulfat, isorhamnetin-3,7-disulfat vµ tamarixetin-3-glucosid-7-sulfat, 7,4’-dimethyl quercetin, 3’-methyl quercetin, quercitrin, isoquercitrin, kaempferol-3-glucoside177. C¸c t¸c gi¶ trªn còng cho thÊy tÝnh chÊt chèng « xy hãa cña mét sè flavonoid ®îc s¾p xÕp theo thø tù tõ m¹nh ®Õn yÕu: isoquercitrin >7,4’-dimethyl quercetin > quercetin > 3’-methyl quercetin.

202

O

OO CH3

HO OHOH

OH

OHHO

OH O

3-O-α-L-rhamnopyranosyloxy-3’,4’,5,7-

tetrahydroxyflavone (quercitrin)

OOH

HO O

OH

O

OH

OH

OH

O

OH 3-O-β-D-glucopyranosyloxy-4’,5,7-trihydroxyflavone (kaempferol-3-

glucoside)

OOH

HO O

OH

HO

Scutillarein-7-O-beta-D-glucopyranoside

(6-hydroxyapigenin)

O

OH

HO

HO

OH O

OH

6-hydroxyluteolin-3’,4’,5,6,7-

pentahydroxyflavone

OOH

HO O

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

HO

HO

OH

O

galloyl kaempferol 3 glucoside

O

OH

HO

HO

OH O Scutillarein

O

OOH

HO

OH

OH

O

OHOH

CH3OO C

O

OH

OH

OHO

2’’-O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl)quercitrin

OH

OOH

HO O

OH

OH

quercetin

OOH

O

OH

OH

O

OH

HO

HOO

HO

HO

6-hydroxyluteolin-7-O-beta-D-

glucopyranoside

OO H

H O

O

H O

O H

O

O H

O H

O H

O

O

H O

quercetin-3-O-beta-D-glucuronide

203

Bªn c¹nh çc nghiªn cøu nªu trªn, çc nghiªn cøu vÒ ho¹t tÝnh chèng « xy hãa tõ l¸ loµi nghÓ r¨m còng ®îc tiÕn hµnh. KÕt qu¶ cho thÊy dÞch chiÕt lµ c©y nµy cã ho¹t tÝnh chèng « xy hãa cao178.

V.7.2.KÕt qu¶ nghiªn cøu

V.7.2.1. KÕt qu¶ ph©n lËp çc hîp chÊt

• ChuÈn bÞ mÉu:

MÉu l¸ cña c©y NghÓ r¨m (25 kg), ®îc röa s¹ch, ph¬i kh« trong bãng r©m, sau ®ã sÊy kh« b»ng tñ sÊy ë nhiÖt ®é 50oC, sau cïng ®em nghiÒn nhá thµnh bét thu ®îc 5 kg bét kh«.

• Ph©n lËp çc hîp chÊt tõ c©y nghÓ r¨m (Polygonum hydropiper)

PhÇn l¸ kh« cña c©y NghÓ r¨m (3 kg) ®îc ®em nghiÒn nhá sau ®ã ®îc chiÕt víi MeOH ba lÇn. PhÇn dÞch chiÕt ®îc quay kh« díi ¸p suÊt gi¶m ®Ó t¹o thµnh cÆn chiÕt MeOH (120g). PhÇn cÆn chiÕt sau ®ã ®îc hßa víi níc vµ ph©n líp víi n-hexan, EtOH, BuOH thu ®îc cÆn chiÕt n-hexan(15g), cÆn EtOAc(40,5g), BuOH(35,0g) vµ cÆn níc.

CÆn chiÕt EtOAc (40,5g) ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel (Φ 20 x L 600 mm) víi hÖ dung m«i röa gi¶i lµ CHCl3-MeOH (tõ 30:1 ®Õn 1:1) thu ®îc 5 ph©n ®o¹n lµ F1 (3.5 g), F2 (5.8 g), F3 (6.0 g), F4 (4.0 g), F5 (8.0 g) vµ F6 (2 g). Tõ ph©n ®o¹n F2 tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét silica gel víi hÖ dung m«i CHCl3-EtOAc (5:1) thu ®îc hîp chÊt 1(vina-polygonum A, PH4A2B-16 mg) vµ hîp chÊt 2 (Quercetin, PH3C-10mg). Tõ ph©n ®o¹n F3 s¾c ký cét trªn pha ®¶o YMC RP 18 víi hÖ dung m«i MeOH: H2O (4:1) vµ tiÕn hµnh s¾c ký cét pha thêng lÆp l¹i víi hÖ dung m«i clorofoc: MeOH (7:2) thu ®îc hîp chÊt 3 (ombuin, PH3A1-32 mg).

CÆn chiÕt BuOH (35.0g) ®îc tiÕn hµnh s¾c ký trªn cét (Φ 100 x L 600 mm) víi hÖ dung m«i röa gi¶i lµ CHCl3-MeOH (tõ 50:1 ®Õn 1:5) thu ®îc çc ph©n ®o¹n tõ B1-B7. Tõ ph©n ®o¹n B2(2.5g) tiÕn hµnh s¾c ký cét ((Φ 30 x L 700 mm) víi hÖ dung m«i CHCl3-MeOH-H2O(4:1:0.2) thu ®uîc hîp chÊt 4 (hidropiperosides B, PH3A1R1A1-15mg) vµ hîp chÊt 5 (hidropiperosides A, PH4A3B1-24mg). Tõ ph©n ®o¹n B5 (10.0g) s¾c ký cét trªn pha ®¶o YMC RP 18 (RP18, Φ 50 x L 600 mm) víi hÖ dung m«i MeOH: H2O (1:5:1) vµ s¾c ký cét (Φ 20 x L 600 mm) víi hÖ dung m«i röa gi¶i CHCl3-MeOH-H2O(4:1:0.3) thu ®îc çc hîp chÊt 6 (Vanicoside A, PH3A1A2-20mg), 7(Vanicoside B, PH3A1R1B1-50mg), 8(Vanicoside E, PH3A1R2A-16mg).

204

H×nh V.7.2. S¬ ®å chiÕt ph©n ®o¹n cÆn chiÕt MeOH b»ng c¸c dung m«i n-hexane, EtOAc, BuOH vµ níc

Polygonum hydropiper L. (3 kg)

C¨n chiÕt MeOH (120g)

- ChiÕt víi MeOH ba lÇn - Quay kh« díi ¸p suÊt gi¶m

C¨n chiÕt n-hexane (120g)

n-hexane/níc (1:1)

C¨n chiÕt EtOAc (40.5 g)

Ph©n líp n-hexane

Bæ sung EtOAc

EtOAc/níc (1:1)

Ph©n líp EtOAc

Bæ sung BuOH

C¨n chiÕt BuOH(35,0g)

C¨n chiÕt níc

Ph©n líp BuOH

205

H×nh V.7.3. S¬ ®å ph©n lËp c¸c hîp chÊt tõ ph©n ®o¹n EtOAc

H×nh V.7.4. S¬ ®å ph©n lËp c¸c hîp chÊt tõ ph©n ®o¹n BuOH

C¨n chiÕt EtOAc (40.5 g)

- Cét silica gel (Φ 20 x L 600 mm) - CHCl3-MeOH (tõ 30:1 ®Õn 1:1)

F1 (3.5 g) F2 (5.8 g) F3(6.0 g) F4 (4.0 g) F5 (8.0 g) F6 (2.0 g)

- Cét silica gel - CHCl3-EtOAc (5:1)

(1) PH4A2B 16 mg

(2) PH3C 10mg

- cét silica gel - CHCl3-MeOH (3:1 v/v)

(3) PH3A1-32 mg

PH3A2

- Cét pha ®¶o YMC RP 18 - MeOH: H2O (4:1)

F3.1 14 mg

F3.2 21 mg

F3.3 32 mg

C¨n chiÕt BuOH (35.0g)

- Cét silica gel (Φ 100 x L 600 mm) - CHCl3-MeOH (tõ 50:1 ®Õn 1:5)

B1 (3.5 g) B2 (5.8 g) B3(6.0 g) B4 (4.0 g) B5 (8.0 g) B6 (2.0 g)

- S¾c ký cét ((Φ 30 x L 700 mm) - CHCl3-MeOH-H2O(4:1:0.2)

(6) PH3A1A2 20mg

(4) PH3A1R1A1 15mg

(5) PH4A3B1 24mg

- YMC RP 18 (RP18, Φ 50 x L 600 mm), - MeOH: H2O (1:5:1)

- s¾c ký cét (Φ 20 x L 600 mm) -CHCl3-MeOH-H2O(4:1:0.3)

(7) PH3A1R1B1 50mg

(8) PH3A1R2A 16mg

206

V.7.2.2. H»ng sè vËt lý vµ c¸c d÷ kiÖn phæ cña c¸c hîp chÊt V.7.2.2.1. Hîp chÊt 1(PH4A2B- vina-polygonum A, 3-O-β-D-glucopyranosyl-11α-methoxy-11,12-epoxydrim-7-ene (1): Tinh thÓ kh«ng mµu; §é quay cùc [ ]25

Dα -44.2o (c 0.5, EtOH); Phæ ESI-MS m/z: (+) 429 [M+H]+ 451 [M+Na]+, (-) 427 [M-H]-

(C22H36O8); Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) vµ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng 1 B¶ng V.7.1. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR cña hîp chÊt 1

C δCa,b# δC

a,b DEPT δHa,c (J, Hz) H-H COSY

HMBC

(H to C)

1 37.61 38.72 CH2 1.73*/1.36* H-2 2 27.13 27.12 CH2 2.05*/1.73* H-1, H-3 3 79.00 90.41 CH 3.31* H-2 4 38.75 40.16 - - H-5 5 49.22 50.93 CH 1.37* H-4, H-6 6 23.45 24.38 CH2 2.10*/2.17* H-5 7 116.92 118.19 CH 5.57 br s 5, 8, 9, 12 8 136.31 137.62 - - 9 61.40 61.60 CH 2.19* H-11 7, 8, 10, 11

10 33.17 33.96 - - H-9 11 99.23 107.32 CH 4.81* 12 68.83 69.68 CH2 4.30 br d (11.0)

4.15 br d (11.0) 7, 8, 9

7, 8, 9 13 14.86 16.70 CH3 0.96 s 3, 4, 5, 14 14 27.71 28.08 CH3 1.08 s 3, 4, 5, 13 15 14.07 14.37 CH3 0.82 s 1, 5, 9, 10 1′ 106.67 CH 4.36 d (7.5) H-2′ 3, 1′, 2′ 2′ 75.65 CH 3.25* H-1′, H-3′ 3′ 77.65 CH 3.32* H-2′, H-4′ 4′ 71.67 CH 3.31* H-3′, H-5′ 5′ 78.24 CH 3.36* H-4′, H-6′ 6′ 62.80 CH2 3.68 dd (5.5, 12.0)

3.87 dd (2.0, 12.0) H-5′ H-5′

4′, 5′ 4′, 5′

OCH3 55.68 CH3 3.38 s 11 aDo trong dung m«i CDCl3,

b125 MHz, c500 MHz, §é dÞch chuyÓn hãa häc (δ) tÝnh b»ng ppm, #δC gi¸ trÞ tham kh¶o cña hîp chÊt danilol (Echeverri, 1997).

V.7.2.2.2. Hîp chÊt 2 (Quercetin, PH3C-10mg) Tinh thÓ mµu vµng, nhiÖt ®é nãng ch¶y 313-314oC; Phæ hång ngo¹i (IR, KBr) νmax (cm-1): 3390, 3297 (br, OH), 2924, 2845 (CH), 1660 (C=O), 1616 (C=C), 1094 (C-O-C); Phæ khèi nguån ESI(+) m/z: 303 [M+H]+ (C15H10O7); Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR (500 MHz, MeOD-d4) vµ 13C-NMR (125 MHz, MeOD-d4) ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng V.7.2 B¶ng V.7.2. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR cña hîp chÊt 2

C δCa,b δH

a,c (J, Hz) C δCa,b δH

a,c (J, Hz)

2 148.0 10 104.5 3 137.2 1’ 124.2 4 177.3 2’ 116.0 7.75 (1H, d, 2.1)

207

5 162.5 3’ 146.2 6 99.2 6.20 (1H, d, 2.1) 4’ 148.7 7 165.6 5’ 116.2 6.90 (1H, d, 8.2)

8 99.4 6.41 (1H, d, 2.1) 6’ 121.7 7.65 (1H, dd, 8.2, 2.1) 9 158.2

aDo trong dung m«i MeOD-d4, b125 MHz, c500 MHz, §é dÞch chuyÓn hãa häc (δ) tÝnh b»ng ppm

V.7.2.2.3. Hîp chÊt 3 (ombuin, PH3A1-32 mg) Tinh thÓ mµu vµng, nhiÖt ®é nãng ch¶y 291-292oC, Phæ khè nguån ESI(+) m/z: 331 [M+H]+ vµ 353 [M+Na]+, nguån ESI(-) m/z: 329 [M-H]-(C17H14O7). Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) vµ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng V.7.3 B¶ng V.7.3. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR cña hîp chÊt 3

C δ#C

a,b δ#H

a,c (J, Hz) δCa,b δH

a,c (J, Hz)

2 146.8 147.03

3 135.8 136.10

4 175.7 175.97

5 160.6 160.32

6 98.1 6.18 (1H, d,2.1) 97.47 6.34 (1H, br s)

7 163.8 164.91

8 93.3 6.37(1H,d,2.1) 92.07 6.76 (1H, br s)

9 156.1 156.06

10 103.0 103.99

1’ 121.9 121.80

2’ 115.1 7.67(1H,d,2.2) 111.76 7.78 (1H, d, J = 1.5)

3’ 145.0 148.94

4’ 147.6 147.39

5’ 115.5 6.89(1H,d,8.3) 115.52 6.93 (1H, d, J = 8.0)

6’ 119.9 7.53(1H,dd,8.3,2.2) 121.86 7.73 (1H, dd, J = 8.0, 1.5)

OCH3 - 55.83 3.33(3H,s)

OCH3 - 56.02 3.36(3H,s) aDo trong dung m«i DMSO-d6,

b125 MHz, c500 MHz, §é dÞch chuyÓn hãa häc (δ) tÝnh b»ng ppm, #δC gi¸ trÞ tham kh¶o cña hîp chÊt quercetin [11].

V.7.2.2.4. Hîp chÊt 4 (hidropiperosides A) Tinh thÓ v« ®Þnh h×nh, kh«ng mµu. §iÓm nãng ch¶y 156-157oC, ®é quay cùc

20][ Dα :- 350 (c 1.0, MeOH). Phæ hång ngo¹i IR(KBr) vmax cm-1: 3300-3450(OH), 1684 (>C=O, ester), 1615(C=C), 1032(C-O-C). Phæ khèi nguån ESI(+) m/z 833[M+Na]+, nguån ESI(-) m/z 809[M-H]-, phæ khèi ph©n gi¶i cao HR-ESI-MS cho gi¸ trÞ m/z 809.2289 [M-H]- víi kÕt qu¶ tÝnh to¸n lý thuyÕt lµ 809.2293 øng víi c«ng

208

thøc C40H41O18. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) vµ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng V.7.4 B¶ng V.7.4. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR cña hîp chÊt 5

5 C δCa, b δH

a, c mult. (J, Hz)

fructose 1 64.0 4.31 d (12.0)/4.43 d (12.0) 2 104.4 - 3 78.7 4.19 d (8.5) 4 76.4 4.22* 5 80.8 4.02* 6 66.5 4.46 m/4.50 m glucose 1′ 93.8 5.45 d (7.5) 2′ 73.1 3.47* 3′ 74.7 3.75* 4′ 72.2 4.23* 5′ 72.3 3.30* 6′ 65.5 4.22 m/4.60 m phenylpropanoids (glc-6) feruloyl 1″ 127.8 - 2″ 111.7 7.21 d (2.0) 3″ 149.3 - 4″ 150.7 - 5″ 116.4 6.77 d (8.5) 6″ 124.4 7.05 dd (8.5, 2.0) 7″ 147.2 7.64 d (16.0) 8″ 115.5 6.44 d (16.0) 9″ 169.2 - O-Me 56.5 3.85 s (fruc-1) coumaroyl 1′′′ 127.1 - 2′′′ 131.3 7.45 d (8.5) 3′′′ 116.8 6.80 d (8.5) 4′′′ 161.4 - 5′′′ 116.8 6.80 d (8.5) 6′′′ 131.3 7.45 d (8.5) 7′′′ 147.2 7.65 d (16.0) 8′′′ 114.6 6.35 d (16.0) 9′′′ 168.5 - O-Me (fruc-6) coumaroyl 1′′′′ 127.1 - 2′′′′, 6′′′′ 131.2 7.33 d (8.5)

209

3′′′′, 5′′′′ 116.8 6.75 d (8.5) 4′′′′ 161.3 - 7′′′′ 146.8 7.55 d (16.0) 8′′′′ 114.9 6.26 d (16.0) 9′′′′ 169.0 - (fruc-3) 1′′′′′ 2′′′′′, 6′′′′′ 3′′′′′, 5′′′′′ 4′′′′′ 7′′′′′ 8′′′′′ 9′′′′′ CO-CH3 CO-CH3

aDo trong dung m«i CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, §é dÞch chuyÓn hãa häc (δ) tÝnh b»ng ppm, *TÝn hiÖu bÞ che khuÊt

O

OR2

OH

O

O

O

R4OHO

R3O

O

O

OH

O

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = R2 = R3= R4 = H

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'

V.7.2.2.5. Hîp chÊt 5 (hidropiperosides B, PH3A1R1A1-15mg) Tinh thÓ v« ®Þnh h×nh, kh«ng mµu. §iÓm nãng ch¶y 145-147oC, ®é quay cùc

20][ Dα :- 400 (c 1.0, MeOH). Phæ hång ngo¹i IR(KBr) vmax cm-1: 3428(OH), 1680 (>C=O, ester), 1613(C=C), 1075(C-O-C). Phæ khèi nguån ESI(+) m/z 1051[M+Na]+, nguån ESI(-) m/z 1051[M-H]-, phæ khèi ph©n gi¶i cao HR-ESI-MS cho gi¸ trÞ m/z 1027.2874 [M-H]- víi kÕt qu¶ tÝnh to¸n lý thuyÕt lµ 1027.2872 øng víi c«ng thøc C52H51O22. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) vµ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng V.7.5 B¶ng V.7.5. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR cña hîp chÊt 5

5 C δCa, b δH

a, c mult. (J, Hz)

fructose 1 66.3 4.25 d (12.0)/4.32 d (12.0) 2 103.6 - 3 79.5 5.59 d (8.5) 4 74.3 4.65*

210

5 81.1 4.20* 6 65.4 4.56 m/4.58 m glucose 1′ 90.7 5.74 d (7.5) 2′ 74.3 4.72 m 3′ 72.2 3.88* 4′ 72.1 3.40* 5′ 72.3 4.30 m 6′ 65.4 4.27 m/4.73 m Phenylpropanoids (glc-6) feruloyl 1″ 127.7 - 2″ 111.7 7.25 d (2.0) 3″ 148.3 - 4″ 150.6 - 5″ 116.5 6.78 d (8.5) 6″ 124.4 7.04 dd (8.5, 2.0) 7″ 147.2 7.63 d (16.0) 8″ 115.3 6.46 d (16.0) 9″ 169.2 - O-Me 56.5 3.87 s (fruc-1) feruloyl 1′′′ 127.7 - 2′′′ 111.7 7.21 d (2.0) 3′′′ 149.3 - 4′′′ 150.6 - 5′′′ 116.3 6.76 d (8.5) 6′′′ 124.4 7.10 dd (8.5, 2.0) 7′′′ 147.2 7.67 d (16.0) 8′′′ 115.3 6.38 d (16.0) 9′′′ 168.4 - O-Me 56.5 3.87 s (fruc-6) coumaroyl 1′′′′ 127.0 - 2′′′′, 6′′′′ 131.2 7.38 d (8.5) 3′′′′, 5′′′′ 116.8 6.78 d (8.5) 4′′′′ 161.2 - 7′′′′ 146.9 7.60 d (16.0) 8′′′′ 114.9 6.30 d (16.0) 9′′′′ 168.9 - (fruc-3) coumaroyl 1′′′′′ 127.2 - 2′′′′′, 6′′′′′ 131.3 7.45 d (8.5) 3′′′′′, 5′′′′′ 116.8 6.82 d (8.5) 4′′′′′ 161.3 -

211

7′′′′′ 147.8 7.74 d (16.0) 8′′′′′ 114.6 6.50 d (16.0) 9′′′′′ 168.3 - CO-CH3 21.0 2.12 s CO-CH3 172.5 -


O

OR2

OH

O

O

O

R4OHO

R3O

O

O

OH

O

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = OCH3, R2 = trans-p-courmaroyl, R3= Ac, R4 = H

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'

V.7.2.2.6. hîp chÊt 6 (Vanicoside A) Tinh thÓ v« ®Þnh h×nh, nhiÖt ®é nãng ch¶y 161-162oC, Phæ khèi nguån ESI(+) m/z 1021 [M + Na]+, nguån ESI(-) m/z 997 [M - H]-; C51H50O21; Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) vµ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng V.7.6 B¶ng V.7.6. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR cña hîp chÊt 6

6 C δCa, b δH

a, c mult. (J, Hz)

fructose 1 66.4 4.22 (d, J = 12.0, Ha-1)

4.32 (d, J = 12.0, Hb-1) 2 103.6 3 79.4 5.59 (d, J = 8.5) 4 74.3 4.65 (m) 5 81.0 4.23 (m) 6 65.4 4.51-4.58 (2H, m) glucose 1′ 90.6 5.73 (d, J = 7.5) 2′ 74.3 4.70 (m) 3′ 72.2 3.90 (m) 4′ 72.1 3.43 (m) 5′ 72.4 4.31 (m) 6′ 65.4 4.55 (m, Ha-6′)

4.72 (m, Hb-6′) feruloyl 1″ 127.7 2″ 111.6 7.22 (1H, d, J = 2.0) 3″ 149.3

212

4″ 150.5 5″ 116.3 6.80 (1H, d, J = 8.0) 6″ 124.5 7.04 (1H, dd, J = 8.0, 2.0) 7″ 147.2 7.65 (d, J = 16.0) 8″ 115.3 6.47 (d, J = 16.0) 9″ 169.2 O-Me 56.5 3.86 (3H, s) 3 trans-p-coumaroyl 1′′′ 127.0 × 2, 127.1 2′′′ 131.2 , 131.3, 131.5 7.31-7.45 (6H, H-2′′′/H-6′′′) 3′′′ 116.8x3 6.75-6.80 (6H, H-3′′′/ H-5′′′) 4′′′ 161.2, 161.3, 161.5 5′′′ 116.8x3 6.75-6.80 (6H, H-3′′′/ H-5′′′) 6′′′ 131.2 , 131.3, 131.5 7.31-7.45 (6H, H-2′′′/H-6′′′) 7′′′ 146.9, 147.2, 148.0 7.60-7.74 (3H, H-7′′′) 8′′′ 114.2, 114.6, 114.8 6.29-6.50 (3H, H-8′′′) 9′′′ 168.3 × 2, 168.7 acetyl CO-CH3 21.0 2.11 (3H, s) CO-CH3 172.5


V.7.2.2.7. Hîp chÊt 7 (Vanicoside B) Tinh thÓ v« ®Þnh h×nh, NhiÖt ®é nãng ch¶y 157-159oC; Phæ khèi nguån ESI(+) m/z 979 [M + Na]+, nguån ESI(-) m/z 955 [M - H]-; C«ng thøc ph©n tö C49H48O20; Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) vµ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng V.7.7 B¶ng V.7.7. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR cña hîp chÊt 7

7 C δCa, b δH

a, c mult. (J, Hz)

fructose 1 66.3 4.23 (d, J = 12.0 Hz, Ha-1)

4.34 (d, J = 12.0 Hz, Hb-1) 2 103.4 3 79.1 5.57 (d, J = 8.5) 4 74.0 4.63 (m) 5 81.0 4.25 (m) 6 65.4 4.51- 4.58 (2H, m) glucose 1′ 90.9 5.71 (d, J = 7.5) 2′ 72.92 4.65 (m) 3′ 74.9 3.91 (m) 4′ 72.26 3.42 (m) 5′ 72.4 4.33 (m) 6′ 65.7 4.55 (m, Ha-6′)

213

4.70 (m, Hb-6′) feruloyl 1″ 127.7 2″ 111.6 7.23 (d, J = 2.0) 3″ 149.3 4″ 150.6 5″ 116.3 6.81 (d, J = 8.0) 6″ 124.5 7.05 (dd, J = 8.0, 2.0) 7″ 146.8 7.67 (d, J = 16.0) 8″ 115.4 6.48 (d, J = 16.0) 9″ 169.3 O-Me 56.5 3.86 (3H, s) 3 trans-p-coumaroyl 1′′′ 127.1 2′′′ 131.2 7.32 -7.45 (6H, H-2′′′/H-6′′′) 3′′′ 116.8 6.74-6.80 (6H, H-3′′′/H-5′′′) 4′′′ 161.5 5′′′ 116.8 6.74-6.80 (6H, H-3′′′/H-5′′′) 6′′′ 131.5 7.32 -7.45 (6H, H-2′′′/H-6′′′) 7′′′ 147.2 7.61-7.74 (3H, H-7′′′) 8′′′ 114.7 6.28-6.51 (3H, H-8′′′) 9′′′ 168.5

aDo trong dung m«i CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, §é dÞch chuyÓn hãa häc (δ) tÝnh b»ng ppm, *TÝn hiÖu bÞ che khuÊt.

