Synthesen von NAD+-Analoga undihre Anwendungen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Gradeseines Doktors der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt von

Dipl.-Chem. Yan Wang

an der

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion

Fachbereich Chemie

Tag der mundlichen Prufung: 25. Juni 20151. Referent/Referentin: Prof. Dr. Andreas Marx

2. Referent/Referentin: Prof. Dr. Valentin Wittmann

Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-0-296783

Teile dieser Arbeit sind veroffentlicht

Y. Wang, D. Rosner, M. Grzywa, A. Marx: Kettenterminierende und durch Click-

Chemie modifizierbare NAD+-Analoga zur Markierung von Zielproteinen der ADP-

Ribosyltransferasen, Angew. Chem., 2014, 126, 8298-8301; Chain-terminating and

clickable NAD+ analogues for labeling the target proteins of ADP-ribosyltransferases,

Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 8159-8162.

Danksagung

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juli 2010 bis Juni 2014 im Arbeitskreis

von Herrn Prof. Andreas Marx am Lehrstuhl fur Organische und Zellulare Chemie

im Fachbereich Chemie der Universitat Konstanz.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Andreas Marx fur die Aufnahme in seinen

Arbeitskreis, die Uberlassung des sehr vielseitigen und interessanten Promotionsthe-

mas, die hervorragende wissenschaftliche Betreuung in jeder Phase der Arbeit sowie

fur die zahlreichen sachkundigen und richtungsweisenden Anregungen.

Bedanken mochte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann fur die Uber-

nahme des Zweitgutachtens und Herrn Prof. Dr. Gerhard Muller fur die Ubernahme

des Prufungsvorsitzes.

An dieser Stelle mochte ich mich bei allen jetzigen und fruheren Mitgliedern der

Arbeitsgruppe fur die unterhaltsame Zeit, die gute Arbeitsatmosphare und die Hilfs-

bereitschaft bedanken. In diesem Zusammenhang mochte ich besonders meinen La-

borkollegen Anna-Lena Steck, Meike Liebmann, Meng Zheng fur die unkomplizierte

Zusammenarbeit, die schone und lustige Zeit im Labor und die vielen wissenschaft-

lichen Gesprache danken, Xiaohui Zhao und Sarah Wallrodt fur die sehr anregenden

Gesprache uber Forschung und Science Fiction.

Außerdem mochte ich Daniel Rosner fur die Unterstutzung bei meinen biochemischen

Experimenten danken, Anna-Lena Steck und Holger Bußkamp fur die Aufnahme der

hochauflosenden Massenspektren. Mein Dank gilt weiterhin Karin Lanz-Schwarz, To-

bias Strittmatter und Sarah Wallrodt fur das Korrekturlesen dieser Dissertation.

Anke Friemel und Ulrich Haunz danke ich fur die Aufnahme zahlreicher NMR-

Spektren.

All meinen Freunden und Bekannten im Fachbereich Chemie danke ich fur viele un-

vergessliche und lustige Momente.

Ich mochte mich ganz besonders bei meinen Eltern bedanken. Ohne ihre Unterstutz-

ung und den bedingungslosen Familienruckhalt ware es nicht moglich gewesen, diese

Arbeit zu beenden.

Nicht zuletzt mochte ich mich bei meiner Ehefrau Jingjing Han bedanken, die in jeder

Situation Frustration und Gluck mit mir teilt.

Abstract

Based on its diverse functions, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is well

known to participate in a variety of cellular processes, such as redox metabolism,

signaling pathways, and post-translational modifications. In 1963 Chambon et. al.

reported for the first time about the formation of a nucleic acid like polymer derived

from NAD+, now referring to us as poly(ADP-ribose) (PAR). ADP-ribosylation is a

reversible post-translational modification of proteins, catalyzed by a family of enzy-

mes termed ADP-ribosyltransferases (ARTs), formerly known as poly(ADP-ribose)

polymerases (PARPs). ARTs play important roles in a wide range of biological pro-

cesses, including DNA repair, maintenance of genomic stability and transcriptional

regulation. ADP-ribosylation comprises the transfer of a single or multiple ADP-

ribose moieties from NAD+ to a specific amino acid residues on a target protein,

referring to us as mono(ADP-ribosyl)ation or poly(ADP-ribosyl)ation respectively.

In this process, the covalent transfer onto glutamic acid, aspartic acid (forming an

ester bond) or lysine residues (forming a Schiff base) of target proteins is described.

To further investigate the functions of ADP-ribosylation and determine the crosstalk

with other post-translational modifications, the identification of ADP-ribose acceptor

site is crucial. Mass spectrometry based approaches for the identification of acceptor

sites turned at to be a challenging task, because of the complex structure of attached

PAR.

Encouraged by current research results, the toolbox of NAD+ analogues were ex-

panded by designing and synthesizing NAD+ analogues. New NAD+ analogues are

described in this thesis that are efficiently incorporated by wild-type ARTs and a)

bear an affinity tag that will allow subsequent manipulations such as labeling and

sample enrichment and b) lead to PAR chain termination owing to a lack of the re-

quired hydroxyl group. Since little is known about the substrate scope of ARTs, the

five novel NAD+ analogues 1-5 were successful synthesized and applied in enzymatic

1

studies, and were found to be efficient substrates for ARTD1 and were used to label

ADP-ribosylated ARTD1 and histone H1.2.

The synthesis of the analogues 1-5 was conducted by first synthesizing the modified

adenosine cores 10, 15, 39, 41 and 49, which bear an iodine atom at the nucleoba-

se. The synthesis of these compounds started from commercially available starting

material 6, 11, 28, 33 and 42 respectively. The alkyne function was then introdu-

ced with the Sonogashira reaction to yield 17, 18, 50-52, which were subsequently

converted into the monophosphates 19, 20, 53-55. The respective monophosphates

were subsequently converted into the NAD+ analogues 1-5 by coupling with activated

β-nicotinamide mononucleotide 25. In addition, the fluorescent dye 27, which was

required in the following biochemical experiment, was synthesized from sulfo-Cy5-

NHS-ester 26 and 3-azido-1-propanamine with good yields. The required affinity tag

58 was synthesized from D-(+)-biotin and an azido linker.

The obtained results of the biochemical experiments showed that the modified NAD+

1 had been accepted by the ARTD1 much better than the 2 in the trans(ADP-

ribos)ylation of histone H1.2 as well as in the auto(ADP-ribos)ylation of ARTD1. By

the systematic modification of the hydroxy groups of adenosine, it was that explored

the substrate scope of ARTD1 in terms of its dependence of the presence of a 2′′- and

3′′-OH group in the assembly of PAR. Whereas 1 led to the formation of long PAR,

4 and 5 act as chain terminators when applied in trans- or auto(ADP-ribos)ylation

reactions. This confirms the need for the 2′′-OH for PAR formation and shows that

the absence of this group cannot be rescued by the presence of a 3′′-OH. Furthermore

it was found that the 3′′-OH group participates in the ADP-ribosylation catalysed by

ARTD1 since the employment of 3 leads to less efficient PAR formation as compared

to the reactions where an analogue with both 2′′- and 3′′-OH groups (1) was employ-

ed. It was further found that the modifications carried within 5 turn this component

into an efficient chain terminator of PAR synthesis that competes with natural NAD+

2

in ADP-ribosylation reactions. This study provides insight into the substrate scope of

ARTD1 and its catalytic mechanism for trans- or auto(ADP-ribos)ylation. Further-

more, the herein described NAD+ analogues 1, 3-5 could be added to the currently

limited toolbox of NAD+ analogues for studying ADP-ribosylation processes. The

alkyne modified chain-terminating analogues should facilitate the identification and

analysis of target proteins of ADP-ribosylation in proteomics approaches, since first

results of labeling histone H1.2 in the context of an in vitro pull-down assay are very

promising, and should thus spur progress towards the development of new chemical

tools to elucidate the metabolism of PAR.

3

Inhaltsverzeichnis

1 Einfuhrung 1

1.1 NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1 Redoxfunktion von NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.1.2 Nicht-Redoxfunktion von NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.1.3 Biosynthese von NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.2 Bioorthogonale Chemie und Modifikationen von NAD+ . . . . . . . . 7

1.2.1 Bioorthogonale Chemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.2.2 Click-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.2.3 Staudinger-Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.3 Modifikationen von NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.4 ARTD1 und Poly(ADP-Ribos)ylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.4.1 ARTD1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.4.2 Poly(ADP-Ribose) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.4.3 Poly(ADP-Ribos)ylierung und ihr Mechanismus . . . . . . . . 20

1.4.4 Identifikation der spezifischen ADPR-Akzeptorstellen . . . . . 23

1.5 ARTD1 und DNA-Reparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

1.5.1 Uberblick uber ARTD1 und DNA-Reparatur . . . . . . . . . . 25

1.5.2 Einfluss von ARTD1 in Basenexzisionsreparatur und Einzel-

strangbruchen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

1.5.3 Einfluss von ARTD1 in der Doppelstrangbruchreparatur . . . 30

1.6 ARTD1 Inhibitoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

I

1.6.1 ARTD1 Inhibitoren und ihre Entwicklung . . . . . . . . . . . 33

1.6.2 Anwendungen der ARTD1 Inhibitoren . . . . . . . . . . . . . 35

2 Aufgabenstellung 39

3 Ergebnisse und Diskussion 41

3.1 Synthese vom C2- oder C7-modifizierten NAD+ . . . . . . . . . . . . 42

3.1.1 Syntheseplanung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.1.2 Ergebnisse der Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.2 Synthese des Azido-Fluoreszenzfarbstoffs . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.3 Biochemische Experimente der C2- oder C7-modifizierten NAD+ . . . 48

3.3.1 Spektroskopische Eigenschaften der NAD+-Analoga . . . . . . 49

3.3.2 ADP-Ribosylierung vom C2- oder C7-modifizierten NAD+ . . 50

3.4 Synthese der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+ . . . . . . . . . 53

3.4.1 Syntheseplanung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.4.2 Ergebnisse der Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.5 Synthese des Azido-Biotins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.6 Biochemische Experimente der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+ 59

3.6.1 Spektroskopische Eigenschaften der NAD+-Analoga . . . . . . 59

3.6.2 ADP-Ribosylierung der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+ 60

3.6.3 Kompetition von NAD+-Analoga mit dem naturlichen NAD+ 65

3.7 Pulldown-Experimente unter Anwendung des Kettenterminators . . . 67

3.7.1 Strategie der Pulldown-Experimente . . . . . . . . . . . . . . 67

3.7.2 Ergebnisse der Pulldown-Experimente . . . . . . . . . . . . . 69

4 Zusammenfassung und Ausblick 75

5 Experimenteller Teil 80

5.1 Materialien und Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

5.1.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

5.1.2 Losungsmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

II

5.1.3 Praparative Saulenchromatographie . . . . . . . . . . . . . . . 81

5.1.4 Dunnschichtchromatographie (DC) . . . . . . . . . . . . . . . 81

5.1.5 Ionenaustauschchromatographie (IEX) . . . . . . . . . . . . . 81

5.1.6 Mitteldruckflussigkeitschromatographie (MPLC) . . . . . . . . 82

5.1.7 Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

5.1.8 NMR-Spektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

5.1.9 Verbrauchsmaterial fur die molekularbiologischen Arbeiten . . 83

5.1.10 Gerate fur die molekularbiologischen Arbeiten . . . . . . . . . 83

5.1.11 Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

5.2 Reagenzien und Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.2.1 Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB)-Puffer . . . . . 85

5.2.2 Puffer und Losungen fur den molekularbiologischen Teil . . . . 85

5.3 Chemische Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

5.3.1 2′,3′,5′-Tri-O-acetylguanosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

5.3.2 2-Amino-6-chlor-9-[(2′,3′,5′-tri-Oacetyl)-β-D-ribofuranosyl]purin 89

5.3.3 6-Chlor-2-iod-9-[(2′,3′,5′-tri-O-acetyl)-β-D-ribofuranosyl]purin 90

5.3.4 2-Iodadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.3.5 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-bezoyl-D-ribose . . . . . . . . . . . . . 93

5.3.6 4-Chlor-5-iod-7-[(2′,3′,5′-tri-O-benzoyl)-β-D-ribofuranosyl]-7H -

pyrrol[2,3-d]pyrimidin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

5.3.7 7-Iod-7-deazaadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.3.8 2-Ethinyladenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

5.3.9 7-Ethinyl-7-deazaadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

5.3.10 2-Ethinyladenosin-5′-monophosphat . . . . . . . . . . . . . . . 100

5.3.11 7-Ethinyl-7-deazaadenosin-5′-monophsphat . . . . . . . . . . . 101

5.3.12 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-β-D-ribose . . . . . . . . . . . . . . . . 102

5.3.13 3-(Carbamoyl)-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-Dribofuranosyl)pyridini-

umtriflat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

III

5.3.14 3-(Ethoxycarbonyl)-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)py-

ridiniumtriflat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

5.3.15 2A-Ethinyl-NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

5.3.16 7DA-Ethinyl-7-deazaNAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

5.3.17 3-Azidopropyl-1-amino-sulfocyanin 5 (Sulfo-Cy5-Azid) . . . . 109

5.3.18 N2, 9-Diacetylguanin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

5.3.19 2-Amino-6-chlorpurin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

5.3.20 9-Acetyl-2-amino-6-chlorpurin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

5.3.21 6-Chlor-2-iodpurin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

5.3.22 1,2-O-Isopropyliden-5-O-(4-methybenzoyl)-α-D-xylofuranose . 114

5.3.23 3-Deoxy-1,2-O-isopropyliden-5-O-(4-methylbenzoyl)-α-D-ribo-

furanose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

5.3.24 3-Deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-α,β-D-ribofuranose . . . . . . 116

5.3.25 1,2-Di-O-acetyl-3-deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-α,β-D-ribofur-

anose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

5.3.26 6-Chlor-2-iod-9-[(2′-O-acetyl-3′-deoxy-5′-O-(4-methylbenzoyl)-β-

D-ribofuranosyl]purin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

5.3.27 2-Iod-3′-deoxyadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

5.3.28 6-Chlor-2-iod-9-[2′-deoxy-3′,5′-di-O-(4-methylbenzoyl)-β-D-rib-

ofuranosyl]purin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

5.3.29 2-Iod-2′-deoxyadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

5.3.30 2′-Deoxy-3′,5′-di-O-acetylguanosin . . . . . . . . . . . . . . . . 124

5.3.31 2-Amino-6-chlor-9-[(3′,5′-di-O-acetyl-2′-deoxy)-β-D-ribofuranos-

yl]purin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

5.3.32 2-Amino-6-chlor-9-(2′-deoxy-β-D-ribofuranosyl)purin . . . . . 126

5.3.33 2-Amino-6-chlor-9-[2′-deoxy-5′-O-(tert-butyldimethylsilyl)-β-D-

ribofuranosyl]purin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

5.3.34 2-Amino-6-chlor-9-[2′,3′-dideoxy-5′-O-(tert-butyldimethylsilyl)-

β-D-ribofuranosyl]purin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128

IV

5.3.35 6-Chlor-2-iod-9-[2′,3′-dideoxy-5′-O-(tert-butyldimethylsilyl)-β-D-

ribofuranosyl]purin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

5.3.36 2-Iod-2′,3′-dideoxyadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

5.3.37 2-Ethinyl-3′-deoxyadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

5.3.38 2-Ethinyl-2′-deoxyadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

5.3.39 2-Ethinyl-2′, 3′-dideoxyadenosin . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

5.3.40 2-Ethinyl-3′-deoxyadenosin-5′-monophosphat . . . . . . . . . . 135

5.3.41 2-Ethinyl-2′-deoxyadenosin-5′-monophosphat . . . . . . . . . . 136

5.3.42 2-Ethinyl-2′,3′-dideoxyadenosin-5′-monophosphat . . . . . . . 137

5.3.43 2A-Ethinyl-3′′-deoxy-NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

5.3.44 2A-Ethinyl-2′′-deoxy-NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

5.3.45 2A-Ethinyl-2′′,3′′-dideoxy-NAD+ . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

5.3.46 1,2-Bis(2-azidoethoxy)ethan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

5.3.47 N-(2-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)ethyl)biotinylamid . . . . . . . 142

5.4 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

5.4.1 Enzymatische Reaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

5.4.1.1 Ubersicht der verwendeten Protein- und DNA-Sequenz 144

5.4.1.2 ADP-Ribosylierung von Histon H1.2 . . . . . . . . . 144

5.4.1.3 Automodifikation von ARTD1 . . . . . . . . . . . . . 145

5.4.2 Proteinbiochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

5.4.2.1 Click-Reaktion von modifizierten Proteinen . . . . . 145

5.4.2.2 SDS-PAGE Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . 145

5.4.2.3 Coomassie-Farbung von SDS-PAGE Gelen . . . . . . 146

5.4.2.4 Western-Blot von Proteinen auf PVDF-Membranen . 146

5.4.2.5 Detektion mittels Streptavidin-alkalischer Phosphatase 147

5.4.3 Pulldown-Experiment unter Anwendung des Kettenterminators 148

5.4.3.1 Bruch der Biotin-Streptavidin-Interaction . . . . . . 148

5.4.3.2 Spaltung der Phosphodiesterbindung . . . . . . . . . 149

5.4.3.3 Aminolyse der Esterbindung . . . . . . . . . . . . . . 149

V

5.4.3.4 Pulldown-Experiment von Histon H1.2 . . . . . . . . 151

6 Abkurzungsverzeichnis 152

7 Literaturverzeichnis 159

VI

Kapitel 1

Einfuhrung

1.1 NAD+

Im Jahr 1906 wurde von Harden und Young[1] das Nicotinamidadenindinukleotid

(NAD+) im Zuge von Studien zur alkoholischen Garung in Hefeextrakten entdeckt

und stellt somit das erstbeschriebene Coenzym dar. Aufgrund der chemischen Struk-

tur, gehort NAD+ zur Verbindungsklasse der Pyridinnukleotiden. In den 1920iger

Jahren konzentrierten sich die Forscher auf das Gebiet der Coenzyme. Von Euler

gelang es 1931 NAD+ aus Hefeextrakten zu isolieren und er klarte auf, dass es sich

struktur-chemisch um ein Pentosenukleosid handelt. Wenig spater konnte er zeigen,

dass sich NAD+ aus den beiden Mononukleotiden Adenosinmonophosphat (AMP)

und Nicotinamidmononukleotid (NMN) mit dem pyridinahnlichen Nicotinamid (NA)

zusammensetzt. Beide Mononukleotide sind durch ein Pyrophosphat miteinander ver-

knupft[2]. Die Redoxaktivitaten der Pyridinnukleotide wurde zuerst von Warburg

und Christian[3] im Jahr 1935 beschreiben. Anhand der Reduktion des Acetaldehyds

zu Ethylalkohol wurde gezeigt, dass NAD+ in Elektronenubertragungsreaktionen in-

volviert ist. Am Pyridin von NAD+ findet die eigentliche Wasserstoff- bzw. Elek-

tronenubertragung statt[3]. Fast der gesamte Fokus des Interesses richtete sich das

letzte Jahrhundert hindurch auf Dinukleotide mit ihren reduzierten Formen (NADH

und NADPH) und ihre Beteiligung an zahlreichen Redoxreaktionen des Stoffwech-

1

sels der Zelle. Als immer mehr zellulare Geheimnisse durch wissenschaftliche For-

schung enthullt wurden, stellte sich heraus, dass NAD+ nicht nur als Redoxcoen-

zym fungiert, sondern auch weitere wichtige Funktionen in der Zelle hat. So wurde

in den spaten 60iger Jahren die zweite Hauptfunktion von NAD+ entdeckt, wobei

ADP-Ribose (ADPR) an zellulare Nukleophile, wie z.B. pos-translational an Prote-

ine ubertragen wird[4]. Diese”neue“ Chemie der NAD+ ist vielfaltig und hat sich

auf Sauger-Organismen erweitert. Heute sind 18 ADP-Ribosyltransferasen[5] (ARTs,

fruher bekannt als Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen oder PARPs) und 7 Sirtuine[6]

bekannt, die unter Nutzung dieser Chemie in die verschiedene Signalubertragungen

und die Zellanpassung involviert sind.

1.1.1 Redoxfunktion von NAD+

Es ist bekannt, dass NAD+ eine direkte Rolle im Katabolismus spielt. NAD+ beteiligt

sich als Co-Substrat in mehreren Schritten der Glykolyse[7], in der Lactat-Pyruvat-

Umwandlung und der Pyruvat-Oxidation zu Acetyl-CoA durch Katalyse des Pyruvat-

Dehydrogenase-Komplexes[7], im Citratcyclus[7] und als Elektronendonor zur NADH-

Dehydrogenase (Komplex I) in der Atmungskette[7].

Die Redoxeigenschaften von NAD+ (Abbildung 1.1.1.1) resultieren aus dem Man-

gel in der Elektronendichte in dem Nicontinamid-Ring. Wenn zur Ribose konjugiert,

wird der Elektronenmangel durch Quaternarization des Pyridin-Stickstoffs im He-

terocyclus akzentuiert. Diese quartare Pyridin-Gruppe wird noch mehr durch den

Elektronenmangel des Carboxamids, was bekanntlich eine gute elektronenziehende

Gruppe darstellt, stabilisiert. Der Elektronenmangel des Pyridin-Rings stellt eine

treibende Kraft fur die Aufnahme des Hydrid-Ions (ein Proton und zwei Elektronen)

in der C4-Position dar. Die zwei Elektronen werden beim Angriff auf das C4-Atom

des Rings aufgenommen, wobei der Stickstoff und das para-standige Kohlenstoffatom

reduziert und das aromatische System aufgehoben wird. Die Ruckreaktion wird hin-

2

gegen durch die Wiederherstellung der Aromatizitat angetrieben. Diese Redoxchemie

spiegelt die genaue Bilanz zwischen Aufnahme und Entfernung des Hydrid-Ions wie-

der. Diese Redoxreaktionen sind in der Regel reversibel, so dass es dabei nicht zu

einem Nettoverbrauch des Coenzyms kommt.

Abbildung 1.1.1.1: Struktur der oxdierten und reduzierten Form von NAD+ und der zugehorige

Redoxreaktionsmechanismus.

Denn NAD+ und seine reduzierte Form NADH sind als Redox-Coenzyme an nahe-

zu jeder Stoffwechselreaktion, die in Zellen zur Umwandlung von chemischen Stoffen

durchgefuhrt wird, beteiligt. Deshalb stehen die beiden an einer Schlusselposition

des Stoffwechsels. Dabei ubernehmen die beiden unterschiedliche Funktionen. Bei

Saugern ist NAD+ fur die Aufnahme von Elektronen in Energiestoffwechselwegen[8]

zustandig. Die Reduktionsenergie des NADH begunstigt die Ausbildung eines Proto-

nengradienten[8] uber die innere Mitochondrienmembran und wird zur Synthese von

ATP[8] genutzt. Um das NADH genugend zu erzeugen, ist das Verhaltnis von NAD+

zu NADH in den meisten Geweben erhoht, sodass eine NAD+-Reduktion begunstigt

wird[8].

1.1.2 Nicht-Redoxfunktion von NAD+

NAD+ ist ein Elektrophil und der Ribose-Ring wird uber das anomere Kohlenstof-

fatom am Nicotinamid in NAD+ konjugiert. Deshalb kann es durch eine Vielzahl

von zellularen Nukleophilien, inklusive Proteinen, angegriffen und die ADPR-Einheit

3

anschließend auf Nukleophile ubertragen werden (Abbildung 1.1.2.1). Diese ADPR-

Ubertragung wird durch die Eigenschaft des Nicontinamids als gute Abgangsgruppe

erleichtert. Es gibt mehrere Enzymklassen[9], die NAD+ als Co-Substrat verwenden

bzw. unter NAD+ Verbrauch diverse Reaktionen katalysieren. Dabei findet je nach

der Art des Enzyms eine Poly(ADP-Ribos)ylierung oder Mono(ADP-Ribos)ylierung

statt. Die vielfaltigen NAD+-konsumierenden Enzyme haben vor kurzem großes In-

teresse wegen ihrer wichtigen biologischen Funktionen hervorgerufen. Es wurde ver-

mutet, dass die ADPR-Ubertragungsreaktion eine grundlegende Bedeutung fur die

Modellierung der Saugetierphysiologie[10] hat.

Abbildung 1.1.2.1: ADPR-Ubertragungsreaktion von NAD+ auf ein zellulares Nukleophil.

Neben diesen verschiedenen ADPR-Ubertragungsreaktionen wurde kurzlich eine neue

Modifikationsreaktion entdeckt: die NAD+-abhangige Proteindeacetylierung[11]. Bei

dieser Reaktion wird O-Acetyl-ADP-Ribose (OAADPR) durch die Deacetylierung

von acetylierten Lysinen in Histonen[12] erzeugt (Abbildung 1.1.2.2).

Abbildung 1.1.2.2: Struktur von OAADPR und sein Reaktionsmechanismus.

4

Jedoch ist die physiologische Relevanz der Ubertragung der Acetylgruppe auf AD-

PR weitgehend unbekannt. Es wurde vermutet, dass es sich bei OAADPR um ein

neues Signalmolekul handeln konnte. Aktuellen Ergebnisse[13] zeigen jedoch, dass

OAADPR in Genregulation zu einer Hemmung, Steuerung eines Ionenkanals und

Redoxregulation dienen konnte. Außerdem konnte das Molekul noch eine zentrale

Rolle in der Biologie von Sirtuin[13] spielen.

Eine weitere wichtige Reaktionsart ist die Cyclisierung von NAD+ und die Reaktion

liefert die cyclische ADPR (cADPR). Das Molekul wurde zuerst im Jahr 1987 bei der

Inkubation von NAD+ mit Seeigeleierhomogenaten[14] entdeckt und 7 Jahren spater

konnte seine Struktur[15] ermittelt werden.

Abbildung 1.1.2.3: Schematische Darstellung der Bildung von cADPR.

Die cADPR wird aus NAD+ durch CD38[16], ein Enzym der Familie der ADP-

Ribosyl-Cyclasen (ADPRC)[17], synthetisiert (Abbildung 1.1.2.3). Obwohl CD157

auch zur Familie der ADPRC gehort, konnte nur eine sehr schwache Cyclaseakti-

vitat[18] nachgewiesen werden. Die cADPR wird durch Cyclisierung von NAD+ unter

Freisetzung von Nicotinamid gebildet. Dabei wird das Nicotinamid abgespalten und

eine N-glycosidische Bindung zwischen dem Adeninring und der Ribose gebildet[19].

Als sekundarer Botenstoff ist die cADPR fur die Ca2+-Signalgebung[20] verantwort-

lich.

5

1.1.3 Biosynthese von NAD+

Sowohl vom biochemischen als auch strukturellen Standpunkt ist die NAD+-Bio-

synthese eines der am besten untersuchten Stoffwechselwege. Je nach Organismus

konnen drei verschiedene Bausteine (Chinolinsaure, Nicotinsaure und Nicotinamid)

fur die NAD+-Biosynthese[21] verwendet werden. Chinolinsaure ist der Ausgangsstoff

fur die de novo Synthese. In Eukaryoten wird normalerweise von Tryptophan ausge-

gangen, wahrend in Bakterien NAD+ aus L-Aspartat und Dihydroxyacetonphosphat

synthetisiert wird. Im anderen Fall kann NAD+ ausgehend von Nicotinsaure und

Nicotinamid, die durch die verschiedenen Abbau- und Verbrauchsreaktionen im zahl-

reichen zellularen Metabolismus aus NAD+ und NADP+ erzeugt werden, erhalten

werden (Abbildung 1.1.3.1[22]).

Abbildung 1.1.3.1: Schematische Darstellung der NAD+-Biosynthese[22]. (a) Chemische Struktur

von NAD+ und seinen Derivaten. (b) Schematische Darstellung der biochemischen Prozesse der

NAD+-Biosynthese.

Zuerst werden Chinolinsaure, Nicotinsaure und Nicotinamid durch geeignete Phos-

phoribosyltransferasen[23] in Nicotinsauremononukleotid oder NMN verwandelt. En-

6

zyme dieser Klasse konnen die Phosphoribosyl-Einheit von Phosphoribosylpyrophos-

phat (PRPP) in ihre spezifischen Substrate ubertragen. Dann wird die Umwandlung

der erhaltenden Molekule in entsprechende Dinukleotide durch von Mononukleotid-

Adenylyltransferasen[24] katalysierte Adenylierungsreaktion durchgefuhrt. Schließlich

katalysiert die NAD+-Synthase die Amidierung. Dadurch wird NAD+ aus Nicotin-

saureadenindinukleotid erzeugt.

Trotz der intensiven Untersuchung sind die verschiedenen Wege der NAD+-Synthese

z.B. bei Saugern nur noch allgemein zu verstehen und konnen in der Natur durch

viele Faktoren beeinflusst werden. Deshalb werden verschiedene NAD+-Analoga als

maßgeschneiderte Werkzeuge fur weitere Untersuchungen benotigt.

1.2 Bioorthogonale Chemie und Modifikationen von

NAD+

1.2.1 Bioorthogonale Chemie

Seit langem wollten Forscher Biomolekule in ihrer naturlichen Umgebung untersu-

chen. Jedoch ist diese Aufgabe wegen der enormen Komplexitat zellularer Syste-

me sehr anspruchsvoll, bis Bertozzi et. al.[25] erst vor Kurzem die bioorthogonale

Chemie[26] signifikant weiter entwickelte. Die bioorthogonale Chemie bezieht sich auf

jede chemische Reaktion, die mit einem biologischen System weder eine Wechselwir-

kung eingehen noch eine Storung auftreten kann. Die teilnehmenden funktionellen

Gruppen mussen hochselektiv und rasch unter biokompatiblen Bedingungen mitein-

ander reagieren konnen und nicht toxisch fur Zellen und Organismen sein. Genetisch

verschlusselte Peptidmarker (z.B. das grun fluoreszierende Protein, GFP[27]) werden

wegen umfanglicher Anwendung und außergewohnlicher Bedeutung nun haufig in der

Proteinforschung verwendet. Jedoch sind viele andere Biomolekule wie Nukleinsaur-

7

en, Lipide und Glycane sowie post-translationale Modifikationen (PTM) mit diesen

genetisch codierten Markern nicht zuganglich und konnen nicht beobachtet werden.

Uber die Jahre wurden mehrere ortsspezifische und bioorthogonale Methoden[28] zur

kovalenten Bindung von Fluoreszenzsonden oder Affinitatsmarkern an unterschiedli-

chen Biomolekulen entwickelt.

1.2.2 Click-Reaktion

Die in vielen bioorthogonalen Reaktionen am haufigsten verwendete Reportergrup-

pe ist die Azidgruppe[29]. Wegen seiner Eigenschaften wie z.B. chemisch inert und

stabil unter physiologischen Bedingungen sowie nicht Vorkommen in biologischen

Systemen[30] ist das Azid ein besonders vorzuglicher chemischer Reporter. Trotz die-

ser tauglichen Eigenschaften konnte es in biologischen Systemen jedoch keine An-

wendungsmoglichkeit finden, bis ein zweckmaßiger Reaktionspartner fur das Azid

entwickelt wurde.

Eine Reaktionsmoglichkeit fur das Azid ist seine Beteiligung an der 1,3-dipolaren

Cycloaddition[31]. Zwar wurde diese Reaktion zum ersten Mal im spaten 19. Jahrhun-

dert beschrieben[31], jedoch konnte der Reaktionsmechanismus erst durch Huisgen[32]

in den 60er Jahren erklart werden. Wegen der fur die Reaktion benotigt hohen Tem-

peraturen oder Drucke hat man an Verwendungen dieser Cycloaddition in zellularen

Umgebungen sowie in lebenden Systemen nicht gedacht. Seit das Konzept der Click-

Reaktion 2001 von Sharpless et. al.[33] begrundet wurde, wurde eine neue Tur in der

Chemie und Biologie geoffnet. Mit der Click-Reaktion konnen zielgerichtete Zielmo-

lekule schnell, stereospezifisch und unter einfachen Reaktionsbedingungen und hoher

Ausbeute aus kleineren Einheiten synthetisiert werden. Eine bedeutende Reaktion

dieses Bereichs ist die kupfer(I)-katalysierte 1,3-dipolare Azid-Alkin-Cycloaddition

(CuAAC)[34]. Der beschriebene Mechanismus[35] der CuAAC ist in Abbildung 1.2.2.1

zu sehen.

8

Abbildung 1.2.2.1: Der Mechanismus der CuAAC.

Der Cu(I)-Katalysator koordiniert vor allem das Alkin und das Azid. Die Koordi-

nation verringert pKs-Wert des Alkins[35] und aktiviert das Azid fur nukleophilen

Angriff[35]. Im nachsten Schritt fuhrt der Stickstoff im Azid einen nukleophilen An-

griff auf das Alkin aus und ein Metallcyclus wird gebildet. Nach Entstehung eines

Triazolrings wird das Triazol dissoziiert und der Cu(I)-Katalysator regeneriert sich.

Die CuAAC ist schnell, effizient, selektiv und einfach durchfuhrbar und findet heute

zahlreiche Anwendungen[36] in der organischen Synthese, kombinatorischen Chemie,

Polymerchemie, Materialchemie und chemischen Biologie. Jedoch verhindert die Toxi-

zitat[37] des Cu(I)-Katalysators die Anwendungen der CuAAC in lebenden Systemen.

Um die Biokompatibilitat der Azid-Alkin-Cycloaddition zu verbessern, wurde aus-

probiert die Alkine durch Ringspannung ohne Metallkatalysator zu aktivieren. Die

Studien[38] zeigten bereits, dass das Cyclooctin ein geeigneter Kandidat zu die-

sem Zweck ist. Aber die Reaktionsgeschwindigkeit der spannungskatalysierten Cy-

cloaddition war in ersten Untersuchungen deutlich langsamer als die CuAAC. Durch

Einfuhren der elektronenziehenden Fluoratome (z.B. DIFO: difluoriertes Cyclooctin)

an der Propargylposition wird die Geschwindigkeit erhoht und eine Reihe der Ver-

bindungen wird entwickelt. Das Azacyclooctin[39] und das Benzocyclooctinol[40] sind

typisch fur solche Verbindungen. Die entwickelte Methode wird kupferfreie Click-

Reaktion (Abbildung 1.2.2.2) genannt. Die kupferfreie Click-Reaktion ermoglicht die

Abbildung azidmarkierter Biomolekule nicht nur in komplexen biologischen Umge-

bungen sondern auch in lebenden Systemen[41].

9

Abbildung 1.2.2.2: Schematische Darstellung der kupferfreien Click-Reaktion.

1.2.3 Staudinger-Ligation

Eine andere Reaktionsmoglichkeit fur das Azid ist die Staudinger-Ligation[42]. Die

Staudinger-Ligation ist eine Modifikation der klassischen Staudinger-Reduktion[43]

von Aziden mit Triphenylphosphan.

Abbildung 1.2.3.1: Der Reaktionsmechanismus der Staudinger-Ligation von Aziden und Triarylp-

hosphanen. Unter der Spaltung des Stickstoffs bildet sich ein intermediares Aza-Yild. Anschließe-

nd cyclisiert das Aza-Yild zu einem intramolekularen Amid. Die Hydrolyse des Amids liefert ein

stabiles Ligationsprodukt.

Wie in Abbildung 1.2.3.1[44] dargestellt wird, greift das Phosphoratom das Azid an

und bildet unter der Abspaltung des Stickstoffs ein intermediares Aza-Yild. Anschlie-

ßend wird das nukleophile Aza-Yild durch intramolekulare Cyclisierung unter Amid-

bindung abgefangen. Im nachsten Schritt wird das intramolekulare Amid in wass-

10

riger Umgebung spontan hydrolysiert und liefert ein stabiles Ligationsprodukt und

das Phosphanoxid. Die Vorteile der Methode sind, dass diese Reaktion bei Raum-

temperatur und in Wasser quantitativ verlauft und beide Ausgangsstoffe abiotisch

sind. Deshalb kann die Staudinger-Ligation beispielsweise zur Markierung von Bio-

molekulen wie Glycane, Lipide, DNA und Proteine in ihren vielen zellularen Umge-

bungen benutzt werden[45].

Eine weitere Entwicklung der Methode wurde besonders fur die Proteinsynthese an-

gepasst. Die sogenannte spurlose Staudinger-Ligation wurde von Raines et. al.[46] und

Bertozzi et. al.[47] gleichzeitig beschrieben. Der Vorteil der Methode liegt daran, dass

diese Modifikation eine Amidbindung liefert, ohne dass das storende Triarylphosphan-

oxid verknupft werden kann. Der Verlauf der spurlosen Staudinger-Ligation wird in

Abbildung 1.2.3.2 dargestellt.

Abbildung 1.2.3.2: Der Reaktionsmechanismus der spurlosen Staudinger-Ligation mit dem Thiol-

Hilfsstoff.

Das Diphenylphosphanylmethanthiol als Thiol-Hilfsstoff wird am C-Terminus eines

Peptids 1 angreifen und danach einen C-terminalen Phosphanylthioester bilden. Der

Phosphanylthioester reagiert anschließend mit einem Azido-Peptid 2 unter Bildung

eines Iminophosphorans. Das Iminophosphoran lagert sich intramolekular um und

fuhrt zum Amidophosphonium-Salz. Nach der Hydrolyse in wassriger Umgebung

11

erhalt man ein Amid. Ein entscheidender Punkt zur nativen chemischen Ligation

(NCL)[48] ist, dass die spurlose Staudinger-Ligation keinen Cysteinrest an der Ver-

knupfungsstelle benotigt.

Obwohl die Staudinger-Ligation vielfaltige Anwendungsmoglichkeiten in der zellularen

Biologie hat, unterliegt sie aber noch Einschrankungen: Sie hat eine relativ langsa-

me Reaktionskinetik und benotigt hohe Konzentrationen an Triarylphosphan. Die

Verbesserung der Kinetik durch Erhohung der Nukleophilie der Phosphanreagentien

und eine großere Anfalligkeit gegen Phosphanoxidation an der Luft ermoglichen die

weitere Entwicklung der Staudinger-Ligation, um eine außerst geeignete Methode in

der chemischen Biologie zu werden.

Außer der vorgestellten Click-Reaktion und der Staudinger-Ligation gibt es noch viele

andere bioorthogonale Reaktionen[49]. Die bioorthogonalen Reaktionen eroffnen neue

Moglichkeiten fur biologische Untersuchungen und grundlegende Entdeckungen auf

Gebieten der Biophysik, der chemischen Biologie und der Medizin.

1.3 Modifikationen von NAD+

NAD+ als Coenzym ist nicht nur an zahlreichen zellularen Redoxreaktionen des Stoff-

wechsels beteiligt, sondern es ist auch ein funktionelles Molekul in vielen Aspek-

ten des Lebens. Es wurde festgestellt, dass NAD+ eine entscheidende Rolle in der

Calcium-Homoostase[50], Zellproliferation[51], Alterung[52], Apoptose[53], kovalenten

Protein Modifikation[54], Genexpression und Regulation zahlreicher NAD+-abhangi-

ger Emzyme[55] spielt. Die aktuellen Studien zeigen, dass NAD+ als Immunregula-

tor[56] fungiert oder den Tod von T-Zellen[56] induzieren kann. Um seine Funkti-

on in komplexen biologischen Prozessen zu erforschen, ist man auf unterschiedliche

Modifikationen des Molekuls angewiesen. Allgemein kann das NAD+-Molekul in der

12

Adenosin-, der Diphosphat (PPi)- und der Nicotinamid-Ribosid-Untereinheit modi-

fiziert werden (Abbildung 1.3.1).

Abbildung 1.3.1: Modifikationsmoglichkeiten des NAD+-Molekuls. Das Molekul kann in der Ad-

enosin-, der Diphosphat (PPi)- und der Nicotinamid-Ribosid-Untereinheit modifiziert werden.

Um den molekularen Mechanismus der NAD+-beteiligten biochemischen Prozesse

zu entschlusseln, wurden verschiedene modifizierte NAD+ in den aktuellen Untersu-

chungen verwendet. Hirst et. al.[57] verwendete ein Wasserstoffisotop fur die Detek-

tion der Ubertragung des Hydrid-Ions wahrend der NADH Oxidation uber NADH-

Dehydrogenase. Obwohl die NADH-Dehydrogenase vor mehr als 50 Jahren erstmals

gereinigt wurde[58], ist zum Mechanismus der Redox-getriebenen Protonentranslo-

kation nur wenig bekannt[59]. Man weißt nicht, wie die Protonubertragung zwischen

der C4-Position des Nicotinamidrings und der N5-Position vom Flavinmononukleotid

(FMN) erfolgt. Hirst et. al. bereitete das R-NADD und S -NADD als NAD+-Analoga

vor und fuhrte die Kinetikmessung des Oxidationsschritts durch. Aus gemessenen

Experimentdaten wurde herausgefunden, dass die Reaktionsgeschwindigkeit von S -

NADD im Vergleich vom NADH signifikant gesunken ist und deutlich ein primarer

kinetischer Isotopeneffekt hinwies. Es bestatigte sich, dass die Hydridubertragung

stereospezifisch von der pro-S Position des Nicotiamidrings aus stattfindet. Und zu-

sammen mit der NAD+-Dissoziation sind beide zum Teil der geschwindigkeitsbe-

stimmende Schritt fur NADH Oxidation uber NADH-Dehydrogenase[57]. Im ande-

ren Fall berichtete Li et. al.[60] die Synthese und Evaluation der Azido- und Diazo-

NAD+-Analoga in Photoaffinitatsmarkierungsexperimenten. Die Azidogruppe an der

2- bzw. 6-Position des Adenins kann leicht zu einem Tetrazol isomerisieren[61]. Des-

13

halb wurden einige Modifikationen am Pyridinring von NAD+ angebracht. Eine von

der Alkoholdehydrogenase (ADH) aus der Leber katalysierten Redoxreaktion wurde

als ein Modell fur die Untersuchung der NAD+-Analoga eingesetzt. Die Erbenisse[60]

zeigten, dass die NAD+-Analoga die Coenzymaktivitat besaßen, wenn das Molekul

die Carbonylgruppe enthalt. Es wurde darauf hingewiesen, dass die Carbonylgrup-

pe in der Redoxreaktion eine wichtige Rolle fur Bildung einer Wasserstoffbindung

mit dem Enzym spielte. Die Subsitution vom α-Diazoketon bzw. Arylazido-Rest an

der Carboxamidgruppe des Nicotinamids und die Azidogruppe an der 5-Position des

Pyridinrings zeigten zwar keine Coenzymaktivitat, aber die Molekule senkten die Re-

aktionsgeschwindigkeit der Bildung von NADH, wenn das naturliche NAD+ in der

enzymatischen Reaktion vorhanden war. Solche Modifikationen konnen als Inhibitor

ahnlich der Redoxreaktion angewendet werden.

Die NAD+-Analoga wurden nicht nur in der Untersuchung der Redoxreaktion ge-

braucht, sondern sie hatten auch Anwendungsmoglichkeiten in der Forschung der

ADP-Ribosylierung. Die Arbeitsgruppe von Lin hat berichtet, dass eine Propargyl-

gruppe auf die 6-Position bzw. 8-Position des Adenosins[62] gebracht wurde und

die erhaltenen NAD+-Analoga[62] in vitro getestet wurden. Mit Hilfe einer Click-

Reaktion konnen die auf Proteine ubergetragenen ADPR-Einheiten und die entspre-

chenden Proteine durch fluoreszierende Farbstoffe in SDS-Gel visuell dargestellt wer-

den. Zuerst wurde diese Methode zur Untersuchung der ART-Aktivitat von Sirtui-

nen[63] verwendet. Es wurde herausgefunden, dass das 6-Alkin-NAD+ ein Substrat fur

die Deacetylierungsreaktionen ist und das 8-Alkin-NAD+ inaktiv war. Jedoch kann

beim 6-Alkin-NAD+ keine Aktivitat der Sirtuin-abhangige ADP-ribosylierung festge-

stellt werden. Ein eventueller Grund liegt darin, dass die ADP-Ribosylierungsaktivitat

von Sirtuinen nicht physiologisch relevant sein konnte. Außerdem wurden vier mogli-

che Mechanismen fur Sirtuin-abhangige ADP-Ribosylierung aus den relativen Experi-

mentdaten dargestellt. Lin et. al.[64] fokussierte noch seine Untersuchungen mit Hilfe

von 6- bzw. 8-Alkin-NAD+ durch die Markierung und zur Identifizeirung der entspre-

14

chenden Substratproteine in der Poly(ADP-Ribos)ylierung. Durch die gleiche Metho-

de kann er sowohl das ARTD1 selbst als auch andere Proteine wie p53, RAP74(TFIIF-

Untereinheit), TRF1, sowie mehrere mitochondrialen Proteine markieren. Aus den

erhaltenen Ergebnissen kann noch abgeleitet werden, dass das 8-Alkin-NAD+ auch

kein effizientes Substrat fur ARTD1 ist. Wahrscheinlich erzeugt die Alkinmodifika-

tion auf der 8-Position des Adenosins die sterische Hinderung, wenn es an ARTD1

bindet[64]. Außerdem konnen uber 70 ADPR-markierte Substratproteine[64] aus dem

ARTD1 niedergeschlagenen Zelllysat durch Biotin-Affinitatstag herausgefischt und

separat identifiziert werden.

Außerdem wurden einige NAD+-Modifikationen als Inhibitor der NAD+-abhangigen

Enzyme in verschiedenen Metabolismen verwendet. Durch Hemmung einer Aktivitat

der beteiligten Enzyme konnte man schließen, welche Funktion NAD+ in diesem

Fall besitzt. Ein Beispiel der NAD+-Modifikationen ist die spezifische Hemmung

der NAD+-Glycohydrolaseaktivitat von CD38, das nach der HIV-Infektion haufig

als Marker bei der B- und T-Zellaktivierung verwendet wird (HIV-Monitoring)[65].

Wall et. al.[66] wollte wirksame und spezifische Inhibitoren verfugen und versuchte

dadurch zu ermitteln, wie die cADPR-Aktivitat mit der biologischen Funktion von

CD38 in Zusammenhang steht. Das synthetisierte Carba-NAD+ und Pseudocarba-

NAD+ wurden in das Enzymassay eingesetzt und es wurde aus gemessenen IC50-

Werte[66] festgestellt, dass das Pseudocarba-NAD+ eine signifikante Aktivitat zur

Hemmung der einigen Enzyme, insbesondere zum menschlichen CD38 zeigte. Die

Ergebnisse[66] wiesen darauf hin, dass die ungewohnliche Stereochemie dieses Di-

nukleotids eine hochspezifische Pyridin-Dinukleotid-Bindungsstelle in den sensitiven

Enzymen beinhaltet und der Mechanismus der Hemmung die Bildung eines ternaren

Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplexes benotigt. Ein anderes Beispiel ist Synthese und

Evaluation der C-Nukleosid-Analoga vom Ribosylnicotinamid. Es wurde beschrie-

ben, dass solche Analoga mit verschiedenen biologischen Wirkungen von Anti-Tumor-

Aktivitaten ausstatten[67] und einige derzeit in klinischen Studien getestet sind[68].