O

OR2

OH

O

O

O

R4OHO

R3O

O

O

OH

O

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = R3= R4 = H, R2 = trans-p-courmaroyl

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'

V.7.2.2.8. Hîp chÊt 8(Vanicoside E, ?-16mg) Tinh thÓ kh«ng mÇu, v« ®Þnh h×nh; nhiÖt ®é nãng ch¶y 143-145oC; phæ khèi nguån ESI(+) m/z: 1063 [M + Na]+, nguån ESI(-) m/z: 1039 [M - H]-; C«ng thøc ph©n tö: C53H52O22; Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) vµ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng V.7.8 B¶ng V.7.8. Gi¸ trÞ phæ 1H-NMR vµ 13C-NMR cña hîp chÊt 8

8 C δCa, b δH

a, c mult. (J, Hz)

fructose 1 66.8 4.19 (d, J = 12.0 Hz, Ha-1)

4.32 (J = 12.0 Hz, Hb-1)

214

2 104.0 3 80.0 5.52 (d, J = 8.5) 4 74.4 4.59 (m) 5 81.6 4.20 (m) 6 64.9 4.52-4.55 (2H, m) glucose 1′ 90.6 5.77 (d, J = 7.5) 2′ 74.0 4.75 (m) 3′ 70.0 4.00 (m) 4′ 72.69 3.91 (m) 5′ 70.2 4.42 (m) 6′ 66.8 4.25 (m, Ha-6′)

4.40 (m, Hb-6′) feruloyl 1″ 127.7 2″ 111.7 7.21 (d, J = 2.0) 3″ 149.3 4″ 150.8 5″ 116.4 6.80 (d, J = 8.0) 6″ 124.5 7.05 (dd, J = 8.0, 2.0) 7″ 147.3 7.65 (d, J = 16.0) 8″ 115.1 6.45 (d, J = 16.0) 9″ 169.8 O-Me 56.5 3.86 (3H, s) 3 trans-p-coumaroyl 1′′′ 127.1 2′′′ 131.2 7.32 -7.45 (6H, H-2′′′/H-

6′′′) 3′′′ 116.8 6.74-6.80 (6H, H-3′′′/H-

5′′′) 4′′′ 161.5 5′′′ 116.8 6.75 - 6.84(6H, H-3′′′/H-

5′′′) 6′′′ 131.5 7.40 -7.53 (6H, H-2′′′/H-

6′′′) 7′′′ 147.2 7.66-7.78 (3H, H-7′′′) 8′′′ 114.7 6.32-6.48 (3H, H-8′′′) 9′′′ 168.5 Acetyl 2′-COCH3 21.9 2.11 (3H,s) 2′-COCH3 172.3 4′-COCH3 20.7 1.92 (3H,s) 4′-COCH3 171.9


215

O

OR2

OH

O

O

O

R4OHO

R3O

O

O

OH

O

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = H, R2 = trans-p-courmaroyl, R3 = R4 = Ac

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'

V.7.2.3. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc çc hîp chÊt V.7.2.1. Hîp chÊt 1 (PH4A2B, vina-polygonum A, hîp chÊt míi) Phæ 1H-NMR (H×nh V.7.2.1.1) cña chÊt 1 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu doublet cña proton nèi víi cacbon anome t¹i δH= 4.36 (J=7.5 Hz), mét nhãm CH cã ®é dÞch chuyÓn ho¸ häc dÞch chuyÓn vÒ phÝa trêng thÊp h¬n so víi nh÷ng proton cña CH b×nh thêng δ 5,57 (1H brd s, H-7), sù xuÊt hiÖn cña nhãm oximethine ®îc x¸c ®Þnh t¹i tÝn hiÖu singlet δ 4,81, nhãm « xy methylene t¹i 4.3 (brd s, J=11.0 Hz) vµ 4.15 (brd s, J=11 Hz), ®iÒu nµy cho thÊy hai nhãm trªn cã thÓ nèi víi 1 nguyªn tö oxi. Ngoµi ra, ba nhãm metyl ®îc x¸c ®Þnh bëi tÝn hiÖu δ 0,82 (3H s), 0, 96 (3H s)vµ 1,08 (3H s). TÝn hiÖu cña mét nhãm metoxi t¹i δ 3.38 (3H, s).

H×nh V.7.2.1.1. Phæ 1H-NMR cña 1 Phæ 13C-NMR (H×nh V.7.2.1.2) cña hîp chÊt 1 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu t¬ng øng víi 22 cacbon bao gåm 6 tÝn hiÖu ®îc nhËn d¹ng lµ cña ph©n tö ®êng (δ 106.67, 78.24, 77.65, 75.65, 71.76 vµ 62.80), mét tÝn hiÖu cña nhãm metoxi δ 55.68, So s¸nh çc gi¸ trÞ phæ NMR cña 15 tÝn hiÖu cßn cña 1 víi çc gi¸ trÞ phæ t¬ng øng cña danilol thÊy r»ng çc vÞ trÝ t¬ng øng cña khung drimane lµ hoµn toµn phï hîp (B¶ng 1) [3,5,9].

H×nh V.7.2.1.2. Phæ 13C-NMR cña 1

216

H×nh V.7.2.1.3. Phæ Dept cña 1

Nhãm proton δ 3.31, 5.57, 4.81 t¬ng t¸c víi cac bon δ 90.41, 118, 19, 107.32 lÇn lît ®îc x¸c ®Þnh nhê vµo çc t¬ng t¸c trªn phæ DEPT (H×nh V.7.2.1.3) vµ phæ HSQC (H×nh V.7.2.1.4).

H×nh V.7.2.1.4. Phæ HSQC cña 1

T¬ng tù çc nhãm proton δ 4.3, 4.15 t¬ng t¸c víi çc bon methylene δ 69.68, nhãm proton methyl δ 0.82, 0.96 vµ 1.08 t¬ng t¸c víi çc bon δ 14.37, 16.7 vµ 28.08. Çc t¬ng t¸c kh¸c ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng 1. Sè liÖu phæ NMR t¹i tÊt c¶ çc vÞ trÝ trong ph©n tö cña hîp chÊt 1 ®îc g¸n b»ng çch so s¸nh trùc tiÕp víi çc sè liÖu phæ t¹i çc vÞ trÝ t¬ng øng cña hîp chÊt 1 vµ ®îc kh¼ng ®Þnh l¹i b»ng çc t¬ng t¸c trªn phæ céng hëng tõ h¹t nh©n hai chiÒu HMBC (h×nh 6) vµ COSY, trªn phæ H-H COSY (H×nh V.7.2.1.5) quan s¸t thÊy sù t¬ng t¸c gi÷a tÝn hiÖu cña proton H-2 víi çc proton H-1vµ H-3, t¬ng t¸c cña proton H-6 víi H-5 vµ H-7, t¬ng t¸c cña H-9 víi H-11.

H×nh V.7.2.1.5. Phæ Cosygp cña 1

217

Trªn phæ HMBC (H×nh V.7.2.1.6) cho thÊy çc t¬ng t¸c cña H-1′(δ 4.36) víi tÝn hiÖu cac bon C-3 (δ 90.41), t¬ng t¸c cña proton methoxy (δ 3.38) víi tÝn hiÖu cña cac bon C-11 (δ 107.32), t¬ng t¸c cña proton H-11(δ 4.81) víi C-8 (δ137.62) vµ t¬ng t¸c cña proton H-7(δ 5.57) víi çc tÝn hiÖu C-9(δ 61.60)/C-5(δ 50.93). Çc t¬ng t¸c trªn cho phÐp kh¼ng ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña nhãm methoxy t¹i vÞ trÝ C-11, liªn kÕt ®«i t¹i C-7/C-8 vµ liªn kÕt cña ph©n tö ®êng t¹i vÞ trÝ cacbon C-3. Ngoµi ra, çc t¬ng t¸c trªn cßn cho phÐp kh¼ng ®Þnh cÊu h×nh cña proton t¹i vÞ trÝ C-3 lµ alpha vµ liªn kÕt cña nhãm methoxy ë vÞ trÝ C-11 lµ alpha [3,5,9].

H×nh V.7.2.1.6. Phæ HMBC cña 1

Cuèi cïng cÊu tróc cña hîp chÊt 1 ®îc kh¼ng ®Þnh thªm víi kÕt qu¶ phæ khèi nguån ESI (+) (H×nh V.7.2.1.7) cho gi¸ trÞ m/z 429 [M+H]+, 451 [M+Na]+ çc gi¸ trÞ nµy t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C22H36O8.

H×nh V.7.2.1.7. Phæ MS cña 1

Nh vËy, hîp chÊt 1 ®îc x¸c ®Þnh lµ 3-O-β-D-glucopyranosyl-11α-methoxy-11,12-epoxydrim-7-ene, mét hîp chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®îc tõ thiªn nhiªn vµ ®îc gäi tªn lµ vina-polygonum A (H×nh V.7.2.1.8)

OH3CO

O

HOHO OH

O

OH 12

34

56

7

89

10

11

12

13 14

15

H×nh V.7.2.1.8. CÊu tróc cña hîp chÊt 1

V.7.2.2. Hîp chÊt 2 (Quercetin, PH3C-10mg) Trªn phæ 1H-NMR (h×nh H×nh V.7.2.2.1) cña 2 xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña 1

vßng bezen bÞ thÕ ë vÞ trÝ 1,3,4 [δ 7.57 (1H, s), 6.90 (1H, d, J=9.0) vµ 7.65 (1H, d,

218

J=9.0)]. Ngoµi ra cã tÝn hiÖu cña 2 proton th¬m kh¸c céng hëng ë δ 6.20 (1H, s) vµ δ 6.41 (1H, s).

H×nh V.7.2.2.1. Phæ 1H -NMRcña 2

C«ng thøc ph©n tö cña 2 ®îc x¸c ®Þnh lµ C15H10O7 bëi sù xuÊt hiÖn cña çc pÝc m/z: 324.8 [M+Na]+, m/z: 300.9 [M-H]- (H×nh 10)

H×nh V.7.2.2.2 Phæ khèi lîng ESI cña BF5B

Tõ nh÷ng dÉn chøng trªn cïng víi sù so s¸nh gi÷a phæ NMR cña 2 víi quercetin [10,11], cã thÓ kÕt luËn lµ 2 lµ quercetin (h×nh V.7.2.2.3), mét hîp chÊt rÊt phæ biÕn trong çc loµi thùc vËt.

O

O

OH

OH

OH

OH

HO2

345

6

78

9

10

1'2'

3'4'

5'6'


V.7.2.3. Hîp chÊt 3 (Ombuin, PH3A1-32 mg) Trªn phæ 1H-NMR (h×nh V.7.2.3.1) cña 3 xuÊt hiÖn çc tÝn hiÖu cña 1 vßng

bezen bÞ thÕ ë vÞ trÝ 1,3,4 [δ 7.78 (1H, d,1.5), 7.73 (1H, dd, 8.0, 1.5) vµ 6.93 (1H, d, 8.0)] vµ cã tÝn hiÖu cña 2 proton th¬m kh¸c céng hëng ë δ 6.34 (1H, br s) vµ δ 6.76 (1H, brd s). Ngoµi ra cßn xuÊt hiÖn thªm tÝn hiÖu cña hai nhãm metoxi t¹i δ 3.33 (3H,s) vµ 3.36 (3H,s).

H×nh V.7.2.3.1. Phæ 1H-NMR cña 3

219

Trªn phæ 13C-NMR (h×nh V.7.2.3.2a) xuÊt hiÖn 17 tÝn hiÖu çc bon trong ®ã cã 5CH, hai tÝn hiÖu cña nhãm metoxi. So s¸nh çc gi¸ trÞ phæ NMR cña 3 víi çc gi¸ trÞ phæ t¬ng øng cña quercetin cho thÊy r»ng çc vÞ trÝ t¬ng øng cña khung lµ hoµn toµn phï hîp (B¶ng 3) [11]. Sù kh¸c nhau chñ yÕu lµ sù xuÊt hiÖn cña hai tÝn hiÖu cña hai nhãm metoxi t¹i δ 55.83 vµ 56.02.

Nhãm proton δ 6.34, 6.76, 7.78, 6.93, 7.73, 3.33 vµ 3.36 t¬ng t¸c víi cac bon δ 97.47, 92.07, 111.76, 115.52, 121.86, 55.83 vµ 56.02 lÇn lît ®îc x¸c ®Þnh nhê vµo çc t¬ng t¸c trªn phæ DEPT (h×nh V.7.2.3.2b) vµ phæ HSQC (h×nh V.7.2.3.3).

H×nh V.7.2.3.2a. Phæ 13C-NMR cña 3

H×nh V.7.2.3.2b. Phæ Dept cña 3

H×nh V.7.2.3.3. Phæ HS QC cña 3

Trªn phæ HMBC (h×nh V.7.2.3.4) cho thÊy çc t¬ng t¸c cña proton nhãm metoxi (δ 3.33) víi tÝn hiÖu cac bon C-4’ (δ 147.39), t¬ng t¸c cña proton methoxy

220

(δ 3.36) víi tÝn hiÖu cña cac bon C-7 (δ 164.91). Çc t¬ng t¸c trªn cho phÐp kh¼ng ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña nhãm methoxy t¹i vÞ trÝ C-4’, C-7.


Cuèi cïng cÊu tróc cña hîp chÊt 3 ®îc kh¼ng ®Þnh thªm víi kÕt qu¶ phæ khèi nguån ESI (+) (h×nh ) 331 [M+H]+ vµ 353 [M+Na]+, nguån ESI(-) m/z: 329 [M-H]-t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C17H14O7. Hîp chÊt nµy cã tªn gäi lµ Obuin hay cßn gäi lµ 4’,6-dimethoxy-quercetin (H×nh V.7.2.3.6)


O

O

OH

OH

OCH3

OH

H3CO2

345

6

78

9

10

1'2'

3'4'

5'6'


V.7.2.4. Hîp chÊt 4 (hidropiperosides A) Phæ 1H-NMR (h×nh V.7.2.4.1) cña hîp chÊt 4 cho çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña hÖ ABX víi çc tÝn hiÖu cña proton thÕ ë çc vÞ trÝ 1,3,4 trªn vßng benzen, çc gi¸ trÞ cô thÓ nh sau δ 7.21 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2″), 6.77 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5″), vµ 7.05 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6″). Bªn c¹nh ®ã cßn cã tÝn hiÖu ®Æc trng cña trans-olefin t¹i gi¸ trÞ δ 7.64 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7″)/6.44 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8″). TÝn hiÖu cña nhãm methoxyl còng ®îc nhËn d¹ng t¹i δ 3.85 (3H, s, 3″-OMe), tÝn hiÖu nµy cho phÐp nhËn d¹ng sù cã mÆt cña nhãm feruloyl. Ngoµi ra, sù cã mÆt cña hai nhãm trans-p-coumaroyl còng ®îc nhËn d¹ng th«ng qua tÝn hiÖu ®Æc trng t¹i δ 6.75 vµ 6.80 (2H, d, J = 8.5 Hz); 7.33 vµ 7.45 (2H, d, J = 8.5 Hz); 7.55 vµ 7.65 (2H, d, J = 16.0 Hz); vµ 6.26 vµ 6.35 (1H, d, J = 16.0 Hz). Çc tÝn hiÖu cña çc proton kh¸c ®îc nhËn d¹ng lµ çc tÝn hiÖu cña ph©n tö ®êng th«ng qua çc

221

gi¸ trÞ tham kh¶o tµi liÖu (Takasaki et al., 2001; Li et al., 2002), th«ng tin nµy ®îc kh¼ng ®Þnh chÝnh x¸c th«ng qua çc thÝ nghiÖm x¸c ®Þnh ®êng.


Phæ 13C-NMR (h×nh V.7.2.4.2) cña hîp chÊt 4 xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cña 40 carbon (xem b¶ng 4) t¬ng øng víi çc tÝn hiÖu cña mét ph©n tö ®êng, mét gèc feruloyl, vµ hai nhãm trans-p-coumaroyl (Takasaki et al., 2001; Li et al., 2002).


Th«ng qua phæ Dept (h×nh V.7.2.4.3) cã thÓ x¸c nhËn sù cã mÆt cña mét nhãm methoxyl, ba nhãm methylene, vµ hai m¬i hai nhãm methine, vµ sù cã mÆt cña 14 nhãm cac bon bËc 4.


Sù t¬ng t¸c cña çc nguyªn tö çc bon vµ proton ®îc x¸c nhËn th«ng qua çc tÝn hiÖu trªn phæ HSQC (h×nh V.7.2.4.4). Phæ khèi nguån ESI(+) (h×nh V.7.2.4.5) xuÊt hiÖn gi¸ trÞ peak ion t¹i m/z 833 [M + Na]+ vµ nguån ESI(-) xuÊt hiÖn peak ion t¹i m/z 809 [M - H]-, çc tÝn hiÖu trªn cho phÐp gi¶ thiÕt c«ng thøc ph©n tö cña hîp chÊt 4 cã thÓ lµ C40H42O18 (M = 810), víi c«ng thøc ph©n tö vµ çc gi¸ trÞ ph©n tÝch vÒ tÝn hiÖu phæ NMR nªu trªn cã thÓ gi¶ thuyÕt cÊu tróc cña hîp chÊt 4 t¬ng tù cÊu tróc cña lapathoside C.

222



Khi so s¸nh çc gi¸ trÞ phæ NMR cña hîp chÊt 4 víi gi¸ trÞ tham kh¶o cña lapathoside C (Takasaki et al., 2001) thÊy cã nhiÒu ®iÓm t¬ng ®ång (xem b¶ng 4). Tuy nhiªn, th«ng qua viÖc so s¸nh çc gi¸ trÞ phæ cho thÊy cã mét vµi ®iÓm kh¸c nhau vÒ çc tÝn hiÖu phæ. §iÓm kh¸c nhau chñ yÕu ë tÝn hiÖu cña gèc fructose, qua ®ã cã thÓ gi¶ thuyÕt cÊu tróc cña 4 lµ mét isomer h×nh thµnh trong qu¸ tr×nh este hãa hîp chÊt lapathoside C. Xem xÐt l¹i çc gi¸ trÞ phæ NMR cña hîp chÊt 4 so víi çc gi¸ trÞ phæ cña lapathoside C (Takasaki et al., 2001), kÕt hîp víi çc tÝn hiÖu trªn phæ HSQC, HMBC (h×nh V.7.2.4.6) vµ phæ COSY (h×nh V.7.2.4.7) cho thÊy tÝn hiÖu cña proton H-3 dÞch chuyÓn vÒ phÝa trêng cao víi gi¸ trÞ cô thÓ lµ δ 5.65, trong khi ®ã tÝn hiÖu cña proton nµy lµ δ 4.19 trªn cÊu tróc cña lapathoside C. Nh vËy nhãm coumaroyl kh«ng thÓ g¾n vµo vÞ trÝ C-3 trªn cÊu tróc cña 4.


223

Trªn phæ HMBC cho t¬ng t¸c cña proton H-1 (δ 4.31/4.43) víi C-9′′′ (δ 168.5) vµ proton H-6 (δ 4.46/4.50) víi C-9′′′′ (δ 169.0), t¬ng t¸c nµy còng ®îc kh¼ng ®Þnh l¹i th«ng qua viÖc so s¸nh víi çc gi¸ trÞ cña 1-p-O-coumaroyl-6-O-feruroyl)-β-D-fructofuranosyl-α-D-glucopyranoside (Li et al. 2002). T¬ng t¸c cña H-6′ (δ 4.22/4.60) víi C-9′′ (δ 169.2) ®îc qua s¸t th«ng qua gi¸ trÞ trªn phæ HMBC, kh¼ng ®Þnh sù cã mÆt cña nhãm feruloyl t¹i C-6′. Çc kÕt qu¶ ph©n tÝch trªn cho phÐp kh¼ng ®Þnh cÊu tróc cña hîp chÊt 4 lµ 6′-feruloyl-1,6-di-p-coumaroyl sucrose, mét hîp chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®îc tõ hîp chÊt thiªn nhiªn vµ ®îc gäi tªn lµ hidropiperosides A.

O

OR2

OH

O

OO

R4OHO

R3O

O

O

OHO

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = R2 = R3= R4 = H

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'


V.7.2.5. Hîp chÊt 5 (hidropiperosides B, PH3A1R1A1-15mg) Çc gi¸ trÞ phæ NMR (h×nh V.7.2.5.1, h×nh V.7.2.5.2, V.7.2.5.3) cña hîp chÊt 5 t¬ng tù nh gi¸ trÞ phæ cña hîp chÊt 4. Khi so s¸nh çc tÝn hiÖu cña hai hîp chÊt nµy cã thÓ dÔ dµng nhËn thÊy sù kh¸c nhau chñ yÕu gi÷a hai hîp chÊt thÓ hiÖn sù cã mÆt cña mét nhãm acetyl vµ mét nhãm feruloyl trªn cÊu tróc cña hîp chÊt 5. Gi¶ thuyÕt nµy ®îc kh¼ng ®Þnh th«ng qua gi¸ trÞ phæ khèi nguån ESI(+) víi gi¸ trÞ m/z 1051 [M + Na]+ vµ nguån ESI(-) víi gi¸ trÞ m/z 1027 [M - H]-, t¬ng øng víi c«ng thøc ph©n tö C52H52O22 (M = 1028).



224


Toµn bé çc vÞ trÝ trªn cÊu tróc cña hîp chÊt 5 ®îc kh¼ng ®Þnh th«ng qua çc tÝn hiÖu cña phæ HSQC (H×nh V.7.2.5.4) vµ phæ HMBC (h×nh V.7.2.5.5) vµ th«ng qua viÖc so s¸nh víi çc gi¸ trÞ phæ cña hîp chÊt lapathoside A (Takasaki et al., 2001) vµ vanicoside A (Zimmermann and Sneden, 1994).


VÞ trÝ este hãa cña nhãm feruloyl t¹i C-1 vµ C-6′ ®îc kh¼ng ®Þnh th«ng qua phæ HMBC víi çc t¬ng t¸c cña H-1 (δ 4.25/4.32) víi C-9′′′ (δ 168.4) vµ t¬ng t¸c cña H-6′ (4.27/4.73) víi C-9′′ (δ 169.2). T¬ng t¸c gi÷a H-3 (δ 5.59) vµ C-9′′′′′ (δ 168.3), gi÷a H-6 (δ 4.56/4.58) vµ C-9′′′′ (δ 168.9) còng ®îc quan s¸t vµ kh¼ng ®Þnh th«ng qua phæ HMBC.


225

§iÒu nµy cho phÐp kh¼ng ®Þnh vÞ trÝ este hãa cña nhãm coumaroyl t¹i C-3 vµ C-6. Cuèi cïng, liªn kÕt cña nhãm acetyl ë vÞ trÝ C-2’ còng ®îc kh¼ng ®Þnh th«ng qua t¬ng t¸c cña H-2′ (δ 4.72) víi çc bon cña nh¸nh acetyl (δ 172.5). Çc kÕt qu¶ ph©n tÝch trªn cho phÐp kh¼ng ®Þnh cÊu tróc cña hîp chÊt 4 lµ 2′-acetyl-1,6′-diferuloyl-3,6-di-p-coumaroyl sucrose, mét hîp chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®îc tõ hîp chÊt thiªn nhiªn vµ ®îc gäi tªn lµ hidropiperosides B.

O

OR2

OH

O

O

O

R4OHO

R3O

O

O

OH

O

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = OCH3, R2 = trans-p-courmaroyl, R3= Ac, R4 = H

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'

V.7.2.10.hîp chÊt 10 (Vanicoside A) Çc tÝn hiÖu trªn phæ 1H-NMR (H×nh V.7.2.6.1) cña hîp chÊt 6 t¹i vïng 6.29 ®Õn 7.78 rÊt phøc t¹p, gi¸ trÞ tÝch ph©n t¹i vïng tÝn hiÖu nµy cho thÊy cã kho¶ng 23 proton. §i s©u vµo ph©n tÝch çc tÝn hiÖn trªn phæ 1H-NMR trªn vïng tÝn hiÖu trªn cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña bèn cÆp tÝn hiÖu doublet t¹i çc gi¸ trÞ 6.38-7.62 ppm, 6.42-7.69 ppm, 6.43-7.75 ppm vµ 6.58-7.64 ppm. Çc ph©n tÝch trªn cho phÐp gi¶ thuyÕt sù cã mÆt cña bèn liªn kÕt ®«i d¹ng trans, mçi nhãm liªn kÕt nµy g¾n trùc tiÕp víi mét nhãm cacbonyl. TiÕn hµnh lo¹i trõ çc proton ®· x¸c ®Þnh, 15 proton cßn l¹i ®ãng vai trß çc proton cña vßng th¬m. TiÕn hµnh çc bíc ph©n tÝch phæ 1H-NMR cña hîp chÊt 6 cho çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña hÖ ABX víi çc tÝn hiÖu cña proton thÕ ë çc vÞ trÝ 1,3,4 trªn vßng benzen.

H×nh V.7.2.6.1. Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt 6

Çc tÝn hiÖu trªn phæ 13C-NMR (H×nh V.7.2.6.2) cña hîp chÊt 6 cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña çc tÝn hiÖu vßng benzen vµ tÝn hiÖu cña gèc ®êng, tiÕn hµnh ph©n tÝch çc gi¸ trÞ trªn phæ Dept cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña nhãm methine t¹i 66.4 vµ 65,.4, tÝn hiÖu cña nhãm methoxy 56.5 ppm, çc tÝn hiÖu cña çc nhãm CH t¹i çc gi¸ trÞ 79.4ppm, 81.0, 90.6, 74.3, 72.2, 72.1, 72.4, 116.3, 124.5, 147.2 vµ 115.3 çc gi¸ trÞ t¬ng ®ång so víi çc gi¸ trÞ phæ cña hîp chÊt vanicoside A [12].