15

Migaud et. al.[69] synthetisierte drei neuartige C-Nukleosid-Analoga vom Ribosylni-

cotinamid, um bestimmte Strukturmerkmale zur spezifischen Erkennung aufzuzeigen

und die Enzym- und Zellselektivitat zu optimieren. Im Screening wiesen zwei β-

NAD+-Analoga die selektive Hemmung der Dehydrogenaseaktivitat auf. Diese Wirk-

samkeit ist von der Substitutionsstruktur eines Thiophenrings abhangig. Die effekti-

ve Hemmung wird erzielt, wenn die Substitutionsgruppe als ein Wasserstoffbrucken-

Akzeptor wirkt und sie die elektrostatische Wechselwirkung des Sauerstoff-Atoms in

der Furanose kompensieren kann.

Aus einigen beschriebenen Bespielen wurde herausgefunden, dass NAD+ ein vielfalti-

ges Molekul ist. Die durch Einfugung der verschiedenen Funktionalitaten modifizier-

ten NAD+-Molekule sind ein erforderliches und sehr hilfreiches Werkzeug, das in den

enzymtiachen Untersuchungen verwendet wird um eigene Funktionen des Moleuls live

in lebenden Zellen wahrend der DNA-Reparatur oder in anderen biologischen Pro-

zessen zu beobachten und den Mechanismus der NAD+-beteiligten Reaktionen sowie

neue biologische Signalwege, die durch bekannte oder neue NAD+-konsumierende

Reaktionen reguliert sind, zu verstehen. Die herausgefundenen Resultate ermogli-

chen ein breites Spektrum von Anwendungen in der weiteren Grundlagenforschung

der chemischen Biologie und Medizin, der Medikamentenherstellung und der Krank-

heitsbekampfung.

1.4 ARTD1 und Poly(ADP-Ribos)ylierung

Poly(ADP-Ribos)ylierung ist eine kovalente PTM von Proteinen, die durch ARTs ka-

talysiert (Abbildung 1.4.1) wird. Vor 50 Jahren publizierten Chambon[70] und andere

Forscher erstmals eine neue Entdeckung, bei der ein nukleinsaureartiges Polymer aus

NAD+ entstand. Die genaue chemische Identitat des gebildeten Polymers, die zugrun-

de liegende enzymatische Reaktion und ihre Hochregulation durch DNA-Schadigung

16

wurden innerhalb weniger Jahre beschrieben und nun als Poly(ADP-Ribos)ylierung,

eine neue Art der PTM, benannt, die hauptsachlich im Zellkern stattfindet und an

vielen wichtigen zellularen Mechanismen[71] beteiligt ist.

Abbildung 1.4.1: Poly(ADP-Ribos)ylierung und Struktur der Poly(ADP-Ribose). Die einzelnen

ADPR-Einheiten sind uber α-O-glykosidische Bindungen verknupft. Die Linearitat des Polymers

erfolgt uber 1′′-2′-Verknupfungen und die Verzweigungen sind 1′′′-2′′ verlinkt.

1.4.1 ARTD1

ARTD1 (ADP-Ribosyltransferase Diphtherietoxin-ahnlich 1, fruher bekannt als PA-

RP-1) ist das am besten untersuchte Mitglied der ARTD-Familie[72]. ARTD1 ist

ein 113 kDa großes, 1014 Aminosauren langes, nukleares Protein, das in allen euka-

ryotischen Zellen vorkommt[72], und das hauptsachlich in der DNA-Reparatur und

an der Apoptose beteiligt ist. Diese ARTD-Familie besteht aus 18 Mitgliedern[5],

die sehr unterschiedliche Strukturen und Funktionen[72] besitzen. Bisher wurden nur

17

bei wenigen Mitgliedern ARTD1 (PARP-1), ARTD2 (PARP-2), ARTD3 (PARP-3),

ARTD4 (vPARP oder PARP-4), ARTD5 (Tankyrase-1 oder PARP-5a) und ARTD6

(Tankyrase-2 oder PARP-5b) nachgewiesen, dass sie Poly(ADP-Ribose)transferase-

Aktivitat[73] zeigen.

Abbildung 1.4.1.1: Schematische Darstellung der ARTD1 funktionellen Domanen[74].

ARTD1 wurde 1963 erstmals entdeckt[70] und 1966 aus Rattenleber isoliert[75]. Es

besteht strukturell aus drei Domanen: einer DNA-bindenden Domane (DBD) am

N-Terminus, einer Automodifikationsdomane und einer katalytischen Domane am

C-Terminus (Abbildung 1.4.1.1[74]). Die 46 kDa große DBD enthalt drei Zinkfinger-

Domanen und eine Kernlokalisierungsequenz (NLS: Nuclear Localisation Signal) mit

einer Schnittstelle fur die apoptotischen Enzyme Caspase 3 und Caspase 7 (DEVD-

Sequenz: Asp-Glu-Val-Asp). Die Zinkfinger-Domane-1 und Domane-2 sind verbrei-

tete DNA-Bindungsmotive, die strukturell jeweils 28 bzw. 30 Aminosauren enthal-

ten und in denen Zn2+-Ionen von drei Cystein- und einem Histidin-Rest (Cys21,

Cys24, His53, Cys56 sowie Cys125, Cys129, His159, Cys162)[76] komplexiert werden.

Sie vermitteln die spezifische Bindung des Enzyms an DNA-Strangbruche[76]. Fur

ARTD1 wurde die Aktivierung sowohl durch DNA-Einzelstrangbruche[77]als auch

DNA-Doppelstrangbruche[78] gezeigt. Jedoch ist die Bindungsfahigkeit der beiden

Zinkfinger-Domanen mit DNA-Strangbruchen unterschiedlich. Das Zinkfingermotiv-

1 interagiert hauptsachlich bei Doppelstrangbruchen, wahrend das Zinkfingermoti-2

18

hingegen nur mit DNA-Einzelstrangbruchen[79] bindet. Neben den beiden Zinkfinger-

Domanen ist die genaue Funktion vom Zinkfingermotiv-3 (Cys295, Cys298, Cys311,

Cys321) noch unklar. Die zentrale 22 kDa große Automodifikationsdomane ist die

Domane, an der sich ARTD1 vor allem an Glutamatresten (15 Glutamatreste wer-

den in dieser Domane konserviert) selbst poly(ADP-Ribosyl)iert. Zusatzlich enthalt

diese Domane ein BRCT (Breast Cancer Carboxaterminal)-Bindungsmotiv, das fur

Protein-Protein-Wechselwirkungen z.B. mit XRCC1[80] verantwortlich ist. In der ka-

talytischen Domane (54 kDa) befindet sich die NAD+-bindende Domane. Dort fin-

det die eigentliche Poly(ADP-Ribos)ylierung statt. Katalytische Aktivitaten dieser

Domane bringen die Synthese des ADPR-Polymers und dessen Bindung an Zielpro-

teine in Zusammenhang und bestehen aus NAD+-Hydrolyse, Initiation, Elongation,

Verzweigung und Beendigung des Polymers. Die katalytische Domane von ARTD1

ist sehr groß und kann allgemein in zwei Teile unterteilt werden: die Akzeptor-

Stelle[81] und die Donor-Stelle[81]. Die Akzeptor-Stelle ist mit der ADP-Einheit der

PAR-Ketten beschaftigt, wobei die Donor-Stelle mit NAD+ belegt ist. Die Donor-

Stelle besteht noch aus drei Untereinheiten: die Nicotinamid-Ribose-Bindungsstelle

(NI-Stelle)[81], die Phosphat-Bindungsstelle (PH-Stelle)[81] und die Adenin-Ribose-

Bindungsstelle (AD-Stelle)[81]. Die Region von 859 bis 908 wird allgemein als die

”PARP-Signatur“ bezeichnet, jedoch wurde sie nicht umfassend charakterisiert und

ihre genaue Funktion ist noch unbekannt.

1.4.2 Poly(ADP-Ribose)

Poly(ADP-Ribose) (PAR) ist ein nukleinsaureartiges Polymer, das als Signalmolekul

bei zellularem Stress[82] und an vielen anderen Prozessen beteiligt ist. PAR besitzt

eine sehr komplexe Struktur (Abbildung 1.4.1). Im Unterschied zu DNA oder RNA

erfolgt eine lineare Verknupfung der Monomere jedoch uber 1′′-2′-α-O-glykosidische

Ribose-Ribose-Bindungen[83]. Weiterhin kann PAR noch Verzweigungen durch ei-

ne Verknupfung der ADPR Einheiten uber 1′′′-2′′-α-O-glykosidische Bindungen[84]

19

bilden. Diese glykosidischen Bindungen fuhren zur Verlangerung und Verzweigung

der Ketten um bis zu 200-ADPR Einheiten. Die Verzweigungen treten jedoch im

Durchschnitt nach 20 ADPR-Einheiten auf und haben somit relativ regelmaßige

Abstande[72]. Nach Aktivierung der PAR-Synthese wird sich die Konzentration der

Polymere im Zellkern um das 100-500 fache erhohen[71]. Jedoch besitzt PAR in der

Zelle nur eine geringe Halbwertszeit in weniger als einer Minute[85], da gleichzei-

tig zur Synthese bereits der enzymatische Abbau des Polymers erfolgt. Der Abbau

von PAR erfolgt spezifisch durch die Poly(ADP-Ribose)-Glykohydrolase (PARG), die

PAR zwischen den beiden Ribose-Einheiten schneidet[86]. Als Abbauprodukt entsteht

freie ADPR. Die ADP-Ribose-Pyrophosphatase hydrolysiert frei stehende ADPR in

AMP und Ribose-5-Phosphat[87], die in der NAD+-Biosynthese und anderen Prozes-

sen recycelt werden konnen.

1.4.3 Poly(ADP-Ribos)ylierung und ihr Mechanismus

Zur ausfuhrlichen Ermittlung des molekularen Mechanismus der Poly(ADP-Ribos)yl-

ierung wurden zahlreiche Studien durchgefuhrt. Dabei wurde herausgefunden, dass

es sich bei PAR um ein sehr komplexes Biopolymer mit linearen und verzweigten

Ketten handelt. Bei der Initiierung der Poly(ADP-Ribos)ylierung brechen ARTD1

und ARTD2 die N-glykosidische Bindung des Nicotinamids im NAD+-Molekul auf

und ubertragen die erste ADP-Ribosyl-Gruppe auf einen Aminosaurerest von Glut-

amat (Glu)[88], Aspartat (Asp)[88] mit der Carboxylat-Seitenkette oder von Lysin

(Lys)[89] mit der Amino-Seitenkette von Zielproteinen. Zu den Proteinen gehoren z.B.

ARTD1 selbst[90], Histone[91], der Tumorsuppressor p53[92], DNA-Ligasen[93], DNA-

Polymerasen[94], DNA-Topoisomerasen[95] und DNA-abhangige Proteinkinasen[96]

sowie viele andere Proteine. Anschließend werden weitere ADPR Einheiten an 2-

OH Gruppen der beiden Riboseringe angebaut und diese distale Addition der ADPR

Einheiten uber 1′′-2′-α-O-glykosidische Bindungen bzw. 1′′′-2′′-α-O-glykosidische Bin-

dungen fuhrt zur schrittweisen Verlangerung und Verzweigung der PAR-Ketten[97].

20

Basiert auf Kristallstrukturdaten[98] zwischen dem katalytischen Fragment des En-

zyms (PARP-CF, Aminosaure: 662-1014) und dem carba-NAD+ wurde ein Modell

fur die Synthese von PAR dargestellt (Abbildung 1.4.3.1 und 1.4.3.2).

Abbildung 1.4.3.1: Schematische Darstellung des Mechanismus der Elongation der Poly(ADP-Ri-

bos)ylierung. NA: Nicotinamid. Der Aminosaurerest initiiert einen nukleophilen Angriff auf das

C1-Atom des Donors und verknupft es zum ersten ADPR. Wahrend der Elongation unterstutzt

der Aminosaurerest Glu988 den nachsten Angriff des Donors und die 1′′-2′-α-O-glykosidische Ve-

rknupfung der ADPR.

In der katalytischen Domane wird das Donor-NAD+ (Abbildung 1.4.3.1) in einer Form

gebunden, sodass die N-glykosidische Bindung destabilisiert wird und die Spaltung

dieser Bindung uber einen SN2-dissoziativen Mechanismus durch eine Ubergangs-

struktur eines ADP-Ribosyloxocarbeium-Ions[99] verlauft. In diesem Ubergangszust-

and[100] interagieren die 2′-OH Gruppe des Doners und des Akzeptors mit einer des

Carboxylsauerstoffatoms vom Aminosaurerest Glu988 und 3′-OH Gruppe des Ak-

zeptors in Wechselwirkung mit dem anderen Carboxylsauerstoff von Glu988. Gleich-

zeitig bildet diese OH-Gruppe noch eine Wasserstoffbrucke mit dem Aminosaurerest

21

Tyr907. Damit wird die Nukleophilie der 2′-OH Gruppe des Akzeptormolekuls erhoht

und ermoglicht den nukleophilen Angriff auf das C1-Atom des Donors. Um die Ver-

zweigungsstelle (Abbildung 1.4.3.2) zu erzeugen, muss das Akzeptormolekul um 180◦

rotieren[100]. Dadurch ruckt der neue Donor in die Akzeptorposition und die beiden

Molekule werden anschließend miteinander verknupft.

Abbildung 1.4.3.2: Schematische Darstellung des Mechanismus der Verzweigung der Poly(ADP-R-

ibos)ylierung. NA: Nicotinamid. In der Verzweigungsreaktion wird das Akzeptormolekul um 180◦

gedreht und damit ermoglichen das Donor- und Akzeptormolekul eine 1′′′-2′′-α-O-glykosidische

Verknupfung.

22

1.4.4 Identifikation der spezifischen ADPR-Akzeptorstellen

Wie bereits schon im vorherigen Abschnitt geschrieben wurde, spielt NAD+ in der

ARTD1 katalysierten Poly(ADP-Ribos)ylierung eine bedeutende Rolle. Die Komple-

xitat von erzeugter PAR stellt jedoch in der Erforschung eine Herausforderung dar:

1. Die Halbwertszeit von PAR betragt in vivo nur wenige Minuten und sie wird

danach durch PARG abgebaut.

2. Die Vielzahl der moglichen Modifikationsstellen innerhalb eines Substratprote-

ins erschwert die Identifizierung der Positionen der Modifikationen.

3. Unterschiedliche Langen des einzelnen Polymers und mehrere Verzweigungs-

punkte innerhalb jeder Kette steigern die Komplexitat des Systems signifikant.

Bestrebungen, direkte Zielproteine der ARTs sowie deren spezifische ADPR-Akzep-

torstellen zu identifizieren, mussen diese Komplexitat von PAR uberwinden, welche

die nachfolgenden Analysen erschweren. Die zurzeit entwickelten Herangehensweisen

machen sich zunutze, dass mutierte ARTs lediglich Mono(ADP-Ribos)ylierung ka-

talysieren. Sie benutzen proteinbasierte oder chemische Strategien zur Anreicherung

oder spalten PAR-Ketten vom Substrat ab, was zu einer Markierung fuhrt, oder sie

benutzen chemisch veranderte NAD+-Analoga:

1. Wie bereits im Abschnitt 1.4.3 geaußert, spielt der Aminosaurerest Glu988 eine

wichtige Rolle in der Poly(ADP-Ribos)ylierung. Liu et. al.[90] mutierte diesen

Glutaminsaure-Rest zu Glutamin. Dadurch kann der ARTD1-E988Q-Mutant

nur ADPR-Monomer in der Reaktion bilden und die mono(ADP-Ribos)ylierte

Automodifikationsdomane wurde anschließend durch Massenspektrometrie ana-

lysiert und die Modifikationsstellen innerhalb der Domane identifiziert.

2. Goodlett et. al.[101] verwendete die Phosphodiesterase nach Automodifikati-

on von ARTD1, um die Phosphodiesterbindung in PAR zu spalten. Anschlie-

ßend wurde ARTD1 durch Trypsin verdaut. Ein entstandenes Peptid betrug

23

ein Ribose-5′-Phosphat, wenn die Aminosaure innerhalb des Peptids bereits

poly(ADP-Ribos)yliert wurde. Durch Vergleich der Peptidmasse vor und nach

Poly(ADP-Ribos)ylierung in der Massenspektrometrie ist eine Identifizierung

der Modifikationsstellen von ARTD1 moglich. Durch dieses Verfahren wurden

mehrere Modifikationsstellen von ARTD1 gefunden.

3. Eine andere Methode[102] war, dass die entstandene Esterbindung zwischen

Aminosauren und PAR nach Automodifikation durch einen nukleophilen An-

griff vom Hydroxylamin gespalten und ARTD1 anschließend verdaut wurde. Der

Unterschied von 15 Da vor und nach Poly(ADP-Ribos)ylierung in der Massen-

spektrometrie zeigt auch eine Moglichkeit zur Identifizierung der Modifikations-

stellen auf.

4. Die Arbeitsgruppe von Lin synthetisierte zwei NAD+-Analoga[62], die eine Pro-

pargylgruppe auf die 6-Position bzw. 8-Position des Adenosins enthalten. Nach

der Click-Reaktion konnen die in vitro auf Proteine ubergetragenen ADPR-

Einheiten und die entsprechenden Proteine durch fluoreszierende Farbstoffe in

SDS-Gel visuell dargestellt werden. Außerdem konnen die ADPR-markierten

Substratproteine[64] durch Biotin-Affinitatstag herausgefischt und separat iden-

tifiziert werden.

Obwohl jede Methode im eigenen Fall funktionierte, gibt es jedoch noch zu beach-

tende Punkte: In der Methode von Liu wurde nur das mutierte Enzym untersucht.

Man weiß nicht, ob die durch Mutation erhaltenen Ergebnisse in der Automodifi-

kationsdomane des mutierten Enzyms auch direkt ins naturliche Enzym ubertragen

werden konnten. Zwar war die Untersuchungsstrategie von Goodlett fur das naturli-

che Enzym verwendbar, aber die Durchfuhrung des Experiments ist sehr arbeits-

aufwendig. Außerdem entstanden nach der Verdauung vom Trypsin nicht nur ein

Ribose-5′-Phosphat, sondern je nach der Schnittstelle noch viele anderen Fragmen-

te, wie zum Beispiel 5′-Adenosinmonophosphat (5′-AMP), Phosphoribosyladenosin-

monophosphat (PRAMP) oder Diphosphoribosyladenosinmonophosphat (PR2AMP).

24

Diese verdauten Fragmentmischungen aus Peptiden und Phosphaten erschweren die

Ergebnisanalyse in der Massenspektrometrie. Die dritte Methode war auch allgemein

tauglich, jedoch konnen nur die Modifikationsstellen mit Esterbindung identifiziert

werden. Wo das Lysin mit ADPR eine Form von Schiffscher Base[103] bildet, ist die

Untersuchung der Modifikationsstellen von Lysin in diesem Fall unmoglich. Damit

ist das Untersuchungsergebnis nicht vollstandig. Die Entwicklung von Lin′s Arbeits-

gruppe war zwar sehr erfolgreich fur die visuelle Darstellung und Herausfischung der

Substratproteine, jedoch waren die NAD+-Analoga wegen der Komplexitat der ent-

standenen PAR nicht in der Lage, die spezifischen ADPR-Akzeptorstellen innerhalb

ARTD1 oder eines anderen Substratproteins zu identifizieren.

Fur weitere Erforschung dieses Gebiets werden noch mehr geeignete Methoden mit

vielfaltigen Nutzungsmoglichkeiten oder einfache und taugliche Werkzeuge nachge-

fragt werden.

1.5 ARTD1 und DNA-Reparatur

1.5.1 Uberblick uber ARTD1 und DNA-Reparatur

Die DNA ist die Tragersubstanz der genetischen Information. Ein Schaden in der

DNA kann jedoch den gesamten Organismus in Gefahr bringen, wenn dadurch der

genetische Code fur die Synthese eines funktionell bedeutenden Proteins verandert

wird. Dies kann zum Tod des Organismus fuhren oder zu einem zunehmenden Ver-

lust von zellularen Funktionen sowie zu einem unkontrollierten Zellwachstum, wie

es zum Beispiel bei Krebszellen der Fall ist[8]. Es treten verschiedene Arten von

DNA-Schaden auf (Abbildung 1.5.1.1[104]), z.B.: die Hydrolyse einer Nukleobase

oder der Austausch gegen andere, fehlende oder zusatzliche Nukleotide, die Quer-

vernetzung von DNA-Strangen oder Bruche im Zucker-Phosphat-Ruckgrat[104]. Es

entstehen etwa 104 - 105 DNA-Schaden pro Zelle pro Tag[104]. Fur die Reparatur

25

von DNA-Schaden, wie die Desaminierung, Oxidation oder Alkylierung der Nukleo-

basen sowie DNA-Einzelstrangbruche (SSB) ist hauptsachlich die Basenexzisionsre-

paratur (BER)[105] zustandig. Großraumige DNA-Schaden, wie die Pyrimidindimere

werden vor allem durch die Nukleotidexzisionsreparatur (NER)[106] beseitigt. Dop-

pelstrangbruche werden durch das nicht-homologes End-Joining (NHEJ)[107] oder die

homologe Rekombination (HR)[108] repariert. Die Mismatch-Reparatur (MMR)[109]

korrigiert die in der DNA-Replikation entstandenen Basenfehlpaarungen.

Abbildung 1.5.1.1: DNA-Schaden durch chemische Substanzen, spontane Mutationen, reaktive

Sauerstoffspezies, UV-Strahlung oder fehlerhafte Replikation und deren entsprechenden Repara-

turmechanismen[104].

ARTD1 ist gut bekannt durch die Beteiligung an DNA-Reparaturen. Die DBD der

ARTD1 bindet DNA-Bruche, die direkt oder indirekt durch Oxidation, Alkylierung,

Basenexzision und viele andere Arten von DNA-Schaden erzeugt werden. Im Ver-

gleich zum Ruhezustand von ARTD1, steigert diese Protein-DNA-Interaktion die

Aktivitat der katalytischen Domane auf das mehrere Hundertfache. Infolgedessen

werden ADPR-Einheiten auf verschiedene Zielproteine ubertragen. Diese PTM re-

krutieren andere Proteine und dadurch ermoglichen die beteiligten Enzyme Zugriff

auf und Reparatur der beschadigten DNA-Stellen. Die DNA-Reparaturmechanismen

und ihre zustandigen ARTD1 Funktionen[110] wurden in der folgenden Tabelle (Ta-

belle 1.5.1.1[110]) zusammengefasst.

26

Tabelle 1.5.1.1: Beteiligung von ARTD1 in DNA-Reparaturmechanismen[110].

DNA-Reparaturmechanismus ARTD1 Funktion

Basenexzisionsreparatur (BER)

Bindung an der AP-Stelle, Rekrutierung

des Reparaturproteinkomplexes durch

ARTD1 Automodifikation

Einzelstrangbruch-Reparatur (SSBR)

Rekrutierung des Reparaturprotein-

komplexes durch ARTD1 Automodifi-

kation

Nukleotidexzisionsreparatur (NER) ADP-Ribosylierung von XPA

Mismatch-Reparatur (MMR) ADP-Ribosylierung von MSH6

Nicht-homologes End-Joining (NHEJ)

Erhohung der ARTD1 Aktivitat durch

Ku, ADP-Ribosylierung und Aktivie-

rung von DNA-PKCS

Homologe Rekombination (HR)

Rekrutierung von Mre11 durch ARTD1

Automodifikation

Aktivierung der ATM-Signalubertra-

gung durch PAR

1.5.2 Einfluss von ARTD1 in Basenexzisionsreparatur und

Einzelstrangbruchen

Bei der BER wird ein Fehler in der Basenpaarung in einer der beiden DNA-Strange

behoben. Es gibt zwei Arten von Fehlern: DNA-Einzelstrangbruche oder Modifika-

tionen der Nuklobasen. Ein bedeutender Unterschied zwischen beiden besteht darin,

dass in einem Fall freie DNA-Einzelstrangbruche in der Zelle vorliegen, die von dem

Reparaturproteinenkomplex (ARTD1, XRCC1) detektiert werden mussen. Beim an-

deren dagegen werden Einzelstrangbruche als enzymatische Intermediate wahrend der

27

Reparatur erzeugt, wenn der Schaden (fehlerhafte Base, apurine/apyrimidine (AP)-

Stelle) bereits durch DNA-Glykosylasen und AP-Endonukleasen detektiert wurde.

An der Beseitigung von DNA-Einzelstrangbruchen spielen neben verschiedenen Re-

paraturproteinen ARTD1 und XRCC1 eine zentrale Rolle. ARTD1 erhoht durch Bin-

dung an DNA-Einzelstrangbruche seine Aktivitat und automodifiziert sich dadurch

selbst. Die Poly(ADP-Ribos)ylierungsaktivitat der ARTD1 induziert die Rekrutie-

rung des DNA-Reparaturproteins XRCC1 an dem DNA-Schadensort. XRCC1 wird

ebenfalls mit PAR modifiziert. Die anderen Reparaturproteine wie z.B.: PNK, Polβ

und DNA-Ligase III bilden mit ARTD1 und XRCC1 einen ganzen Reparaturkompl-

ex[111], der die Beseitigung des Einzelstrangbruches zum Ziel hat. Dann erfolgt die

Ligation der Reparaturstelle (Abbildung 1.5.2.1[112]).

Im Vergleich der DNA-Einzelstrangbruche untereinander werden die durch Oxidation

bzw. Alkylierung modifizierten Nukleobasen uber spezifische DNA-Glykosylasen er-

kannt und ausgeschnitten, wodurch AP-Stellen gebildet werden. Es existieren zum

Mechanismus keine unmittelbaren freien Einzelstrangbruche, die zur Aktivierung

der ARTD1 fuhren. Die apurinische/apyrimidinische Endonuklease 1 (APE-1)[113]

schneidet die AP-Stelle am 5′-Ende ein. Nach Einbau von einem oder mehreren Nu-

kleotiden durch Polβ ligiert DNA-Ligase III die Strangbruchsstelle. ARTD1 scheint

fur den Ablauf des BER damit nicht von essentieller Bedeutung zu sein. Neuste

Erkenntnisse[114] weisen darauf hin, dass ARTD1 an der AP-Stelle bindet. Obwohl

ARTD1 fur die PAR-Synthese nach Bindung an der AP-Stelle des DNA-Strangs nur

schwach aktiviert ist, wird sie aber nach dem Einschnitt durch APE-1 im Strang stark

aktiviert. Aufgrund der Bindung an der AP-Stelle konnte ARTD1 bereit sein, sich an

der Reparatur der modifizierten Nukleobasen auch zu beteiligen.

28

Abbildung 1.5.2.1: Schematische Darstellung des Mechanismus der Reparatur von SSB[112].

Im Verlauf von BER entscheidet der Mechanismus sich noch nach”short patch BER“

und”long patch BER“. Aus diesem Grund stellt sich die Frage, wie die Reparatur

zwischen”short patch BER“ und

”long patch BER“ reguliert wird? Spater zeigten

die herausgefundenen Ergebnisse, dass der Verlauf des BER-Mechanismus abhangig

von der beteiligten DNA-Glykosylase ist. Die bifunktionale DNA-Glykosylase[113]

mit ihrer intrinsischen AP-Lyase-Aktivitat verursacht noch eine Spaltung vom Deox-

yribose-5′-phosphat (dRP)-Rest an der AP-Stelle und die Reparatur erfolgt hauptsa-

chlich uber”short patch BER“. Die monofunktionale DNA-Glykosylasen[113] exzi-

diert die modifizierte Nukleobase, wobei eine intakte AP-Stelle zuruckgelassen wird,

die uber beide Wege repariert wird. Außerdem wurde in zellularen Untersuchun-

gen noch herausgefunden, dass eine verringerte Aktivitat von DNA-Ligasen und eine

29

erhohte Polβ-Aktivitat bei einer erniedrigten ATP-Konzentration vorhanden sind.

Diese Erhohung der Polβ-Aktivitat wurde zu dem”long patch BER“ durch den zel-

lularen ATP-Mangel verursacht. Die Hinweise liefern den Einfluss auf die Regulation

des BER-Mechanismus durch die ATP-Konzentration[115].

1.5.3 Einfluss von ARTD1 in der Doppelstrangbruchrepara-

tur

DNA-Doppelstrangbruche (DSB) induzieren besonders schwerwiegende Schaden und

konnen potenziell todliche Auswirkungen haben, z.B.: chromosomale Aberrationen

oder Zelltod. Die beiden wichtigsten Mechanismen zur Reparatur von DSB sind das

nicht-homologe End-Joining (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR).

Das nicht-homologe End-Joining (NHEJ) (Abbildung 1.5.3.1 links[116]) basiert auf

der direkten Verknupfung von beiden Enden des DSBs, wobei Fehler wie Deletio-

nen oder Insertionen auftreten konnen. Deshalb wird der Reparaturmechanismus als

prinzipiell ungenau bezeichnet. Nach Erkennung des DNA-DSBs bindet zunachst das

Ku70/Ku80-Heterodimer[117] an die freiliegenden DNA-Enden und verhindert einen

unkontrollierten Abbau durch Exonukleasen. Anschließend wird die Aktivitat der

katalytischen Untereinheit der DNA-PK (DNA-PKCS)[118] durch die kovalente Mo-

difikation von ARTD1 stimuliert. DNA-PKCS bildet mit dem Ku-Heterodimer das

aktive DNA-PK-Holoenzym[119]. Diese Modifikation von DNA-PKCS durch ARTD1

konnte eine wichtige Rolle bei der Erhohung der Interaktion zwischen DNA-PKCS

und dem Ku-Heterodimer spielen. Jedoch ist die genaue Rolle von ARTD1 in NHEJ

noch unklar. Die Aufgabe des DNA-PK-Komplexes[120] ist, dass die Bruchstelle in di-

rekter Nachbarschaft gehalten wird, um sofort wieder verbunden werden zu konnen.

Der Enzymkomplex aktiviert dann ihre Serin/Threonin-Kinaseaktivitat und fuhrt

zu ihrer Autophosphorylierung, wahrend Enzyme wie z.B: Artemis die beschadig-

30

te DNA fur die Ligation vorbereiten. Im nachsten Schritt aktiviert die DNA-PK

den XRCC4/LigaseIV-Komplex[121], welcher die Bruchenden ligiert. Ein weiterer

NHEJ-Faktor XLF[122] konnte spater noch identifiziert werden, welcher ebenfalls

mit dem XRCC4/LigaseIV-Komplex[123] interagiert, so dass die DSB-Enden durch

die Interaktion[123] zwischen XLF und XRCC4 und der resultierenden Bruckenbild-

ung[124] in nachster Nahe zusammengehalten werden. Außerdem erhoht XLF die

Effizienz der Ligation[125] vom XRCC4/LigIV-Komplex in vitro.

Die homologe Rekombination (HR) (Abbildung 1.5.3.1 rechts[116]) ist eine stets feh-

lerfreie Reparatur von DSB. Jedoch steht dieser Reparaturweg nicht wie das NHEJ

wahrend des gesamten Zellcyclus zur Verfugung. Fur die HR dient ein ungeschadigtes

Schwesterchromatid als Schablone fur die Reparatur. Jedoch muss diese DNA Sequenz

in unmittelbarer Nahe des Bruchs vorliegen. Deshalb kann die HR in hoheren Euka-

ryoten nur in der S- und G2-Phase des Zellcyclus[126] stattfinden. Bei der HR werden

DSB zunachst in 5′-3′-Richtung durch den MRN-Proteinkomplex[127] aus Mre11,

Rad50 und Nbs1 erkannt. Der MRN-Komplex zusammen mit dem CtIP-Komplex

kommt danach zur nukleolytischen Prozessierung der Bruchenden, so dass einzel-

strangige 3′-Uberhange entstehen, die durch RPA stabilisiert werden. MRN aktiviert

auch die ATM-Signalubertragung[128], einschließlich der DNA-Schadensantwort, die

den Zellcycluseinhalt einleitet. BRCA2[129] vermittelt anschließend den Austausch

vom RPA zu der Rekombinase Rad51 an den einzelstrangigen Uberhangen. Mit Un-

terstutzung durch Komponenten der Rad52-Epistasisgruppe erfolgt im Anschluss die

Stranginvasion dieses Nukleoprotein-Filaments in den DNA-Doppelstrang der un-

geschadigten Schwesterchromatide[130]. Das 3′-Ende der geschadigten DNA wird un-

ter Zuhilfenahme der Matrize des ungeschadigten Strangs durch die DNA-Polymerase

I verlangert. Nach der Ligation der offenen Enden durch die Ligase I wird Heterodup-

lex-DNA erzeugt und die resultierenden Holliday-Verzweigungen[131] werden durch

Resolvasen behoben. Die Funktion von ARTD1 in diesem Prozess wurde intensiv un-

tersucht, jedoch konnte nur ein Modell vorgeschlagen werden, dass ARTD1 etwas zu

31

Replikationsgabeln durch Bindung der einzelstrangigen Uberhange und zur Rekru-

tierung vom Mre11[132] beitragen konnte.

Abbildung 1.5.3.1: Schematische Darstellung des Mechanismus des NHEJs (links)[115] und der HR

(rechts)[116].

Eine langjahrige Frage im ARTD-Bereich war außerdem, ob die Poly(ADP-Ribos)yl-

ierung ein richtiger Regler beim fruhzeitigen DNA-Schaden-Signalweg sein konnte.

Ein Hinweis darauf zeigte, dass das Zelluberleben durch chemische Hemmung oder

genetische Storung von ARTD1 wesentlich verringert wird, besonders in Verbindung

mit genetischen Erkrankungen, bei denen eine HR beeintrachtigt ist. Es wurde die

Hypothese aufgestellt, dass die fruhzeitige PAR-abhangige Signalantwort durch ATM

beeinflusst wird. In der Studie wurde festgestellt, dass die Hemmung der Aktivitat

von ARTD durch den Inhibitor unbestreitbar die fruhzeitige DNA-Schaden-induzierte

32

Phosphorylierung der ATM-abhangigen Substrate[128] stort.

Zur Klarung der genauen Rolle von ARTD1 in der Doppelstrangbruchreparatur be-

darf es noch weiterer Untersuchungen um exakte Vorstellungen uber die zellularen

Vorgange zu erhalten.

1.6 ARTD1 Inhibitoren

1.6.1 ARTD1 Inhibitoren und ihre Entwicklung

ARTD1 Inhibitoren sind eine Gruppe von pharmakologischen Inhibitoren[133] des En-

zyms. Strukturell besitzen alle bekannten ARTD1 Inhibitoren einen ahnlichen Aufbau

wie NAD+ und konkurrieren somit mit dem naturlichen NAD+ Substrat im aktiven

Zentrum des Enzyms.

Abbildung 1.6.1.1: Strukturanforderungen fur neue, wirksame ARTD1 Inhibitoren[134].

Beim Design von neuen, wirksamen ARTD1 Inhibitoren sind folgende Strukturanford-

erungen[134] berucksichtigt (Abbildung 1.6.1.1[134]):

i) Ein effizienter Inhibitor erhalt ein elektronenreiches aromatisches Ringsystem,

einschließlich einer Carboxamidgruppe mit mindestens einem Wasserstoff an

dem Amidstickstoff.

33

ii) Die Verbindung sollte auch eine nicht spaltbare Bindung in 3-Position in Bezug

auf Carbonsaureamidgruppe haben.

iii) Die Carboxamideinheit sollte eingeschrankt werden, um die cis-(oder anti -)

Konfiguration fur die erforderliche Wasserstoffbruckenbindung einschließlich der

kritischen Reste in die NAD+-Bindungsstelle ubernehmen zu konnen.

Die meisten ARTD1 Inhibitoren wurden konstruiert um die Substrat-Enzym-Wechs-

elwirkungen von NAD+ mit ARTD1 nachzuahmen. Das Nicotinamid[135] wurde 1971

als ein schwacher Inhibitor von ARTD gefunden (IC50 = 210 µM). Der zuerst umfang-

reich getestete Stoff ist das 3-Aminobenzamid[136] (3-AB, IC50 = 33 µM , Abbildung

1.6.1.2). Er wurde 1980 entwickelt und kann als kompetitiver Inhibitor wirken und die

NAD+-Bindungsstelle an der katalytischen Domane des Enzyms blockieren. Jedoch

wurde in weiteren Studien gezeigt, dass bei hoheren Konzentrationen von 3-AB die

de novo Synthese von Purinen gehemmt wird und die Zellteilung in Zellkulturen[137]

stoppt. In der zweiten Generation wurden Nicotinamid-basierende Molekule mit Ziel

der Fixierung der Carboxamidgruppe in der gewunschten cis-Konformation fur eine

Wechselwirkung mit der NAD+-Bindungsstelle von ARTD1 angelegt. NU1025[138]

(8-Hydroxy-2-methylchinazolin-4-[3H]-on, IC50 = 400 nM , Abbildung 1.6.1.2) und

PD128763[138] (3,4-Dihydro-5-methylisochinolin, IC50 = 420 nM , Abbildung 1.6.1.2)

sind in dieser Zeit entwickelte ARTD1 Inhibitoren. In Studien wurde herausgefunden,

dass diese zwei Verbindungen ungefahr 50-mal effektiver[139] als 3-AB sind.

Abbildung 1.6.1.2: Struktur der verwendeten ARTD1 Inhibitoren.

34

1.6.2 Anwendungen der ARTD1 Inhibitoren

ARTD1 ist fur die Reparatur von DNA-Schadigungen verantwortlich. Bei gehemm-

ter ARTD1-Aktivitat kann die Reparatur nicht mehr durchgefuhrt werden und die

fehlerhaften Zellen fuhren zum Zelltod[134]. Als Zelltod werden hauptsachlich zwei

verschiedene Formen unterschieden: Apoptose und Nekrose. Die Apoptose ist eine

Form des programmierten Zelltods und die Nekrose ist ein unkoordinierter Zelltod

durch Schadigung der Zellstruktur. Bei leichten Schaden konnen Proteine die ent-

sprechende Reparatur durchfuhren und die Zelle uberlebt. In anderen Fallen sind die

Schaden, die z.B. durch alkylierende Agenzien (EMS, MMS und MNNG) oder oxi-

dativen Stress (Peroxide) entstehen konnen, so stark dass die DNA-Reparatur nicht

mehr genugt. ARTD1 wird zusammen mit anderen Reparaturenzymen ausgeschaltet

um den Zelltod einleiten zu konnen. Bei der Krebsbehandlung sind verschiedene For-

men von Krebs stark von ARTD1 abhangig als normale Zellen. Deshalb ist ARTD1

ein attraktives Ziel fur die Krebstherapie[140].

Die ARTD1 Inhibitoren haben zwei mogliche therapeutische Anwendungen fur die

Arzneimittelforschung: In der ersten Anwendung sind sie als Chemopotentiator[141]

bekannt. Um Krebszellen schnell zu zerstoren, zielen viele Anti-Krebstherapeutika auf

die Hemmung von ARTD1, und die dadurch verursachten DNA-Schaden, als Wirk-

mechanismus ab. ARTD1-Inhibitoren in Kombination mit DNA-bindenden Chemo-

therapeutika oder eine Bestrahlung stellen eine geeignete Strategie in der Krebsch-

emotherapie[134] dar (Abbildung 1.6.2.1[134]), z.B.: DNA-Methylierungsmittel ver-

ursachen SSB und die BER ist erforderlich. ARTD1 macht Krebszellen gegen Me-

thylierungsmittel resistent[142]. Um die BER zu deaktivieren, werden in diesem Fall

ARTD1 Inhibitoren eingesetzt. Die von Methylierungsmittel verursachte SSB konnen

nicht repariert werden und fuhren zu DSB. Wenn die HR durch Zugabe von SSB

uberwaltigt wird, tritt der Zelltod ein.

35

Abbildung 1.6.2.1: Pharmakologische Hemmung von ARTD1 in der Krebschemotherapie[134].

Eine niedrige Dosierung von DNA-bindenden Arzneimitteln kann milde DNA-Schaden induzieren

und ARTD1 aktivieren. In diesem Fall kann die Verwendung von ARTD1-Inhibitoren in Kombin-

ation mit DNA-bindenden Chemotherapeutika die DNA-Reparatur effizient blockieren und ansc-

hließend zum apoptotischen Zelltod fuhren. Eine hohe Arzneimitteldosierung kann massive DNA-

Schaden induzieren und ARTD1 uberaktivieren. Die anschließende Erschopfung des NAD+- und

ATP-Speichers kann zum nekrotischen Tumorzelltod fuhren. In diesem Fall kann die Verwendung

von ARTD1-Inhibitoren in Kombination mit DNA-bindenden Arzneistoffen die Uberaktivierung

von ARTD1 blockieren und den Tumorzelltod von Nekrose zur Apoptose geschaltet werden.

Zweitens konnen ARTD1 Inhibitoren als einzelner Wirkstoff fur Tumorarten, die be-

reits in bestimmten Arten der DNA-Reparaturmechanismen fehlerhaft sind, verwen-

det werden. Im Jahr 2005 wurden Ergebnisse von zwei unabhangigen Gruppen uber

die Empfindlichkeit der BRCA1/2[143] mangelhaften Zelllinien mit ARTD1 Inhibi-

toren veroffentlicht. BRCA1/2 sind wichtige Proteine fur die DSB-Reparatur durch

die fehlerfreie HR[144]. Die Mutationen von beiden Proteinen pradisponieren Brust-

und andere Krebsarten[143]. ARTD1 ist ein zustandiges Protein fur die Reparatur

von SSB. Wahrend die Hemmung von ARTD1 eine Erhohung der SSB verursacht.

Die uberwiegende SSB fuhrt schließlich uber den Zerfall der Replikationsgabel[145]

zu mehreren DSB. Diese Erhohung der DSB in Tumoren mit BRCA1/2-Mutationen

36

fuhrt zu chromosomaler Aberration und Instabilitat des Genoms und die Tumorzellen

sterben. Normale Zellen konnen durch die ARTD1 Inhibitoren[146] uberleben, weil

sie ihre DNA nicht so oft wie Krebszellen replizieren konnen und ein Fehlen von je-

der mutierten BRCA1/2 noch entsprechend repariert werden kann. Dieses Phanomen

wird als synthetische Letalitat bezeichnet (Abbildung 1.6.2.2[147]).

Abbildung 1.6.2.2: Mechanismus der von ARTD (PARP) Inhibitoren erzeugenden Tumor-selekti-

ven synthetischen Letalitat[147]. ARTD1 Inhibitoren hemmen die DNA-Reparatur von SSB und

diese SSB werden durch DNA Replikation in DSB uberfuhrt. Die HR-fehlerhafte Tumorzellen

sterben wegen der beeintrachtigten HR-vermittelten DNA-Reparatur. Die normalen Zellen mit

regularer HR-Funktion konnen DSB reparieren und uberleben.

Es gilt die Regel, dass ARTD1 Inhibitoren an der NI-Stelle, teilweise an der Akzeptor-

Stelle binden und nicht an der PH-Stelle oder AD Stelle der katalytischen Domane.

Aktuelle ARTD1 Inhibitoren sind in der Entwicklung der dritten Generation. Sie

haben eine großere Wirksamkeit und Spezifitat fur ARTD1. Diese neuen resultieren-

den ARTD1 Inhibitoren sind bis zu 1000-mal starker als die klassischen Benzamide

und erhohen die in vitro Zytotoxizitat von DNA monofunktionellen Alkylierungs-

mitteln und ionisierender Strahlung. Allerdings ist es wichtig, mutmaßliche Nachteile

37

der Anwendungen von ARTD1 Inhibitoren bei der Behandlung der menschlichen

chronischen Pathologien wie Krebs in Kauf zu nehmen. Eine große Anzahl von Si-

cherheitsproblemen z.B. wie Pharmakokinetik, Pharmakodynamik, Toxizitat, orale

Bioverfugbarkeit, langfristige Auswirkungen und Sicherheit bei der Anwendung am

Menschen, sowie Stoffwechselprozesse mussen vor klinischer Erprobung gelost werden.

38

Kapitel 2

Aufgabenstellung

Im Rahmen dieser Dissertation sollten NAD+-Analoga entwickelt werden, die in der

Poly(ADP-Ribos)ylierung und anderen vielfaltigen NAD+-konsumierenden Reaktio-

nen universal und tauglich verwendbar sind. Als Ziele fur dieses Vorhaben sollten neue

NAD+-Analoga synthetisiert, die effizient durch Wildtyp ARTD1 eingebaut werden

und a) einen Affinitatsmarker tragen, der Manipulationen wie Markierungen und An-

reicherungen von Proben ermoglicht und b) durch die Abwesenheit der benotigten

Hydroxylgruppe zum PAR-Kettenabbruch fuhren.

Wie bereits schon in der Einleitung erwahnt, spielt NAD+ nicht nur eine bedeutende

Rolle im Katabolismus der Zelle, sondern es hat noch viele signifikante Funktionen in

biochemischen Prozessen. Insbesondere ist NAD+ als Substrat in der ARTD1 kataly-

sierten Poly(ADP-Ribos)ylierung beteiligt. Die entstandene PAR ist als ein Signalmo-

lekul an DNA-Reparatur, genomischer Stabilitat, Regulation der Transkription vieler

anderer zellularer Prozesse beteiligt. Direkte Zielproteine der ARTs, sowie deren spe-

zifische ADPR-Akzeptorstellen zu identifizieren, mussen diese Komplexitat von PAR

uberwinden, welche die nachfolgenden Analysen erschweren. Anhand der neu entwi-

ckelten NAD+-Analoga (Abbildung 2.1) wollte man zuerst wissen, welche Rolle die

Modifikationen an den unterschiedlichen Positionen des Adenins fur die Aktivitat des

NAD+-Molekuls als Substrat in der ARTD1 katalysierten Poly(ADP-Ribos)ylierung

39

spielen konnen. Danach wird noch der Mechanismus der Poly(ADP-Ribos)ylierung

durch eine systematische Desoxygenierung des Adenosins untersucht, um zu erfahren,

wie die 2′- und 3′-OH Gruppe die Entstehung von PAR beeinflussen konnen. Aus den

erhaltenen Ergebnissen wollte man auch noch die NAD+-Analoga als maßgeschnei-

derte chemische Werkzeuge verwenden, um eine Untersuchungsstrategie zu entwickeln

und damit zu entdecken, welche Substratproteine sowie welche Aminosauren inner-

halb der Proteine durch ADPR post-translational modifiziert werden konnen. Die

Vorteile bestehen darin, dass diese entwickelte Strategie nicht nur die Komplexitat

von PAR uberwindet, sondern sie auch universal und tauglich zur Identifizierung der

Zielproteine der ARTs und deren spezifischen ADPR-Akzeptorstellen verwendbar ist.

Abbildung 2.1: Struktur der NAD+-Analoga. Eine Alkingruppe (rote Markierung) wurde an der

C2-Postion der Verbindung 1, 3-5 und an der C7-Position der Verbindung 2 eingebracht. Außer-

dem wiesen die Verbindungen 1, 3-5 eine systematische Desoxygenierung (blaue Markierung) auf.

40

Kapitel 3

Ergebnisse und Diskussion

Da bisher nur wenig uber das Substratspektrum[148] von ARTs bekannt ist, sollten

neue NAD+-Analoga mit einer Alkingruppe an der Nukleobase sowie systematischer

Deoxygenierung der Hydroxylgruppen am Adenosin entwickelt werden. Dazu soll-

te die Alkingruppe zuerst an der C2- oder C7-Position des Adenosins eingebracht,

sowie anschließend in PAR eingefuhrt werden, um zu erkennen, welche Modifikati-

on vom naturlichen ARTD1 effizienter eingebaut wird. Anschließend soll die syste-

matische Desoxygenierung am Adenosin angebracht werden. Diese Modifikationen

ermoglichen, den Einfluss der jeweiligen OH-Gruppe auf die Aktivitat von ARTs

(d.h., ARTD1) zu untersuchen. Nach enzymatischen Reaktionen soll Click-Chemie

durchgefuhrt werden, um einen Fluoreszenzfarbstoff (Sulfo-Cy5-Azid) oder einen Af-

finitatstag (Biotin-Azid) zu den Alkin-modifizierten ADPR-Einheiten, die aus dem

Einbau der NAD+-Analoga abgeleitet werden, zu konjugieren. Danach soll das am

besten geeignete NAD+-Analogon in der Entwicklung der Strategie fur die Identi-

fizierung der Zielproteine der ARTs sowie deren spezifische ADPR-Akzeptorstellen

eingesetzt werden.