226

H×nh V.7.2.6.2. Phæ 13C-NMR cña hîp chÊt 6

H×nh V.7.2.6.3. Phæ Dept cña hîp chÊt 6

Th«ng qua phæ HSQC (H×nh V.7.2.6.4) vµ phæ HMBC (H×nh V.7.2.6.5) çc tÝn hiÖu t¬ng t¸c gi÷a proton víi çc bon ®îc x¸c ®Þnh. Cô thÓ t¬ng t¸c gi÷a H-6’’ gi÷a C-9’’, t¬ng t¸c H-1 víi C-9’’’, H-6 víi C-9’’’, t¬ng t¸c gi÷a proton H-1’ vµ C-2. Çc ph©n tÝch trªn kÕt hîp víi so s¸nh sè liÖu víi tµi liÖu tham kh¶o [12] cho phÐp kh¼ng ®Þnh hîp chÊt 6 lµ vanicoside A (xem H×nh V.7.2.6. 6), mét hîp chÊt ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi P. pensylvanicum

H×nh V.7.2.6.4. Phæ HSQC cña hîp chÊt 6

H×nh V.7.2.6.4. Phæ HMBC cña hîp chÊt 6

227

O

OR2

OH

O

O

O

R4OHO

R3O

O

O

OH

O

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = R4 = H, R2 = trans-p-courmaroyl, R3= Ac

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'

V.7.2.11. Hîp chÊt 11 (Vanicoside B, 50mg) Çc tÝn hiÖu trªn phæ 1H-NMR (H×nh V.7.2.7.1) cña hîp chÊt 7 t¹i vïng 6.29 ®Õn 7.78 t¬ng tù nh hîp chÊt 6 rÊt phøc t¹p, gi¸ trÞ tÝch ph©n t¹i vïng tÝn hiÖu nµy cho thÊy cã kho¶ng 23 proton. §i s©u vµo ph©n tÝch çc tÝn hiÖn trªn phæ 1H-NMR trªn vïng tÝn hiÖu trªn còng cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña bèn cÆp tÝn hiÖu doublet t¹i çc gi¸ trÞ 6.38-7.62 ppm, 6.42-7.69 ppm, 6.43-7.75 ppm vµ 6.58-7.64 ppm t¬ng tù nh hîp chÊt 6. Çc ph©n tÝch trªn cho phÐp gi¶ thuyÕt sù cã mÆt cña bèn liªn kÕt ®«i d¹ng trans, mçi nhãm liªn kÕt nµy g¾n trùc tiÕp víi mét nhãm cacbonyl. TiÕn hµnh lo¹i trõ çc proton ®· x¸c ®Þnh, 15 proton cßn l¹i ®ãng vai trß çc proton cña vßng th¬m. TiÕn hµnh çc bíc ph©n tÝch phæ 1H-NMR cña hîp chÊt 7 cho çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña hÖ ABX víi çc tÝn hiÖu cña proton thÕ ë çc vÞ trÝ 1,3,4 trªn vßng benzen.

H×nh V.7.2.7.1. Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt 7 Çc tÝn hiÖu trªn phæ 13C-NMR (H×nh V.7.2.7.2) cña hîp chÊt 7 cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña çc tÝn hiÖu vßng benzen vµ tÝn hiÖu cña gèc ®êng, tiÕn hµnh ph©n tÝch çc gi¸ trÞ trªn phæ Dept cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña nhãm methine t¹i 66.3 vµ 65.7, tÝn hiÖu cña nhãm methoxy 56.5 ppm, çc tÝn hiÖu cña çc nhãm CH t¹i çc gi¸ trÞ 79.4ppm, 81.0, 90.6, 72.92, 72.2, 72.1, 72.4, 116.3, 124.5, 147.2 vµ 115.3 çc gi¸ trÞ t¬ng ®ång so víi çc gi¸ trÞ phæ cña hîp chÊt 6. Sù kh¸c nhau chñ yÕu ë vÞ trÝ C-2’ tÝn hiÖu cña cacbon gi¶m so víi tÝn hiÖu çc bon trªn hîp chÊt 6.


228


H×nh V.7.2.7.4. Phæ MS cña hîp chÊt 7 Çc ph©n tÝch trªn kÕt hîp víi so s¸nh sè liÖu víi tµi liÖu tham kh¶o [12] cho phÐp kh¼ng ®Þnh hîp chÊt 7 lµ vanicoside B (xem H×nh V.7.2.7. 5), mét hîp chÊt ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi P. Pensylvanicum

O

OR2

OH

O

O

O

R4OHO

R3O

O

O

OH

O

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = R3= R4 = H, R2 = trans-p-courmaroyl

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'

H×nh V.7.2.7.5. CÊu tróc ña hîp chÊt 7

V.7.2.8. Hîp chÊt 8(Vanicoside E, 16mg) Çc tÝn hiÖu trªn phæ 1H-NMR (h×nh V.7.2.8.1) cña hîp chÊt 8 t¹i vïng 6.29 ®Õn 7.78 t¬ng tù nh hîp chÊt 6 vµ 7 rÊt phøc t¹p, gi¸ trÞ tÝch ph©n t¹i vïng tÝn hiÖu nµy cho thÊy cã kho¶ng 23 proton. §i s©u vµo ph©n tÝch çc tÝn hiÖn trªn phæ 1H-NMR trªn vïng tÝn hiÖu trªn còng cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña bèn cÆp tÝn hiÖu doublet t¹i çc gi¸ trÞ 6.38-7.62 ppm, 6.42-7.69 ppm, 6.43-7.75 ppm vµ 6.58-7.64 ppm t¬ng tù nh hîp chÊt 6 vµ 7. T¬ng tù nh hîp chÊt 6 vµ 7 cã thÓ nhËn thÊy sù cã mÆt cña bèn liªn kÕt ®«i d¹ng trans, mçi nhãm liªn kÕt nµy g¾n trùc tiÕp víi mét nhãm cacbonyl. Çc proton cßn l¹i ®ãng vai trß çc proton cña vßng th¬m víi çc

229

gi¸ trÞ thÕ ®Æc trng cña hÖ ABX víi çc tÝn hiÖu cña proton thÕ ë çc vÞ trÝ 1,3,4 trªn vßng benzen.

H×nh V.7.2.8.1. Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt 8

Çc tÝn hiÖu trªn phæ 13C-NMR (H×nh V.7.2.8.2) vµ Dept (h×nh V.7.2.8.3) cña hîp chÊt 8 cho thÊy sù xuÊt hiÖn cña çc tÝn hiÖu vßng benzen vµ tÝn hiÖu cña gèc ®êng vµ tÝn hiÖu cña nhãm acetyl



Ngoµi ra, trªn phæ khèi (h×nh V.7.2.8.4) nguån ESI(+) cho thÊy khèi lîng ph©n tö cña hîp chÊt 8 lín h¬n hîp chÊt 6 víi sè khèi t¬ng øng víi mét nhãm acetate. Bªn c¹nh çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña ph©n tö sucrose cßn cã çc tÝn hiÖu ®Æc trng cña p-coumaryl vµ proton ®Æc trng cña nhãm feruloyl. Sù dÞch chuyÓn vÒ phÝa trêng thÊp cña çc proton 1’ vµ 2’ cho thÊy sù cã mÆt cña mét nhãm este g¾n vµo vÞ trÝ C-2’ so víi hîp chÊt 6, sù dÞch chuyÓn vÒ phÝa trêng thÊp cßn quan s¸t ®îc ë vÞ trÝ proton 4’ trªn b¶ng 8. Nh÷ng tÝn hiÖu trªn cho phÐp gi¶ thuyÕt hîp chÊt 8 kh¸c so víi hîp chÊt 6 vµ 7 ë vÞ trÝ C-4’ víi sù liªn kÕt cña mét nhãm este.

H×nh V.7.2.8.4. Phæ MS cña hîp chÊt 8

230

Toµn bé çc vÞ trÝ trªn cÊu tróc cña hîp chÊt 8 ®îc kh¼ng ®Þnh th«ng qua çc tÝn hiÖu cña phæ HSQC (H×nh V.7.2.8.5) vµ phæ HMBC th«ng qua viÖc so s¸nh víi çc gi¸ trÞ phæ cña hîp chÊt 6 vµ 7. Trªn phæ HMBC (h×nh V.7.2.8.6) cho thÊy çc t¬ng t¸c cña proton nhãm metoxi (δ 3.33) víi tÝn hiÖu cac bon C-4’ (δ 74), t¬ng t¸c cña proton methoxy (δ 3.36) víi tÝn hiÖu cña cac bon C-2’ (δ 72.69). Çc t¬ng t¸c trªn cho phÐp kh¼ng ®Þnh vÞ trÝ liªn kÕt cña nhãm methoxy t¹i vÞ trÝ C-4’, C-2’

H×nh V.7.2.8.5. Phæ HSQC cña hîp chÊt 8

Th«ng qua phæ HSQC (h×nh V.7.2.8.5) vµ phæ HMBC (h×nh V.7.2.8.6) çc tÝn hiÖu t¬ng t¸c gi÷a proton víi çc bon ®îc x¸c ®Þnh. Cô thÓ t¬ng t¸c gi÷a H-6’’ gi÷a C-9’’, t¬ng t¸c H-1 víi C-9’’’, H-6 víi C-9’’’, t¬ng t¸c gi÷a proton H-1’ vµ C-2. Çc ph©n tÝch trªn kÕt hîp víi so s¸nh sè liÖu víi tµi liÖu tham kh¶o [12] cho phÐp kh¼ng ®Þnh hîp chÊt 6 lµ vanicoside E (xem h×nh V.7.2.8.7), mét hîp chÊt ®· ®îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc tõ loµi P. Pensylvanicum

H×nh V.7.2.8.6. Phæ HMBC cña hîp chÊt 8

231

O

OR2

OH

O

O

O

R4OHO

R3O

O

O

OH

O

OOH

R1

HO

H3CO O

1

2

3

5

6

6'

R1 = H, R2 = trans-p-courmaroyl, R3 = R4 = Ac

1'3'

4'

1"3"

5"

7"

9" 1'''

3'''

5'''7'''9'''

1'''' 3''''

5''''

7''''

9''''

2'

5'

8'


V.7.2.4. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh sinh häc a. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng « xy hãa Çc hîp chÊt ph©n lËp ®îc ®îc tiÕn hµnh ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng « xy hãa theo ph¬ng ph¸p nªu ë môc II.4 KÕt qu¶ cho thÊy çc hîp chÊt hydropiperoside B vµ Vanicoside A thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng « xy hãa víi çc gi¸ trÞ SC50 lÇn lît lµ 23.4 vµ 26.7 µg/ml; Hîp chÊt Vanicoside E thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng « xy hãa víi gi¸ trÞ trung b×nh víi SC50 =49.0 µg/ml. Çc hîp chÊt kh¸c cã gi¸ trÞ SC50 > 200 µg/ml, trong thö nghiÖm nµy ®îc coi lµ kh«ng cã ho¹t tÝnh. b. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo Çc hîp chÊt ph©n lËp ®îc ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo theo ph¬ng ph¸p nªu trªn môc II.5. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ®éc tÕ bµo cho thÊy çc hîp chÊt Vanicoside A, B, E ®Òu thÓ hiÖn kÕt qu¶ g©y ®éc tÕ bµo víi gi¸ trÞ IC50 lÇn lît lµ 28.4, 32,8 vµ 29,7 µg/ml. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh nªu trªn sÏ gãp phÇn ®Þnh híng cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo ®èi víi c©y nghÓ r¨m Polygonum hydropiper L.

232

Ch¬ng VI. KÕt qu¶ nghiªn cøu t¹o s¶n phÈm thùc phÈm chøc n¨ng

VI.1. T¹o s¶n phÈm thùc phÈm chøc n¨ng viªn Mallotus a. C¬ së khoa häc h×nh thµnh s¶n phÈm

Cho ®Õn nay ®· cã kh¸ nhiÒu nghiªn cøu trªn thÕ giíi32-38 còng nh ë ViÖt nam nghiªn cøu thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y bïm bôp156. Trong ®ã çc nghiªn cøu ë ViÖt nam cho thÊy thµnh phÇn çc chÊt cã kiÓu khung benzopyran, nhãm hîp chÊt 2H-chromen ®îc chó ý nghiªn cøu nhiÒu nhÊt vµ ®· ®îc chøng minh lµ nhãm cã ho¹t chÊt vµ chiÕm hµm lîng kh¸ cao trong loµi Mallotus apelta. Cho ®Õn nay tõ loµi Mallotus apelta chóng t«i ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 06 hîp chÊt cã kiÓu khung benzopyran míi vµ mét sè hîp chÊt kh¸c156. Bªn c¹nh ®ã, trong ®Ò tµi nghiªn cøu träng ®iÓm cÊp ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt nam çc nghiªn cøu vÒ Mallotus apelta ®· ®îc thùc hiÖn rÊt chi tiÕt vµ bµi b¶n, ®©y chÝnh lµ c¬ së khoa häc cho viÖc t¹o ra çc s¶n phÈm tõ Mallotus apelta. b. Quy tr×nh t¹o s¶n phÈm Viªn Mallotus

Cïng víi çc nghiªn cøu vÒ ho¸ häc, ph¬ng ph¸p s¾c ký fingerprint trong viÖc ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu Mallotus vµ çc nghiªn cøu vÒ dîc lý cña hîp chÊt t¸ch ®îc tõ Mallotus apelta. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu, ph¸t triÓn vµ ®a ra s¶n phÈm thùc phÈm Viªn Mallotus. S¶n phÈm nµy kh«ng ph¶i lµ thuèc vµ kh«ng cã t¸c dông nh thuèc. S¶n phÈm nµy lµ sù kÕt hîp cña bét cao kh« hoµ tan Mallotus, bét nh©m s©m vµ t¸ dîc võa ®ñ, hµm lîng cña ho¹t chÊt malloapelta B trong bét cao kh« vµ mét sè thµnh phÇn kh¸c ®îc ®¸nh gi¸ b»ng ph¬ng ph¸p fingerprint. S¶n phÈm cã chøc n¨ng thanh nhiÖt lîi tiÓu, gi¶i ®éc. Dïng hµng ngµy tèt cho nh÷ng ngêi bÞ viªm gan m·n tÝnh, nguêi ®ang ®iÒu trÞ ung th b»ng ho¸ chÊt vµ tia x¹. S¶n phÈm ®îc ph¸t triÓn bëi c«ng ty Dîc phÈm §«ng d¬ng víi quy tr×nh tãm t¾t nh sau:

Bíc 1: Dîc liÖu Mallotus apelta ®îc röa s¹ch ph¬i, sÊy kh«. C©n lîng nhiªn liÖu ban ®Çu.

Bíc 2: NghiÒn nhá dîc liÖu, thªm vµo mét lîng níc s¹ch võa ®ñ t¹o nguyªn liÖu d¹ng bét mÞn. §¶m b¶o hµm lîng chÊt kh« hoµ tan trong níc >30%

Bíc 3: ChiÕt xuÊt dÞch chiÕt. Lo¹i bá luîng t¹p chÊt b»ng çc ph¬ng ph¸p vËt lý. DÞch chiÕt cã mïi, vÞ ®Æc trng cña Mallotus apelta.

Bíc 4: C« ®Æc dîc liÖu thµnh cao ®Æc. DÞch chiÕt ®îc ®a vµo tñ sÊy h¬i v« trïng. KiÓm tra çc chØ tiªu vÖ sinh nh: Tæng sè vi sinh vËt hiÕu khÝ, Vi khuÈn E.coli, Vi khuÈn Coliform…NhiÖt ®é cña tñ sÊy dao ®éng tõ 50 0C-60 0C.

Bíc 5: SÊy kh« dîc liÖu. Dîc liÖu cã mïi th¬m ®Æc trng. Bíc 6: Trén t¸ dîc vµ glucose, sacarose (®· sÊy kh«) víi dîc liÖu theo tû lÖ ®·

®îc tÝnh tríc, dîc liÖu cã vÞ ngät nhÑ, kh«ng cã vÞ l¹ Bíc 7: Xay vµ r©y dîc liÖu thµnh bét mÞn. KiÓm so¸t tû lÖ bét qua lç r©y lµ <5.0

mm. Bíc 8: Cån 900 ®îc thªm vµo dîc liÖu. Bét dîc liÖu cho qua m¸y s¸t h¹t. Bíc 9: SÊy bét dîc liÖu trong tñ sÊy h¬i v« trïng. Bíc 10: Söa h¹t. Tû lÖ h¹t qua lç r©y <0.158 mm. Bíc 11: KiÓm nghiÖm b¸n thµnh phÈm

233

Bíc 12: §ãng tói thiÕc 3 g hoÆc lä 5g Bíc 13: §ãng hép (kho¶ng 20 gãi) Bíc 14: KiÓm nghiÖm thµnh phÈm Bíc 15: NhËp kho • S¬ ®å quy tr×nh:

C©n nguyªn liÖu

T¸ dîc Cao kh« Mallotus

T¹o hçn hîp bét kÐp

H×nh thµnh khèi Èm

NhËp kho

§ãng nang

§ãng gãi

Phèi trén nguyªn liÖu

SÊy cèm

Söa h¹t

SÊy cèm

KiÓm nghiÖm thµnh phÈm

Cao Nh©n s©m

X¸t cèm

Cèm kh«

KiÓm nghiÖm b¸n thµnh phÈm

§¸nh gi¸ nguyªn liÖu ®Çu vµo b»ng ph¬ng ph¸p dÊu

v©n tay s¾c ký

KiÓm ®Þnh s¶n phÈm b»ng ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾cký

234

c. S¶n phÈm Viªn Mallotus

Thùc phÈm chøc n¨ng: Viªn Mallotus ®· ®îc x©y dùng tiªu chuÈn c¬ së ¸p

dông cho s¶n phÈm. S¶n phÈm ®¹t çc chØ tiªu:

• Çc chØ tiªu:

- Çc chØ tiªu vÒ c¶m quang:

+ Ngo¹i h×nh: D¹ng viªn nang

+ mµu s¾c: Viªn mµu xanh

+ mïi: Th¬m tù nhiªn ®Æc trng cña c©y bïm bôp

+ VÞ: Ngät nhÑ, h¬i ®¾ng, kh«ng cã vÞ l¹

- §¶m b¶o çc chØ tiªu vÒ lý ho¸: Hµm lîng Èm <9; Khèi lîng viªn 500mg;

Hµm lîng cao kh« Mallotus 400 mg/viªn; Hµm lîng cao nh©n s©m 100 mg/ viªn;

Hµm lîng tro kh«ng tan trong HCl 10% <0.01% chÊt kh«; Thêi gian ph©n r· <30

phót; hµm lîng carbonhydrate 30-40%;

- §¶m b¶o çc chØ tiªu vi sinh

- Hµm lîng çc kim lo¹i nÆng ë møc ®é an toµn cña vÖ sinh thùc phÈm

- D lîng thuèc b¶o vÖ thùc vËt ®îc ®¸nh gi¸ theo danh môc tiªu chuÈn vÖ

sinh ®èi víi l¬ng thùc, thùc phÈm ban hµnh kÌm theo quyÕt ®Þnh sè 867/1998/ Q§-

BYT cña Bé trëng Bé Y tÕ ngµy 4 th¸ng 4 n¨m 1998.

b. Thµnh phÇn cÊu t¹o

- Bét cao kh« Mallotus 1.0 g 1.5 g - Bét nh©n s©m 0.1 g 0.15 g - Glucose 1.0 g 1.5 g - Sacarose 0.9 g 1.85 g - T¸ dîc võa ®ñ 1 gãi 3.0 g 5.0 g

B¶n c«ng bè chÊt lîng s¶n phÈm sè 02/07/DD ®îc c«ng bè ngµy 10 th¸ng

03 n¨m 2007 (xem phô lôc kÌm theo)

Tiªu chuÈn c¬ së cña thùc phÈm chøc n¨ng nµy ®· ®îc Côc An toµn vÖ sinh

thùc phÈm chøng nhËn tiªu chuÈn s¶n phÈm sè 5273/2007/YT-CNTC ngµy 30 th¸ng

08 n¨m 2007.

235

Hình VI.1.1. Chế phẩm viên Mallotus

236

VI.2. KÕt qu¶ øng dông ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trong viÖc ®¸nh gi¸ chÊt lîng s¶n phÈm thùc phÈm viªn Mallotus. B¶n dÊu v©n tay s¾c ký yªu cÇu ®Çu vµo cho nguyªn liÖu:

H×nh VI.2.1. B¶n s¾c ký tiªu chuÈn cho nguyªn liÖu ®Çu vµo cña Viªn nang

Mallotus. Trong ®ã, vïng A: Çc ho¹t chÊt cã trong nguyªn liÖu cao kh« Mallotus; Vïng B: çc ho¹t chÊt cã trong cao kh« nh©n s©m; Vïng C çc ho¹t chÊt cã trong t¸ dîc phô thªm; Vïng D ho¹t chÊt malloapelta B. ChiÒu cao cña çc pÝc trong s¾c ký ®å t¬ng øng víi hµm lîng ®îc ®¸nh gi¸ b»ng ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng (xem h×nh VI.2.2). Trªn b¶n s¾c ký tiªu chuÈn trªn hµm lîng cña ho¹t chÊt malloapelta B kh«ng ®îc vît qu¸ ngìng nghiªn cøu cña ®éc cÊp. NÕu mÉu cã hµm lîng vît qu¸ hoÆc mÉu kh«ng cã ho¹t chÊt malloapelta B th× kh«ng ®îc lùa chän (H×nh VI.2.3. mét trong nh÷ng mÉu kh«ng ®¹t tiªu chuÈn).

y = 17246x - 85.844R2 = 0.9991

0.00

2000.00

4000.00

6000.00

8000.00

10000.00

12000.00

14000.00

16000.00

18000.00

20000.00

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Concentration

Peak

are

a

H×nh VI.2.2. S¾c ký ®å cña malloapelata B vµ ®å thÞ ®êng chuÈn ®Þnh lîng hµm

lîng malloapelta B

A B C C

237

H×nh VI.2.3. MÉu cao kh« Mallotus kh«ng ®¹t, kh«ng cã ho¹t chÊt malloapelta B

H×nh VI.2.4. MÉu cao kh« Mallotus kh«ng ®¹t tiªu chuÈn do hµm lîng cña malloapelta B qu¸ thÊp

238

VI.3. X©y dùng ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trong ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu Mallotus ë ViÖt Nam VI.3.1. Mét sè th«ng tin vÒ ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu ë ViÖt nam. Tình hình sö dông dîc liÖu cæ truyÒn ë ViÖt nam: ViÖt Nam ®· cã lÞch sö l©u ®êi sö dông c©y cá tù nhiªn ®Ó ch÷a bÖnh cho con ngêi. Tõ thêi V¨n Lang dùng níc, cha «ng ta ®· biÕt dïng trÇu, gõng vµ rîu ®Ó ®iÒu trÞ bÖnh. §Õn thêi kú An D¬ng V¬ng, ngêi ta ®· biÕt dïng tªn tÈm ®éc trong s¨n b¾n vµ chiÕn ®Êu. Tr¶i qua thêi kú 1000 n¨m B¾c thuéc, viÖc sö dông thuèc cæ truyÒn Trung Quèc trong ch÷a bÖnh ®· trë nªn phæ biÕn ë níc ta. Danh y TuÖ TÜnh, ngêi viÕt cuèn “Nam dîc thÇn diÖu” vµ “ThËp tam ph¬ng gia gi¶m”, ®· liÖt kª 580 c©y thuèc vµ 3932 bµi thuèc d©n téc. Danh y TuÖ tÜnh còng chÝnh lµ ngêi ®· kh¬i gîi ý tëng “Dïng thuèc ViÖt ®Ó ch÷a cho ngêi ViÖt”. §Õn thêi kú 1720-1791, H¶i Thîng L·n «ng ®· biªn so¹n bé B¸ch khoa th vÒ Y häc cæ truyÒn ViÖt Nam “H¶i Thîng Y T«ng T©m LÜnh”. C«ng tr×nh cña «ng lµ sù ®óc rót kinh nghiÖm, tri thøc vÒ sö dông c©y cá ®Ó ch÷a bÖnh vµ ch¨m sãc søc khoÎ tõ xa xa cña d©n téc ta. Tr¶i qua mét thêi kú dµi kh«ng ®îc sö dông réng r·i do sù du nhËp cña T©y dîc, ngµy nay y häc d©n téc ®· t×m l¹i vÞ trÝ cña m×nh trong ®iÒu trÞ vµ ch¨m sãc søc khoÎ ngêi d©n. §Æc biÖt, víi sù hç trî cña çc ph¬ng ph¸p nghiªn cøu míi, tiªn tiÕn vµ xu thÕ “Quay vÒ víi tù nhiªn”, y häc cæ truyÒn nay ®· vµ ®ang ®îc ¸p dông réng r·i bªn c¹nh y häc hiÖn ®¹i. §Õn nay, theo nh÷ng thèng kª ban ®Çu, ®· cã 39813 bµi thuèc vµ ph¬ng thuèc cæ truyÒn ë níc ta. §©y chÝnh lµ kho tµng tri thøc v« gi¸ cÇn ®îc b¶o tån, khai th¸c vµ øng dông trong ®êi sèng, phôc vô cho c«ng t¸c b¶o vÖ, ch¨m sãc søc kháe céng ®ång1.

Víi truyÒn thèng sö dông thuèc d©n téc tõ l©u n¨m, ViÖt Nam ®· thùc hiÖn viÖc nghiªn cøu ¸p dông y häc cæ truyÒn vµo hÖ thèng y häc hiÖn ®¹i tõ nh÷ng n¨m 1950. Toµn quèc cã 03 ViÖn nghiªn cøu y häc cæ truyÒn, 45 BÖnh viÖn y häc d©n téc, 242 BÖnh viÖn cã sö dông thuèc d©n téc trong ®iÒu trÞ bÖnh vµ kho¶ng h¬n 30.000 thÇy thuèc hµnh nghÒ y häc cæ truyÒn ë kh¾p n¬i. Nh÷ng nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy hÇu hÕt çc c«ng ty dîc phÈm ®Òu sö dông nguån nguyªn liÖu tù nhiªn ®Ó s¶n xuÊt thuèc vµ cã kho¶ng 60% ngêi d©n ®îc hái cho biÕt hä lùa chän thuèc d©n téc nh lµ lùa chän hµng ®Çu trong phßng ch÷a bÖnh174.

Sö dông th¶o dîc ë ViÖt Nam: Víi kinh nghiÖm sö dông th¶o dîc lµm thuèc tõ l©u ®êi, ViÖt Nam ®· ®a y häc cæ truyÒn vµo hÖ thèng ch¨m sãc søc khoÎ céng ®ång tõ nh÷ng n¨m ®Çu 1950. Tuy nhiªn, trong viÖc sö dông th¶o dîc lµm thuèc còng cã nhiÒu vÇn ®Ò cha chÝnh x¸c nh: Sù nhÇm lÉn vÒ nguån gèc xuÊt xø cña th¶o dîc, nhÇm lÉn trong viÖc thu thËp mÉu, vµ çc lçi trong nhËn d¹ng sai çc mÉu th¶o dîc. Th«ng thêng dùa vµo dîc ®iÓn mét th¶o dîc cã thÓ ®îc x¸c ®Þnh. Tuy nhiªn trªn thùc tÕ, mét lîng lín th¶o dîc kh«ng ®îc ghi chÐp trong dîc ®iÓn. §«i khi th¶o dîc cßn tån t¹i díi rÊt nhiÒu tªn gäi ®Þa ph¬ng kh¸c nhau, tªn

239

gäi nµy chØ kh¸c nhau vÒ tiÒn tè, tøc lµ chØ g¾n thªm phÇn ®Þnh danh n¬i th¶o dîc sinh sèng nh khu vùc, vïng miÒn. VÝ dô: Trªn thÞ trêng Trung Quèc, lo¹i th¶o cã tªn Trung Quèc lµ “Huang Qi” víi tªn khoa häc lµ Astragalus membranaceus thuéc hä Fabaceae. ë ViÖt Nam gäi lµ “Hoang ky”, cïng víi tªn th¶o dîc nµy, ë Trung Quèc cã mét loµi c©y kh¸c thuéc hä Astragalus, vÝ dô Astragalus mongholicus, A. tongolensis, A. sinicus, A. bontanensis.