41

3.1 Synthese vom C2- oder C7-modifizierten NAD+

3.1.1 Syntheseplanung

Bei der Synthese C2- oder C7-modifizierter NAD+ konnen die Zielmolekule 1[149]

und 2 durch mehrere Synthesestufen erreicht werden (Abbildung 3.1.1.1): Sie konnen

aus den Monophosphaten[149] uber eine Kupplung an β-Nicotinamidmononukleotid

(β-NMN) hergestellt werden. Die Synthese von Monophosphaten werden nach der

Methode von Kovacs und Otvos[150] aus den Nukleosiden[149, 151] durchgefuhrt.

Die Nukleoside konnen anhand der Sonogashira-Reaktion[152] mit den Iodverbindu-

ngen[153, 154] sowie einem TMS-geschutzen Alkin an der C2- bzw. C7-Position ver-

knupft werden. Die Molekule Iodverbindungen werden nach literaturbekannten We-

gen aus den kommerziell verfugbaren Startmaterialien zur Verfugung gestellt.

Abbildung 3.1.1.1: Retrosynthese der C2- oder C7-modifizierten NAD+.

42

3.1.2 Ergebnisse der Synthese

Die Synthese der Verbindung 10[154] (Abbildung 3.1.2.1) wurde von kommerziell

erhaltlichen Guanosin 6 gestartet. Die drei Hydroxylgruppen wurden durch Acetyl-

gruppen fast quantitativ geschutzt. Anschließend wurde die Substanz 7[153] mit frisch

destilliertem Phosphoroxychlorid, N,N -Dimethylanilin und getrocknetem Tetrame-

thylammoniumchlorid zu ihrer chlorierten Form 8[153] umgesetzt. Die Aminogruppe

des mit ausreichender Ausbeute erhaltenen Produkts 8 wurde im nachsten Schritt

durch eine Sandmeyer-Reaktion[155] in die Iodgruppe uberfuhrt. Nach vollstandiger

Entschutzung der Acetylgruppen sowie der Substitution des Chlors durch Ammoniak

der Substanz 9[153] unter basischen Bedingungen erhielt man die Verbindung 10.

Abbildung 3.1.2.1: Synthese der Verbindung 10.

Bei der Verbindung 15[154] handelt es sich um ein Deazapurin-Derivat und es kann

aus aus der D-Ribose 11 durch mehrere Schritte hergestellt werden. Deshalb wurde

die Substanz 15 in folgenden Synthesewegen (Abbildung 3.1.2.2) dargestellt. Die 1-

O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribose 12[156] kann in wenigen Schritten aus der

D-Ribose 11 synthetisiert werden. Anschließend wird es mit dem 5-Chlor-4-iod-7H -

pyrrol[2,3-d]pyrimidin 13[157] glykosidisch verknupft. Die Ausbeute des Schritts be-

trug nur 50 %. Mittels einer Autoklavenreaktion in der methanolischen Ammoniak-

Losung wurde sowohl die Chlorgruppe in die Aminogruppe uberfuhrt als auch die

drei Benzoylgruppen entfernt, und Verbindung 15 wurde erhalten.

43

Abbildung 3.1.2.2: Synthese der Verbindung 15.

Die entstandenen Produkte 10 und 15 wurden mit einem TMS-geschutzen Alkin 16

in der Sonogashira-Reaktion (Abbildung 3.1.2.3) umgesetzt. Diese Reaktion dauer-

te 16 Stunden und lieferte eine zufriedenstellende Ausbeute. Wahrend der MPLC-

Aufreinigung wurde die TMS-Gruppe des Alkins teilweise entschutzt. Deshalb konnte

keine exakte Ausbeute fur diesen Schritt angeben werden. Die verbliebene TMS-

Gruppe des Alkins der Substanzen wurde in der methanolischen Ammoniak-Losung

noch vollstandig entfernt. Die gesamte Ausbeute der 2-stufigen Reaktion betrug 45 %

fur Produkt 17[151] und 53 % fur 18[154].

Abbildung 3.1.2.3: Synthese der C2- oder C7-modifizierten Nukleoside 17 und 18.

Die Produkte 17 und 18 wurden als Substrat fur die Synthese des Monophosphats

eingesetzt (Abbildung 3.1.2.4). Die Reaktion wurde nach der Methode von Kovacs

und Otvos durchgefuhrt, da die 5′-Selektivitat dieser Reaktion relativ hoch und die

Durchfuhrung der Reaktion einfach ist. Unter Anwesenheit vom 1,8-Bis(dimethylami-

no)naphthalin (Protonenschwamm) wurde das frisch destillierte Phosphoroxychlo-

rid zu den bereits im Trimethylphosphat aufgelosten und im Eisbad abgekuhlten

44

Nukleosiden 17 und 18 zugegeben. Die Reaktion dauerte 4 Stunden und liefer-

te nach den aufwandigen Aufreinigungsschritten durch Ionenaustauschchromatogra-

phie (IEX) und Mitteldruckflussigkeitschromatographie (MPLC) Ausbeuten von etwa

40 % fur beide Monophosphate 19[149] und 20.

Abbildung 3.1.2.4: Synthese der C2- oder C7-modifizierten Monophosphate 19 und 20.

Die Herstellung des β-Nicotinamidribonukleosids 24[158, 159] erwies sich als we-

sentlich problematischer. Beim ersten Versuch wurde die 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-β-

D-ribose 21[160] (Abbildung 3.1.2.5), die aus der D-Ribose 11 in wenigen Schrit-

ten dargestellt wurde, mit Nicotinamid in Anwesenheit einer Lewis-Saure umgesetzt.

Danach sollten die Acetylgruppen des Produkts 22[158] entschutzt werden. Nach

einer separat erfolgreichen MPLC-Aufreinigung des Produkts 22 konnte die Ver-

bindung 24 aus der Entschutzungsreaktion nicht isoliert werden, obwohl das Pro-

dukt durch die Massenspektrometrie detektiert werden konnte. Diese Entschutzungs-

reaktion in einer 7 molaren ethanolischen oder methanolischen Ammoniak-Losung

ubergab das gewunschte Produkt und andere nicht-vollstandig entschutzte Verbin-

dungen. Jedoch konnten sie nicht durch dem Aufreinigungsschritt von MPLC von-

einander getrennt werden. Deswegen wurde die Synthese der Verbindung 24 auf

einem anderen Weg ausprobiert. Die Verbindung 21 wurde mit dem Ethylnicoti-

nat zum 2′,3′,5′-Triacetylethylnicotinatribosid 23[159] (Abbildung 3.1.2.5) gekoppelt.

Anschließend wurde die Substanz 23 in einer 7 molaren alkoholischen Ammoniak-

Losung entschutzt. Allerdings lieferte diese Reaktion sowohl in Ethanol als auch in

Methanol unter unterschiedlicher Reaktionstemperatur und Zeit ein Gemisch aus

geschutztem und entschutztem Zucker, sowie Amid oder Ester, das wieder nicht ge-

45

trennt werden konnte. Trotz mehrmaliger Wiederholung war die Synthese vom β-

Nicotinamidribonukleosid 24 immer ergebnislos. Um die Synthese trotzdem beendet

zu konnen, wurde das β-NMN 25, das fur die weitere Arbeit unbedingt erforderlich

war, gegen einen hohen Preis kommerziell zur Verfugung gestellt.

Abbildung 3.1.2.5: Synthese der Verbindung 24.

Nun konnte die Kupplung zweier Monophosphate im Folgenden durchgefuhrt werden.

Zu dieser Kupplung wurden einige verschiedene Verknupfungsmethoden ausprobiert

(Abbildung 3.1.2.6).

Abbildung 3.1.2.6: Synthesemoglichkeiten der C2-modifizierten NAD+ 1.

Zuerst wurde das Monophosphat 19 uber ein Morpholin[161] aktiviert und anschlie-

ßend versucht, in Anwesenheit vom Mangan(II)chlorid[162] und Magnesiumsulfat[162],

mit dem β-NMN 25 zu verknupfen. Jedoch funktionierte diese Kupplungsmethode

nicht in diesem Fall, denn nur eine sehr geringe Menge des Produkts konnte durch

46

die Massenspektrometrie detektiert und identifiziert werden. Weiterhin wurde ver-

sucht, das Mononukleotid 19 mit β-NMN 25 unter Aktivierung durch Dicyclohexyl-

carbodiimid (DCC)[163] zu kuppeln. Jedoch war dies auch erfolglos. Es wurde kein

gewunschtes Produkt im Reaktionsgemisch gefunden.

Nach erfolglosen Aktivierungen des Mononukleotids 19 wurde eine Aktivierung des

β-NMN 25 versucht. Das β-NMN 25 wurde zuerst durch das Carbonyldiimidazol

(CDI)[164] in Anwesenheit vom Triethylamin aktiviert und dann mit dem Mononu-

kleotid 19 gekoppelt. Dies lieferte nach 4 Tagen das gewunschte modifizierte NAD+

(2Amod NAD+ 1) in einer ausreichenden Ausbeute von 20 %. Das 7-modifizerte

NAD+ (7DAmod NAD+ 2) wurde in gleicher Weise aus dem Mononukleotid 20 und

dem CDI-aktivierten β-NMN 25 dargestellt (Abbildung 3.1.2.7).

Abbildung 3.1.2.7: Synthese der C2- oder C7-modifizierten NAD+ 1 und 2.

Obwohl die Ausbeute des Kopplungsschritts fur die beiden Produkte 1 und 2 nur

circa 20 % betrug, war die erhaltene Menge von 1 und 2 ausreichend fur weitere

biochemische Experimente.

3.2 Synthese des Azido-Fluoreszenzfarbstoffs

Um modifizierte ADPR-Produkte in weiteren biochemischen Experimenten zu mar-

kieren, werden das Sulfo-Cy5-Azid 27[149] (Abbildung 3.2.1) verwendet, das nach

47

bekannten Literaturen synthetisiert wird.

Abbildung 3.2.1: Synthese des Sulfo-Cy5-Azids 27.

Der Sulfo-Cy5-NHS-Ester 26[165], der in synthetischen Vorarbeiten bereitgestellt

wurde, wurde mit dem 3-Azido-1-propanamin[166] in Anwesenheit vom Triethylamin

zusammen gekoppelt. Nach aufwendiger Aufreinigung durch RP-HPLC wurde das

fur weitere Untersuchungen verwendbare Produkt zur Verfugung gestellt.

3.3 Biochemische Experimente der C2- oder C7-

modifizierten NAD+

Die vorliegenden NAD+-Analoga 1 und 2 werden in in vitro Untersuchungen zur

ADP-Ribosylierung mit ARTD1, dem am besten untersuchten ARTD-Familienmit-

glied, herangezogen. Wahrend der ADP-Ribosylierung modifiziert ARTD1 einerseits

Zielproteine durch sogenannte Trans(ADP-Ribos)ylierung (Heteromodifikation), an-

dererseits fungiert es als sein eigener Akzeptor[90] in einem als Auto(ADP-Ribos)yl-

ierung (Automodifikation) bekannten Prozess. Man untersucht daher das Substrat-

spektrum von ARTD1 bezuglich der Akzeptanz von 1 und 2 in der Trans(ADP-Ri-

bos)ylierung und der Auto(ADP-Ribos)ylierung.

48

3.3.1 Spektroskopische Eigenschaften der NAD+-Analoga

Bevor die NAD+-Analoga in den biochemischen Experimenten angewendet wurden,

wollte man die spektroskopischen Eigenschaften der modifizierten NAD+ je nach

der Modifikation separat untersuchen. Die NAD+-Analoga 1 und 2 enthalten eine

Modifikation an der 2- bzw. 7-Postion der Purinbase. Man wurde erwarten, dass

diese beiden Verbindungen ein unterschiedliches Absorptionsmaximum im Vergleich

zu dem naturlichen NAD+-Molekul haben. Die gemessenen UV/Vis-Spektren sieht

man in der Abbildung 3.3.1.1.

Abbildung 3.3.1.1: UV/Vis-Spektren von naturlichem NAD+ und NAD+-Analoga 1 und 2.

Das naturliche NAD+ betragt ein Absorptionsmaximum bei 259 nm, im Vergleich hat das C2-

modifizierte NAD+ ein Maximum bei 266 nm und die C7-Modifikation bei 272 nm.

Das Absorptionsmaximum vom naturlichen NAD+ liegt bei 259 nm[167] verursacht

durch das Adenosin. Durch die Alkinyl-Modifikation der Purinbase verandert sich in

diesem Fall die Verteilung des gesamt konjugierten π-Systems des Molekuls. Das fuhr-

49

te zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums im Spektrum der Verbindungen

1 und 2. Die gemessenen Daten zeigten, dass das NAD+-Analogon 1 ein Maximum

bei 266 nm und das NAD+-Analogon 2 bei 272 nm im Spektrum hat. Der Verlauf

der Spektren ist auch wegen verschiedener Modifikationen unterschiedlich.

3.3.2 ADP-Ribosylierung vom C2- oder C7-modifizierten N-

AD+

Das C2- bzw. C7-modifizierte NAD+ 1 und 2 wurden im Rahmen der Trans(ADP-

Ribos)ylierung[168] von Histon H1.2 untersucht, welches ein Hauptakzeptor von AD-

PR ist, um zu erfahren, ob sie in dieser enzymatischen Reaktion durch ARTD1 uber-

haupt akzeptiert werden konnte. In diesem Experiment wurde ARTD1 mit jedem

der NAD+-Analoga 1 und 2 in Gegenwart eines oktameren doppelstrangigen Oli-

gonukleotides und H1.2 inkubiert. ARTD1 wurde durch den Oligonukleotid-Duplex,

welcher DNA-Schaden simuliert, aktiviert. Nach der enzymatischen Reaktion wurde

das Sulfo-Cy5-Azid zu den Alkin-modifizierten ADPR-Einheiten, die aus dem Einbau

der NAD+-Analoga 1 und 2 abgeleitet wurden, durch die Click-Reaktion konjugiert.

Nach Entfernung von nicht umgesetztem Sulfo-Cy5-Azid uber eine Sephadex G-25

Minisaule, wurde das Reaktionsgemisch durch SDS-PAGE analysiert. Die Fluores-

zenzmarkierung wurde gegenuber dem Coomassie-Blau eingefarbten Gel verglichen.

Die in diesem Experiment verwendeten Probenkonzentrationen und Durchfuhrungen

sind im experimentellen Teil genau beschrieben. In Abbildung 3.3.2.1 sind die Ergeb-

nisse des Experiments mit den C2- bzw. C7-modifizierten NAD+ 1 und 2 zu sehen.

50

Abbildung 3.3.2.1: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit dem C2- bzw. C7-modifizierten NAD+-Analo-

ga 1 und 2. Der linke Teil zeigt das Bild der Sulfo-Cy5 Fluoreszenz, wahrend rechts dasselbe Gel

Coomassie-Blau eingefarbt wurde. Spuren 1 und 1′: Negativkontrolle: Trans(ADP-Ribos)ylierung

ohne ein doppelstrangiges Oligonukleotid; Spur 2 und 2′: Positivkontrolle: Trans(ADP-Ribos)yli-

erung mit naturlichem NAD′; Spur 3 und 3′: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit 1; Spur 4 und 4′:

Trans(ADP-Ribos)ylierung mit 2. Die totale Konzentration aller NAD+-Analoga betrug 1 mM .

Bei einem Kontrollversuch (Spur 1 und 1′) wurde das Reaktionsgemisch aus ARTD1,

naturlichem NAD+, H1.2 in Abwesenheit eines oktameren doppelstrangigen Oligonu-

kleotides als”Negativkontrolle“ durchgefuhrt. Wegen des fehlenden Oligonukleotids

ist ARTD1 inaktiv. In Gegenwart des zweiten Kontrollversuch (Spur 2 und 2′), der als

”Positivkontrolle“ bezeichnet wurde, wurden ARTD1, naturliches NAD+, H1.2 und

ein Oligonukleotid-Duplex zugegeben, um somit die ADP-Ribosylierung stattfinden

zu lassen. Die anderen Reaktionslosungen wurden jeweils mit einem der modifizier-

ten NAD+ 1 und 2 versetzt. Bei der Reaktion mit 1 (Spur 3 und 3′) hatte die

ADP-Ribosylierung stattgefunden und PAR wurde gebildet, die mit dem Sulfo-Cy5

geclickt wurde und durch das Fluoreszenzsignal nachgewiesen wurde. Im Vergleich

zum NAD+-Analogon 1 wurde 2 (Spur 4 und 4′) nicht von ARTD1 als Substrat in

der enzymatischen Reaktion inkorporiert.

Im folgenden Versuch wurde weiterhin die Auto(ADP-Ribos)ylierung mit den NAD+-

Analoga 1 und 2 studiert. Um zu wissen, ob die beiden Analoga ein effektives Substrat

fur ARTD1 in der Auto(ADP-Ribos)ylierung sind. In Abbildung 3.3.2.2 sind die Er-

gebnisse dargestellt. Das NAD+-Analogon 1 (Spur 3 und 3′) war in der Lage, ARTD1

selbst zu modifizieren. Im Fall von 2 sah man nur das Hintergrundsignal (Spur 4 und

51

4′). Trotz der Variierung der Reaktionszeit lieferte das NAD+-Analogon 2 keine si-

gnifikante Anderung des Ergebnisses.

Abbildung 3.3.2.2: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit dem C2- bzw. C7-modifizierten NAD+-Analo-

ga 1 und 2. Der linke Teil zeigt das Bild der Sulfo-Cy5 Fluoreszenz, wahrend rechts dasselbe Gel

Coomassie-Blau eingefarbt wurde. Spuren 1 und 1′: Negativkontrolle: Auto(ADP-Ribos)ylierung

ohne ein doppelstrangiges Oligonukleotid; Spur 2 und 2′: Positivkontrolle: Auto(ADP-Ribos)ylie-

rung mit naturlichem NAD+; Spur 3 und 3′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 1; Spur 4 und 4′:

Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 2. Die totale Konzentration aller NAD+-Analoga betrug 1 mM .

Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass 1 in sowohl Trans- als auch Auto-

(ADP-Ribos)ylierung viel effektiver als 2 von ARTD1 akzeptiert und an Zielpro-

teine ubertragen wurde. Es gibt bisher keine detaillierten Untersuchungen die er-

klaren, warum dieses Ereignis geschah? Ein moglicher Grund ware, dass die Alkinyl-

Modifikation wahrscheinlich auf der 7-Position des Adenosins eine sterische Hinde-

rung erzeugt, wenn es an ARTD1 bindet. Das ahnliche Phanomen wurde auch von

Lin beobachtet[64]. Denn jedes Enzym besitzt ein aktives Zentrum ganz bestimmter

Struktur, das nur die, genau in das aktive Zentrum hineingepassten Substratmolekule,

binden kann. Aus den erhaltenen Ergebnissen konnte geschlussfolgert werden, dass

die 7-Position des Adenosins im NAD+ ganz nah am aktiven Zentrum von ARTD1 ist

und eine Modifikation an den beiden Stellen nicht zulassig ist. Im Gegensatz zu der

Modifikation an der 2-Postion wurde die enzymatische Aktivitat von ARTD1 nicht

gestort und diese C2-Modifikation kann in weiteren Untersuchungen von ARTD1 ver-

wendet werden.

52

3.4 Synthese der C2-modifizierten desoxygenier-

ten NAD+

3.4.1 Syntheseplanung

Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen der ersten biochemischen Experimente wur-

de festgestellt, dass die 7-Postion des Adenosins im NAD+-Molekul die enzymatische

Aktivitat von ARTD1 stort und wahrscheinlich wegen der sterischen Hinderung keine

Modifikation zulassig ist. Die Modifikation an der 2-Postion jedoch lasst das Molekul

als ein effektives Substrat in der ARTD1 katalysierten ADP-Ribosylierung sein. An-

hand der Resultate wird die weitere systematische Desoxygenierung des Adenosins

mit der C2-modifizierten Nukleobase durchgefuhrt. Zur systematischen Desoxygenie-

rung werden jeweils die 3′-, 2′- und 2′, 3′-OH des Adenosins im NAD+ entfernt.

Abbildung 3.4.1.1: Retrosynthese der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+.

Bei der Synthese der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+ konnen die Zielmo-

lekule 3-5[149] in einer identischen Synthesestrategie wie 1 und 2 dargestellt werden

(Abbildung 3.4.1.1): Sie konnen aus den modifizierten Monophosphaten[149] uber eine

Kupplung an β-NMN hergestellt werden. Die modifizierten Monophosphate werden

nach der Methode von Kovacs und Otvos aus den Nukleosiden[149], die mittels der

Sonogashira-Reaktion mit den entsprenden Iodverbindungen[149] sowie einem TMS-

53

geschutzen Alkin an der C2-Position verknupft werden konnen, dargestellt. Bei den

desoxygenierten Iodverbindungen handelt es sich um unbekannte modifizierte Nu-

kleoside. Deshalb konnen sie nur aus selbst entwickelten Synthesewegen prasentiert

werden.

3.4.2 Ergebnisse der Synthese

Um die 3-desoxygenierte Iodoverbindung zu erhalten, benotigt man eine modifizierte

Nukleobase 32[169] und eine 3-Deoxyribose 37[170]. Das Guanin 28 wurde zunachst

mit der Acetylgruppe geschutzt und danach wurde es mit dem Phosphoroxychlorid

zum Chlorguanin umgesetzt. Nach Entschutzung der Acetylgruppen in einer 15 %

Natronlauge erhielt man das Produkt 30[171]. Die Aminogruppe der 9-Position wur-

de anschließend noch mit der Acetylgruppe geschutzt und die Aminogruppe der 2-

Position zu der Iodgruppe uberfuhrt. Nach basischer Entschutzung der Acetylgruppe

der 9-Position wurde das 6-Chlor-2-iodpurin 32 (Abbildung 3.4.2.1) erfolgreich dar-

gestellt.

Abbildung 3.4.2.1: Synthese der modifizierten Nukleobase 32.

Die D-Xylose 33 wurde als Ausgangsmaterial fur die Synthese der 3-Deoxyribose 37

verwendet. Die 1- und die 2-Hydroxygruppe der D-Xylose 33 wurden zuerst durch

die Isopropylidengruppe geschutzt und dann wurde die 5-Hydroxygruppe durch die

Toluoylgruppe geschutzt. Anschließend wurde die 3-Hydroxygruppe des Produkts

54

34[170] durch das Phenylchlorthionocarbonat aktiviert und danach in der Barton-

McCombie-Reaktion[172] zu einem Wasserstoff reduziert. Die Ausbeute des Schritts

betrug 62 %. Die Isopropylidengruppe der Verbindung 35[170] wurde im nachsten

Schritt unter sauren Bedingungen entfernt und die zwei erhaltenen freien Hydroxy-

gruppen wurden anschließend durch Acetylgruppen mit einer guten Ausbeute zur

Verbindung 37 (Abbildung 3.4.2.2) geschutzt.

Abbildung 3.4.2.2: Synthese der 3-Deoxyribose 37.