VÒ mÆt nguyªn t¾c, çc loµi thùc vËt kh¸c nhau th× sÏ cã nh÷ng thµnh phÇn ho¹t chÊt kh¸c nhau. Do vËy viÖc thu thËp mÉu kh«ng chÝnh x¸c sÏ dÉn ®Õn nh÷ng hËu qu¶ kh«n lêng. Mét vÝ dô ®iÓn h×nh tõ mét vÞ thuèc cã tªn §éc ho¹t. §éc ho¹t thêng lµ tªn gäi cho çc rÔ cña loµi thuéc chi Angelica (hä Tróc §µo Apiaceae) nh Xuyªn ®éc ho¹t (A. laxiflora Diels vµ A. megaphylla Diels), H¬ng ®éc ho¹t (A. pubescens Maxim.). VÞ thuèc nµy còng cã thÓ thuéc mét chi kh¸c nh Ngu vÞ ®éc ho¹t (Heracleum hemsleyanum Michx.), §éc ho¹t l«ng mÒm (Heracleum lanatum Michx.) hay thËm chÝ thuéc mét hä kh¸c nh Cöu nhìn ®éc ho¹t (Aralia cordata, hä Nh©n S©m, Araliaceae) hoÆc nh cïng mét lo¹i dîc liÖu cã tªn Thæ tam thÊt nhng cã ®Õn vµi loµi kh¸c nhau cã cïng tªn nh vËy, ®ã lµ Gynura pseudochina, Stahlianthus thorelii Gagn, thêng ®îc sö dông thay thÕ cho Panax notoginseng mµ kh«ng cã sù quan t©m ®Õn nh÷ng thay ®æi vÒ hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y. Ngoµi ra, viÖc thu thËp mÉu còng gÆp rÊt nhiÒu khã kh¨n, ®Æc biÖt víi nh÷ng mÉu cã h×nh th¸i t¬ng ®èi gièng nhau. VÝ dô nh viÖc thu mÉu c©y ChÌ vµng (Jasminum subtriplinerve Bl.) dïng ®Ó ch÷a çc bÖnh viªm nhiÔm, d¹ dµy, sÏ rÊt dÔ nhÇm lÉn víi c©y L¸ ngãn (Gelsemium elegans Benth.), mét c©y cã ®éc tÝnh rÊt cao, cã thÓ g©y chÕt ngêi1,165.

Nh÷ng g× võa ®Ò cËp ë phÇn trªn cho thÊy cã v« sè çc vÊn ®Ò cÇn gi¶i quyÕt trong qu¶n lý chÊt lîng th¶o dîc hiÖn nay. HiÖn nay ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký ®· vµ ®ang ®îc øng dông trªn thÕ giíi ®Ó qu¶n lý chÊt lîng dîc liÖu148. ë ViÖt Nam viÖc ph©n tÝch, kiÓm so¸t vµ nhËn d¹ng çc thµnh phÇn dîc liÖu còng ®· dùa theo ph¬ng ph¸p trªn. Çc nghiªn cøu chñ yÕu dùa trªn viÖc ph©n tÝch sù cã mÆt cña çc chÊt chØ thÞ trªn s¾c ký ®å th«ng qua çc kÕt qu¶ s¾c ký tõ GC hay HPLC. VÝ dô nh viÖc ph©n biÖt mËt gÊu vµ çc lo¹i kh¸c qua HPLC dùa trªn chÊt chuÈn lµ axÝt tauroursodeoxycholic (TUDC) hay taurochenodeoxycholic (TCDC) ®· ®îc th«ng b¸o bëi çc nhµ khoa häc ViÖt Nam163. VI.3.2. Bíc ®Çu x©y dùng ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trong ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu Mallotus ë ViÖt Nam. a. C¬ së khoa häc trong viÖc lùa chän ®èi tîng nghiªn cøu Chi Mallotus (Euphorbiaceae) gồm khoảng 150 loài2, phân bố ở các khu vực từ Nam Á (Ấn độ, Sri Lanka) đến Đông Nam Á (Việt Nam, Lào, Campuchia..). Ở Việt Nam, một số loài Mallotus được sử dụng trong y học cổ truyền làm thuốc chữa bệnh4,5. Ví dụ như loài Mallotus apelta được dùng như một vị thuốc dân tộc cổ

240

truyền để chữa trị các bệnh viêm nhiễm, máu trắng và các bệnh về đường tiêu hoá1,4,5. Các nhà khoa học Trung Quốc còn phát hiện dịch chiết MeOH của cây này có hoạt tính kháng HIV155. Trong những nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của một số loài Mallotus, các nhà khoa học Việt Nam đã phân lập được rất nhiều hợp chất70,78,95, thành phần hoạt tính của các hoạt chất này cũng đã được nghiên cứu nhiều156,166. Ví dụ như hoạt chất Malloapelta B có tác dụng ức chế mạnh yếu tố nhân NF-κB hoạt hóa, có tác dụng với cả ba dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư biểu mô người (KB), tế bào ung thư màng tử cung (FL) và tế bào ung thư gan người (Hep-G2)156. Hiện nay một loạt các sản phẩm thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu Mallotus apleta đã được nghiên cứu và đưa ra thị trường (chè hoà tan Mallotus, viên nang Mallotus), sản phẩm này đang ngày càng thu hút nguời sử dụng, sản phẩm có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch và hỗ trợ người bị bệnh ung thư.

Hình VI.3.1. Sản phẩm thực phẩm chức năng từ Mallotus apelta

Tuy nhiên, trong cùng một loài dược liệu hoặc các sản phẩm từ dược liệu, luôn có mặt hàng nghìn các thành phần chưa biết, những thành phần này có thể chỉ có mặt với hàm lượng rất nhỏ. Hơn thế nữa, các thành phần này có thể tồn tại trong những loại dược liệu khác157,158. Thành phần hoá học của các thảo dược có thể thay đổi vào mùa vụ thu hoạch, nơi sinh sống và ngay cả quá trình xử lý nguyên liệu trước khi hình thành sản phẩm và một số yếu tố khác157. Với sự phát triển của sản phẩm từ Mallotus thì vấn đề đánh giá đầu vào cho nguyên liệu Mallotus là một yêu cầu cần thiết. Nếu chỉ dựa trên một vài hợp chất phân lập được và hoạt tính thì chưa đủ để đánh giá chất lượng của nguyên liệu đầu vào cho các sản phẩm và ®¸nh gi¸¸ quản lý chất lượng sản phẩm. Trên cơ sở của chương trình hợp tác nghiên cứu khoa học giữa Việt Nam và Vương quốc Bỉ, bước đầu lựa chọn đối tượng các loài Mallotus làm đối tượng để xây dựng phương pháp dấu vân tay sắc ký nhằm đánh giá chất lượng dược liệu Mallotus159,160. b. Phương pháp xây dựng dấu vân tay sắc ký trong ®¸nh gi¸ chất lượng dược liệu Mallotus ở Việt nam.

Lựa chọn mô hình nghiên cứu: Như đã đề cập ở các phần trên, gần đây rất nhiều mô hình dấu vân tay sắc ký được sử dụng như là một công cụ hữu dụng đÓ ®¸nh gi¸ chất lượng dược liệu và các sản phẩm. dấu vân tay sắc ký thực sự là tiêu chí để

241

đánh giá chất lượng của dược liệu làm thuốc và ngày càng thu hút được sự chú ý bởi vì kỹ thuật này tập trung vào đặc tính của các thành phần của mẫu và tập trung xác định và đánh giá sự ổn định của dược liệu. Qua tham khảo các tài liệu và nghiên cứu quy trình xây dựng dấu vân tay sắc ký của các nhóm nghiên cứu114,116,120,121,140. Có thể dễ dàng nhận thấy sắc ký fingrprint thu được là dạng thông tin đa chiều và do đó việc xử lý và thu nhận được các thông tin hữu ích từ một dấu vân tay sắc ký với nhiều peaks không phải là việc đơn giản. Một số phương pháp được đề xuất dựa trên sự tính toán mật độ tín hiệu, thời gian lưu, diện tích peak và chiều cao peak, các peak độc lập không bị chồng chéo, không sử dụng toàn bộ sắc ký đồ. Các phương pháp tính toán trên thường gặp khó khăn khi trên sắc đồ xuất hiện nhiều peak chồng chéo nhau, sự có mặt của các tác nhân không mong muốn như peak nhiễu, peak của dung môi... Một số phương pháp sử dụng việc chia sắc đồ thành những vùng nhỏ để tính toán. Phương pháp này thường gặp khó khăn trong việc tính toán các peak nằm ở giữa phần phân phân chia và một vài lỗi phát sinh trong việc tính toán thông tin trên dấu vân tay sắc ký 136. Việc sử dụng các chất đã biết để làm chất chuẩn hay chất chỉ thị “Marker” nhằm mục đích hiểu được hoạt tính và những ảnh hưởng của các hợp chất có hoạt tính đến thảo dược được xem như có rất nhiều ưu thế. Tuy nhiên, phương pháp này cũng không hoàn toàn mang lại một bức tranh toàn vẹn cho thảo dược bởi vì trong thảo dược có rất nhiều thành phần tác động qua lại đại diện cho liệu pháp chữa bệnh, việc xác định và cô lập hết các thành phần có hoạt tính là rất khó khăn trong điều kiện khoa học hiện tại. Hơn nữa những thành phần này có thể cộng hợp hoặc phân tách thành những phần hoạt tính riêng biệt và không chỉ tồn tại duy nhất ở một loài hay một sản phẩm. Việc phân lập từng thành phần riêng cũng gặp nhiều khó khăn vì nhiều thành phần chỉ tồn tại dưới dạng hàm lượng rất nhỏ và do đó rất khó khăn để có thể xác định và phân lập được hầu hết các thành phần hoạt tính chứa đựng trong thảo dược109,110,111,136.

Để giải quyết vấn đề trên, phương pháp xây dựng dấu vân tay sắc ký để đánh giá chất lượng của nguyên liệu Mallotus sp tập trung giải quyết các bước như sau (Hình VI.3.2)159,160

:

Bước 1: Trong bước khởi tạo (mô hình tổng quan của phương pháp dấu vân tay sắc ký ) việc thu thập mẫu được thực hiện tại nhiều vùng, ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu. Mẫu được xác định qua các chuyên gia phân loại do dó đảm bảo sự chính xác về nguyên liệu ban đầu.

Bước 2: Trên mô hình dấu vân tay sắc ký việc lựa chọn được thiết bị tạo dấu vân tay sắc ký rất quan trọng. Qua nghiên cứu bước đầu đã lựa chọn thiết bị phân tích là thiết bị HPLC vì thiết bị này có nhiều ưu điểm hơn so với các thiết bị TLC và GC, CE, đồng thời đây còn là thiết bị hiện có ở các phòng thí nghiệm của Việt Nam. Để có sự đánh giá về hoạt tính khi xây dựng mô hình dự đoán hoạt tính chống ô xy hoá, hai chất chuẩn là quercetin và myricetin, có hoạt tính chống ôxy hóa đã được lựa

242

chọn để kiểm tra khả năng đánh giá hoạt tính chống ôxy hoá cũng như tổng hàm lượng flavonoid cho nguyên liệu của mô hình xây dựng được. Mô hình hoạt tính gây độc tế bào với chất chuẩn là malloapelta B sẽ được thông báo trong thời gian tới.

Bước 3: Xây dưng mô hình phát triển dấu vân tay sắc ký với thời gian phân tích được tối ưu hoá với việc giảm thời gian phân tích lần lượt (60 min, 35 min, 22.5 min) để xây dựng phương pháp đánh giá nhanh chất lượng của loài Mallotus sp.

H×nh VI.3.2. M« h×nh dấu vân tay sắc ký trong viÖc ®¸nh gi¸ dîc liÖu Mallotus

Bước 4: Tiền xử lý dữ liệu dựa trên lý thuyết thông tin áp dụng vào dấu vân tay sắc ký . Theo lý thuyết này thì toàn bộ dấu vân tay sắc ký được xem xét không loại trừ peak chồng chéo cũng như các thông tin không hữu ích, dịch chuyển đường nền, dịch chuyển thời gian lưu. Các vấn đề trên sẽ được đánh giá qua phương pháp tiền xử lý dữ liệu với các phương pháp xử lý dữ liệu khác nhau như: Cột trung tâm

Çc th«ng tin cña th¶o dîc: §Þa h×nh, thêi gian thu mÉu, tªn khoa häc…

Thu thËp

Çc mÉu Mallotus

§¸nh gi¸ s¬ bé ho¹t tÝnh

ChuÈn bÞ mÉu vµ chÊt chuÈn

Ph¸t triÓn s¾c ký fingerprint trªn HPLC-VWD

Tèi u çc th«ng sè

Lùa chän çc th«ng sè

T¹o fingerprint

§¸nh gi¸ d÷ liÖu fingerprint

TiÒn xö lý d÷ liÖu

Ph©n tÝch d÷ liÖu b»ng PCA, PLS vµ UVE-PLS

243

(Column centering), Biến đổi bình thường (Normalization) và Biến đổi tiêu chuẩn (Standard normal variate - snv) với phần mềm Matlab 7.0.

Bước 5: Phân tích dữ liệu dựa trên phương pháp PCA và hiệu chỉnh dữ liệu Bước 6: Đánh giá dữ liệu bằng phương pháp bình phương tối thiểu riêng phần và loại trừ các thông tin không hữu ích bằng phương pháp mở rộng của phương pháp bình phương tối thiểu riêng phần (UVE-PLS) qua đó bước đầu xây dựng mô hình đánh giá nhanh hoạt tính chống ôxy hoá từ các dấu vân tay sắc ký . KÕt qu¶ bíc ®Çu x©y dùng ph¬ng ph¸p dÊu v©n tay s¾c ký trong qu¶n lý chÊt lîng dîc liÖu Mallotus ë ViÖt Nam Thiết bị, hoá chất và tác nhân: HÖ thèng HPLC (Chicago, USA) bao gåm lo¹i khÝ (GA1322 Agilent Degasser), b¬m bèn kªnh dung m«i (Agilent 1100 G1311A Quaternary Pump DE11115268), b¬m mÉu tù ®éng vµ ®Ò tec t¬ VWD (Agilent A.09.01) ®îc sö dông ®Ó x©y dùng dÊu v©n tay s¾c ký . §Ó tiÕn hµnh ph©n tÝch, hai cét s¾c ký ChromolithTM Performance RP-18e, 100 nmx 4.6 mm I.D. víi cét b¶o vÖ ChromolithTMGuard Cartridge kit RP-18, 5 mm x 4.6mm I.D vµ cét s¾c ký Lichrospher, 200nm x 4.6 mm I.D. víi cét b¶o vÖ ®îc sö dông. Dung m«i HPLC methanol, acetonitrile (Fisher Scientific, Leicestershire, UK) Dung dịch đệm là trifluroacetic acid (TFA)(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), nước cất lấy từ hệ thống lọc Milli-Q (Millipore, Molsheim, France) được sử dụng làm dung môi pha động. Các hợp chất chuẩn bao gồm myricetin (Sigma. Steinheim, Germany) và Quercetin (Merck, Darmstadt, Germany) và malloapeltaB (Hà Nội, Việt Nam). Toàn bộ dung môi được loại khí trước khi đưa vào hệ thống HPLC bằng thiết bị siêu âm (Branson Ultrasonic Corporation, Danburry, USA) trong 15 phút và trong suốt quá trình phân tính bằng hệ thống loại khí trực tuyến. 39 Mẫu thuộc chi Mallotus (Euphorbiaceae) được thu thập từ một số vùng dọc theo chiều dài đất nước (Xem bảng VI.3.1). Bảng VI.3.1. Các mẫu Mallotus thu thập tại các địa điểm khác nhau và kết quả đánh giá hoạt tính chống ôxy hóa theo phương pháp của Aquino R.166,167

Mẫu Tên khoa học Phần sử dụng Nơi thu %DPPH (n = 3) s

1 M. luchenensis Lá Son La 82.0 12.1 2 M. microcarpus Lá Son La 63.6 13.0 3 M. barbatus Lá Son La 79.4 9.7 4 M. sp Lá Van Hoa 113.0 20.5 5 M. barbatus Lá Hagiang 77.2 10.4 6 M. paniculatus Lá Hagiang 82.2 5.5 7 M. metcalfianus Lá Hagiang 51.1 14.6 8 M. apelta (Ma1) Lá Tam Dao 94.5 0.4 9 M. apelta (Ma2) Lá Tam Dao 92.5 3.3

10 M. paniculatus Lá Tam Dao 58.4 5.4 11 M. glabriusculus Lá Langson 56.8 3.9 12 M. philippensis Lá Langson 98.9 12.7 13 M. macrostachyus Lá Langson 75.7 2.2 14 M. microcarpus Lá Quangbinh 83.1 2.0 15 M. pallidus Lá Quangbinh 65.3 1.9

244

16 M. oblongifolius Lá Quangtri 6.7 0.3 17 M. floribundus Lá Langson 6.4 0.2 18 M. cuneatus Lá Langson 86.9 3.2 19 M. cuneatus Lá Quangbinh 10.3 4.1 20 M. contubernalis Lá Quang tri 91.6 4.1 21 M. yunnanensis Lá Lang Son 91.6 6.6 22 M. poilanei Lá Ke Bang 90.5 7.0 23 M. hookerianus Lá Dakrong 50.0 4.6 24 M. nanus Lá Daclak 78.4 9.5 25 M. anisopodus Lá Daclak 56.9 11.7 26 M. oreophilus Lá LaoCai 88.8 10.5 27 M. philippensis Lá Cucphuong 22.3 10.0 28 M. barbatus Lá Cucphuong 11.3 4.8 29 M. paniculatus Lá Pumat 73.5 8.5 30 M. paniculatus Rễ Pumat 91.5 5.7 31 M. paniculatus Lá Bach Ma 81.5 3.8 32 M. paniculatus Rễ Bach Ma 83.5 6.6 33 M. paniculatus Rễ Cucphuong 27.9 11.3 34 M. paniculatus Lá Cucphuong 75.3 8.8 35 M. nanus Rễ Bachma 12.2 1.7 36 M. nanus Lá Bachma 4.5 1.0 37 M. nanus Thân Bachma 27.1 4.7 38 M. sp Lá VQG Bavi 73.7 8.7 39 M. sp Thân VQG Bavi 65.6 8.0

Trong số các mẫu thu được đã tiến hành đánh giá hoạt tính chống ôxy hoá của 26 mẫu theo thực nghiệm tại Hàn Quốc, UCL-Bỉ và theo mô hình dự đoán trên số liệu dấu vân tay sắc ký xem bảng VI.3.2159, 39 mẫu theo thực nghiệm tại UCL-Bỉ xem bảng VI.3.1 (tại UCL-Vương quốc Bỉ)160,166. Một số chất đã được phân lập từ chi Mallotus Việt Nam dùng làm chất định vị vùng hoạt tính trên sắc đồ dÊu v©n tay (xem hình VI.3.3)70,95. Bảng VI.3.2. Các mẫu Mallotus thu thập tại các địa điểm khác nhau và kết quả đánh giá hoạt tính chống ôxy hóa theo thực nghiệm và dự đoán

Stt Tên khoa học Ký hiệu Nơi thu mẫu (a) s (b) s (c)

1 M. luchenensis 01 Son La 3.0 2.0 82.0 12.1 78.2

2 M. microcarpus 02 Son La 7.7 1.8 63.6 13.0 67.7

3 M. barbatus 03 Son La 86.1 1.1 79.4 9.7 74.7

4 M. sp MA07 Van Hoa 3.4 1.1 113.0 20.5 90.9

5 M. barbatus NT01 Hagiang 34.1 1.2 77.2 10.4 80.0

6 M. paniculatus NT02 Hagiang 35.1 1.3 82.2 5.5 83.3

7 M. metcalfianus NT03 Hagiang 75.7 1.3 51.1 14.6 73.2

8 M. apelta (Ma1) MA01 Tam Dao 25.0 1.0 94.5 0.4 94.8

9 M. apelta (Ma2) MA02 Tam Dao 27.5 1.3 92.5 3.3 99.3

10 M. paniculatus MA03 Tam Dao 46.5 2.2 58.4 5.4 52.1

11 M. glabriusculus SP4 Langson 67.9 3.0 56.8 3.9 69.1

12 M. philippensis SP5 Langson 59.1 3.2 98.9 12.7 70.4

13 M. macrostachyus MA11 Langson 28.5 2.1 75.7 2.2 69.0

245

14 M. microcarpus MA12 Quangbinh 10.1 2.1 83.1 2.0 87.5

15 M. pallidus MA13 Quangbinh 18.6 2.3 65.3 1.9 53.6

16 M. oblongifolius MA14 Quangtri 90.7 1.1 6.7 0.3 5.4

17 M. floribundus MA15 Langson 91.7 2.1 6.4 0.2 24.1

18 M. cuneatus MA16 Langson 14.8 2.2 86.9 3.2 90.3

19 M. cuneatus MA17 Quangbinh 94.6 2.2 10.3 4.1 44.2

20 M. contubernalis MA18 Quang tri -2.3 1.2 91.6 4.1 99.1

21 M. yunnanensis MA19 Lang Son 4.6 1.3 91.6 6.6 83.2

22 M. poilanei MA20 Ke Bang 0.7 3.1 90.5 7.0 92.4

23 M. hookerianus MA22 Dakrong 92.1 2.1 50.0 4.6 45.8

24 M. nanus MA23 Daclak 84.0 0.1 78.4 9.5 68.8

25 M. anisopodus MA24 Daclak 24.6 1.0 56.9 11.7 61.8

26 M. oreophilus M25 LaoCai 9.1 1.8 88.8 10.5 91.8

Ghi chú: M.=Mallotus, (a)-Kết quả đánh giá hoạt tính tại trường Đại học Chung Nam, Hàn Quốc, (b)-Kết quả đánh giá hoạt tính tại trường Đại học UCL-Vương Quốc Bỉ, (c)-Kết quả dự đoán theo mô hình hóa thống kê dựa trên dấu vân tay sắc ký thực hiện tại trường Đại học VUB-Vương Quốc Bỉ159,160.