Zur Synthese der Verbindungen 39[149] und 41[149] verwendete man eine ahnliche

Strategie, und zwar eine Verknupfung zwischen dem 6-Chlor-2-iodpurin 32 und dem

entsprechenden Zucker. Die Nukleobase 32 wurde mit der mit 3-Deoxyribose 37 mit

66 %igen Ausbeute glykosidisch zu 38[149] verknupft. Die Acetylgruppe an der 2-

Postion verursachte einen Nachbargruppeneffekt und ergab selektiv ein β-Produkt

38, da der Ester-Carbonylsauerstoff die α-Position abschirmt. Nach Entfernung der

Toluoyl- und der Acetylgruppe und der Aminierung des Chlors an der 6-Position

in einer Autoklavenreaktion mit der methanolischen Ammoniak-Losung wurde die

3′-desoxygenierte Verbindung 39 (Abbildung 3.4.2.3) gewonnen. Die Verknupfung

zwischen der Nukleobase 32 und dem Hoffer′schen Chlorozucker[173] lief nach einer

SN2-nukleophilen Substitution ab. Das durch das N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid

aktivierte 6-Chlor-2-iodpurin 32 griff das α-Chlor des Zuckers an und bildete eine β-

glykosidische Bindung. Die Ausbeute betrug in diesem Fall 63 %. Nach vollstandiger

Entfernung der Schutzgruppen der Ribose und der Aminierung des Chlors erhielt

man die 2′-desoxygenierte Verbindung 41 (Abbildung 3.4.2.3).

55

Abbildung 3.4.2.3: Synthese der Verbindungen 39 und 41.

Die Herstellung der Verbindung 49 (Abbildung 3.4.2.4)[149] war relativ arbeitsaufwa-

ndig. Die 2′,3′-didesoxygenierte Verbindung 49 konnte weder aus dem 3′-desoxygenie-

rten Produkt 39 noch aus dem 2′-desoxygenierten Produkt 41 direkt eingeleitet wer-

den. Moglich ist, dass die in der Verbindung erhaltene Iodgruppe mit hoher Wahr-

scheinlichkeit wahrend der Barton-McCombie-Reaktion auch durch in der Reaktion

erzeugtes Wasserstoffradikal reduziert werden konnte. Deshalb wurde die Herstellung

vom 2′-Deoxyguanosin 42 angefangen. Die Hydroxygruppen des 2′-Deoxyguanosins

42 wurden mit der Acetylgruppe quantitativ[174] geschutzt und das acetylgeschutz-

te 2′-Deoxyguanosin 43[175] reagierte dann mit dem frisch destillierten Phospho-

roxychlorid, N,N -Dimethylanilin und getrocknetem Tetramethylammoniumchlorid.

Die Acetylgruppen der erhaltenen Verbindung 44[176] wurden danach in einer 25 %

wasserigen Ammoniak-Losung entfernt und die 5′-Hydroxygruppe anschließend mit

der TBDMS-Gruppe geschutzt. Das erhaltende Produkt 46[149] wurde im nachsten

Schritt durch die Barton-McCombie-Reaktion mit 61 %iger Ausbeute zur Verbin-

dung 47[149] reduziert. Die Aminogruppe der Verbindung 47 wurde danach in der

Sandmeyer-Reaktion zur Iodgruppe uberfuhrt. Nach der Aminierung des Chlors und

Entschutzung von TBDMS wurde die 2′,3′-didesoxygenierte Verbindung 49 mit Er-

folg in ausreichender Menge erzeugt.

56

Abbildung 3.4.2.4: Synthese der 2′,3′-didesoxygenierten Verbindung 49.

Die weiteren Synthesewege (Abbildung 3.4.2.5) wurden identisch wie die Herstellung

vom C2- bzw. C7-modifizierten NAD+ 1 und 2 durchgefuhrt. Die desoxygenierten

2-Iodadenosine 39, 41 und 49 wurden durch die Sonogashira-Reaktion mit dem

Alkin 16 verknupft. Die nach der Methode von Kovacs und Otvos durchgefuhrte

Monophosphorylierung lieferte eine zufriedenstellende Ausbeute von 47 % fur die

Verbindung 53[149], 44 % fur 54[149] und 61 % fur 55[149]. Das β-NMN 25 wurde

anschließend durch CDI in Anwesenheit vom Triethylamin zum aktivierten Mono-

nukeotid uberfuhrt und dann mit den Verbindungen 53-55 jeweils zu Zielmolekulen

3-5 (2Amod 3′′dNAD+ 3, 2Amod 2′′dNAD+ 4, 2Amod 2′′,3′′ddNAD+ 5) gekoppelt.

Die Ausbeute blieb bei circa 25 % fur jede Kupplung. Nun waren alle fur weitere

biochemische Untersuchungen benotigten Zielverbindungen 3-5 zur Hand.

57

Abbildung 3.4.2.5: Synthese der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+ 3, 4 und 5.

3.5 Synthese des Azido-Biotins

Das Biotin-Azid 58[177] wird in biochemischen Experimenten verwendet, um gewun-

schte ADPR-Produkte aus einer Mischung zu fischen. Die Synthese des Molekuls ist

literaturbekannt (Abbildung 3.5.1). Das Triethylenglykol 56 reagierte zunachst mit

Tosylchlorid und danach mit Natriumazid. Ein Azid des erzeugten Zwischenprodukts

57 wurde in der Staudinger-Reaktion[178] zum Amin reduziert und anschließend mit

der Carboxygruppe des D-(+)-Biotins in Anwesenheit von BOP zum Amid verknupft.

Nach Umkristallisation stand die Verbindung 58 auch zur Verfugung.

Abbildung 3.5.1: Synthese des Biotin-Azids 58.

58

3.6 Biochemische Experimente der C2-modifizierten

desoxygenierten NAD+

3.6.1 Spektroskopische Eigenschaften der NAD+-Analoga

Bevor die NAD+-Analoga in den biochemischen Experimenten angewendet wurden,

wurden die spektroskopischen Eigenschaften der modifizierten NAD+ 1, 3-5 mit glei-

cher noch Modifikation an der Nukleobase, aber unterschiedlicher an der Ribose ver-

glichen. Die gemessenen UV/Vis-Spektren sieht man in der Abbildung 3.6.1.1.

Abbildung 3.6.1.1: UV/Vis-Spektren von naturlichem NAD+ und NAD+-Analoga 3-5. Das

naturliche NAD+ hat ein Absorptionsmaximum bei 259 nm, im Vergleich haben die NAD+-

Analoga ein gemeinsames Maximum bei 266 nm.

Wie zu erwarten war, sieht man in den Spektren, dass alle C2-modifizierten NAD+

ein gemeinsames Absorptionsmaximum bei 266 nm und einen sehr ahnlichen Spek-

59

tralverlauf besitzen. Denn die Ribose des Adenosins hat keinen Einfluss auf der Ab-

sorption und die Nukleobase beeinflusst ein Absorptionsmaximum bzw. einen Verlauf

des Spektrums.

3.6.2 ADP-Ribosylierung der C2-modifizierten desoxygenier-

ten NAD+

Wie bereits im Abschnitt 3.3.2 beschrieben wurde, ist das C7-modifizierte NAD+

2 wahrscheinlich wegen der sterischen Hinderung im aktiven Zentrum von ARTD1

kein effektives Substrat in der enzymatischen Reaktion. Die enzymatische Aktivitat

von ARTD1 wurde durch die Modifikation an der 2-Position jedoch nicht gestort.

Deshalb wurde die weitere systematische Desoxygenierung des Adenosins mit der

C2-modifizierten Nukleobase durchgefuhrt. Die erhaltenen NAD+-Analoga 3-5 wur-

den zusammen mit 1 in den folgenden Experimenten untersucht.

Zuerst wurde das Verhalten der NAD+-Analoga 1 sowie 3-5 in der Trans(ADP-

Ribos)ylierung von H1.2 untersucht. Die Auswertung des Experiments ist in der

folgenden Abbildung 3.6.2.1 dargestellt. Wie in der Abbildung 3.6.2.1 zu sehen ist,

wurden alle NAD+-Analoga 1, 3-5 in der Trans(ADP-Ribos)ylierung von H1.2 durch

ARTD1 (Spuren 3-6) akzeptiert und die resultierenden ADPR-Addukte konnten

auch fur Click-Chemie vermittelte Fluoreszenzmarkierung verwendet werden. Diese

Markierung trat speziell an ADPR-Addukten von Alkin-abgeleiteten NAD+-Analoga

(Spuren 3-6) auf, ohne eine unspezifische Bindung von Sulfo-Cy5-Azid zu unmodifi-

ziertem ARTD1 oder naturlicher PAR erkennen zu lassen. Die NAD+-Analoga 1 und

3 wiesen aufgrund der Bildung von langen PAR Ketten und vielfachem Einbau von

Alkinfunktionalitaten die starksten Fluoreszenzsignale auf (Spur 3 und 4). Im Fall

von 1 wurden sowohl ARTD1 als auch H1.2 umfangreich poly(ADP-Ribos)yliert. Un-

terschiede in der Zusammensetzung der angehangten PAR verursachten verschiedene

60

Wanderlangen von H1.2 und ARTD1 in der SDS-PAGE-Analyse (Spur 3 und Spur

3′). Interessanterweise kann man beobachten, dass die Abwesenheit der 3′′-OH Grup-

pe die Bildung von PAR (Spur 4) beeinflusste. Denn obwohl das Analogon 3 eindeutig

eingebaut wurde, bestand eine signifikante Veranderung im Vergleich zum Produkt,

welches mit 1 erhalten wurde. Dies deutet auf eine unerwartete Beteiligung der 3′′-

OH Gruppe in der ARTD1 Katalyse hin. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit

1 und 3 erhalten wurden, verhinderte der Gebrauch von 4 und 5 die Bildung von

langen PAR Ketten und zeigte, dass sie als Kettenterminatoren wirken, da lediglich

scharfe Banden von markiertem H1.2 und ARTD1 beobachtet wurden (Spur 5 und

6). Interessanterweise konnte die PAR Bildung durch die Bereitstellung der 3′′-OH

Gruppe mit 4 nicht wiederhergestellt werden und es wurde ein Modifikationsmuster,

vergleichbar mit dem des Dideoxy-Analogon 5 beobachtet (Spur 5 und 6). Diese Er-

gebnisse bestatigten, dass die 2′′-OH Gruppe fur den Aufbau von PAR durch ARTD1

essentiell ist.

Abbildung 3.6.2.1: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit dem C2-modifizierten NAD+ 1, 3-5. Der lin-

ke Teil zeigt das Bild der Sulfo-Cy5 Fluoreszenz, wahrend rechts dasselbe Gel Coomassie-Blau

eingefarbt wurde. Spuren 1 und 1′: Negativkontrolle: Trans(ADP-Ribos)ylierung ohne ein dop-

pelstrangiges Oligonukleotid; Spur 2 und 2′: Positivkontrolle: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit

naturlichem NAD+; Spur 3 und 3′: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit 1; Spur 4 und 4′: Trans(A-

DP-Ribos)ylierung mit 3; Spur 5 und 5′: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit 4; Spur 6 und 6′: Tr-

ans(ADP-Ribos)ylierung mit 5. Die totale Konzentration aller NAD+-Analoga betrug 1 mM .

Angespornt durch diese Resultate, wurde untersucht, ob diese Methode eine Biotin-

markierung der ADP-Ribosylierten Produkte zulasst. Zu diesem Zweck wurde die

61

Click-Reaktion nach der Trans(ADP-Ribos)ylierung von H1.2 durch ARTD1 durch-

gefuhrt, um modifizierte Proteine mit Biotin-Azid konjugieren zu konnen. Nach SDS-

PAGE wurden die modifizierten Proteine entweder mit Coomassie-Blau gefarbt oder

auf eine PVDF-Membran ubertragen und danach mit einem Streptavidin-alkalische-

Phosphatase-Konjugat (Strep-AP) nachgewiesen.

Abbildung 3.6.2.2: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit dem C2-modifizierten NAD+ 1, 3-5. Der linke

Teil zeigt das Bild des Western Blots, wahrend rechts dasselbe Gel Coomassie-Blau eingefarbt

wurde. Spuren 1 und 1′: Negativkontrolle: Trans(ADP-Ribos)ylierung ohne ein doppelstrangig-

es Oligonukleotid; Spur 2 und 2′: Positivkontrolle: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit naturlichem

NAD+; Spur 3 und 3′: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit 1; Spur 4 und 4′: Trans(ADP-Ribos)ylie-

rung mit 3; Spur 5 und 5′: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit 4; Spur 6 und 6′: Trans(ADP-Ribos)-

ylierung mit 5. Die totale Konzentration aller NAD+-Analoga betrug 1 mM .

Tatsachlich gelang es, Biotin kovalent an die Reaktionsprodukte, die durch die Ver-

wendung der modifizierten NAD+ 1, 3-5 (siehe Abbildung 3.6.2.2) erhalten wurden

zu binden. Der hohe Anteil an positiv geladenen Lysinen in H1.2 konnte die Ubertra-

gung des Proteins auf der Membran wahrend des Transferprozesses storen und damit

schwache Signale fur Spur 5 und 6 verursachen.

Anschließend wurden NAD+ 1, 3-5 auch in der Auto(ADP-Ribos)ylierung als Sub-

strat von ARTD1 untersucht. In Abbildung 3.6.2.3 sind die Ergebnisse des Experi-

ments zu sehen. Das Fluoreszenzbild (Spuren 3-6) zeigte deutlich, dass alle NAD+-

Analoga 1, 3-5 auch von ARTD1 in der Auto(ADP-Ribos)ylierung akzeptiert wurden.

Im Fall von 1 wurde eine vergleichbare Aktivitat zu der enzymatischen Reaktion mit

62

naturlichen NAD+ (Spur 2′ und 3′) beobachtet. ARTD1 wurde mit langen und kom-

plexen Ketten von PAR modifiziert. Deshalb gab es ein starkes Fluoreszenzband im

obersten Teil des Gels (Spur 3) und ein Verschwinden des charakteristischen Bands

bei ARTD1 im Coomassie-gefarbten Gel (Spur 3′). Das schwache Fluoreszenzsignal

unter dem ARTD1 wurde bereits von Lin et. al.[64] beschrieben und ergab sich aus hy-

drolysierten und ungebundenen PAR-Ketten, da die Bindung zwischen dem Protein

und der ADPR-Einheit eine relativ labile Esterbindung[64] ist. Auch hier sieht man in

der Abwesenheit der 3′′-OH Gruppe eine Beeinflussung der Bildung von PAR, obwohl

das Analogon 3 deutlich inkorporiert wurde. Wegen der Verhinderung der Verlange-

rungsstelle dienen die NAD+-Analoga 4 und 5 als Kettenterminatoren (Spur 5 und 6).

Abbildung 3.6.2.3: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit dem C2-modifizierten NAD+ 1, 3-5. Der lin-

ke Teil zeigt das Bild der Sulfo-Cy5 Fluoreszenz, wahrend rechts dasselbe Gel Coomassie-Blau

eingefarbt wurde. Spuren 1 und 1′: Negativkontrolle: Auto(ADP-Ribos)ylierung ohne ein dopp-

elstrangiges Oligonukleotid; Spur 2 und 2′: Positivkontrolle: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit nat-

urlichem NAD+; Spur 3 und 3′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 1; Spur 4 und 4′: Auto(ADP-R-

ibos)ylierung mit 3; Spur 5 und 5′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 4; Spur 6 und 6′: Auto(ADP-

Ribos)ylierung mit 5. Die totale Konzentration aller NAD+-Analoga betrug 1 mM .

Wie zu erwarteten war, wurden ahnliche Resultate erzielt als man die Auto(ADP-

Ribos)ylierung von ARTD1 mit der Biotinmarkierung untersuchte (siehe Abbildung

3.6.2.4). Die resultierende Membran und das entsprechend Coomassie-Blau gefarbte

Gel zeigten eine erfolgreiche Biotinmarkierung von ARTD1.

63

Abbildung 3.6.2.4: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit dem C2-modifizierten NAD+ 1, 3-5. Der linke

Teil zeigt das Bild des Western Blots, wahrend rechts dasselbe Gel Coomassie-Blau eingefarbt

wurde. Spuren 1 und 1′: Negativkontrolle: Auto(ADP-Ribos)ylierung ohne ein doppelstrangig-

es Oligonukleotid; Spur 2 und 2′: Positivkontrolle: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit naturlichem

NAD+; Spur 3 und 3′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 1; Spur 4 und 4′: Auto(ADP-Ribos)ylierung

mit 3; Spur 5 und 5′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 4; Spur 6 und 6′: Auto(ADP-Ribos)ylierung

mit 5. Die totale Konzentration aller NAD+-Analoga betrug 1 mM .

Wie bereits in der Einfuhrung beschrieben, wechselwirkt die 3′-OH Gruppe des Ade-

nosins sowohl in der Elongation als auch in der Verzweigungsreaktion mit dem Ami-

nosaurerest Glu988 und Tyr907. Die Desoxygenierung verhindert die Bildung der

Wasserstoffbrucken mit den Aminosaureresten und stort damit die Entstehung des

Ubergangszustands im Enzym. Deshalb wurde eine signifikante Veranderung im Ver-

gleich zum Produkt, welches mit 1 erhalten wurde, beobachtet, obwohl das Analogon

3 eindeutig eingebaut wurde. Nun mochte man das Analogon 3 in der Auto(ADP-

Ribos)ylierung mit einer Zeitreihenanalyse durchfuhren, ob diese Storung durch eine

Verlangerung der Zeit nachgeholt werden konnte.

Die Ergebnisse des Experiments (siehe Abbildung 3.6.2.5) wiesen darauf hin, dass die

Desoxygenierung an der 3′-OH Gruppe des Adenosins die Bildung der langen PAR

Ketten durch mangelhafte Wasserstoffbrucken mit Aminosaureresten verlangsamt.

Jedoch kann diese Verzogerung durch Verlangerung der Inkubationszeit nachgeholt

werden.

64

Abbildung 3.6.2.5: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit dem C2-modifizierten 3′′dNAD+ 3 in Verlang-

erung der Reaktionszeit. Der linke Teil zeigt das Bild der Sulfo-Cy5 Fluoreszenz, wahrend rechts

dasselbe Gel Coomassie-Blau eingefarbt wurde. Spuren 1 und 1′: Negativkontrolle: Auto(ADP-

Ribos)ylierung ohne ein doppelstrangiges Oligonukleotid; Spur 2 und 2′: Positivkontrolle: Auto-

(ADP-Ribos)ylierung mit naturlichem NAD+; Spur 3 und 3′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 3 in

20 Min; Spur 4 und 4′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 3 in 40 Min; Spur 5 und 5′: Auto(ADP-

Ribos)ylierung mit 3 in 60 Min; Spur 6 und 6′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 3 in 90 Min; Spur

7 und 7′: Auto(ADP-Ribos)ylierung mit 3 in 120 Min. Die totale Konzentration aller NAD+-An-

aloga betrug 1 mM .

3.6.3 Kompetition von NAD+-Analoga mit dem naturlichen

NAD+

In diesem Teil der Arbeit wurden die C2-modifizierten Verbindungen 1, 3-5 in der

Trans(ADP-Ribos)ylierung mit naturlichem NAD+ getestet, um herauszufinden, ob

die NAD+-Analoga kompetitive Substrate fur die ARTD1 katalysierte ADP-Ribosyli-

erung sind. Fur diese Experimente wurden die enzymatischen Reaktionen wie oben

beschrieben durchgefuhrt, allerdings mit verschiedenen Verhaltnissen von Analoga zu

dem naturlichen NAD+. In Abbildung 3.6.3.1 wurden die Ergebnisse der Konkurrenz

der NAD+-Analoga mit dem naturlichen NAD+ zusammengefasst. Die Ergebnisse

zeigten eindeutig, dass alle NAD+-Analoga in der Gegenwart von naturlichem NAD+

durch ARTD1 eingebaut wurden.

65

Abbildung 3.6.3.1: Kompetition von NAD+-Analoga 1(A), 3(B), 4(C) und 5(D) und dem naturli-

chen NAD+. Der linke Teil zeigt das Bild der Sulfo-Cy5 Fluoreszenz, wahrend rechts dasselbe Gel

Coomassieblau gefarbt wurde. Spur 1 und 1′: Negativkontrolle: Trans(ADP-Ribos)ylierung ohne

doppelstrangigem Oligonukleotid; Spur 2 und 2′: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit 100 % naturlich-

em NAD+; Spur 3 und 3′: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit 75 % naturlichem NAD+ und 25 %

Analogon; Spur 4 und 4′: mit 50 % naturlichem NAD+ und 50 % Analogon; Spur 5 und 5′: mit

25 % naturlichem NAD+ und 75 % Analogon; Spur 6 und 6′: 100 % NAD+-Analogon. Die totale

Konzentration aller NAD+-Analoga betrug 1 mM .

66

Bereits bei lediglich 25 % vom NAD+-Analogon wurde nach der Click-Reaktion mit

Sulfo-Cy5-Azid ein zur eingebauten Alkinfunktionalitat zugehoriges Fluoreszenzsi-

gnal nachgewiesen. Jedoch gibt es noch Unterschiede zwischen einzelnem NAD+-

Analogon. Mit dem ansteigenden Anteil des Analogons 1 im Reaktionsgemisch sah

man das Fluoreszenzsignal noch intensiver (Abbildung 3.6.3.1A, Spuren 3-6). Fall

3 lieferte zwar auch ein starkes Fluoreszenzsignal (Abbildung 3.6.3.1B, Spuren 3-6),

aber man beobachtete wegen der fehlenden 3′′-OH Gruppe eine deutliche Veranderung

im Vergleich zum Produkt von 1. Wegen fehlenden 2′′-OH Gruppen in Analoga 4 und

5 wurde die Bildung von langen PAR Ketten abgebrochen (Abbildung 3.6.3.1C, D,

Spuren 3-6). Bemerkenswerterweise scheint die ADP-Ribosylierung von H1.2 mit 5 bei

allen Konzentrationen von 5 stattzufinden. Dies steht im Gegensatz zu ARTD1, wo

eine ADP-Ribosylierung nur beobachtet wurde, wenn ausnahmslos 5 eingesetzt wur-

de. Dies weist darauf hin, dass ARTD1 5 effizienter fur die Trans(ADP-Ribos)ylierung

von H1.2 als fur die ADP-Ribosylierung von sich selbst nutzt (Abbildung 3.6.3.1D,

Spuren 3-6). Ahnliche Resultate wurden mit den Analoga 1, 3 und 4 erzielt (Abbil-

dung 3.6.3.1A-C, Spuren 3-6).

3.7 Pulldown-Experimente unter Anwendung des

Kettenterminators

3.7.1 Strategie der Pulldown-Experimente

Pulldown-Experimente basieren auf der Affinitat des Zielmolekuls zu seinem Interak-

tionspartner, welcher an einer Matrix gebunden ist. Hierzu wird das Zielmolekul meist

mit einem Tag versehen und uber dieses an eine geeignete Matrix gebunden. Nach der

Zugabe moglicher Interaktionspartner und anschließender Waschschritte verbleiben

das Zielmolekul an den Interaktionspartner und damit an die Matrix gebunden, und

kann im Folgenden eluiert und analysiert werden.

67

In diesem Fall soll das am besten geeignete NAD+-Analogon in enzymatischer Reak-

tion umgesetzt werden und die alkinylmodifiziert-ADPR-haltigen Produkte werden

nach einer Click-Reaktion an Biotin geknupft. Anschließend wird das Produktge-

misch mit Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen vermischt. Die an Biotin gebunde-

nen Protdukte sind in der Lage mit Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen wechsel-

zuwirken. Nach geeigneten Waschschritten konnen die gewunschten Produkte ange-

reichert, eluiert und mittels geeigneter Methoden analysiert werden.

Abbildung 3.7.1.1: Schematische Darstellung der Pulldown-Experimente. S ist das gesuchte Sub-

strat des Experiments.

68

Eine schematische Darstellung der geplanten Strategie ist in Abbildung 3.7.1.1 zu

sehen. Die Vorteile der Methode bestehen nicht nur darin, dass die gewunschten Pro-

dukte angereichert werden konnen, sondern auch, dass die Komplexitat von PAR

durch erzeugte Monomere uberwunden werden kann. Außerdem kann diese Metho-

de weiterhin fur die Untersuchung aller NAD+-konsumierenden Proteine, die an der

ADP-Ribosylierung beteiligt sind, verwendet werden. Eine Besonderheit der Strategie

besteht noch darin, dass diese Strategie anhand des NAD+-Analogon nicht nur die

Substratproteine in der ADP-Ribosylierung, sondern auch die spezifischen ADPR-

Akzeptorstellen eines Proteins identifizieren konnen. Nach der ADP-Ribosylierung

und der Verdauung der beteiligten Proteine konnen die Peptide, die eine oder meh-

rere ADP-ribosylierte Aminosauren enthalten, aus der Mischung herausgefischt und

danach mittels LC/MS analysiert werden. Aus den Daten der Massenspektren von

eluierten Protein-Fragmenten konnen die Modifikationsstellen der NAD+-konsumier-

enden Proteine identifiziert werden.

3.7.2 Ergebnisse der Pulldown-Experimente

Um diese geplante Strategie der Pulldown-Experimente problemlos durchzufuhren,

muss die Funktionsfahigkeit jedes einzelnen Schritts zuerst durch eine entsprechende

Untersuchung gepruft werden. Um die Untersuchungsobjekte in den Testreaktionen

moglichst zu vereinfachen, werden nur der Kettenterminator 5 und ARTD1 verwen-

det. Denn Suhadolnik et. al.[179] hat berichtet, dass das NAD+-Analogon 4 ein 1′′-

3′ verknupftes ADPR-Dimer[179] bilden konnte. Der ADP-Ribosylierungs- und der

Click-Schritt wurden bereits in biochemischen Experimenten, siehe 3.6, nachgewiesen.

Es wird noch untersucht, ob die Eluierung der biotinmarkierten Produkte funktio-

niert.

69

Abbildung 3.7.2.1: Chemische Struktur und Bruchmoglichkeiten der biotinmarkierten Produkte

mit Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen.

In Abbildung 3.7.2.1 ist die chemische Struktur der Produkte der Interaktion zwischen

Biotin und Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen zu sehen. Generell gibt es insge-

samt drei mogliche Bruchstellen, damit gewunschte Produkte eluiert werden konnen.

Das sind:

• die Biotin-Streptavidin-Interaktion (Biotin-Strep-Interaktion).

• die Phosphodiesterbindung.

• die Esterbindung.

Die eingesetzten Mengen der Startmaterialien und Reaktionsbedingungen in der ADP-

Ribosylierung und der Click-Reaktion sind identisch zu den bereits beschrieben. Fur

jede Bruchstelle wurden einige Methoden ausprobiert, um zu wissen, welche Methode

fur die Eluierung der gewunschten Produkte am besten geeignet ist. Die ausprobier-

ten Methoden wurden in der folgenden Tabelle (Tabelle 3.7.2.1) zusammengefasst.

70

Tabelle 3.7.2.1: Methoden zur Eluierung von ADP-ribosyliertem ARTD1.

Bruchmoglichkeit Verwendete Methode Ergebnis

Biotin-Strep-Interaktion

Erhitzung im SDS-PAGE-

Ladepuffer.Kein gewunschtes Produkt

Erhitzung im tridestil-

lierten Wasser mit einem

Temperaturgradient von

25 ◦C bis 70 ◦C[180].

Kein gewunschtes Produkt

Behandlung mit 0,1 M

Glycine-HCl (pH 2,5)[181].Kein gewunschtes Produkt

PhosphodiesterbindungAbspaltung durch Phos-

phodiesterase I (PDE I).Kein gewunschtes Produkt

Esterbindung

Aminolyse mit einer

10 %igen Aminlosung

(Methylamin, Ethanola-

min und Hydrazin).

Kein gewunschtes Produkt

Aminolyse[102] mit dem

100 mM Hydroxylamin im

100 mM HEPES-Puffer.

Kein gewunschtes Produkt

Die Ergebnisse zeigten, dass keine Methode bereits fur die Eluierung von ADP-

ribosyliertem ARTD1 funktionierte. Warum die ausprobierten Methoden im einzelnen

Fall nicht mehr funktionierte, wurde nicht weiterfuhrend untersucht. Jedoch liegt es

wahrscheinlich daran, dass die verwendeten Methode entweder nicht ausreichend stark

war, um diese Biotin-Streptavidin-Interaktion abzuberechen, oder bereits stark genug

war, das Protein unter der Bedingung zu hydrolysieren. Die 115 kD große Phospho-

diesterase I (PDE I) aus Klapperschlangengift ist auch nicht in der Lage, die in einer

71

modifizierten ADPR liegende Phosphodiesterbindung zu spalten. Denn die Dideoxy-

ADPR konnte durch Abwesenheit der beiden Hydroxygruppen nicht mehr mit dem

aktiven Zentrum der PDE I interagieren. Weshalb die Spaltung der Phosphodiester-

bindung in diesem Fall nicht stattgefunden hat. Die Basizitat vom Methylamin, Etha-

nolamin und Hydrazin waren genugend stark, um ARTD1 wahrend der Aminolyse

zu hydrolysieren. Das Hydroxylamin konnte zwar nach der Auto(ADP-Ribos)ylierung

das erzeugte naturliche PAR abspalten, aber es funktionierte nicht in dem Fall der

Verwendung des Analogons 5, welches durch das Fluoreszenzsignal von Sulfo-Cy5

verfolgt werden konnte. Eine Vermutung ware, dass das entstandene PAR-Polymer

das Akzeptorprotein abschirmte und die Ersterverbindung sowie das Akzeptorprotein

nicht so leicht durch das Hydroxylamin angegriffen werden wurde. Bei der Verwen-

dung von 5 besitzt das erzeugte Produkt nur eine relativ einfache Struktur und das

Amin konnte leicht an die Zielstellen diffundieren und Aminolyse findet dann statt.

Gleichzeitig konnte das Protein auch unter diesen Bedingungen hydrolysiert werden.

Die ubrige Proteinmenge war so niedrig, dass das Protein nicht detektierbar war.

Bei einer Wiederholung des Experiments waren die Erhohung der untersuchten Pro-

teinmenge und eine kurze Reaktionszeit der Aminolyse sinnvoll. Außerdem konnten

die bereits getesteten Methoden fur den Bruch der Interaktion zwischen Biotin und

Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen durch die Erhohung der Proteinmenge und

einer langere Erhitzungszeit noch funktionieren.

Es war nicht moglich ARTD1 in großerer Menge zu darzustellen. Jedoch konnte das

andere Akzeptorprotein wie Histon H1.2 innerhalb der eigenen Arbeitsgruppe noch

zur Verfugung gestellt und im Pulldown-Experiment verwendet werden. Die Kompe-

titionexperimente wiesen bereits darauf hin, dass das NAD+-Analogon 5 als Substrat

effizienter fur die Trans(ADP-Ribos)ylierung von H1.2 als fur die ADP-Ribosylierung

von sich selbst durch ARTD1 genutzt werden konnte. Anhand der erhaltenen Ergeb-

nisse wurde anschließend das Pulldown-Experiment mit H1.2 durchgefuhrt.

72

Abbildung 3.7.2.2: Pulldown-Experiment mit H1.2. EG: Eingabe, PD: Pulldown, WL: Waschlo-

sung. Spuren 1: Negativkontrolle: Trans(ADP-Ribos)ylierung ohne ein doppelstrangiges Oligon-

ukleotid; Spur 2: Positivkontrolle: Trans(ADP-Ribos)ylierung mit naturlichem NAD+; Spur 3:

Trans(ADP-Ribos)ylierung und 1 und Click-Reaktion mit Biotin-Azid; Spur 4: Trans(ADP-Ri-

bos)ylierung mit 5 und Click-Reaktion mit Biotin-Azid; Spur 5: Pulldown fur Negativkontrol-

le; Spur 6: Pulldown fur Positivkontrolle; Spur 7: Pulldown mit 1; Spur 8: Pulldown mit 5;

Spur 9: Waschlosung fur Negativkontrolle; Spur 10: Waschlosung fur Positivkontrolle; Spur 11:

Waschlosung mit 1; Spur 12: Waschlosung mit 5. Die totale Konzentration von NAD+ und den

Analoga 1 und 5 betrug 1 mM .

In Abbildung 3.7.2.2 wurden die Ergebnisse des Pulldown-Experiments mit H1.2 dar-

gestellt. Im Experiment betrug die totale Konzentration von H1.2 113 µM (das war

25-fache hoher als sie vorher in der Trans(ADP-Ribos)ylierung verwendet wurde). Die

Verbindung 5 als Substrat und 1 als Vergleichsprobe wurden in diesem Experiment

eingesetzt. Nach der Trans(ADP-Ribos)ylierung und der Click-Reaktion sowie dem

Affinitatsaufreinigungsschritt[182] unter Verwendung von Streptavidin-haltigen Ma-

gnetkugelchen, wurden die Proben 15 Minuten bei 95 ◦C erhitzt, um das Streptavidin

zu denaturieren und die Interaktion mit Biotin zu brechen und anschließend auf das

SDS-Gel aufzutragen. Danach wurde eine elektrophoretische Analyse durchgefuhrt.

In der Eingabe (Spur 1 bis 4) sah man, dass das Analogon 1 die PAR (Spur 3) bildete

73

und 5 als Kettenterminator (Spur 4) fungierte. Nach dem Pulldown sah man das H1.2

unter Verwendung von 5 im Coomassie-Blau eingefarbten Gel (Spur 8), jedoch wur-

de kein H1.2 (Spur 7) unter Verwendung von 1 detektiert. Vermutlicher Grund fur 1

ware, dass das Biotin aufgrund der Bildung von langen und verwickelten PAR Ketten

sehr stark an Streptavidin-haltige Magnetkugelchen bindet. Diese Interaktion war so

stark, dass nicht ausreichend Zeit vorhanden war, um sie zu unterbrechen. Obwohl

die Eluierung von H1.2 in der Negativ- und Positivkontrolle mangels der Interakti-

on zwischen dem Biotin und Streptavidin unmoglich war, sind noch die schwachen

Signale von H1.2 (Spur 5 und 6) zu sehen. Dieses Phanomen konnte aus einer unspe-

zifischen Wechselwirkung zwischen H1.2 und Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen

kommen. Das ARTD1 wurde wieder wegen der geringen Konzentration nach dem

Pulldown nicht detektiert. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass der Kettentermi-

nator 5 ein sehr nutzliches und effizienteres Werkzeug fur das Pulldown von H1.2 ist.

Vielleicht konnte es auch fur die anderen NAD+-konsumierenden Proteine einsetzbar

sein.

74

Kapitel 4

Zusammenfassung und Ausblick

Als ein essentielles Coenzym wird Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) in allen le-

benden Zellen gefunden. NAD+ spielt eine direkte Rolle bei dem Katabolismus und ist

auf verschiedenen Ebenen der zellularen Energietransformationen beteiligt. Die Redo-

xeigenschaften von NAD+ sind bereits seit uber hundert Jahren bekannt. In der zwei-

ten Halfte des 20. Jahrhunderts wurde die Nicht-Redoxfunktionen als zweite wichtige

Funktion von NAD+ erkannt. Bisher wurden einige der NAD+-konsumierenden Re-

aktionen entdeckt. Eine Art der intensiv erforschten enzymatischen Reaktion ist die

ADP-Ribosylierung. Die ADP-Ribosylierung ist eine reversible, post-translationale

Proteinmodifikation, katalysiert durch die Enzymfamilie der ARTs mit ARTD1 als

bestbeschriebenem Mitglied. ARTs nutzen NAD+ als Substrat und spielen aufgrund

der Ubertragung von mehreren ADPR-Einheiten, sowie der Bildung von PAR-Ketten

unterschiedlicher Lange an Zielproteinen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl bio-

logischer Prozesse, darunter DNA- Reparatur, Aufrechterhaltung der genomischen

Stabilitat sowie der transkriptionellen Regulation. Die ADP-Ribosylierung umfasst

die Ubertragung von einem oder mehreren ADPR-Resten von NAD+ auf spezifische

Aminosaureseitenketten eines Zielproteins, was zu dessen Mono(ADP-Ribos)ylierung

bzw. Poly(ADP-Ribos)ylierung fuhrt. In diesem Zusammenhang wurde eine kova-

lente Ubertragung an Glutatminsaure-, Asparaginsaure- oder Lysinreste beschrie-

ben. Bestrebungen, direkte Zielproteine der ARTs, sowie deren spezifische ADPR-

75

Akzeptorstellen zu identifizieren, mussen die Komplexitat von PAR uberwinden, wel-

che die nachfolgenden Analysen erschweren. Deshalb sind neue entwickelte NAD+-

Analoga erforderlich, die effizient durch Wildtyp-ARTs eingebaut werden und a) einen

Affinitatsmarker tragen, der Manipulationen wie Markierungen und Anreicherungen

von Proben ermoglicht und b) durch Abwesenheit der benotigten Hydroxylgruppe

zum PAR-Kettenabbruch fuhren.

Im Laufe der Dissertation gelang es, funf neue NAD+-Analoga 1-5 darzustellen. Das

C2- oder C7-modifizierter NAD+ 1 und 2 konnten aus den Mononukleotide 19 und 20

und dem CDI-aktivierten β-NMN 25 mit ausreichenden Ausbeuten verknupft werden.

Die Mononukleotide 19 und 20 erhielt man analog durch eine Methode von Kovacs

und Otvos. Denn sie bietet eine relativ hohe 5′-Selektivitat und eine vergleichsweise

einfache Durchfuhrbarkeit. Die C2- bzw. C7-Funktionalisierung wurden mittels der

Sonogashira-Reaktion mit den Iodverbindungen 10 und 15 und dem Alkin 16 an

der entsprechenden Position mit befriedigenden Ausbeuten realisiert. Die Synthese

der Verbindungen 10 ist bereits literaturbekannt und konnte aus dem Guanosin 6

uber die Substitutionsreaktion an der Nukleobase und die Sandmeyer-Reaktion sowie

die erforderliche Schutzgruppenchemie mit gesamt guten Ausbeuten dargestellt wer-

den. Die Verbindung 15 konnte aus dem 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribose

12 und 5-Chlor-4-iod-7H -pyrrol[2,3-d]pyrimidin 13 uber die Glykosylierung und die

Entfernung der verwendeten Schutzgruppen hergestellt werden. Außerdem wurde der

in weiteren biochemischen Experimenten benotigte Fluoreszenzfarbstoff 27 uber die

Verknupfung zwischen dem Sulfo-Cy5-NHS-ester 26 und dem 3-Azido-1-propanamin

mit guten Ausbeuten synthetisiert.

Bevor die NAD+-Analoga 1 und 2 in den biochemischen Experimenten angewendet

werden konnten, wollte man die spektroskopischen Eigenschaften der modifizierten

NAD+ untersucht haben. Durch die Alkinyl-Modifikation an der 2- bzw. 7-Postion

der Purinbase fuhrte es zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums im Spek-

76

trum der Verbindungen 1 und 2 im Vergleich zu dem naturlichen NAD+-Molekul. In

den biochemischen Experimenten wurden die Zielmolekule 1 und 2 vor allem im Rah-

men der Trans(ADP-Ribosyl)ierung von Histon H1.2 und Auto(ADP-Ribosyl)ierung

getestet. Dies wurde bewerkstelligt, um Einblicke zu erhalten, ob diese in den en-

zymatischen Reaktionen durch ARTD1 uberhaupt akzeptiert werden konnten. Die

Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass 1 (C2-Modifikation) in sowohl Trans-

als auch Auto(ADP-Ribos)ylierung viel besser als 2 (C7-Modifikation) von ARTD1

akzeptiert und an Zielproteine ubertragen wurde.

Basierend auf den Ergebnissen der ersten biochemischen Experimente wurde die wei-

tere systematische Desoxygenierung des Adenosins mit der C2-modifizierten Nukleo-

base durchgefuhrt. Die systematische Desoxygenierung erfolgte in einer Reihenfolge

von 3′-, 2′- und 2′, 3′-OH des Adenosins im NAD+. Die C2-modifizierten desoxygenier-

ten NAD+ 3-5 konnten in einer identischen Synthesestrategie wie 1 und 2 aus den Iod-

verbindungen 39, 41 und 49 uber die Sonogashira-Reaktion und die Monophosphory-

lierung, sowie Kopplung aus den Mononukleotiden 53-55 und dem CDI-aktivierten β-

NMN 25 dargestellt werden. Die Synthesen der 3′- oder 2′-desoxygenierten Iodverbin-

dungen 39 und 41 konnten aus der 1,2-Di-O-acetyl-3-deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-

α, β-D-ribofuranose 37 bzw. dem Hoffer′schen Chlorozucker uber die Verknupfung

mit der modifizierten Nukleobase 32 und die Entfernung der notigen Schutzgruppen

produziert werden. Die Verbindung 37 und der Hoffer′sche Chlorozucker konnten uber

die literaturbekannten Synthesewege hergestellt werden. Der Syntheseweg der 2′,3′-

didesoxygenierten Iodverbindung 49 ist unbekannt und wurde aus dem kommerziell

verfugbaren 2′-Deoxyguanosin 42 uber die Substitutionsreaktion an der Nukleobase,

die Barton-McCombie-Reaktion und die Sandmeyer-Reaktion sowie die notwendige

Schutzgruppenchemie relativ arbeitsaufwendig entwickelt. Außerdem wurde das fur

die Biotinmarkierung benotigte Biotin-Azid 58 uber die Verknupfung zwischen dem

D-(+)-Biotin und dem Azidlinker 57 mit guten Ausbeuten hergestellt.

77

Die Ergebnisse der spektroskopischen Untersuchung der modifizierten NAD+ 1, 3-5

gaben an, dass alle C2-modifizierten NAD+ ein gemeinsames Absorptionsmaximum

und einen sehr ahnlichen Spektralverlauf besitzen. Die NAD+-Analoga 1, 3-5 wur-

den anschließend analog in enzymatischen Untersuchungen eingesetzt, in denen sie

sich als effiziente Substrate von ARTD1 zeigten, ebenso wurden sie zur Markierung

von ADP-Ribosylierten Proteinen (hier ARTD1 und H1.2) verwendet. Mit der syste-

matischen Modifikation der Hydroxygruppen am Adenosin erforschte man das Sub-

stratspektrum von ARTD1 bezuglich dessen Abhangigkeit vom Vorhandensein der

2′′-OH- bzw. 3′′-OH-Gruppe bei der Synthese von PAR. Wahrend 1 zum Aufbau von

langer PAR fuhrte, hatten 4 und 5 einen Kettenabbruch zur Folge, sobald sie in

Trans- oder Auto(ADP-Ribos)ylierungsreaktionen eingesetzt wurden. Dies bestatigt

die Notwendigkeit der 2′′-OH-Gruppe bei der PAR-Synthese und zeigt, dass die Ab-

wesenheit dieser Gruppe nicht durch die Anwesenheit der 3′′-OH-Gruppe kompensiert

werden kann. Daruber hinaus wurde eine Beteiligung der 3′′-OH Gruppe in der ADP-

Ribosylierung durch ARTD1 festgestellt, indem der Einsatz von 3, verglichen mit

einem Analogon, welches beide OH-Gruppen 2′′ und 3′′ aufweist (1), zu einer weniger

effizienten Synthese von PAR fuhrte. Jedoch kann dieser Effizienzverlust noch durch

Zeitverlangerung nachgeholt werden. Weiterhin wurde herausgefunden, dass die Mo-

difikationen von 5 diese Verbindung im Vergleich mit anderen in einen effektiven

Kettenterminator der PAR-Synthese in ADP-Ribosylierungsreaktionen mit naturli-

chem NAD+ umwandeln. Die erzielten Ergebnisse geben Einblick in das Substrat-

spektrum von ARTD1, sowie dessen katalytischen Mechanismus in der Trans- und

Auto(ADP-Ribos)ylierung. Zudem bereichern die vorgestellten NAD+-Analoga 1, 3-

5 das momentan beschrankte Repertoire an Werkzeugen, das zur Untersuchung von

ADP-Ribosylierungsprozessen zur Verfugung steht. Das kettenterminierende Analo-

gon 5 sollte die Identifizierung und Analyse von Zielproteinen der ADP-Ribosylierung

in der Proteomikforschung erleichtern. Erste Resultate mit Markierungen von Histon

H1.2 in vitro verliefen sehr vielversprechend, und daher wird der Weg zur Entwick-

lung neuer maßgeschneiderter chemischer Werkzeuge fur die Aufklarung des PAR

78

Metabolismus geebnet, obwohl die Ergebnisse der vorlaufigen Pulldown-Experimente

nicht erfolgreich waren.

Im Rahmen der Dissertation wurden NAD+-Analoga mit einer Alkingruppe an der

Nukleobase und die systematische Desoxygenierung der Hydroxygruppen am Adeno-

sin erfolgreich entwickelt. Diese Modifikationen ermoglichen uns hauptsachlich den

Einfluss der jeweiligen OH-Gruppe auf die Aktivitat der Elongation von ARTD1 zu

untersuchen. Jedoch wurde die Verzweigungsreaktion nicht besonders berucksichtigt.

Ob die Verzweigung der PAR-Ketten auch in vielen biologischen Prozessen eine wich-

tige Rolle spielt, konnte in diesem Fall nicht untersucht werden. Deshalb benotigt man

noch andere neue NAD+-Analoga fur zukunftige Untersuchungen der Aktivitat von

ARTs. Perspektiv sollte noch eine systematische Desoxygenierung der Hydroxygrup-

pen am Teil des β-Nicotinamidribonukleosids synthetisiert werden. Aus heutiger Sicht

konnen die Probleme zur Synthese des β-Nicotinamidribonukleosids noch durch ande-

re Synthesewege und Kenntnisse der Schutzgruppenchemie aufgelost werden. Durch

der Kreuzkupplung zwischen den systematisch desoxygenierten Adenosinmonophos-

phaten und Nicotinamidribonukleotiden werden funfzehn NAD+-Analoga erzeugt.

Wenn die Aktivitat aller NAD+-Analoga in den weiteren biochemischen Experimen-

ten durch ARTD1 vollstandig erforscht werden wurde, hatte man einen mit allen

NAD+-Werkzeuge beinhaltenden chemischen Werkzeugkasten in der Hand. Danach

konnte man mit Hilfe solcher Werkzeuge neue NAD+-konsumierende Reaktionen und

neue biologische Signalwege, die durch bekannte oder neue NAD+-konsumierende Re-

aktionen reguliert sind, entdecken und erforschen. Das ware ein enormer Erfolg in der

Grundlagenforschung der chemischen Biologie und Medizin.

79

Kapitel 5

Experimenteller Teil

5.1 Materialien und Gerate

5.1.1 Chemikalien

Alle Chemikalien wurden von den Firmen Acros, Fischer, Merck, Sigma-Aldrich oder

VWR bezogen und, falls nicht anders angegeben, ohne weitere Aufreinigung in der

Synthese eingesetzt.

5.1.2 Losungsmittel

Die absoluten Losungsmittel die fur die Synthesen verwendet wurden, wurden von

der Firma Aldrich-Sigma bezogen. Alle weiteren benotigten Losungsmittel hatten

mindestens p.a. Qualitat. Die technischen Losungsmittel fur die Saulenchromatogra-

phie wurden vor der Verwendung destilliert. Bei den Losungsmitteln beziehen sich

die angegebenen Mischungsverhaltnisse auf die eingesetzten Volumina (v/v). Fur die

chemischen Synthesen wurde vollentsalztes Wasser aus dem Leitungsnetz der Univer-

sitat Konstanz verwendet. Die molekularbiologischen Experimente wurden mit tride-

stilliertem Wasser aus einer Arium 611-Anlage von der Firma Satorius durchgefuhrt.