OH3CO

OCH3

O

2

3

45

6

7

8

9

10

11

12

1'

2'

3'4'

(1)-Malloapelta B

OHO

OH O

OH

OH

OH

OH

(2)-Myricetin

OHO

OH O

OH

OH

OH

(3)-Quercetin Hình VI.3.3. Một số hợp chất được phân lập từ chi Mallotus dùng làm chất xác

định vùng hoạt tính trên dấu vân tay sắc ký Chuẩn bị mẫu: Cân 2.5g mẫu thô thảo dược và chiết với dung môi MeOH (3x25ml) trong thiết bị siêu âm (Branson Ultrasonic Corporation, Danburry, USA). Lọc mẫu qua giấy lọc đường kính d=240 nm (Whatman, Hanoi, Vietnam) cất loại dung môi dưới áp suất giảm (60 atm-70 atm) tại nhiệt độ từ 40- 50oC. Cao khô được chia thành ba phần: Phần 1 sử dụng để đánh giá hoạt tính, phần 2 được sử dụng để xây dựng dấu vân tay sắc ký , phần 3 được lưu trữ tại thư viện dịch chiết của Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên. Để chuẩn bị mẫu cho việc phân tích trên HPLC, cân chính xác 50 mg dịch thô và hoà tan trong 2 ml MeOH trong bình chiết, sau đó dung dịch này được đưa và bồn lắc trong 15 phút (Branson Ultrasonic Corporation, Danburry, USA). Dung dịch được lọc qua màng lọc Chromafil® A20/25 filter (đường kính lõi 0.2 µm và bán kính 25mm) bằng bơm tiêm của hãng Macherey-Nagel MN(Duren, Germany). Một lượng 10 µl dung dịch được bơm vào hệ thống HPLC. Điều kiện chạy sắc ký: Đầu tiên tại bước khởi đầu của thí nghiệm, điều kiện chạy sắc ký được khởi tạo như sau: Cột sắc ký (pha tĩnh) là hai cột ChromolithTM Performance RP-18e (100mm-4.6 mm I.D) với cột bảo vệ Chromolith và cột Lichrospher (200mm-4.6 mm I.D) với cột bảo vệ. Dung môi hữu cơ dùng trong pha động là metanol và acetonitrile. Thành phần của pha động bao gồm 0.05 % TFA trong dung môi hữu cơ (Kênh A) và 0.05 % TFA trong m-Q nước cất (kênh B) sử

246

dụng chương trình gradient với dung môi hữu cơ tăng từ 5 đến 95% (A) từ 0 đến 50 phút, 95% (A) trong 50 đến 60 phút. Các điều kiện thí nghiệm khác: Nhiệt độ cột là 25oC, thể tích bơm mẫu 10 ml, tốc độ dòng là 1.0 ml/phút, Bước sóng được thiết lập là 254 nm. Tiếp đó, tại bước tối ưu cho các điều kiện sắc ký, cột sắc ký được lựa chọn là hai hoặc ba cột ChromolithTM Performance RP-18e (100mm-4.6 mm I.D) và cột bảo vệ. Dung môi hữu cơ được lựa chọn là acetonitrile. Thành phần của pha động bao gồm 0.05 % TFA trong acetonitrile (A) và 0.05 % TFA trong m-Q nước (B) sử dụng chương trình gradient với dung môi hữu cơ tăng từ 5 đến 95% (A) trong khoảng từ 0 đến 50 phút, 95% (A) trong khoảng 50 đến 60 phút. Các điều kiện thí nghiệm khác giữ nguyên như đã đề cập ở trên. Cuối cùng điều kiện để xây dựng dấu vân tay sắc ký là hai cột chromolithTM Performace RP-18e, (100mm-4.6 mm I.D) với cột bảo vệ được lựa chọn làm pha tĩnh. Dung môi pha động bao gồm 0.05 % TFA trong ACN (A) và 0.05 % TFA trong nước m-Q (B) sử dụng chương trình gradient cho thời gian phân tích 60 phút dung môi pha động tăng từ 5 đến 20% (A) trong 0 đến 20 phút, 20 đến 95% (A) trong 20-50 phút, 95% (A) trong 50-60 phút. Tối ưu hoá thời gian phân tích giảm xuống 35 phút với chương trình gradient là pha động tăng 5-25 % (A) trong 0-12.5 phút, 25-95% (A) trong 12.5 - 25 phút, 95% (A) trong 25-35 phút và chương trình gradient cho thời gian phân tích 22.5 phút dung môi pha động tăng từ 10 đến 30 % (A) trong 0- 6.25 phút, 30-95% (A) trong 6.25-12.5 phút, 95% (A) in 12.5-22.5 phút. Các điều kiện thí nghiệm khác giữ nguyên như đã đề cập ở trên. Công cụ phân tích dữ liệu: Dữ liệu được tính toán trên máy tính có cấu hình chíp xử lý intel Pentium IV processor 1.69 MHz, 256 MB Ram, chạy hệ điều hành Microsoft Windows Xp và MatlabTM6.5 software (The MathWorks inc., Natick, MA) với công cụ tính toán hoá đo lường phát triển tại Đại học Vrije Universiteit Brussel (VUB). Toàn bộ phương pháp tiền xử lý số liệu (column centering , normalizing and column centering, snv), PCA và phương pháp phân tích số liệu đa biến (PLS, UVE-PLS) được thực hiện trên các chương trình con viết bằng ngôn ngữ Matlab phiên bản 6.5. Kết quả và bàn luận: Kết quả lựa chọn điều kiện phù hợp cho sắc ký: Trong bước khởi tạo thí nghiệm ban đầu phương pháp chuẩn bị mẫu theo168 được đề xuất, theo phương pháp này: 1 g thảo dược khô được hoà tan trong 20.0 ml 65% ethanol. Dung dịch được trộn trong thời gian 15 phút trong bể siêu âm và sau đó tiến hành lọc. Tuy nhiên do ban đầu thảo dược khô đã được chiết bằng MeOH do dó phương pháp chiết mẫu được đề xuất theo phương pháp sau: 50mg dịch cô của thảo dược được hoà tan trong 2.0 ml MeOH (Mẫu A) hoặc trong 2.0 ml Ethanol:water (60:40) (Mẫu B), dung dịch

247

được trộn trong 15 phút trong bể siêu âm và lọc. Sau đó, mô hình thiết kế thí nghiệm 22 full factorial được đề xuất (xem bảng VI.3.3), theo mô hình này sẽ có bốn thí nghiệm với hai yếu tố ảnh hưởng chính được khảo sát, hai yếu tố chính được xem là có ảnh hưởng nhiều nhất đến thí nghiệm đó là: Yếu tố thứ nhất là cột sắc ký (Pha tĩnh) với các mức ảnh hưởng là mức dương (+1) đối với hai cột chromolithTM Performace RP-18e, (100mm-4.6 mm I.D) với bảo vệ cột và mức âm (-1) cột Lichrospher C18 với bảo vệ cột. Yếu tố thứ hai là thành phần của dung môi hưu cơ trong pha động (mobile phase), với mức dương (+1) methanol và mức âm (-1) acetonitrile. Chương trình gradient với thời gian phân tích là 60 phút, trong đó thành phần pha động bao gồm kênh (A) 5-95 % dung môi hữu cơ với đệm là 0.05% TFA, kênh (B) 95-5 % nước Milli Q với đệm 0.05 % TFA. Nhiệt độ cột là 250C, tốc độ dòng là 1.0 ml/phút, lượng mẫu bơm là 10µl, bước sóng lựa chọn là 254 nm. Bảng VI.3.3. Số thí nghiệm và các yếu tố được lựa chọn

Số thí nghiệm Yếu tố 1: Cột sắc ký Yếu tố 2: Dung môi hữu cơ 1 - - 2 - + 3 + - 4 + +

Mẫu thảo dược có ký hiệu Ma17 (số 19 trong bảng VI.3.2) có kết quả thử hoạt tính chống ôxy hoá cao nhất, theo kết quả thử hoạt tính đã được thực hiện trong khuôn khổ của đề tài tại Hàn Quốc. Sau khi tiến hành thiết kế thí nghiệm, các kết quả thực nghiệm được so sánh, mỗi dấu vân tay sắc ký thu được được so sánh đánh giá, kết quả đánh giá ban đầu cho thấy thí nghiệm với mẫu được chuẩn bị trong MeOH (Mẫu A), dung môi acetonitrile làm dung môi hữu cơ và hai cột chromolithTM Performance RP-18e với cột bảo vệ, cho kết quả tốt hơn kết quả của ba thí nghiệm còn lại. Các điều kiện trong thí nghiệm này được lựa chọn để tiến hành các bước tối ưu tiếp theo. Tại bước tối ưu hoá tiếp theo, đầu tiên số lượng cột sắc ký HPLC được chọn làm thông số để tiến hành tối ưu hoá. Hai hoặc ba cột Chromolith Performance RP-18e với cột bảo vệ được đánh giá. Các điều kiện thí nghiệm khác được đề cập ở trên. Trong quá trình thí nghiệm, áp suất của hệ thống với ba cột sắc ký cao hơn rất nhiều so với hai cột sắc ký, áp suất này có thể làm hại đến cột. Hơn thế, không hoặc có rất ít sự thay đổi trên sắc đồ dÊu v©n tay của hệ ba cột so với hai cột. Do đó, hai cột sắc ký được lựa chọn cho các bước phân tích tiếp theo. Tiếp đó, chương trình gradient được lựa chọn để tối ưu hoá: ban đầu, thành phần của pha động bao gồm (kênh A) 0.05 % TFA trong ACN và (kênh B) 0.05 % TFA trong m-Q nước sử dụng chương trình gradient trong đó 0.05% TFA trong ACN (kênh A) thay đổi từ 5 đến 95% trong 50 phút và sau đó giữ nguyên 95% trong 10

248

phút. Các điều kiện thí nghiệm khác giữ nguyên như trên. Kết quả HPLC dÊu v©n tay xem trên hình VI.3.4. Trên sắc ký HPLC dÊu v©n tay này, các peak phân bố chủ yếu từ 6 phút đến 30 phút, có nhiều peak chồng chéo. Việc tối ưu chương trình gradient tiếp tục thực hiện với sự thay đổi của dung môi trong pha động (kênh A) từ 5 đến 15% (A) 25 phút, tiếp đó thay đổi (kênh A) từ 15 đến 95% trong 25 phút, sau đó giữ nguyên 95% trong vòng 10 phút. Các điều kiện thí nghiệm khác giữ nguyên như đã đề cập ở trên. Dấu vân tay sắc ký được thể hiện trên hình VI.3.4.

Hình VI.3.4. Kết quả HPLC dÊu v©n tay tại bước tối ưu đầu tiên

Trên bản dấu vân tay sắc ký này, các peak đã phân bố rộng hơn từ 3 phút đến 60 phút. Tuy nhiên, vẫn có quan sát được các peak chồng chéo nhau trong khoảng từ 30 phút đến 40 phút. Tiếp tục thay đổi chương trình gradient với dung môi pha động của kênh A thay đổi từ 5% đến 20% trong 20 phút, tiếp đó thay đổi 20% đến 95% (A) trong 30 phút, sau đó giữ ở 95% trong 10 phút. Các điều kiện thí nghiệm khác giữ nguyên như đối với các thí nghiệm trên. Kết quả quan sát dấu vân tay sắc ký trên hình VI.3.4 cho thấy thông tin thu nhận được rõ ràng, mức độ phân tách của các peak tăng, mật độ phân bố của các peak trải đều trên sắc ký đồ. Không hoặc quan sát thấy rất nhỏ các peak chồng chéo nhau. Tiếp tục tiến hành tối ưu hoá chương trình gradient, kết quả thu được không có sự thay đổi nhiều. Do đó điều kiện thí nghiệm và gradient trên được lựa chọn để xây dựng các protocol tạo dấu vân tay sắc ký của các mẫu Mallotus ở các thời gian phân tích khác nhau159. Hình VI.3.5 là một trong những dấu vân tay sắc ký được tạo ra từ mô hình nghiên cứu với các điều kiện nêu trên.

Hình VI.3.5. Dấu vân tay sắc ký của mẫu M.cuneatus

Quy trình xây dựng dấu vân tay sắc ký của các mẫu Mallotus: Protocol 60 phút: Bằng các bước tối ưu và lựa chọn các điều kiện phân tích như trên. Protocol để xây dựng dấu vân tay sắc ký của các mẫu Mallotus trong thời gian 60 phút được trình bày trên các hình VI.3.6.

a b

249

(a)

(b)

Hình VI.3.6. Protocol 60 phút dấu vân tay sắc ký cña mÉu Mallotus vµ vÝ dô HPLC dÊu v©n tay cña mÉu MA15

Các bước để thực hiện protocol như sau: Bước khởi tạo là lập điều kiện cho cột và các điều kiện cho hệ thống sắc ký, tiếp theo là chương trình bơm mẫu, bước thứ ba là quá trình rửa sau khi bơm mẫu và bước cuối cùng là rửa sau quá trình phân tích để kết thúc quá trình thực hiện protocol. Ví dụ áp dụng protocol với mẫu MA15 (mẫu số 17 trong bảng VI.3.2) được trình bày trên hình VI.3.6. Protocol 35 min Trong phân tích nhất là với mục đích để đánh giá nhanh chất lượng sản phẩm.

(a)

(b)


Mong muốn để giảm bớt thời gian phân tích là rất cần thiết, trên cơ sở các bước tối ưu đã thực hiện ở trên. Tiến hành xây dựng protocol xây dựng dấu vân tay sắc ký với thời gian phân tích giảm xuống còn 35 phút (xem hình VI.3.7). Với protocol này giảm thời gian phân tích từ 60 xuống 35 phút bằng cách thay đổi chương trình gradient với chương trình gradient thay đổi như sau: dung môi hữu cơ tăng 5% đến 25 % (kênh A) trong khoảng 0-12.5 phút, 25-95% (kênh A) trong 12.5 đến 25 phút, 95% (A) trong 25-35 phút. Các điều kiện phân tích khác được giữ nguyên như đối với protocol 60 phút. Ví dụ thực hiện protocol 35 phút với mẫu MA15 (số 17 trong bảng VI.3.2) xem trên hình VI.3.7. Protocol 22.5 min Tiếp tục giảm thời gian phân tích xuống còn 22.5 phút. Chúng tôi xây dựng protocol 22.5 phút (xem trên hình VI.3.6) với chương trình gradient thay đổi như sau: Dung môi pha động tăng từ 10 đến 30 % (kênh A) trong khoảng từ 0 đến 6.25

250

phút, 30-95% (A) trong 6.25 đến 12.5 phút, 95% (A) từ 12.5 đến 22.5 phút. Các điều kiện khác cho thí nghiệm được giữ nguyên. Một ví dụ cho việc thực hiện mô hình đối với mẫu MA15 (số 17 trong bảng VI.3.2) xem trên hình VI.3.8.

(a)

(b)


Áp dụng protocol 60 phút, 35 phút, 22.5 phút trong xây dựng dấu vân tay sắc ký của 39 mẫu Mallotus và các mẫu chuẩn. Kết quả áp dụng mô hình 60 phút, 35 phút, 22.5 phút xây dựng HPLC dÊu v©n tay cho 39 mẫu Mallotus và các mẫu chuẩn được trình bày trên hình VI.3.9 a,b,c và hình IV.10

Hình VI.3.9.a. Kết quả áp dụng mô hình 60 phút

Hình VI.3.9.b. Kết quả áp dụng mô hình 35 phút

Hình VI.3.9.c. Kết quả áp dụng mô hình 25 phút

Kết quả dấu vân tay sắc ký tạo ra trên các mô hình cho thấy có rất nhiều thành phần trên dấu vân tay sắc ký của Mallotus, nhiều thành phần có hàm lượng rất nhỏ và khả năng phân tách là rất khó khăn (Hình VI.3.10).

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5- 5 0 0

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

T i m e

Inte

nsity

0 5 1 0 1 5 2 0-5 0 0

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

Tim e

Inte

nsity

0 10 20 30 40 50 60-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Tim e

Inte

nsity

251

0 10 20 30 40 50 60-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

time

inte

nsity

Hình 4.10. Xen phủ các dấu vân tay sắc ký (a) 60 phút, (b) 35 phút của 26 mẫu Mallotus (ký hiệu đường liền ──) và sự có mặt của hai chất chuẩn myricetin,quercetin (ký hiệu đường nét đứt ---). Mục đích của việc xây dựng dấu vân tay sắc ký là để đánh giá chất lượng của nguyên liệu Mallotus, công việc đánh giá này dựa trên nhiều tiêu chí: thành phần hóa học, hoạt tính, độc tố, hàm lượng flavonoid tổng, ancaloid tổng... Trong các nghiên cứu bước đầu về đánh giá nguyên liệu Mallotus, các nghiên cứu ban đầu sẽ tập trung đánh giá hàm lượng tổng flavonoid thông qua việc đánh giá hoạt tính chống ôxy hoá với một vài chất chuẩn, các chất chuẩn này được chứng minh có mặt trong thành phần hóa học một số loài thuộc chi Mallotus bằng các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc. Công việc đầu tiên đã được tiến hành tách những peak riêng biệt của những hợp chất có hoạt tính chống ôxy hoá bằng phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học 70,78,95

. Công việc tiếp theo là chỉ định hoặc phân chia thành những vùng có những peak của các hợp chất có hoạt tính chống ôxy hoá 159,160. Công việc này được thực hiện bằng cách so sánh các số liệu dấu vân tay sắc ký của mẫu với số liệu trên dấu vân tay sắc ký của chất chuẩn. Kết quả so sánh cho thấy các mẫu (MA14, MA15, MA17, MA22) có những vùng trên đó có chứa các peak của các hợp chất có thể hiện hoạt tính chống ôxy hoá. Ví dụ việc so sánh của sắc đồ chất chuẩn và sắc đồ mẫu MA15 (mẫu số 17 trong bảng IV.3.2) tại 60 phút (Hình VI.3.11).

Hình VI.3.11. So sánh của sắc đồ chất chuẩn và sắc đồ mẫu MA15 (mẫu số 17 trong bảng VI.3.2) tại 60 phút

0 5 10 15 20 25 30 35 -500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

time

intensity

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 00

1 0 0

2 0 0

T im e

Inte

nsity

M A 1 5 -c h ro m a 1 7

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 00

5 0 0

1 0 0 0

T im e

Inte

nsity

M y ric e t in

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 00

5 0 0

1 0 0 0

T im e

Inte

nsity

Q u e rc e t in

0 5 1 0 1 5 2 00

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

Tim e

Inte

nsity

C h ro m a 1 7 -M A 1 5

0 5 1 0 1 5 2 00

1 0 0 0

2 0 0 0

Tim e

Inte

nsity

M y ric e t in

0 5 1 0 1 5 2 00

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

Tim e

Inte

nsity

Q u e rc e t in

quer

cetin

m

yric

etin

(a)

myr

icet

in

(b)

252

Tuy nhiên việc so sánh này cho kết quả rất hạn chế bởi vì nếu số mẫu cần so sánh gia tăng thì việc đánh giá bằng thị giác trở nên rất khó khăn. Hơn thế nữa nếu có sự dịch chuyển thời gian lưu của peak cần so sánh với các peak trên sắc đồ chuẩn hoặc với chất chuẩn do các nguyên nhân đã được đề cập ở trên thì việc lựa chọn peak và vùng có peak để so sánh gặp nhiều khó khăn trong cả việc tính toán và bằng thị giác. Khi có sự dịch chuyển thời gian lưu của các peak thì việc so sánh các peak để hiệu chỉnh sự dịch chuyển mà không có các thiết bị phân tích như diodearray detector (DAD) hoặc số liệu về phổ khối (Mass spectrometric -MS) sẽ giảm sự tin cậy. Ngay cả việc sử dụng phương pháp COW153 để hiệu chỉnh sự sai lệch về thời gian lưu cũng gặp phải vấn đề liên quan đến sự thiếu hụt xác nhận của phổ UV và MS, thêm vào đó phương pháp này mất nhiều thời gian và tài nguyên của máy tính. Để khắc phục nhược điểm trên, Việc ứng dụng các phương pháp xử lý số liệu bằng các phương pháp của hoá thống kê (hoá đo lường-chemometric) là lựa chọn đầu tiên. Trước hết tiến hành tiền xử lý số liệu bằng cách kết hợp giữa phương pháp tiền xử lý số liệu theo các quá trình xử lý hóa thống kê: column centering, normalization tiếp đó là column centering và standard normal variate transformation (SNV), cuối cùng là column centering. Đánh giá kết quả xử lý trên phương pháp phân tích thành phần chính (Principal component analysis -PCA). Sau đó sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu riêng phần và mô hình mở rộng của phương pháp này là UVE-PLS (Uninformative Variable Elimination by PLS) để xây dựng mô hình đánh giá (dự đoán) hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu Mallotus qua các dấu vân tay sắc ký của chúng. Tiền xử lý dữ liệu

Hình VI.3.12. Kết quả đánh giá trên PCA dữ liệu sau khi tiến hành tiền xử lý

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

PC1

PC

2

1 2

3

4

5 6

7

8 9

10

11

12

13

1415

1617

18

19

2021

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

3839

A

B

C

D

253

-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

1

2

3

4

5

6

7

8 9

1011

12

13

14

15 16 17

18

1920

21

2223

242526

PC1

PC2

Hình VI.3.13. Giản đồ PC1-PC2 của 26 mẫu Mallotus, sử dụng bản dấu vân tay sắc ký 60 phút. Trong đó có các nhóm: (a) các mẫu 16-17-19 (màu đen), (b)3-7-25-26 (màu đỏ), (c) 2-6-14-15-20-22-23 (màu lục cam), (d) 10-11-12 (màu đỏ tươi), (e) 1-5-13-18-21-24 (màu xanh), và (f) 4-8-9 (xanh lá cây) với các số mâu theo thứ tự trên bảng VI.3.2 Trong mô hình tiền xử lý dữ liệu, các phương pháp tiền xử lý số liệu khác nhau được áp dụng nhằm nâng cao hiệu quả của mô hình đánh giá chất lượng của loài Mallotus qua việc đánh giá hoạt tính chống ôxy hoá (phương pháp đánh giá với các hoạt tính khác được tiến hành tương tự). Để thực hiện được việc này trước khi xây dựng mô hình đánh giá dấu vân tay sắc ký bằng các phương pháp PLS hoặc PLS-UVE, các số liệu dấu vân tay sắc ký tại (60 phút, 35 phút, 22.5 phút) được tiền xử lý bằng các phương pháp hoá thống kê (chemometric) nhằm mục đích giảm thiểu ảnh hưởng của các peak chồng chéo, dịch chuyển đường nền, nhiễu và ngay cả sự dịch chuyển thời gian lưu của các peak trong quá trình xây dựng dấu vân tay sắc ký . Các phương pháp tiền xử lý số liệu như: column centering, normalization tiếp đó là column centering, standard normal variate transformation (SNV) và column centering. Phương pháp phân tích thành phần chính (Principal component analysis-PCA)151-154được áp dụng vào đánh giá dữ liệu trước và sau khi tiến hành xử lý (hình VI.3.12 và hình VI.3.13 ). Mục đích của việc áp dụng phương pháp PCA trong mô hình đánh giá này là tìm kiếm các nhóm có hoạt tính chống ôxy hoá (theo kết quả thử hoạt tính các mẫu có số thứ tự 3,7,11,12,16,17,19,23,24 trên bảng VI.3.2). Trên lý thuyết các nhóm này sẽ tạo thành các nhóm riêng biệt trên biểu đồ kết quả của phương pháp PCA. Tuy nhiên quan sát trên kết quả của PCA cho thấy ngay cả khi áp dụng các phương pháp tiền xử lý số liệu, các nhóm thảo dược có hoạt tính chống ôxy hoá không phân tách hoàn toàn thành các nhóm riêng biệt trên biểu đồ, trên biểu đồ vẫn còn một số dược liệu có kết quả thử hoạt tính chống ôxy hóa trên thực nghiệm nằm khác vùng so với các nhóm thể hiện hoạt tính chống ôxy hóa. Khi xem xét trên biểu đồ này có thể nhìn thấy các nhóm theo số thứ tự trong bảng kết quả đánh giá hoạt tính chống ôxy hoá (Xem bảng VI.3.2 và hình VI.3.11). Có các nhóm

254

tương ứng với các số thự tự của mẫu trên bảng VI.3.2 như nhóm: (a) các mẫu 16-17-19 (màu đen), (b)3-7-25-26 (màu đỏ), (c) 2-6-14-15-20-22-23 (màu lục cam), (d) 10-11-12 (màu đỏ tươi), (e) 1-5-13-18-21-24 (màu xanh), và (f) 4-8-9 (xanh lá cây). Trên giản đồ hình VI.3.11 dễ dàng nhận thấy ba mÉu cña nhãm (f) n»m xa tÊt c¶ çc nhãm kh¸c cïng trªn trôc PC2, mÆc dï ®· lo¹i trõ çc ¶nh hëng cña çc yÕu tè kh«ng mong muèn kh¸c b»ng çc xö lý hãa thèng kª. Çc bíc lÆp cña tiÕn tr×nh xö lý PCA ®îc lÆp ®i lÆp l¹i nh»m lo¹i bá çc ¶nh hëng cña mét sè yÕu tè phô. MÆc dï çc nhãm (b) vµ (d), (a) ®· ®îc ph©n biÖt râ rµng vµ t¸ch ra tõ çc mÉu kh¸c. Çc mÉu thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng «xy ho¸ cña nhãm (a) ®îc t¸ch ra râ rµng h¬n so víi çc nhãm kh¸c (h×nh VI.3.12). Tuy nhiªn, vÉn cßn cã sù chång chÐo x¶y ra gi÷a çc mÉu cña nhãm (c) vµ (e). Tiếp tục thực hiện các phép xử lý theo nguyên lý hóa thống kê đối với số liệu đầu vào là 39 mẫu dấu vân tay sắc ký Mallotus, kết quả cho thấy các vùng trên giản đồ PCA những mẫu thể hiện hoạt tính chống ôxy hóa (hình VI.3.14, VI.3.15). Như vậy các mẫu có hoạt tính 3,7,11,12,16,17,19,23,24 không nằm riêng thành một nhóm mà vẫn có mặt sang các nhóm khác.

Hình VI.3.14. Khoanh vùng trên PCA những mẫu dự kiến có hoạt tính chống ôxy

hóa.

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1

2

3

4

5 6

7

8

9

1011

12

13

1415

1617

18

19

2021

22

23

24

2526

27

28 29

30

31

32

3334

35

36

37

3839

PC1

PC2

H×nh VI.3.15. Gi¶n ®å PCA(PC1-PC2) với số liệu đầu vào là 39 bản dấu vân tay sắc ký của 39 mẫu Mallotus (Bảng VI.3.1). Năm nhóm được phân biệt, tức là (a) có chứa các mẫu 16-17-19-27-28 (▲), (b) với mẫu 35-36-37 (•), (c) với mẫu ), (d) với mẫu 4-8-9 (■), và (e) với mẫu∗6-10-29-30 -31-32-33-34-38-39 ( 3-7-25-26 (▼). 9 mẫu các chất chống oxy hoá rất tích cực này được đánh dấu đậm. Các mẫu còn 1-2-5-11-12-13-14-15-18-20-21-22-23 được chỉ định với x.

(d)

(b)

(e)

255

Nguyên nhân này có thể được giải thích như sau: Do sự dịch chuyển thời gian lưu của một số peak trên một số dấu vân tay sắc ký do các nguyên nhân đã đề cập ở trên, do sự tồn tại của một số thông tin không hữu ích, những thông tin này hình thành do quá trình chiết mẫu hoặc lấy mẫu (sự có mặt của các hợp chất tanin, sugar, protein và nhựa) những thông tin này có thể ảnh hưởng đến việc làm tăng hoặc giảm hoạt tính chống ôxy hoá giữa các mẫu. Một nguyên nhân khác nảy sinh ngay tại phương pháp PCA, bởi vì phương pháp này rất nhạy đối với các số liệu dù rất nhỏ và với sự có mặt của các đối tượng gây nhiễu và lỗi. Trên lý thuyết thì phương pháp PCA có thể được thực hiện rất tốt khi không có mặt các yếu tố ảnh hưởng trên. Để hiệu chỉnh sự sai lệch trong thời gian lưu của một số các peak trên dấu vân tay sắc ký , có thể áp dụng một phương pháp có tên là tối ưu hoá sự tương quan giữa các đuờng cong (correlation optimised warping-COW)150. Tiến hành một bước thử nghiệm với việc áp dụng phương pháp xử lý COW đối với các mẫu dấu vân tay sắc ký thu được. Kết quả so sánh trên hình VI.3.16 cho thấy khả năng sử dụng phương pháp COW để xử lý số liệu không mang lại kết quả khả quan. Các hình ảnh của dấu vân tay sắc ký trên hình VI.3.16 trước và sau khi xử lý không quan sát được sự thay đổi bằng mắt thường, kiểm tra số liệu trên phần mềm tính toán cho thấy không có sự sai khác. Nguyên nhân là do có quá nhiều peak trên dấu vân tay sắc ký , với thời điểm hiện tại khả năng nhận dạng của phần mềm xử lý số liệu COW không phù hợp với số liệu đầu vào bao gồm dấu vân tay sắc ký của nhiều mẫu khác loại.

0

1000

2000

3000

4000

time

inte

nsity

0 10 20 30 40 50 600

1000

2000

3000

4000

time

inte

nsity

unaligned

aligned

H×nh VI.3.16. H×nh ¶nh dÊu v©n tay s¾c ký 60 phót cña c¸c mÉu Mallotus, tríc

vµ sau khi xö lý b»ng COW-Correlation Optimized Warping.

256

Trên thực tế trong trường hợp này sự dịch chuyển thời gian lưu của peak không nhiều, khó xác định được peak nào trên dấu vân tay sắc ký nào có sự dịch chuyển và phân bố giữa các dấu vân tay sắc ký nếu không có số liệu hỗ trợ của đầu dò (DAD) hoặc phổ khối lượng (Mass spectrometric-MS). Khi không có số liệu của các thiết bị hỗ trợ này thì rất khó có thể nhận biết được peak nào sẽ cần phải hiệu chính cho phù hợp với các peak khác trên dấu vân tay sắc ký . Xây dựng mô hình đánh giá hoạt tính chống ôxy hoá các dấu vân tay sắc ký của các mẫu Mallotus bằng PLS và UVE-PLS Do số lượng các dấu vân tay sắc ký không đủ lớn để chia dữ liệu thành hai dạng mô hình là: mô hình tính toán và mô hình kiểm tra. Do đó toàn bộ dữ liệu dấu vân tay sắc ký được dùng để xây dựng mô hình tính toán theo PLS, mô hình kiểm tra sẽ được xây dựng sau khi đã chuẩn hóa được mô hình tính toán với số liệu đầu vào cho mô hình tính toán đủ lớn. Mức độ tối ưu của mô hình tính toán PLS được tính toán sai số bình phương tối thiểu riêng phần RMSECV áp dụng cho từng thành phần của PLS với việc xác định các thành phần này qua thủ tục LOO-CV đã trình bày trong phần lý thuyết ở trên (kết quả so sánh trên bảng VI.3.4). Bảng VI.3.4. So sánh sai số bình phương tối thiểu riêng phần RMSECV

%SA %DPPH Mô hình

Phương pháp xử lý số liệu theo hóa thống kê # RMSECV # RMSECV

Column centering 4 27.8 4 15.3

Normalization and column

centering 3 24.1 5 12.5

60

SNV and column centering 4 23.7 3 13.9



centering 3 25.3 6 9.9

35




centering 3 23.7 6 9.0

22.5


Các mô hình tối ưu theo phương pháp PLS được xây dựng từ những dữ liệu có chứa ma trận X (26 mẫu Mallotus) và véc tơ đáp ứng của y, tức là các giá trị thử hoạt tính theo phương pháp thực hiện tại Hàn Quốc (ký hiệu % SA) hoặc kết quả đánh giá hoạt tính chống ôxy hoá thực hiện tại UCL-Bỉ (ký hiệu DPPH%). Sự phức tạp của mô hình tối ưu đã được xác định từ các giá trị RMSECV tính toán, đối với các mô hình với các thông số khác nhau của các thành phần hồi quy PLS, các thông số LOO-CV. Mô hình thu nhận được gọi là mô hình đơn giản và tối ưu đạt được với các RMSECV thấp nhất. Sự ảnh hưởng của ba phương pháp tiếp cận tiền xử lý dữ

257

liệu và kết quả chính xác của hai phương pháp đánh giá hoạt tính được đánh giá trên mô hình hồi quy PLS (Bảng VI.3.4). Nói chung, RMSECV thu được nhỏ hơn khi sử dụng các kết quả DPPH% (các kết quả thử hoạt tính tại UCL-Bỉ). Liên quan đến các phương pháp tiền xử lý, các phương pháp xử lý số liệu normal tiếp đến phương pháp centering sẽ dẫn đến các mô hình hồi quy PLS với mức độ dự đoán tốt hơn khả năng tiên đoán. Đối với độ dài dấu vân tay sắc ký, với quy trình 22,5 phút cho kết quả dự đoán tốt hơn. Để đánh giá sự ảnh hưởng của những chất và nhóm chất đối với mô hình hồi quy PLS đưa ra, tính toán các hệ số hồi quy được chỉ ra trên hình VI.3.17. Với mô hình dấu vân tay sắc ký độ dài 60 phút. Áp dụng đối với các mẫu Mallotus oblongifolius (mẫu 16), Mallotus floribundus (mẫu 17), và Mallotus cuneatus (mẫu 19), được vẽ trên cùng hệ số hồi quy PLS. Những mẫu có thể hiện hoạt tính chống ôxy hóa hoặc có chứa một số hợp chất chống ôxy hóa (↓) sẽ có hệ số quy phủ định (theo chiều ngược). Kết quả thể hiện trên các hình VI.3.17a-f.

0 10 20 30 40 50 60-600

-200

200

600

1000

1400

1800

time

inte

nsity

and

100

x re

gres

sion

coe

ffici

ents

Sample 16Sample 17Sample 19100 x regression coefficients

(a)

0 10 20 30 40 50 60-2000

-1000

0

1000

2000

3000

4000

time

inte

nsity

Sample 3Sample 7Sample 25Sample 26300 x regression coefficients

(b)

0 10 20 30 40 50 60-400

0

400

800

1200

1600

2000Sample 2Sample 6Sample 14Sample 15Sample 20Sample 22Sample 2350 x regression coefficients

(c)

0 10 20 30 40 50 60-600

-200

200

600

1000

1400

1800

time

inte

nsity


(d)

258

0 10 20 30 40 50 60-1500

-1000

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

time

inte

nsity

Sample 1Sample 5Sample 13Sample 18Sample 21Sample 24200 x regression coefficients

(e)

0 10 20 30 40 50 60-1500

-1000

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

time

inte

nsity

and

200

x re

gres

sion

coe

ffici

ents


(f)

Hình VI.3.17. Hệ số hồi quy PLS với dấu vân tay sắc ký các mẫu Mallotus. Trong đó đường hệ số hồi quy (đường màu đen rắn ─ ─), hai hợp chất myricetin (peak cao thứ nhất) và quercetin (peak cao thứ hai) với đường hệ số hồi quy (đường màu đen-). Các nhóm tương ứng với các mẫu: (a) 16-17-19, (b) 3-7-25-26, (c) 2-6-14-15-20-22-23, (d) 10 11 12, ( e) 1-5-13-18-21-24, và (f) 4-8-9. Trên bảng VI.3.2, giá trị DPPH theo mô hình đánh giá mẫu 03Ma (Mẫu số 3 trong bảng VI.3.2), NT03 (mẫu số 7 trong bảng VI.3.2), SP04 (mẫu số 11 trên bảng VI.3.2), MA14, MA15 (mẫu số 16, 17 trong bảng VI.3.2), MA17 (mẫu số 19 trong bảng VI.3.2) là chấp nhận được. Tuy nhiên theo mô hình đánh giá, có các mẫu 02Ma (mẫu số 2 trong bảng VI.3.2), MA03 (mẫu số 10 trong bảng VI.3.2), MA22, MA23 (mẫu số 23, 24 trong bảng VI.3.2) vẫn cần xem xét. Có thể lý giải cho vấn đề này là do một số ảnh hưởng của các thông tin không có giá trị (uninformative chromatographic variables) tồn tại trên các dấu vân tay sắc ký , một nguyên nhân khác có thể là phương pháp đánh giá DPPH thực hiện tại Hàn Quốc và phương pháp chiết mẫu thực hiện tại Việt Nam (Theo đó phương pháp chiết mẫu bằng MeOH có thể kéo theo sự có mặt của đường, protein và tanin trong dịch chiết). Để giải quyết các vấn đề nảy sinh trên, trước hết chúng tôi sử dụng mô hình UVE-PLS nhằm loại trừ khả năng ảnh hưởng của các thông tin không hữu ích tồn tại trên các dấu vân tay sắc ký . Mô hình này theo lý thuyết xây dựng phương pháp thì phương pháp này có khả năng loại trừ các thông tin không hữu ích trên dấu vân tay sắc ký . Thông thường mô hình UVE-PLS thường có độ phức tạp thấp hơn vì sử dụng số thành phần đã được tối ưu từ mô hình PLS, mô hình UVE-PLS sẽ cung cấp một sự cải tiến đáng kể trong khả năng đánh giá (dự đoán) của mô hình. Trong tài liệu này chúng tôi không trình bày toàn bộ các phương pháp tính toán mà chỉ trình bày tóm tắt kết quả và đánh giá mô hình. Bằng cách sử dụng mô hình PLS-UVE mức độ phức tạp của mô hình PLS được giảm xuống. Giá trị của RMSECV và số thành phần chính của mỗi giá trị trong mô hình PLS được sử dụng cho bước khởi tạo của mô hình PLS-UVE, các giá trị đánh giá mô hình UVE-PLS được trình bày trên bảng VI.3.5.

259

Bảng VI.3.5. Đánh giá mô hình UVE-PLS PLS UVE-PLS

M«

h×nh Sè yÕu

tè ¶nh

hëng

Sè biÕn RMSECV

Sè yÕu

tè ¶nh

hëng

Sè biÕn RMSECV

60 min 4 18000 23.6721 4 2405 8.7401

35 min 2 10500 25.7938 6 305 6.8751

22.5

min 3 6750 23.7267 6 417 6.8342

Trên bảng VI.3.5 nhận thấy mặc dù số thành phần chính trong mô hinh UVE-PLS lớn hơn trong mô hình PLS. Tuy nhiên số biến trong mô hình UVE-PLS đã giảm xuống hơn so với mô hình PLS bởi vì số thông tin không hữu ích trong mô hình UVE-PLS đã được loại bỏ, do đó giá trị RMSECV nhỏ hơn so với giá trị RMSECV trong mô hình PLS. Qua đó chứng tỏ khả năng đánh giá các mẫu theo mô hình UVE-PLS tối ưu hơn mô hình PLS. Mặt khác khi xem xét kết quả đánh giá hoạt tính chông ôxy hóa trên thực tế với kết quả dự đoán có thể kết luận mô hình dự đoán có thể chỉ ra một số mẫu có những đặc tính khác biệt so với các mẫu khác. Một số mẫu mặc dù kết quả thử hoạt tính trên thực tế cho ra kết quả tốt nhưng khi kiểm tra trên mô hình lại không thực sự nằm trên cùng vùng với các nhóm có chứa các hợp chất có hoạt tính. Điều này có thể giúp cho việc kiểm soát các mẫu này, nhiều trường hợp kết quả thử hoạt tính thực tế bị ảnh hưởng bởi nồng độ của các chất gây hiệu ứng phụ cho phép thử hoạt tính như tanin có thể gây ra sự nhầm lẫn trong hoạt tính chống ôxy hóa. Trên biểu đồ hình VI.3.18, một số mẫu không nằm trong nhóm chất thể hiện hoạt tính chông ôxy hóa có vị trí rất xa so với các mẫu có chứa chất chống ôxy hóa.

Hình VI.3.18. Kết quả dự đoán hoạt tính của mô hình dự đoán

Loại bỏ nguyên nhân các phép thử hoạt tính chống ôxy hóa trên thực tế bị mắc lỗi. Tiếp tục áp dụng các phương pháp xử lý số liệu như: Multiple linear

260

regression169, Principal component regression170-172, Orthogonal Projection to latent structures173 để kiểm tra tính chống ôxy hóa của các mẫu có giá trị hoạt tính chông ôxy hóa khác so với sô liệu dự đoán. Các kết quả được trình bày trên hình VI.3.19, trên hình này có thể nhận thấy mỗi phương pháp xử lý số liệu cho một hình ảnh đặc trưng về đặc tính của mẫu nghiên cứu. Khi kết hợp các phương pháp có thể chỉ rõ các ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đến giá trị thử hoạt tính chống ôxy hóa. Các peak âm thể hiện trên hình VI.3.19 từ thời gian lưu 28.9 đến 31.1 phút, vùng này có rất nhiều peak và là vùng có chứa các hợp chất chống ôxy hóa. Các phương pháp xử lý số liệu hóa thống kê được áp dụng đã loại trừ được các peak không mong muốn, tức là các peak chứa các thông tin không quan trọng, trong trường hợp này có thể là thông tin không hữu ích nảy sinh do quá trình chạy phân tích. Qua các bước xử lý trên, các peak còn lại là các peak đại diện cho các hợp có tiềm năng chống ôxy hóa. Công việc này cần được khẳng định rõ ràng thông qua các nghiên cứu về LC-MS và phân lập trực tiếp các hợp chất nằm trên các sắc ký đồ dÊu v©n tay đã được chỉ ra.

0100020003000

inte

nsity

-1000100

-200

20

regr

essi

on c

oeffi

cien

ts

-505

regr

essi

on c

oeffi

cien

ts

-200

20

0 10 20 30 40 50 60-505

time

Step-MLR

PCR

PLS

UVE-PLS

O-PLS

H×nh VI.3.19. H×nh ¶nh c¸c dÊu v©n tay s¾c ký víi ph¬ng thøc xö lý sè liÖu kh¸c

nhau nh MLR, PCR, PLS, UVE-PLS và O-PLS.

261

Như vậy, trong mô hình dấu vân tay sắc ký dùng để đánh giá chất lượng dược liệu, các yếu tố trong mô hình có vai trò quan trọng như nhau. Sự thay đổi của từng yếu tố trong mô hình có thể dẫn đến sự thay đổi của cả mô hình. Cách thức áp dụng mô hình dấu vân tay sắc ký cho từng đối tượng dược liệu cụ thể cần được khảo sát để xác định các yếu tố trong mô hình. Khi các yếu tố đã được xác định, việc tối ưu hoá các yếu tố là rất cần thiết để đạt được một mô hình tối ưu nhất.

Mô hình đánh giá chất lượng loài thảo dược Mallotus của Việt Nam cũng dựa trên các yêu cầu đã nêu trên. Trong mô hình này đối tượng được lựa chọn để đánh giá là các loài thực vật thuộc chi Mallotus được thu thập tại các địa điểm khác nhau ở Việt Nam. Các yếu tố chính trong mô hình này đã được lựa chọn như: Nguyên liệu đầu vào là các loài Mallotus, hoạt tính chống ôxy hoá, mô hình phát triển sắc ký dựa trên thiết bị HPLC-VWD, Các phương pháp xử lý số liệu theo hoá thống kê như: column centering, normalization tiếp đó là column centering, standard normal variate transformation (SNV) và column centering. Phương pháp phân tích thành phần chính (Principal component analysis-PCA), phương pháp bình phương tối thiểu riêng phần –PLS, UVE-PLS. Mô hình này bước đầu đánh giá mối tương quan giữa dấu vân tay sắc ký và hoạt tính chống ôxy hoá (Phần nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào sẽ được thông báo trong một chuyên đề nghiên cứu khác). Khả năng dự đoán hoạt tính chống ôxy hoá thông qua các mẫu dấu vân tay sắc ký hoàn toàn có thể thực hiện được. Các bước tối ưu hoá các yếu tố của mô hình như: quá trình xử lý mẫu, phát triển sắc ký trên hệ thống tối ưu hơn như HPLC-MS với sự thay đổi các thông số của hệ... sẽ giúp cho việc đánh giá và dự đoán hoạt tính được chính xác hơn và đáng tin cậy hơn.

262

KÕt luËn

1. §· tiÕn hµnh thu thËp vµ x©y dùng bé c¬ së d÷ liÖu vÒ c¸c loµi thuéc chi Ba bÐt vµ mét sè loµi thùc vËt kh¸c phôc vô cho sµng läc ho¹t tÝnh, nghiªn cøu hãa häc vµ x©y dùng ph¬ng ph¸p d©u v©n tay s¾c ký trong ®¸nh gi¸ chÊt lîng mét sè loµi thuéc chi Mallotus cña ViÖt Nam. 2. §· tiÕn hµnh x©y dùng quy tr×nh nghiªn cøu hãa häc vµ kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc cña 7 loµi thùc vËt, trong ®ã cã 6 loµi thuéc chi Mallotus vµ 01 loµi thùc vËt kh¸c. KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy: - Tõ loµi Mallotus nanus ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 9 hîp chÊt, ®ã lµ: mallonaonside A, mallonaonside B, juglanin, rhoifolin, kaempferin, quercetin, myricitrin, daucosterol vµ Stigmast-5-en-3-O--6-O-eicosanoyl-D-glucopyranoside. Trong ®ã hîp chÊt mallonaonside A (1), mallonaonside B (2) lµ nh÷ng chÊt míi. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng « xy hãa cho thÊy hai ho¹t chÊt míi thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng « xy hãa m¹nh h¬n c¶ vitamin E vµ trolox. - Tõ loµi Mallotus anisopodus ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 6 hîp chÊt, ®ã lµ: anisoposide A, anisoposide B, bergenin, junipetrioloside A, N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide, α-tocopherol. Trong ®ã hîp chÊt anisoposide A, anisoposide B lµ nh÷ng hîp chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp tõ hîp chÊt thiªn nhiªn. - Tõ loµi Mallotus paniculatus ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 8 hîp chÊt, ®ã lµ: pinoresinol, taraxerone, epitaraxerol, astiblin, taxifolin, blumenol A, quercetin, quercitrin. - Tõ loµi Mallotus luchenensis ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 12 hîp chÊt, ®ã lµ:malloluchenoside, corgilagin, kaempferol, afzelin, juglanin, astragalin, quercetin, quercitrin, astilbin, myricitrin, axit gallic, daucaosterol vµ Stigmast-5-en-3-O--6-O-eicosanoyl-D-glucopyranoside. Trong ®ã hîp chÊt malloluchenoside lµ chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp tõ hîp chÊt thiªn nhiªn. - Tõ loµi Mallotus glabriusculus ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 10 hîp chÊt, ®ã lµ: mallonaoside A, (-) isolariciresinol, tiliroside, astragalin, afzelin, kaempferol, quercitrin, isoquercitrin, myricitrin, daucosterol. - Tõ loµi Mallotus philippinensis ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 9 hîp chÊt, ®ã lµ: bilariciresinol, mallonanoside A, bergenin, 4-O-galloylbergenin, platanoside, dihydromyricetin, pachysandiol A, isovitexin, dopaol. Trong ®ã hîp chÊt bilariciresinol lµ hîp chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®îc tõ hîp chÊt thiªn nhiÖn. Nh÷ng hîp chÊt nµy ®îc sö dông lµm chÊt chuÈn trong viªc x©y dùng ph¬ng ph¸p fingerprint ®¸nh gi¸ chÊt lîng dîc liÖu Mallotus. - Tõ loµi Polygonum hydropiper L ®· ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®îc 8 hîp chÊt, ®ã lµ: vina-polygonum A, Quercetin, ombuin, hidropiperosides B,

263

hidropiperosides A, Vanicoside A, Vanicoside B, Vanicoside E. Trong ®ã hîp chÊt vina-polygonum A, hidropiperosides B, hidropiperosides A lµ nh÷ng hîp chÊt míi lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®îc tõ hîp chÊt thiªn nhiªn. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh chèng « xy hãa cho thÊy çc hîp chÊt hydropiperoside B vµ Vanicoside A thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng « xy hãa víi çc gi¸ trÞ SC50 lÇn lît lµ 23.4 vµ 26.7 µg/ml; Hîp chÊt Vanicoside E thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng « xy hãa víi gi¸ trÞ trung b×nh víi SC50 =49.0 µg/ml. Çc hîp chÊt kh¸c cã gi¸ trÞ SC50 > 200 µg/ml, trong thö nghiÖm nµy ®îc coi lµ kh«ng cã ho¹t tÝnh. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo cho thÊy çc hîp chÊt Vanicoside A, B, E ®Òu thÓ hiÖn kÕt qu¶ g©y ®éc tÕ bµo víi gi¸ trÞ IC50 lÇn lît lµ 28.4, 32,8 vµ 29,7 µg/ml. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh nªu trªn sÏ gãp phÇn ®Þnh híng cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo ®èi víi c©y nghÓ r¨m Polygonum hydropiper L. 3. §· x©y dùng ph¬ng ph¸p d©u v©n tay s¾c ký ®Ó ®¸nh gi¸ nhanh chÊt lîng dîc liÖu Mallotus theo ®Þnh hîng ho¹t tÝnh chèng « xy hãa. KÕt qu¶ cho thÊy ph¬ng ph¸p x©y dùng ®îc hoµn toµn cã thÓ ¸p dông ®Ó dự đoán hoạt tính chống ôxy hoá thông qua các mẫu dấu vân tay sắc ký.

4. §· kÕt hîp çc nghiªn cøu kÕ thõa tõ çc kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ loµi Mallotus tõ tríc vµ trong ®Ò tµi ®Ó x©y dùng qui tr×nh bµo chÕ s¶n xuÊt thùc phÈm chøc n¨ng viªn nang Mallotus. §· ®¨ng ký tiªu chuÈn chÊt lîng vµ ®îc Côc VÖ sinh an toµn thùc phÈm cÊp giÊy phÐp tiªu chuÈn chÊt lîng.

5. §· thùc hiÖn ®îc 4 lît çn bé ViÖt Nam thùc tËp t¹i BØ vµ 1 ®oµn çn bé BØ vµo trao ®æi khoa häc t¹i ViÖt Nam. §· thêng kú thùc hiÖn çc cuéc héi th¶o gi÷a hai bªn vÒ kÕt qu¶ nghiªn cøu cña ®Ò tµi.

6. §· ®¨ng ký vµ ®îc chÊp nhËn ®¬n hîp lÖ 01 b»ng s¸ng chÕ, c«ng bè ®îc 7 bµi b¸o quèc tÕ, 7 bµi b¸o trªn t¹p chÝ trong níc.

7. §· tham gia ®µo t¹o 3 NCS trong ®ã cã 2 NCS ®· b¶o vÖ cÊp Nhµ níc, 1 NCS ®ang thùc hiÖn; 1 th¹c sÜ ®· b¶o vÖ.

§¸nh gi¸ chung: §Ò tµi ®· hoµn thµnh tèt çc nhiÖm vô theo hîp ®ång ®· ký

kÕt. NhiÒu néi dung ®· vît chØ tiªu kÕ ho¹ch.

264

Danh môc çc s¶n phÈm vµ kÕt qu¶ ®¸nh gi¸ møc ®é hoµn thµnh so víi hîp ®ång

Stt Tªn s¶n phÈm Chi tiªu kinh tÕ hoÆc yªu

cÇu khoa häc

Sè lîng ®¨ng ký

trong H§

Sè lîng hoµn thµnh so víi Hîp ®ång

§¸nh gi¸ chung

1 Bé c¬ së d÷ liÖu vÒ çc loµi thuéc chi Ba bÐt (Mallotus) thu thËp vµ nghiªn cøu trong ®Ò tµi

B¸o ço chi tiÕt kÕt qu¶ nghiªn cøu sang läc çc loµi chi Ba bÐt (Mallotus) díi d¹ng ®Üa CD

01 01 Hoµn thµnh

2 B¸o ço quy tr×nh nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña 6 c©y thuèc ®· qua sµng läc

B¸o ço chi tiÕt çc quy tr×nh lµ kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ 6 c©y thuèc

06

07 quy tr×nh nghiªn cøu HH vµ HTSH, bao gåm : - Quy tr×nh NC c©y M. nanus - Quy tr×nh NC c©y M. anisopodus - Quy tr×nh NC c©y M. paniculatus - Quy tr×nh NC c©y M. luchenensis - Quy tr×nh NC c©y M. glabriusculus -Quy tr×nh NC c©y M. philippinensis - Quy tr×nh NC c©y Polygonum hydropiper L

Hoµn thµnh vît møc so

víi Hîp ®ång

3 Héi th¶o khoa häc hµng n¨m ®¸nh gi¸ kÕt qu¶ nghiªn cøu gi÷a 2 bªn

TuyÓn tËp b¸o ço kÕt qu¶ nghiªn cøu hµng n¨m 2007-2009 03

03 b¸o ço, bao gåm: - Héi th¶o kÕt thóc nhiÖm vô - TuyÓn tËp b¸o ço thêng kú cña hai bªn - B¸o ço kÕt thóc thùc hiÖn nhiÖm vô hai bªn

Hoµn thµnh so víi Hîp

®ång

4 B¸o ço ph¬ng ph¸p fingerprint trong x¸c ®Þnh chÊt lîng dîc liÖu

Ph¬ng ph¸p cã thÓ ¸p dông t¹i ViÖt Nam 01 01

Hoµn thµnh so víi Hîp

®ång

5 S¶n phÈm thùc phÈm chøc n¨ng (thuéc chi ba bÐt hoÆc tõ loµi thùc vËt kh¸c cña ViÖt Nam)

§¹t tiªu chuÈn VSATTP

10000 viªn 10000 viªn Hoµn thµnh so víi Hîp

®ång

6 §µo t¹o

- Nghiªn cøu sinh - Cao häc - Çn bé thùc tËp khoa häc

01 02 03

03 02 04

Vît 02 Nghiªn cøu sinh vµ 01

thùc tËp KH

7 B»ng s¸ng chÕ Côc Së h÷u trÝ tuÖ ViÖt Nam 01 01 Hoµn thµnh

8 Bµi b¸o khoa häc §¨ng trªn t¹p chÝ chuyªn ngµnh trong vµ ngoµi níc

10 bµi 14 bµi, trong ®ã:

- 7 bµi quèc tÕ - 7 bµi trong níc

Vît 4 bµi quèc tÕ so víi Hîp

®ång 9 S¸ch chuyªn kh¶o XuÊt b¶n t¹i

Nhµ xuÊt b¶n 00 01 Vît so víi Hîp ®ång

10 B¸o ço tæng kÕt khoa häc

§¨ng t¶i toµn bé kÕt qu¶ nghiªn cøu khoa häc

01 01 Hoµn thµnh

265

1. Danh môc s¸ch Tªn t¸c gi¶ Tªn s¸ch, sè trang, n¨m Sè ®¨ng ký, Nxb Ch©u V¨n Minh, Phan V¨n KiÖm, L· §×nh Mìi, Ph¹m Quèc Long, NguyÔn ThÞ Kim Thanh, NguyÔn Xu©n Cêng,NguyÔn Hoµi Nam

Chi Mallotus hóa học, hoạt tính sinh học và sắc ký fingerprint, 238 trang, 2009

830-2009/CXB/033-03/KHTNCN Nhµ xuÊt b¶n khoa häc tù nhiªn vµ c«ng nghÖ

2. Danh môc s¸ng chÕ Tªn t¸c gi¶ Tªn s¸ng chÕ Sè ®¨ng ký Ch©u V¨n Minh, Phan V¨n KiÖm, NguyÔn H¶i §¨ng, NguyÔn ThÞ Mai vµ nh÷ng ngêi kh¸c

Hợp chất axít 3,5 dihydroxy-4-methoxy-2-C-beta-D-glucopyranosyl-benzoic và phương pháp chiết hợp chất này từ cây ba bét lùn (Mallotus nanus)

Số đơn: 1-2008-02796 Quyết định chấp nhận đơn hợp lệ số 3217/QĐ-SHTT ngày 2 tháng 2 năm 2009, Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ KH và CN Việt Nam

3. Danh môc c«ng tr×nh trong vµ ngoµi níc

a. T¹p chÝ quèc tÕ (07 bµi)

Stt Tªn t¸c gi¶, n¨m, tªn bµi b¸o, tªn t¹p chÝ, sè, sè trang

1 N. Nguyen Hoai, B. Dejaeghera, C. Tistaert , V. Nguyen Thi Hongb, C. Rivièrec, G. Chataignéc, K. Phan Van, M. Chau Van, J. Quetin-Leclercq, Y. Vander Heyden (2009), Development of HPLC fingerprints for Mallotus species extracts and evaluation of the peaks responsible for their antioxidant activity, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (SCI), Vol. 50(5), pp. 753–763

2 Tistaert C, Dejaegher B, Nguyen Hoai Nam, Chataigné G, Rivière C, Nguyen TH, Chau Van Minh, Quetin-Leclercq J, Vander Heyden Y.(2009), Potential antioxidant compounds in Mallotus species fingerprints. Part I: Indication, using linear multivariate calibration techniques., Anal Chim Acta (SCI), Vol. 652(1-2), pp. 189-197

3 Céline Rivière, Van Nguyen Thi Hong, Luc Pieters, Bieke Dejaegher, Yvan Vander Heyden, Minh Chau Van, Joëlle Quetin-Leclercq (2009), Polyphenols isolated from antiradical extracts of Mallotus metcalfianus, Phytochemistry, Vol. 70(1), pp. 86-94

4 Chau Van Minh, Nguyen Thi Kim Thanh, Tran Hong Quang, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Nghia Thin, Nguyen Hoai Nam, Yvan Vander Heyden, Joelle Quetin-Leclercq and Phan Van Kiem (2009), Two new megastigmane sulphonoglucosides from Mallotus aniposodus, Natural Products communication (SCIE), Vol. 4(7), pp. 889-892

5 C. Rivière, Nguyen Thi Hong Van, Q. Tran Hong, G. Chataigné1, N. Nguyen Hoai, B. Dejaegher, C. Tistaert, T. Nguyen Thi Kim, Y. Vander Heyden, M. Chau Van and J. Quetin-Leclercq, Mallotus species from Vietnamese mountainous areas: phytochemistry and pharmacological activities, Phytochemistry Reviews (In press). Doi : 10.1007/s11101-009-9152-6

266

6 Phan Van Kiem, Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Xuan Cuong, Tran Quynh Hoa, Hoang Thanh Huong, Le Mai Huong, Chau Van Minh, and Young Ho Kim, New Phenylpropanoid Esters of Sucrose from Polygonum hydropiper and Their Antioxidant Activity, Archives of Pharmacal Research, 31(11), 1477-1482 (2008).

7 Phan Van Kiem, Nguyen Thi Mai, Chau Van Minh, Nguyen Huu Khoi, Nguyen Hai Dang, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Xuan Nhiem, Gyo Nam Kim, J. Quetin-Leclercq, Y. Vander Heyden, Hae Dong Jang and Young Ho Kim, Two New C-Glucosyl Benzoic Acids and Flavonoids from Mallotus nanus and Their Antioxidant Activity, Archives of Pharmacal Research (in press)

b. C«ng tr×nh trong níc (07 bài)

Stt Tªn t¸c gi¶, n¨m, tªn bµi b¸o, tªn t¹p chÝ, sè, sè trang 8 Nguyen Hoai Nam, Nguyen Hai Dang, Phan Van Kiem, Luu Van Chinh, Phan Thi

Binh, La Dinh Moi, and Chau Van Minh (2007), Study on benzopyrans and other isolated compounds from Mallotus apelta, T¹p chÝ Hãa häc, TËp 45, Sè ®Æc biÖt, trang 111-121

9 Nguyen Hoai Nam, Nguyen Huu Tung, Nguyen Xuan Nhiem, Chau Van Minh, Phan Van Kiem (2007), Study on synthesis of some new derivatives of malloapelta B isolated from Mallotus apelta, T¹p chÝ Hãa häc, TËp 45, Sè 2, trang 250-254.

10 Tran Quynh Hoa, Phan Van Kiem, Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Thanh Huong, Ha Viet Hai, Chau Van Minh, Study on chemical constituents of Polygonum hydropiper L., Vietnamese Journal of Chemistry, 45(ĐB), 122-126 (2007).

11 Nguyen Thi Hong Van, Chau Van Minh, Phan Van Kiem, Celine Riviere, Yvan vander Heyden, Joelle Quetin-Leclercq, Flavonoid consitituents and antioxidant activity of Mallotus metcalfianus, Vietnamese Journal of Chemistry, 46(5A), 436-440, (2008)

12 Nguyễn Tiến Đạt, Phan Văn Kiệm, Hoàng Thanh Hương, Châu Văn Minh, Lê Thị Phương Quỳnh, Jung Joon Lee, Cơ chế kháng NF-κB của malloapelta B phân lập từ cây bùm bụp (Mallotus apelta), T¹p chÝ Hãa häc, Sè 47(4A), trang 657-660 (2009)

13 Chau Van Minh, Nguyen Huu Toan Phan, Dinh Thi Thu Thuy, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Hai Dang, Phan Van Kiem, Yvan Vander Heyden and Joëlle Quetin-Leclercq, Flavonoid Constituents from Mallotus luchenensis, Vast proceeding, 2008

14 Nguyen Thi Mai, Chau Van Minh, Phan Van Kiem, Nguyen Huu Khoi, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hai Dang, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Hoai Nam, Nghiên cứu thành phần flavonoit glycosit của cây ba bét lùn (Mallotus nanus), Héi nghÞ Khoa häc-Nghiªn cøu khoa häc phôc vô ®µo t¹o vµ ph¸t triÓn kinh tª-v¨n hãa-x· héi giai ®o¹n hiÖn nay, §¹i häc s ph¹m II, Hµ Néi

c. Héi nghÞ Quèc tÕ (02 bài) 15 C. Tistaert , Hong VNT, M. Chau Van, J. Quetin-Leclercq, Y. Vander Heyden,

Antioxidant activities of polyphenols isolated from Mallotus metcalfianus Croizat, 7th joint Meeting of GA, AFERP, ASP, PSE&SIF, Athens, Greece, August 3-8, 2008

16 B. Dejaegher, C. Tistaert, N. Nguyen Hoai, Van Nguyen Thi Hong, G.Chataigne,

267

C. Rivière, M. Chau Van, J. Quetin-Leclercq, J. Smeyers Verbeke, Y. Vander Heyden, Identification of peaks from HPLC fingerprints responsible for the antioxidant activity of Mallotus species, 11th Scandinavian Symposium on Chemometrics (SSC11) - June 8th-11th 2009 - Loen - Norway

4. danh mục các nghiên cứu sinh và cao học trong khuôn khổ của nhiệm vụ a. Nghiên cứu sinh

STT Hä vµ tªn NCS Tªn luËn ¸n Ghi chó

1 NguyÔn Hoµi Nam Nghiªn cøu hãa häc vµ ho¹t tÝnh chèng ung th cña mét sè hîp chÊt benzopyran nguån gèc thùc vËt

§· b¶o vÖ cÊp Nhµ níc

2 NguyÔn H÷u Toµn Phan

Nghiªn cøu vÒ hãa häc mét sè c©y thuèc chän läc ViÖt Nam cã ho¹t tÝnh chèng ung th

§· b¶o vÖ cÊp Nhµ níc

3 NguyÔn ThÞ Kim Thanh

Nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña çc loµi thuéc chi Ba bÐt (Mallotus Lour.), hä thÇu dÇu (Euphorbiaceae) ë ViÖt Nam

§ang thùc hiÖn

b. Học viên cao học

STT Hä vµ tªn học viªn Tªn luËn ¸n Ghi chó

1 §inh Thu Thñy Nghiªn cøu thµnh phÇn hãa häc cña c©y Çm lîn (Mallotus luchenensis) §· b¶o vÖ

5. Danh mục cán bộ trao đổi khoa học trong khuôn khổ nhiệm vụ

STT Tªn çn bé khoa häc Thêi gian Môc ®Ých

1 Nguyễn Hoài Nam 5/2007 - 10/2007

Nghiên cứu phát triển phương pháp dấu vân tay sắc ký (chromatography fingerprint) trong quản lý chất lượng các mẫu thực vật được lựa chọn

2 Nguyễn Thị Hồng Vân 5/2007 - 11/2007

Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Mallotus và một số loài thực vật khác trong khuôn khổ dự án

3 Đoàn Lan Phương 6/2008 - 10/2008

Nghiên cứu phát triển phương pháp dấu vân tay sắc ký (chromatography fingerprint) trong quản lý chất lượng các mẫu thực vật được lựa chọn

4 Trần Hồng Quang 4/2008 - 7/2008

Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Mallotus và một số loài thực vật khác trong khuôn khổ dự án

5 GS.TS Yvan Vander Heyden và GS.TS Joelle Quetin-Leclercq

25/10 - 30/10/ 2008

Chủ nhiệm nhiệm vụ phía Bỉ đến thăm và làm việc với chủ nhiệm dự án phía Việt Nam về các kết quả đạt được và kế hoạch xây dựng giai đoạn tiếp theo của Nhiệm vụ

268

Tµi liÖu tham kh¶o 1 L· §×nh Mìi, TrÇn Minh Hîi, D¬ng §øc HuyÕn, TrÇn Huy Th¸i, Ninh Kh¾c B¶n. Tµi

nguyªn thùc vËt ViÖt Nam - Nh÷ng c©y chøa c¸c hîp chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc, tËp I, NXB N«ng nghiÖp, 2005, tr 47-57.

2 Nguyen Nghia Thin. Taxonomy of Euphorbiaceae in Vietnam. Vietnam National University Publishers, 2007, pp 179-202.

3 ViÖn Sinh th¸i vµ Tµi nguyªn Sinh vËt. Danh lôc c¸c loµi thùc vËt ViÖt Nam, tËp II, NXB N«ng nghiÖp, 2003, tr 626-633.

4 Ph¹m Hoµng Hé. C©y cá ViÖt Nam, tËp II, NXB TrÎ, 2003, tr 248-256. 5 Vâ V¨n Chi. Tõ ®iÓn c©y thuèc ViÖt Nam, NXB Y häc, 1999. 6 Okabe H, Inoue K, and Yamauchi T. Studies on the constituents of Mallotus japonicus

Muell. Arg. I. Cardiac glycosides from the seeds. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1976, 24(1), 108-113.

7 Kim H S, Lim H K, Chung M W, Kim Y C. Antihepatotoxic activity of bergenin, the major constituent of Mallotus japonicus, on carbon tetrachloride-intoxicated hepatocytes. Journal of ethnopharmacology, 2000, 69(1), 79-83.

8 Lim H K, Kim H S, Chung M W, Kim Y C. Protective effects of bergenin, the major constituent of Mallotus japonicus, on D-galactosamine-intoxicated rat hepatocytes. Journal of ethnopharmacology, 2000, 70(1), 69-72.

9 Shigematsu N, Kouno I, and Kawano N. Phloroglucinol derivatives from fruits of Mallotus japonicus, Phytochemistry, 1983, 22(1), 323-325.

10 Kouno I, Shigemastu N, Iwagami M, and Kawano N. Further phloroglucinol derivatives in the fruits of Mallotus japonicus, Phytochemistry, 1985, 24(3), 620-621.

11 Arisawa M, Fujita A, Suzuki R, Hayashi T, Morita N, Kawano N, and Koshimura S. Studies on cytotoxic constituents in pericarps of Mallotus japonicus, Part I. Journal of natural products, 1985, 48(3), 455-459.

12 Arisawa M, Fujita A, Saga M, Hayashi T, Morita N, Kawano N, and Koshimura S. Studies on cytotoxic constituents in pericarps of Mallotus japonicus, Part II. Journal of natural products, 1986, 49(2), 298-302.

13 Fujita A, Hayashi T, Arisawa M, Shimizu M, Morita N, Kikuchi T, Tezuka Y. Studies on cytotoxic constituents in pericarps of Mallotus japonicus, Part III. Journal of natural products , 1988, 51(4), 708-712.

14 Arisawa M, Fujita A, Hayashi T, Morita N, Kikuchi T, Tezuka Y. Studies on cytotoxic constituents in pericarps of Mallotus japonicus, Part IV. Chemical & pharmaceutical bulletin, 1990, 38(3), 698-700.

15 Arisawa M. Constituents of the pericarps of Mallotus japonicus (Euphobiaceae). Yakugaku Zasshi, 2003, 123(4), 217-224.

16 Nakane H, Arisawa M, Jujita A, Koshimura S, and Ono K. Inhibition of HIV-reverse transcriptase activity by some phlorogluconinol derivatives. Febs, 1991, 286, 83-85.

17 Ishii R, Horie M, Saito K, Arisawa M, Kitanaka S. Inhibitory effects of phloroglucinol derivatives from Mallotus japonicus on nitric oxide production by a murine macrophage-like cell line, RAW 264.7, activated by lipopolysaccharide and interferon-gamma. Biochimica et biophysica acta, 2001, 1568(1), 74-82.

18 Saijo R, Nonaka G, Nishioka I. Tannins and related compounds. LXXXIV. Isolation and characterization of five new hydrolyzable tannins from the bark of Mallotus japonicus. Chemical & pharmaceutical bulletin, 1989, 37(8), 2063-2070.

19 Hatano T, Yasuhara T, Yoshihara R, Agata I, Noro T, Okuda T. Effects of interaction of tannins with co-existing substances. VII. Inhibitory effects of tannins and related polyphenols on xanthine oxidase. Chemical & pharmaceutical bulletin, 1990, 38(5), 1224-1229.

20 Tabata H, Katsube T, Tsuma T, Ohta Y, Imawaka N, Utsumi T. Isolation and evaluation of the radical-scavenging activity of the antioxidants in the leaves of an edible plant,

269

Mallotus japonicus. Food Chemistry,2008, 109, 64-71 21 Gschwendt M, Muller HJ, Kielbassa K, Zang R, Kittstein W, Rincke G, Marks F.

Rottlerin, a novel protein kinase inhibitor. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1994, 199(1), 93-98.

22 Widen CJ, Puri HS. Natural occurence and chemical variability of phloroglucinols in Kamala. Planta Medica, 1980, 40, 284-287.

23 Torricelli C, Fortino V, Capurro E, Valacchi G, Pacini A, Muscettola M, Soucek K, Maioli E. Rottlerin inhibits the nuclear factor κB/Cyclin-D1 cascade in MCF-7 breast cancer cells. Life Sciences, 2008, 82, 638–643.

24 Daikonya A, Katsuki S, Wu JB, Kitanaka S. Anti-allergic agents from natural sources (4): anti-allergic activity of new phloroglucinol derivatives from Mallotus philippensis (Euphorbiaceae). Chem Pharm Bull., 2002, 50(12), 1566-1569.

25 Daikonya A, Katsuki S, Kitanaka S. Antiallergic Agents from Natural Sources 9. Inhibition of nitric oxide production by novel chalcone derivatives from Mallotus philippinensis (Euphorbiaceae). Chem. Pharm. Bull., 2004, 52(11) 1326-1329.

26 Li Y, Luo Y, Huang W, Wang J, Lu W. Total synthesis of mallotophilippen C. Tetrahedron Letters, 2006, 47, 4153–4155.

27 Tanaka T, Ito T, Linuma M, Takahashi Y, Naganawa H. Dimeric chalcone derivatives from Mallotus philipensis. Phytochemistry, 1998, 48(8), 1423-1427.

28 Furusawa M, Ido Y, Tanaka T, Ito T, Nakaya K, Ibrahim I, Ohyama M, Linuma M, Shirataka Y, Takahashi Y. Novel, complex flavonoids from Mallotus philippensis (Kamala tree). Helvetica Chimica Acta, 2005, 88, 1048-1058.

29 Zaidi SF, Yoshida I, Butt F, Yusuf MA, Usmanghani K, Kadowaki M, Sugiyama T. Potent bactericidal constituents from Mallotus philippinensis against Clarithromycin and Metronidazole resistant strains of Japanese and Pakistani Helicobacter pylori. Biol Pharm Bull., 2009, 32(4), 631-636.

30 Tanaka R, Nakata T, Yamaguchi C, Wada S, Yamada T, Tokuda H. Potential anti-tumor-promoting activity of 3α-hydroxy-D:A-friedooleanan-2-one from the stem bark of Mallotus philippensis. Planta Med., 2008, 74(4), 413-416.

31 Shan, Xueqin; Feng, Lianbin; Wu, Chengshun. Chemical constituents of the roots of Mallotus apelta (Lour.) Muell.-Arg. Zhiwu Xuebao, 1985, 27(2), 192-195.

32 X. F. Cheng, Z. M. Meng, Z. L. Chen. A pyridine-type alkaloid from Mallotus apelta. Phytochemistry, 1998, 49(7), 2193-2194.

33 X. F. Cheng, Z. L. Chen, Z. M. Meng. Three new diterpenoids from Mallotus apelta Muell.Arg. Journal of Asian Natural Product Research, 1999, 1(3), 163-168.

34 X. F. Cheng, Z. L. Chen. Two new diterpenoids from Mallotus apelta Muell.Arg. Journal of Asian Nat. Prod. Research, 1999, 1(4), 319-25.

35 X. F. Cheng, Z. L. Chen. Coumarinolignoids of Mallotus apelta. Fitoterapia, 2000, 71 (3), 341-342.

36 T. Y. An, L. H. Hu, X. F. Cheng. Benzopyran derivatives from Mallotus apelta. Phytochemistry, 2001, 57(2), 273-278.

37 Tian-Yin An, Li-Hong Hu, Xiao-Fang Cheng, Zhong-Liang Chen. Two new benzopyran derivatives from Mallotus apelta. Natural Product Research, 2003, 17(5), 325–328.

38 Shu Xu, Zhi-Ping L, Hong-Bing Cai, Xiao-Gang Zhang, Qiang Liu, Yan Tan. Inhibiting effects of root of Mallotus apelta on duck hepatitis B virus. Journal of Chinese Integrative Medicine, 2006, 4(3), 285-288.

39 Jian-Fu Xu, Zi-Ming Feng, Jian Liu, Pei-Cheng Zhang. New Hepatoprotective Coumarinolignoids from Mallotus apelta. Chemistry & Biodiversity, 2008, 5, 591-597.

40 Kawashima, Takeshi; Nakatsu, Tetsuo; Fukazawa, Yoshimasa; Ito, Sho. Diterpenic lactones of Mallotus repandus. Heterocycles, 1976, 5(1), 227-232.

41 Nakatsu, Tetsuo; Ito, Sho; Kawashima, Takeshi. Mallotucin C and D, two diterpenic lactones from Mallotus repandus. Heterocycles, 1981, 15(1), 241-4.

42 Hui, Wai-Haan; Li, Man-Moon. An examination of the Euphorbiaceae of Hong Kong.

270

Part 14. Triterpenoids from Mallotus repandus: three new δ-lactones. Phytochemistry, 1977, 16(1), 113-115.

43 Huang, Pao-Lin; Wang, Li-Wen; Lin, Chun-Nan. New triterpenoids of Mallotus repandus. Journal of Natural Products, 1999, 62(6), 891-892.

44 Sutthivaiyakit, Somyote; Thongtan, Jiraporn; Pisutjaroenpong, Somchai; Jiaranantanont, Kanitha; Kongsaeree, Palangpon. D:A Friedo-oleanane lactones from the stems of Mallotus repandus. Journal of Natural Products, 2001, 64(5), 569-571.

45 Hikino, Hiroshi; Tamada, Mitsuru; Yen, Kun-Ying. Mallorepine, cyano-γ-pyridone from Mallotus repandus. Planta Medica, 1978, 33(4), 385-8.

46 Saijo R, Nonaka G, Nishioka I. Tannins and related compounds. LXXXVII. Isolation and characterization of four new hydrolyzable tannins from the leaves of Mallotus repandus. Chem Pharm Bull, 1989, 37, 2624-2630.

47 Ikuro Abe, Yasuhiko Kashiwagi, Hiroshi Noguchi, Takashi Tanaka, Yasumasa Ikeshiro, Yoshiki Kashiwada. Ellagitannins and Hexahydroxydiphenoyl Esters as Inhibitors of Vertebrate Squalene Epoxidase. J. Nat. Prod. 2001, 64, 1010-1014

48 Roberts, K. D.; Weiss, Ek.; Reichstein, T. Glycosides and aglycons. CCLXXII. The cardenolides of the seeds of Mallotus paniculatus. Helvetica Chimica Acta, 1966, 49(1), 316-29.

49 Tang, Zongjian; Song, Chunqing; Feng, Shengchu; Yang, Yiping; Xu, Rensheng; Zhong, Qiongxin; Zhong, Yi. Chemical constituents of Mallotus anomalus. I. The structure of anomaluone. Huaxue Xuebao, 1990, 48(7), 705-708.

50 Yang, Yiping; Tang, Zongjian; Feng, Shengchu; Xu, Rensheng; Zhong, Qiongxi; Zhong, Yi. Studies on the chemical constituents of Mallotus anomalus. III. Structure of new rosane-type diterpenoids. Huaxue Xuebao, 1992, 50(2), 200-204.

51 Yang, Yiping; Tang, Zongjian; Xu, Rensheng; Zhong, Qiongxi; Zhong, Yi. Studies on the chemical constituents of Mallotus anomalus. IV. Structures of trace new diterpenoids. Huaxue Xuebao , 1992, 50(2), 205-207.

52 Feng, Sheng Cu; Tang, Zong Jian; Yang, Yi Ping; Xu, Ren Sheng.Studies on chemical constituents of Mallotus anomalus. II. Structures of the antitumor components from Mallotus anomalus. Chinese Chemical Letters, 1994, 5(9), 743-6.

53 Ji Ma, Shannon H. Jones, Sidney M. Hecht. A Coumarin from Mallotus resinosus that Mediates DNA Cleavage. J. Nat. Prod., 2004, 67, 1614-1616.

54 Butsarakham Supudompol, Kittisak Likhitwitayawuid, Peter J. Houghton. Phloroglucinol derivatives from Mallotus pallidus. Phytochemistry, 2004, 65, 2589–2594.

55 Likhitwitayawuid K, Supudompol B. A new phloroglucinol dimer from Mallotus pallidus. Heterocycles, 2005, 65, 161-164.

56 K. Likhitwitayawuid, B. Supudompol, B. Sritularak, V. Lipipun, K. Rapp, R.F. Schinazi. Phenolics with Anti-HSV and Anti-HIV Activities from Artocarpus gomezianus, Mallotus pallidus, and Triphasia trifolia. Pharmaceutical Biology, 2005, 43(8), 651–657.

57 Wei K, Li W, Koike K, Liu L, Fu X, Lin L, Chen Y, Nikaido T. Two New Galloylglucosides from the Leaves of Mallotus furetianus. Chem. Pharm. Bull., 2004, 52(6), 776-779.

58 Rana V S, Rawat M S M, Pant G, Nagatsu A. Chemical constituents and antioxidant activity of Mallotus roxburghianus leaves. Chemistry & Biodiversity, 2005, 2, 792-798.

59 Yang Bai, Yi-ping Yang, Yang Ye. Hookerianolides A–C: three novel casbane-type diterpenoid lactones from Mallotus hookerianus. Tetrahedron Letters, 2006, 47, 6637–6640.

60 El-Sayed, N. H., Ammar, N. M., Al-Okbi, S. Y., Abou El-Kassem, L. T., and Mabry, T. J., Antioxidant activity and two new flavonoids from Washingtonia filifera. Nat. Prod. Res., 2006, 20, 57-61.

61 Pachaly, P., Klein, M., Constituents of Andromeda polifolia, Planta Med., 1987, 53, 442-444.

62 Kim, H.J., Woo, E.R., Park, H., A novel lignan and flavonoids from Polygonum aviculare,

271

J. Nat. Prod., 1994, 57, 581-586. 63 Kaneko, T., Sakamoto, M., Ohtani, K., Ito, A., Kasai, R., Yamasaki, K., Padorina, W.,

Secoiridoid and flavonoid glycosides from Gonocaryum calleryanum, Phytochemistry, 1995, 39(1), 115-129.

64 Kaouadji, M., Acylated and non-acylated kaempferol monoglycosides from Plantanus acerifolia Buds, Phytochemistry, 1990, 29, 2295-2297.

65 Chung, S.K., Kim, Y.C., Takaya, Y., Terashima, K., Niwa, M., Novel flavonol glycoside, 7-O-methyl mearnsitrin, from Sageretia theezans and its antioxidant effect, J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (15), 4664-4668.

66 Xi-Ning, Z., Hideaki, O., Ide, T., Hirata, E., Takushi, A., Takeda, Y., Three flavonol glysosides from leaves of Myrsine segnuinii, Phytochemistry, 1997, 46, 943-946.

67 Voutquenne, L., Lavaud, C., Massiot, G., Sevenet, T., Hadi, H.A., Phytochemistry, 1999, 50, 63-69.

68 Ali, M.S., Saleem, M., Erian, A.W., A new acylated steroid glucoside from Perovskia atriplicifolia, Fitoterapia, 2001, 72, 712-714.

69 Qing-Ying, Z., Gang, W., Shou-Yang, L., Yu-Zhing, Z., Tie-Ming, C., New steroid glycoside derivatives from Stelmatocryton khasianum, Zhongcaoyao, 2002, 33(1), 6-8.

70 Phan Van Kiem, Nguyen Thi Mai, Chau Van Minh, Nguyen Huu Khoi, Nguyen Hai Dang, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Xuan Nhiem, Gyo Nam Kim, J. Quetin-Leclercq, Y. Vander Heyden, Hae Dong Jang and Young Ho Kim. Two New C-Glucosyl Benzoic Acids and Flavonoids from Mallotus nanus and Their Antioxidant Activity. Archives of Pharmacal Research, 2009 (in press).

71 Otsuka H, Zhong XN, Hirata E, Shinzato T, Takeda Y. Myrsinionosides A-E: Megastigmane glycosides from the leaves of Myrsine seguinii Lev.. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2001, 49, 1093-1097.

72 Chakravarty AK, Sarkar T, Masuda K, Shiojima K, Nakane T, Kawahara N. Bacopaside I and II: Two pseudojujubogenin glycosides from Bacopa monniera. Phytochemistry, 2001, 58, 553-556.

73 Abe F, Yamauchi T. Megastigmanes and flavonoids from the leaves of Scorodocarpus borneensis. Phytochemistry, 1993, 33, 1499-1501

74 Saijo R, Nonaka GI, Nishioka I. Gallic acid esters of bergenin and norbergenin from Mallotus japonicus. Phytochemistry, 1990, 29, 267-270.

75 Gilles Comte, Joseph Vercauteren, Albert J. Chulia, Daovy P. Allais, Christiane Delage. Phenylpropanoids from leaves of Juniperus phoenicea. Phytochemistry, 1997, 5 (8), 1679-1682.

76 Pierre Wong, Abderrazak Bachki, Kris Banerjee, Brian Leyland-Jones, 2002. Identification of N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide and N1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide as components in urine extracts of individuals consuming coffee. J. Pharm. Biomed. Anal., 30, 773-780.

77 Junichi Kitajima, Kaoru Kimizuka, Masanobu Arai, and Yasuko Tanaka. Constituents of Ficus pumila leaves. Chem. Pharm. Bull., 1998, 46, 10, 1647-1649.

78 Chau Van Minh, Nguyen Thi Kim Thanh, Tran Hong Quang, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Nghia Thin, Nguyen Hoai Nam, Yvan Vander Heyden, Joëlle Quetin-Leclercq and Phan Van Kiem. Two New Megastigmane Sulphonoglucosides from Mallotus anisopodus. Natural Product Comunications, 2009, 4(7), 889-892.

79 B. Vermes, O. Seligmann, H. Wagner, Synthesis of Biologically active tetrahydro-furofuranlignan-(Syringin, Pinoresinol)-monosaccarit and bis-glucosides, Phytochemistry, 30, 9, 3087-3089, 1991.

80 Nobuko Sakurai, Yoshikatsu Yaguchi, Takao Inoue, Triterpenoids from Myrica rubra, Phytochemistry, 1987, 26, 1, 217-219.

81 Atta-Ur-Rahman, Nighat Sultana, Farzana Akhter, Farzana Nighat, M. Iqbal Choudhary, Phytochemiscal studies on Adhatoda vasica nees, Natural Product Letters, 1997, 10, 249-256.

82 Britto JD, Manickam VS, Gopalakrishan S, Ushioda T, Tanaka N. Determination of

272

aglycone chirality in dihydroflavonol 3-O-α-L-rhamanosides. Chem. Pharm. Bull., 1995, 43(2), 338-339.

83 K. Tshimaru, T. Omoto, I. Asai, K. Ezaki and K. Shimomura, Taxifolin 3-arabinoside from Fragaria x ananassa, Phytochemistry, 1995, 34(1), 345-347.

84 Atonio G. Gonz¸lez, JosÐ A. Guillermo, Angel G. Ravelo, and Ignacio A. Jimenez, 4,5- dihydroblumenol A, A new nor-isoprenoid from Perrottetia multiflora, J. Nat. Prod., 1994, 57(3), 400-402.

85 Shen, C. C., Chang, Y. S., Ho, L. K., Nuclear magnetic resonance study of 5,7-dihydroxyflavonoids, Phytochemistry, 1993, 34(3), 843-845.

86 Markham, K. R., Ternai, B., Stanley, R., Geiger, H and Mabry, T. J., Tetrahedron, 1978, 34, 1389-1392.

87 Kazuma, K., Noda, N., Suzuki, M., Malonoylated flavonl glycosides from the petals of Clitoria ternatea, Phytochemistry, 2003, 62, 229-237.

88 Silva, D. H. S., Yoshida, M., Kato, M. J., Flavonoids from Iryanthera sagotiana, Phytochemistry, 1997, 46 (3), 579-582.

89 Seung-Jin, M., Naoharu, W., Akihito, Y., Kanzo, S., The (3R, 9R)-3-hydroxy-7,8-dihydro-β-ionol disaccharise glycoside is an aroma precursor in tea leaves., Phytochemistry, 2001, 56, 819-825.

90 Latza, S., Ganber, D., Berger, R.G., Cacbohydrate esters of cinnamic acid from fruits of Physalis peruviana, Psidium guajava and Vaccinium vitis-idaea, Phytochemistry, 1996, 43(2), 481-485.

91 Reiko, S.,Gen-ichiro, N., Itsuo, N., Tainnins and related compounds isolate angd characterization of five nem hydrolysable tannis from the Bark of Mallotus japonicus., Chem. Pharm. Bull, 1989, 37(8), 2063-2070.

92 Mahmoud, A., Nawwar, M., Sahar, A. M. H., Irmggard, M., NMR spectial analyis of phenols from Punica granatum., Phytochemistry, 1994, 36 (3), 793-798.

93 Okuyama, T., Hosoyama, K., Hiraga, Y., Kurono, G., Takemmoto, T., The constituents of Osmunda spp a new flavonol glycoside of Osmunda asiatica., Chem. Pharm. Bull., 1978, 26 (10), 3071-3074.

94 Mehta BK, Sharma KMS, Dubey A. 4-Ethylgallic acid from tow Mimosa species. Phytochemistry, 1988, 27(9), 3004-3005.

95 Chau Van Minh, Nguyen Huu Toan Phan, Dinh Thi Thu Thuy, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Hai Dang, Phan Van Kiem, Yvan Vander Heyden and Joëlle Quetin-Leclercq, Flavonoid Constituents from Mallotus luchenensis, VAST proceeding, 2008, 294-300.

96 Xiao-Dong Luo, Da-Gang Wu, Xiang-Hai Cai, and Edward J. Kennelly, New Antioxidant Phenolic Glycosides from Walsura yunnanensis, Chemistry & Biodiversity, 2006, 3, 224-230.

97 Sachiko Tsukamoto, Kyoko Tomise, Maki Aburatani, Hiroyuki Onuki, Hiroshi Hirorta, Eiji Ishiarajima and Tomihisa Ohta, Isolation of Cytochrome P450 Inhibitors form Strawberry Fruit, Fragaria ananassa, J. Nat. Prod, 2004, 67, 1839-1841.

98 Hye Young Kim, Byung Ho Moon, Hak Ju Lee, Don Ha Choi, Flavonol glycosides from the leaves of Eucommia ulmoides, with glycation inhibitory activity, Phytochemistry, 2004, 93, 227–230.

99 Fumiko Abe and Tatsuo Yamauchi., Lignan glycosides from Parsonsia laevigata., Phytochemistry, 1989, 28(6), 1737-1741.

100 Fumiko Abe, Tatsuo Yamauchi, and Alfred S. C. Wan., Lignans related to olivil from Genus cerbera (Cerbera. VI)., Chem. Pharm. Bull., 1988, 36(2), 795-799.

101 Maourad Kaouadji., Acylated and non - acylated kaempferol monoglycosides from Platanus acerifolia Buds., Phytochemistry, 1990, 29(7), 2295-2297.

102 Seong ho Jeon, Wanjoo Chun, Yong Joo Choi, and Yong Soo Kwon., Cytotoxic constituents from the Bark of Salix hulteni., Arch Pharm Res, 2008, 31(8), 978-982.

103 Ramarathnam N, Osawa T, Namiki M, Kawakishi S, Chemical studies on novel rice hull antioxidants. 2. Identification of isovitexin, a C-glycosyl flavonoid. J. Agric. Food Chem.,

273

1989, 37, 316-319. 104 Qu L, Chen X, Lu J, Yuan J, Zhao Y. Chemical component of Leptopus chinensis. Chem

Nat Comp., 2005, 41, 565-568. 105 She-Po Shi, Dan Jiang, Cai-Xia Dong, and Peng-Fei Tu., New Phenolic glycosides from

Clematis mandshurica., Helvetica Chimica Acta, 2006, 89, 1023-1029. 106 Meltm Ozipek, Iclal Saracoglu, Keisuke Kojima, Yukio Ogihara, and Ihsan Calis.,

Fuhsioside a new phenylethanoid glucoside from Veronica fuhsii., Chem. Pharm. Bull., 1999, 47(4), 561-562.

107 World Health Organization (WHO), WPR/RC52/7: A Draft Regional Strategy For Traditional Medicine in Western Pacific. WHO Regional Committee, 52nd Session Darussalam, 10-14 Sept. 2001

108 ViÖn Dîc liÖu (2006), Nghiªn cøu thuèc tõ th¶o dîc, Gi¸o tr×nh sau ®¹i häc, -Nhµ xuÊt b¶n Khoa häc vµ kü thuËt Hµ Néi.

109 Pei-Shan Xie, Albert Y. Leung, Understanding the traditional aspect of Chinese medicine in order to achieve meaningful quality control of Chinese materia medica, Journal of Chromatography A, 2009, 1216(11), 1933-1940.

110 Xin-miao Liang, Yu Jin, Yan-ping Wang, Gao-wa Jin, Qing Fu, Yuan-sheng Xiao, Qualitative and quantitative analysis in quality control of traditional Chinese medicines, Journal of Chromatography A, 2009, 1216(11), 2033-2044.

111 Min Yang, Jianghao Sun, Zhiqiang Lu, Guangtong Chen, Shuhong Guan, Xuan Liu, Baohong Jiang, Min Ye, De-An GuoJournal, Phytochemical analysis of traditional Chinese medicine using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2009, 1216(11), 2045-2062.

112 State Drug Administration of China, Chin. Tradit. Pat. Med. 2000, 22- 825. 113 P. Zou, Y. Hong, H.L. Koh, Chemical fingerprinting of Isatis indigotica root by RP-HPLC

and hierarchical clustering analysis, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 38(3), 514-520.

114 Shikai Yan, Guoan Luo, Yiming Wang, Yiyu Cheng, Simultaneous determination of nine components in Qingkailing injection by HPLC/ELSD/DAD and its application to the quality control. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 40(4), 889-895.

115 Hong-Yang Zhang, Ping Hu, Guo-An Luo, Qiong-Lin Liang, Yu-Li Wang, Shi-Kai Yan, Yi-Ming Wang, Screening and identification of multi-component in Qingkailing injection using combination of liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry and liquid chromatography/ion trap mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2006, 577(2), 190-200.

116 Yi Sun, Tao Guo, Yin Sui, Famei Li. Fingerprint analysis of Flos Carthami by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography B, 2003, 792(2), 147-152.

117 Ming Gu, Fan Ouyang, Zhiguo Su. Comparison of high-speed counter-current chromatography and high-performance liquid chromatography on fingerprinting of Chinese traditional medicine. Journal of Chromatography A, 2004, 1022, 139-144.

118 Ming Gu, Guifeng Zhang, Zhiguo Su, Fan Ouyang. Identification of major active constituents in the fingerprint of Salvia miltiorrhiza Bunge developed by high-speed counter-current chromatography. Journal of Chromatography A, 2004, 1041, 239-243.

119 Ming Gu, Shufeng Zhang, Zhiguo Su, Yi Chen, Fan Ouyang. Fingerprinting of Salvia miltiorrhiza Bunge by non-aqueous capillary electrophoresis compared with high-speed counter-current chromatography. Journal of Chromatography A, 2004, 1057, 133-140.

120 Jin-lan Zhang, Ming Cui, Yun He, Hai-lan Yu, De-an Guo. Chemical fingerprint and metabolic fingerprint analysis of Danshen injection by HPLC–UV and HPLC–MS methods. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 36, 1029-1035.

121 Xiao-Hui Fan, Yi-Yu Cheng, Zheng-Liang Ye, Rui-Chao Lin, Zhong-Zhi Qian. Multiple chromatographic fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicines. Analytica Chimica Acta, 2006, 555, 217-224.

122 Ma Lijuan, Zhang Xuezhu, Zhang Haiping, Gan Yiru. Development of a fingerprint of

274

Salvia miltiorrhiza Bunge by high-performance liquid chromatography with a coulometric electrode array system. Journal of Chromatography B, 2007, 846, 139-146.

123 Ai-Hua Liu, Yan-Hua Lin, Min Yang, Hui Guo, Shu-Hong Guan, Jiang-Hao Sun, De-An Guo. Development of the fingerprints for the quality of the roots of Salvia miltiorrhiza and its related preparations by HPLC-DAD and LC–MSn. Journal of Chromatography B, 2007, 846(1-2), 32-41.

124 Y. C. Yang, S. Y. Huang, J. G. Shi, Chin. Chem. Lett., 2003, 14, 717. 125 Y. C. Yang, S. Y. Huang, J. G. Shi, Chin. Chem. Lett., 2003, 14, 920. 126 Li-wei Yang, Ding-hong Wu, Xi Tang, Wei Peng, Xiao-rui Wang, Yan Ma, Wei-wei Su.

Fingerprint quality control of Tianjihuang by high-performance liquid chromatography–photodiode array detection. Journal of Chromatography A, 2005, 1070(1-2), 35-42.

127 Y. C. Yang, S. Y. Huang, J. G. Shi. Zhongguo Yiyuan Yaoxue Zazhi Bianjibu Zazhi., 2003, 23, 278.

128 Si-Bao Chen, He-Ping Liu, Run-Tao Tian, Da-Jian Yang, Shi-Lin Chen, Hong-Xi Xu, Albert S.C. Chan, Pei-Shan Xie, High-performance thin-layer chromatographic fingerprints of isoflavonoids for distinguishing between Radix Puerariae Lobate and Radix Puerariae Thomsonii. Journal of Chromatography A, 2006, 1121, 114-119.

129 Wei Jin, Ri-Li Ge, Quan-Jia Wei, Tian-You Bao, Hai-Ming Shi, Peng-Fei Tu, Development of high-performance liquid chromatographic fingerprint for the quality control of Rheum tanguticum Maxim. ex Balf. Journal of Chromatography A, 2006, 1132(1-2), 320-324.

130 Yiping Li, Zhen Hu, Langchong He. An approach to develop binary chromatographic fingerprints of the total alkaloids from Caulophyllum robustum by high performance liquid chromatography/diode array detector and gas chromatography/mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 43(5), 1667-1672.

131 Lun-zhao Yi, Da-lin Yuan, Yi-zeng Liang, Pei-shan Xie, Yu Zhao, Quality control and discrimination of Pericarpium Citri Reticulatae and Pericarpium Citri Reticulatae Viride based on high-performance liquid chromatographic fingerprints and multivariate statistical analysis. Analytica Chimica Acta, 2007, 588(2), 207-215.

132 Guang-Hua Lu, Kelvin Chan, Yi-Zeng Liang, Kelvin Leung, Chi-Leung Chan, Zhi-Hong Jiang, Zhong-Zhen Zhao, Development of high-performance liquid chromatographic fingerprints for distinguishing Chinese Angelica from related umbelliferae herbs. Journal of Chromatography A, 2005, 1073(1-2), 383-392.

133 Shuai Wang, Hua-Qiao Ma, Ya-Jie Sun, Cheng-Dong Qiao, Shi-Jun Shao, Sheng-Xiang Jiang, Fingerprint quality control of Angelica sinensis (Oliv.) Diels by high-performance liquid chromatography coupled with discriminant analysis. Talanta, 2007, 72(2), 434-436.

134 Gui-Hua Ruan, Gong-Ke Li, The study on the chromatographic fingerprint of Fructus xanthii by microwave assisted extraction coupled with GC–MS. Journal of Chromatography B, 2007, 850(1), 241-248.

135 Pavel Drašar, Jitka Moravcova, Recent advances in analysis of Chinese medical plants and traditional medicines. Journal of Chromatography B, 2004, 812(1), 3-21.

136 Yi-Zeng Liang, Peishan Xie, Kelvin Chan, Quality control of herbal medicines, Journal of Chromatography B, 2004, 812(1-2), 53-70.

137 William A. Court, John G. Hendel, Jama Elmi, Reversed-phase high-performance liquid chromatography determination of ginsenosides of Panax quinquefolium, Journal of Chromatography A, 1996, 755(1), 11-17.

138 Peishan Xie, Sibao Chen, Yi-zeng Liang, Xianghong Wang, Runtao Tian, Roy Upton, Chromatographic fingerprint analysis - A rational approach for quality assessment of traditional Chinese herbal medicine, Journal of Chromatography A, 2006, 1112(1-2), 171-180.

139 Junhui Chen, Mingyong Xie, Zhihong Fu, Frank Sen-Chun Lee, Xiaoru Wang, Development of a quality evaluation system for Panax quinquefolium. L based on HPLC chromatographic fingerprinting of seven major ginsenosides. Microchemical Journal, 2007, 85(2), 201-208.

275

140 Yi-Bing Ji, Qing-Song Xu, Yu-Zhu Hu, Yvan Vander Heyden, Development, optimization and validation of a fingerprint of Ginkgo biloba extracts by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 2005, 1066(1-2), 97-104.

141 Cheng-Jian Xu, Yi-Zeng Liang, Foo-Tim Chau, Yvan Vander Heyden,Pretreatments of chromatographic fingerprints for quality control of herbal medicines. Journal of Chromatography A, 2006, 1134(1-2), 253-259.

142 M. Dumarey, A.M. van Nederkassel, E. Deconinck, Y. Vander Heyden, Exploration of linear multivariate calibration techniques to predict the total antioxidant capacity of green tea from chromatographic fingerprints, Journal of Chromatography A, 2008, 1192(1), 81- 88.

143 M. Daszykowski, Y. Vander Heyden, B. Walczak, Robust partial least squares model for prediction of green tea antioxidant capacity from chromatograms, Journal of Chromatography A, 2007, 1176(1-2), 12-18.

144 E. Deconinck, H. Ates, N. Callebaut, E. Van Gyseghem, Y. Vander Heyden, Evaluation of chromatographic descriptors for the prediction of gastro-intestinal absorption of drugs, Journal of Chromatography A, 2007, 1138(1-2), 190-202.

145 E. Deconinck, Q.S. Xu, R. Put, D. Coomans, D.L. Massart, Y. Vander Heyden, Prediction of gastro-intestinal absorption using multivariate adaptive regression splines.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 39(5), 1021-1030.

146 A.M. van Nederkassel, V. Vijverman, D.L. Massart, Y. Vander Heyden, Development of a Ginkgo biloba fingerprint chromatogram with UV and evaporative light scattering detection and optimization of the evaporative light scattering detector operating conditions, Journal of Chromatography A, 2005, 1085(2), 230-239.

147 A.M. van Nederkassel, M. Daszykowski, D.L. Massart, Y. Vander Heyden.Prediction of total green tea antioxidant capacity from chromatograms by multivariate modeling.Journal of Chromatography A, 2005, 1096(1-2), 177-186.

148 WHO, Guidelines for the Assessment of Herbal Medicine, World Health Organization,Munich, Germany, 1991, p 2,accessed 25 January 2006. http://whqlibdoc.who.int/hq/1991/WHO_TRM_91.4.pdf

149 Drug Administration Bureau of China, Requirements for studying fingerprints of traditional Chinese Medicine Injection, Bejing, China, 2002.

150 Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, England. Copyright 2003 by John Wiley & Sons, Inc. All rights reserved.

151 Methods of Multivariate Analysis, John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, England, 2006 by John Wiley & Sons, Inc. All rights reserved.

152 Richard G. Brereton, Chemometrics, Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant, University of Bristol, UK. John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, England.

153 Niels-Peter Vest Nielsen, Jens Michael Carstensen, Jørn Smedsgaard, Aligning of single and multiple wavelength chromatographic profiles for chemometric data analysis using correlation optimised warping Journal of Chromatography A, 1998, 805(1-2), 17-35.

154 Vitezslav Centner and Massart DL, Onno E. de Noord, Sijmen de Jong, Bernard M. Vandeginste, Cecile Sterna, Elimination of Uniformative Variables for Multivariate Calibration, Anal.Chem. 1996, 68, 3851-3858.

155 Debprasad Chattopadhyay, G. Arunachalam, Asit B. Mandal, Tapas K. Sur, Subash C. Mandal and S. K. Bhattacharya, Antimicrobial and anti-inflammatory activity of folklore: Mallotus peltatus leaf extract, Journal of Ethnopharmacology, 2002, 82(2-3), 229-237.

156 Kiem PV, Minh CV, Huong HT, Nam NH, Lee JJ, Kim YH, Pentacyclic triterpenoids from Mallotus apelta. Arch Pharm Res., 2004, 27(11), 1109-13.

157 R. Bauer, Quality criteria and standardization of phytopharmaceuticals: can acceptable drug standards be achieved?, Drug Inform. J., 1998, 32, 101–110.

276

158 G.B. Mahady, H.H.S. Fong, N.R. Farnsworth, Botanical Dietary Supplements: Quality, Safety, and Efficacy, Swets and Zeitlinger, The Netherlands, 2001.

159 N. Nguyen Hoai, B. Dejaegher, C. Tistaert, V. Nguyen Thi Hong, C. Rivière, G. Chataigné, K. Phan Van, M. Chau Van, J. Quetin-Leclercq, Y. Vander Heyden, Development of HPLC fingerprints for Mallotus species extracts and evaluation of the peaks responsible for their antioxidant activity, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2009, 50(5), 753-763.

160 C. Tistaert, B. Dejaegher, N. Nguyen Hoai, G. Chataigné, C. Rivière, V. Nguyen Thi Hong, M. Chau Van, J. Quetin-Leclercq, Y. Vander Heyden, Potential antioxidant compounds in Mallotus species fingerprints. Part I: Indication, using linear multivariate calibration techniques Analytica Chimica Acta, 2009, 649(1), 24-32.

161 http://www.acdlabs.com/products/chrom_lab/chrom_manager/appl_db.html 162 Svante Wold, Kim Esbensen, Paul Geladi, Principal component analysis, Chemometrics

and Intelligent Laboratory Systems, 1987, 2(1-3), 37-52. 163 Thu, N.B., Thuan, N.D., and Tuan, D.T. Quality control of bear bile. Proceeding of the

fourth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, 2005, 163-168. 165 Khanh, T. C, Current status of quality of botanical raw material and mesures to overcome.

Proceeding of the fourth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, 2005, 53-58. 166 Céline Rivière, Van Nguyen Thi Hong, Luc Pieters, Bieke Dejaegher, Yvan Vander

Heyden, Minh Chau Van, Joëlle Quetin-Leclercq, Polyphenols isolated from antiradical extracts of Mallotus metcalfianus, Phytochemistry, 2009, 70(1), 86-94.

167 R. Aquino, S. Morelli, M.R. Lauro, S. Abdo, A. Saija, A. Tomaino, Phenolic Constituents and antioxidant activity of an extract of Anthurium versicolor leaves, Journal of Natural Products, 2001, 64, 1019-1023.

168 Goedele Alaerts, Jürgen Van Erps, Nele Matthijs, Yvan Vander Heyden, Chromatographic fingerprint development for herbal extracts: parameters to evaluate the global separation quality. In preparation.

169 B.G.M. Vandeginste, D.L. Massart, L.M.C. Buydens, S. de Jong, P.J. Lewi, J. Smeyers-Verbeke, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics. Part B, Elsevier, Amsterdam, 1998.

170 J. Sun, A Correlation Principal Component Regression Analysis of NIR Data, Journal of Chemometrics, 1995, 9, 21-29.

171 J.M. Sutter, J.H. Kalivas, P.M. Lang, Which Principal Components to Utilize for Principal Component Regression, Journal of Chemometrics, 1992, 6, 217-225.

172 J. Verdú-Andrés, D.L. Massart, Comparison of Prediction- and Correlation-Based Methods to Select the Best Subset of Principal Components for Principal Component Regression and Detect Outlying Objects, Applied Spectroscopy, 1998, 52 1425-1434.

173 J. Trygg, S. Wold, Orthogonal projections to latent structures (O-PLS), Journal of Chemometrics, 2002, 16, 119-128.

174 Dawei Wen, Yuping Liu, Wei Li, Huwei Liu (2004), Separation methods for antibacterial and antirheumatism agents in plant medicines, Journal of Chromatography B, Vol. 812(1-2), pp. 101-117

175 Yoshiyasu Fukuyama, Tsuneo Sato, Iwao Miura, Yoshinori Asakawa, Tsunematsu Takemoto (1983), Hydropiperoside, a novel coumaryl glycoside from the root of Polygonum hydropiper, Phytochemistry, Vol.22(2), pp.549-552

176 Yoshiyasu Fukuyama, Tsuneo Sato, Iwao Miura, Yoshinori Asakawa (1985), Drimane-type sesqui- and norsesquiterpenoids from Polygonum hydropiper, Phytochemistry, Vol.24(7), pp. 1521-1524

177 Takuya Furuta, Yoshiyasu Fukuyama, Yoshinori Asakawa (1986), Polygonolide, an isocoumarin from Polygonum hydropiper possessing anti-inflammatory activity, Phytochemistry, Vol. 25(2), pp. 517-520

178 Zhao Feng Peng, Dieter Strack, Alfred Baumert, Ramanathan Subramaniam, Ngoh Khang Goh, Tet Fatt Chia, Swee Ngin Tan, Lian Sai Chia (2003), Antioxidant flavonoids from leaves of Polygonum hydropiper L., Phytochemistry, Vol.62(2),

277

pp.219-228 179 Haraguchi, H., Hashimoto, K., Yagi, A (1992), Antioxidative substances in leaves of

Polygonum hydropiper. J. Agric. Food.Chem, 40(8), pp. 1349-1351. 180 Echeverri, F., Luis, J. G., Torres, F., Quinonens, W., Alzate, F., Cardona, G., Archbold,

R., Roldan, J., Lanlou, E-H (1997), Danilol, a new drimane sesquiterpene from Polygonum punctatum leaves. Natural Product Letters, 10, pp. 295-301.

181 Chien-Chang Shen, Yuan-Shiun Chang and Li-Kang Ho (1993), Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-Dihydroxyflavonoids. Phytochemistry 34, 3, pp. 843-845.

182 Chien-Chang Shen, Yuan-Shiun Chang, Li-Kang Hott (1993), Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids, Phytochemistry, Vol. 34(3), pp. 843-845

183 Michael L. Zimmermann, Albert Sneden (1994), Vanicosides A and B, protein kinase C inhibitors from Polygonum pensylvanicum, Journal of Natural Product Letters, Vol. 57(2), pp. 236-242

viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

Documents