Ausnahmen sind explizit angegeben.

80

5.1.3 Praparative Saulenchromatographie

Die saulenchromatographische Reinigung der Produkte wurde mit Kieselgel 60 M

(Korngroße: 40-63 µm) der Firma Merck bei einem Uberdruck von 0,2-0,4 bar durch-

gefuhrt. Die jeweils verwendeten Laufmittelgemische sind an jeweiliger Stelle angege-

ben.

5.1.4 Dunnschichtchromatographie (DC)

Bei der analytischen Dunnschichtchromatographie wurden Kieselgel 60 F254 beschich-

tete Aluminiumfolien der Firma Merck verwendet. Die Visualisierung erfolgte mittels

UV-Licht bei 254 nm oder durch folgende Anfarbereagenzien:

Farbereagenz 1: (zum Anfarben der Azide):

Eine Spatelspitze festes Iods wurde in eine Kammer gegeben und es ca. 30 Min mit

Kieselgel zu sublimieren. Zum Anfarben wurden die DC-Alufolien ca. 1 Min in der

Kammer belassen.

Farbereagenz 2: (zum Anfarben der Nukleoside und Nukleotide):

Es wurde eine Losung aus 10 mL konz. Schwefelsaure, 2 mL Essigsaure, 180 mL

Ethanol, 10 mL p-Anisaldehyd hergestellt. Zum Anfarben wurden die DC-Alufolien

in die Losungen getaucht und anschließend mit Warme behandelt.

5.1.5 Ionenaustauschchromatographie (IEX)

Die Reinigung der Monophosphate erfolgte an DEAE SephadexTM A-25 (GE He-

althcare) unter Verwendung eines linearen Gradienten von TEAB-Puffer (0,1-1 M ,

pH = 7,5, Flussrate 2,5 mL/Min). Die Reinigung der Diphosphate erfolgte an Q

Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) unter Verwendung eines linearen Gradienten

von tridestilliertem Wasser/TEAB-Puffer (1 M , pH = 7,5, Flussrate 2,5 mL/Min).

Hierbei wurde ein AKTApurifierTM core System (Pumpe P-900, Monitor pH/C-900,

UV-Monitor 900, Fraktionenkollektor 920, GE Healthcare) verwendet. Der Chroma-

81

tographieverlauf wurde UV-spektroskopisch bei 254 bzw. 280 nm verfolgt. Die ge-

sammelten Fraktionen wurden per ESI-MS analysiert, zusammengehorige Fraktionen

vereinigt und bei 30 ◦C Wassertemperatur am Rotationsverdampfer vom Wasser be-

freit.

5.1.6 Mitteldruckflussigkeitschromatographie (MPLC)

Fur Stufengradienten wurde eine MPLC Anlage mit UV Monitor verwendet (λ = 254

nm). Es wurde eine RP-18 Laborfertigsaule (25-40 µm, Gotec) benutzt. Die Reinigung

erfolgte unter Verwendung eines linearen Gradienten mit Flussrate 10 mL/Min von

Acetonitril und tridestilliertem Wasser. Hierbei wurde eine Anlage von Buchi mit

den Pumpen C-605, dem UV Monitor C-630 (λ = 254 nm) und Fraktionenkollektor

C-660 verwendet. Die vereinigten Fraktionen wurden bei 30 ◦C Wassertemperatur

am Rotationsverdampfer vom Losungsmittel befreit.

5.1.7 Massenspektrometrie

ESI Massenspektren (Elektrosprayionisation) wurden auf einem Esquire 3000 plus

(Bruker) im positiven oder negativen Modus gemessen. Die Proben wurden dabei mit

einer Flussrate von 10 µL/Min eingespritzt. Hochauflosende Massenspektren (HRMS)

wurden auf einem micrOTOF II (Bruker) im positiven oder negativen Modus gemes-

sen. Die Proben wurden dabei mit einer Flussrate von 5 µL/Min direkt eingespritzt.

5.1.8 NMR-Spektren

Die Kernresonanzspektren wurden mit Bruker Avance III 400 oder Bruker Avan-

ce DRX 600 aufgenommen. Hierbei wurden alle Spektren bei 298 K in deuteriertem

Losungsmittel gemessen. Als interner Standard dienten die Resonanzsignale der nicht

vollstandig deuterierten Losungsmittel, welche auf ihre Literaturwerte kalibriert wur-

den (1H/13C). Bei den (31P)-Spektren erfolgte die Kalibrierung mit Hilfe eines zuvor

gemessenen und gespeicherten Phosphorsaurespektrums. Die angegebenen Verschie-

82

bungen (δ) sind relativ zu Tetramethylsilan (1H/13C) bzw. Phosphorsaure (31P) in

ppm angegeben. Die Kopplungs-konstanten wurden mit MestReNova ermittelt.

5.1.9 Verbrauchsmaterial fur die molekularbiologischen Ar-

beiten

Einwegspritzen Braun, Henke-Sass

G-25 MicrospinTM Saulenmaterial GE Healthcare

Handschuhe (Latex) MaiMed

Handschuhe (Nitril) VWR

Kanulen Braun

PVDF-Membran (0,45 µm) Merck Millipore

Reaktionsgefaße (200 µL) Sarstedt

Reaktionsgefaße (1,5 mL) Eppendorf

Spitzen fur Mikropipetten Peske, Aindling, Eppendorf

UV-Kuvetten aus Quarzglas Hellma

Whatman-Filterpapiere BioRad

Zentrifugenrohrchen (15 mL) Sarstedt

Zentrifugenrohrchen (50 mL) Sarstedt

5.1.10 Gerate fur die molekularbiologischen Arbeiten

Kuhl- und Gefrierschrank Premium, Liebherr, Thermo Forma

Mikropipetten Eppendorf Research

pH-Messgerat Mettler Toledo Seven Easy

UV/Vis-Spektralphotometer Varian Cary 100 bio UV/Vis Spektral-

photometer

UV/Vis-Nanodrop PeqLab Nanodrop ND-1000

Thermocycler Biometra T Gradient

83

SDS-PAGE Apparatur BioRad Mini-Protean System

SDS-PAGE Kamm Biorad Mini-Protean 10 cell oder 15

cell

SDS-PAGE Scanner BioRad GS-800TM Calibrated Densito-

meter

Spannungsquelle BioRad Power Pac 3000

Tischzentrifugen Eppendorf 5417C, 5810R, Mini Spin

Uberkopfschuttler Heidolph Reax2

Fluoreszenz-Imaging scanner FujiFilm Starion FLA-9000

Western Blot Kammer BioRad Mini Trans-Blot

Western Blot Apparatur BioRad Mini-Protean System

Scanner Canon LiDE 210

5.1.11 Enzyme

Poly(ADP-ribose) Polymerase 1 Enzo Life Sciences

Streptavidin Alkalin Phosphatase Life Technologies

Phosphodiesterase I Sigma-Aldrich

Streptavidin-haltige Magnetkugelchen Bioclone

Bei den biologischen Experimenten entsprechen alle angegeben Konzentrationen den

jeweiligen Endkonzentrationen in der Reaktionslosung.

84

5.2 Reagenzien und Puffer

5.2.1 Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB)-Puffer

695 mL Triethylamin (506 g, 5 mol) wurden mit 3 L tridestilliertem Wasser versetzt.

Circa 5 kg Trockeneis wurde bei Raumtemperatur verdampft und das entstehende

Kohlenstoffdioxid in die vorgelegte Flussigkeit eingeleitet. Anschließend wurde der

pH-Wert der Losung mit Essigsaure auf 7,5 eingestellt und mit tridestilliertem Was-

ser auf 5 L aufgefullt. Aus diesem 1 M TEAB-Puffer wurde 0,1 M Puffer durch

Verdunnung mit tridestilliertem Wasser erhalten.

5.2.2 Puffer und Losungen fur den molekularbiologischen Teil

Bezeichnung Bestandteil Konzentration

Lagerpuffer fur PARP-1 Tris-HCl pH 7,5 100 mM

β-Mercaptoethanol 14 mM

EDTA 0,5 mM

PMSF 0,5 mM

Glycerol 10 % (v/v)

10 × PARP-Reaktionspuffer Tris-HC1 pH 8,0 1,0 M

MgCl2 100 mM

DTT 10 mM

SDS-PAGE Sammelgel Tris-HCl pH 6,8 250 mM

(4 %) SDS 0,05 % (w/v)

Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) 4 % (v/v)

APS 0,05 % (w/v)

TEMED 0,25 % (v/v)

85

Bezeichnung Bestandteil Konzentration

SDS-PAGE Trenngel Tris-HCl pH 8,8 370 mM

(7,5 %) SDS 0,1 % (w/v)

Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) 7,5 % (v/v)

APS 0,1 % (w/v)

TEMED 0,1 % (v/v)

SDS-PAGE Trenngel Tris-HCl pH 8,8 370 mM

(12 %) SDS 0,1 % (w/v)

Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) 12 % (v/v)

APS 0,1 % (w/v)

TEMED 0,1 % (v/v)

6 × SDS-PAGE Ladepuffer Tris-HCl pH 6,8 225 mM

Glycerol 50 % (v/v)

SDS 5 % (w/v)

Bromphenolblau 0,05 % (v/v)

β-Mercaptoethanol 1,25 % (v/v)

DTT 10 mM

10 × SDS-PAGE Laufpuffer Tris-HCl pH 8,9 250 mM

Glycerol 2 M

SDS 1 % (w/v)

Kolloidale Coomassie- 5 × Roti-Blue (Roth) 1 × Roti-Blue

Farbelosung Methanol 20 % (v/v)

H2O 60 % (v/v)

Coomassie Entfarbelosung Methanol 25 % (v/v)

H2O 75 % (v/v)

Western Blot Transferpuffer 1 × SDS-PAGE Laufpuffer 20 % (v/v)

Methanol 20 % (v/v)

H2O 60 % (v/v)

86

Bezeichnung Bestandteil Konzentration

TBS-Tween (TBST) Tris-HCl pH 7,5 20 mM

NaCl 150 mM

Tween R© 20 0,05 % (v/v)

Western Blot Blockpuffer Magermilchpulver 5 % (w/v) in

TBST

AP-Puffer Tris-HCl pH 9,5 100 mM

NaCl 100 mM

MgCl2 100 mM

Western Blot Entwickler- BCIP-Losung 0,33 % (w/v)

Losung NBT-Losung 3,3 % (w/v)

in AP-Puffer

10 × PBS-Puffer NaCl 1,37 M

KCl 27 mM

Na2HPO4 43 mM

KH2PO4 14 mM

NaOH pH 7,5 einstellen

10 × PDE-Reaktionspuffer Tris-HC1 pH 8,9 1,1 M

NaCl 1,1 M

MgCl2 150 mM

HEPES-Puffer HEPES-Natriumsalz 100 mM

HCl pH 8,5 einstellen

87

5.3 Chemische Synthese

5.3.1 2′,3′,5′-Tri-O-acetylguanosin

7

C16H19N5O8 [409,35 g·mol−1]

70,0 mL abs. Dimethylformamid/Pyridin (5/2) und 28,4 mL (0,300 mol) Essigsaure-

anhydrid wurden zu 14,2 g (0,050mol) Guanosin suspendiert. Diese Suspension wurde

bei 75 ◦C erhitzt. Nach 4 Stunden wurde der Feststoff vollstandig ausgelost. Es ent-

stand eine gelbe Losung. 2/3 Teil des Losungsmittels wurde unter Vakuum entfernt

und die Reste bei 4 ◦C Ubernacht stehen gelassen. Der entstandene Feststoff wurde

abfiltriert und mit kaltem Isopropanol gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 18,2 g (0,045 mol), weißer Feststoff, 90 %

DC (DCM:MeOH, 9:1): Rf : 0,63

MS (ESI, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 410,13

m/z gemessen: 410,13

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 10.72 (1H, s, NH ), 7.92 (1H, s, H -8), 6.52

(2H, s, NH 2), 5.99 (1H, d, 3J = 6,0 Hz, H -1′), 5.79 (1H, t, 3J = 6,0 Hz, H -2′), 5.50

(1H, dd, 3J 1 = 5,9 Hz, 3J 2 = 4,2 Hz, H -3′), 4.38 (1H, dd, 2J = 11,2 Hz,3J = 3,6 Hz,

H -5a′), 4.33-4.30 (1H, m, H -4′), 4.26 (1H, dd, 2J = 11,2 Hz, 3J = 5,6 Hz, H -5b′),

2.11 (3H, s, COCH 3), 2.04 (3H, s, COCH 3), 2.03 (3H, s, COCH 3)

88

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 170.0, 169.4, 169.2, 156.6, 153.9, 151.1, 135.6,

116.8, 84.4, 79.5, 72.0, 70.3, 63.0, 20.5, 20.3, 20.1

5.3.2 2-Amino-6-chlor-9-[(2′,3′,5′-tri-Oacetyl)-β-D-ribofuran-

osyl]purin

8

C16H18ClN5O7 [427,80 g·mol−1]

75,0 mL abs. Acetonitril wurden zu 16,4 g (0,040 mol) 2′,3′,5′-Tri-O-acetylguanosin

suspendiert. 13,3 g (0,080 mol) Tetraethylammoniumchlorid, 5,10 mL (0,040 mol)

N,N -Dimethylanilin und 22,0 mL (0,240 mol) frisch destilliertes Phosphorylchlorid

wurden in der Reinfolge zugegeben. Die Mischung ist zu einer gelben Losung gewor-

den. Die Losung wurde unter Ruckfluss 10 Min erhitzt (Olbad wurde auf 100 ◦C

vorgeheizt). Nach kurz Abkuhlung wurden die fluchtigen Substanzen unter Vakuum

entfernt. Das entstandene gelbe Ol wurde von 150 mL Chloroform aufgenommen und

noch 100 mL destilliertes Wasser zugegeben. Das Gemisch wurde unter Eiskuhlung

15 Min geruhrt. Die Phasen wurden getrennt. Die wassrige Phase wurde noch dreimal

mit jeweils 50 mL Chloroform extrahiert. Die organische Phase wurde anschließend

dreimal mit jeweils 50 mL destilliertem Wasser und 5 % NaHCO3 gewaschen, danach

uber Na2SO4 getrocknet. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kie-

selgel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 95:5).

Ausbeute: 10,2 g (0,024 mol), weißer Feststoff, 60 %

89

DC (DCM:MeOH, 95:5): Rf : 0,55

MS (ESI, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 428,10

m/z gemessen: 428,10

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.87 (1H, s, H -8), 6.00 (1H, d, 3J = 4,9 Hz, H -1′),

5.95 (1H, t, 3J = 5,1 Hz, H -2′), 5.74 (1H, t, 3J = 5,1 Hz, H -3′), 5.27 (2H, br, NH 2),

4.46-4.34 (3H, m, H -4′, H -5′), 2.13 (3H, s, COCH 3), 2.09 (3H, s, COCH 3), 2.07 (3H,

s, COCH 3)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 170.6, 169.7, 169.4, 159.2, 153.2, 152.1, 140.8,

126.0, 86.8, 80.2, 72.9, 70.6, 63.0, 20.8, 20.6, 20.5

5.3.3 6-Chlor-2-iod-9-[(2′,3′,5′-tri-O-acetyl)-β-D-ribofuranos-

yl]purin

9

C16H16ClIN4O7 [538,68 g·mol−1]

10,2 g (0,024 mol) 2-Amino-6-chlor-9-[(2′,3′,5′-tri-O-acetyl)-β-D-ribofuranosyl]purin

wurden in 60 mL abs. Tetrahydrofuran aufgelost. 6,10 g (0,024 mol) Iod, 19,4 mL

(0,240 mol) Diiodmethan, 5,40 g (0,028 mol) Kupferiodid und 9,60 mL (0,072 mol)

Isopentylnitrit wurden in der Losung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter

Ruckfluss erhitzt. Nach 1 Stunde war das Edukt nicht mehr zu sehen. Der Feststoff

wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum trocken gezogen. Das Rohprodukt

90

wurde saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 99:1).

Ausbeute: 5,55 g (10,3 mmol), hellgelber Feststoff, 43 %

DC (DCM:MeOH, 98:2): Rf : 0,31

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 560,96

m/z gemessen: 560,98

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.19 (1H, s, H -8), 6.20 (1H, d, 3J = 5,4 Hz, H -1′),

5.78 (1H, t, 3J = 5,5 Hz, H -2′), 5.59 (1H, dd, 3J 1 = 5,5 Hz, 3J 2 = 4,4 Hz, H -3′),

4.48 (1H, q, 3J = 4,2 Hz, H -4′), 4.42 (1H, dd, 2J = 12,4 Hz, 3J = 3,3 Hz, H -5a′),

4.39 (1H, dd, 2J = 12,4 Hz, 3J = 3,5 Hz, H -5b′), 2.17 (3H, s, COCH 3), 2.14 (3H, s,

COCH 3), 2.10 (3H, s, COCH 3)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 170.3, 169.7, 169.5, 152.1, 151.2, 143.2, 132.4,

117.1, 86.8, 81.0, 73.5, 70.7, 63.1, 21.0, 20.7, 20.5

5.3.4 2-Iodadenosin

10

C10H12IN5O4 [393,14 g·mol−1]

5,40 g (10,0mmol) 6-Chlor-2-iod-9-[(2′,3′,5′-tri-O-acetyl)-β-D-ribofuranosyl]purin wu-

rden in 550mL gesattigter Ammoniak/abs. Ethanol-Losung gegeben. Die gelbe Losung

91

wurde zuerst 1 Stunde bei 0 ◦C geruhrt. Anschließend wurde langsam auf Raum-

temperatur erwarmt und anschließend weitere 24 Stunden geruhrt. Danach wurde

das Losungsmittel unter Vakuum entfernt und wieder in 50,0 mL abs. Methanol

aufgelost. 50,0 mL 50,0 mM NaOCH3 wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung

wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur geruhrt, um die restlichen Acetylgruppen zu

entfernen. Die Losung wurde danach mit saurem Ionenaustauscher neutralisiert. Der

Ionenaustauscher wurde abfiltriert und das Filtrat wurde unter Vakuum trocken gezo-

gen. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent:

DCM:MeOH 9:1).

Ausbeute: 2,68 g (6,68 mmol), hellbrauner Feststoff, 67 %

DC (DCM:MeOH, 9:1): Rf : 0,25

MS (ESI, negativ Modus): [M-H]−

m/z berechnet: 391,99

m/z gemessen: 392,03

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.29 (1H, s, H -8), 7.70 (2H, s, NH 2), 5.80 (1H,

d, 3J = 6,1 Hz, H -1′), 5.44 (1H, d, 3J = 6,2 Hz, 2′-OH ), 5.18 (1H, d, 3J = 4,9 Hz,

3′-OH ), 5.02 (1H, dd, 3J 1 = 6,2 Hz, 3J 2= 5,2 Hz, 5′-OH ), 4.52 (1H, q, 3J = 6,1 Hz,

H -2′), 4.14-4.09 (1H, m, H -3′), 3.94 (1H, q, 3J = 3,8 Hz, H -4′), 3.65 (1H, dt, 2J =

11,9 Hz, 3J = 4,6 Hz, H -5a′), 3.54 (1H, ddd, 2J = 12,0 Hz, 3J 1 = 6,3 Hz, 3J 2 = 4,0

Hz, H -5b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 155.9, 149.7, 139.4, 120.8, 119.0, 87.2, 85.8,

73.6, 70.5, 61.4

92

5.3.5 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-bezoyl-D-ribose

12

C28H24O9 [504,48 g·mol−1]

15,0 g (0,100 mol) D-Ribose wurden in 100 mL abs. Methanol zugegeben. 0,270

mL (5,00 mmol) konz. Schwefelsaure wurden langsam zu der Suspension eingetropft.

Die Reaktionsmischung wurde bei -2 ◦C Ubernacht geruhrt. Anschließend wurde das

Losungsmittel unter Vakuum bei 30 ◦C entfernt. Der entstandene Ruckstand wur-

de nun mit 25,0 mL (0,300 mol) abs. Pyridin evaporiert, um die Schwefelsaure zu

neutralisieren. Der Ruckstand wurde in 100 mL abs. Pyridin gelost und im Eisbad

auf 0 ◦C abgekuhlt. 40,0 mL (0,350 mol) Benzoylchlorid wurden innerhalb von ca.

45 Min zugetropft, wobei die Temperatur immer zwischen -1 und +1 ◦C blieb. Die

Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 0 ◦C geruhrt. Anschließend wurde die Losung

bei Raumtemperatur geruhrt, bis alle OH-Gruppen geschutzt wurden (DC Kontrol-

le). Das Pyridin wurde unter Vakuum bei 30 ◦C entfernt. Der Ruckstand wurde ins

Eiswasser gegossen und mehrmals mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase

wurde mit 1 M HCl, gesattigter NaHCO3- und NaCl-Losung jeweils dreimal ge-

waschen und uber MgSO4 getrocknet. Das Losungsmittel wurde unter Vakuum bei

30 ◦C entfernt. Der Ruckstand wurde mit 100 mL Eisessigsaure und 28,4 mL (0,300

mol) Essigsaureanhydrid versetzt, anschließend im Eisbad gekuhlt. Dann wurde diese

Losung mit 8,00 mL (0,150 mol) konz. Schwefelsaure versetzt und auf Raumtempe-

ratur erwarmt. Diese Losung wurde bei Raumtemperatur Ubernacht geruhrt. Nach

der Reaktion wurden die Essigsaure und Essigsaureanhydrid unter Vakuum bei 30 ◦C

moglichst gut entfernt. Der Ruckstand wurde ins Eiswasser gegossen. Das Produkt

wurde funfmal mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde funfmal je-

weils mit 50 mL gesattigter NaHCO3- und NaCl-Losung gewaschen und durch MgSO4

93

getrocknet. Das Losungsmittel wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur entfernt.

Der entstandene Ruckstand wurde getrocknet. Das Rohprodukt wurde saulenchro-

matographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: n-Hexan:EtOAc 3:1) und anschließend

in Isopropanol/Ethanol (5:1) umkristallisiert.

Ausbeute: 25,4 g (0,050 mol), weißer Feststoff, 50 %

DC (n-Hexan:EtOAc, 3:1): Rf : 0,47

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 527,13

m/z gemessen: 527,07

1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6): δ = 8.10 (2H, dd, 3J 1 = 8,4 Hz, 3J 2 = 1,3 Hz,

Ar-H ), 8.05 (2H, dd, 3J 1 = 8,4 Hz, 3J 2 = 1,3 Hz, Ar-H ), 7.92 (2H, dd, 3J 1 = 8,4 Hz,

3J 2 = 1,3 Hz, Ar-H ), 7.68-7.60 (3H, m, Ar-H ), 7.51 (4H, t, 3J = 7,7 Hz, Ar-H ), 7.41

(2H, td, 3J 1 = 7,6 Hz, 3J 2 = 1,7 Hz, Ar-H ), 6.42 (1H, s, H -1), 5.97 (1H, dd, 3J 1 =

7,1 Hz, 3J 2 = 4,9 Hz, H -2), 5.82 (1H, d, 3J = 4,9 Hz, H -3), 4.92-4.88 (1H, m, H -4),

4.80 (1H, dd, 2J = 12,2 Hz, 3J = 3,8 Hz, H -5a), 4.60 (1H, dd, 2J = 12,2 Hz, 3J =

4,5 Hz, H -5b), 2.01 (3H, s, COCH 3)

13C-NMR (101 MHz, Aceton-d6): δ = 169.6, 166.5, 166.1, 165.9, 134.8, 134.6, 134.3,

131.1, 130.7, 130.6, 130.5, 130.3, 130.2, 129.8, 129.7, 129.6, 99.4, 81.0, 76.3, 72.6, 64.7,

21.1

94

5.3.6 4-Chlor-5-iod-7-[(2′,3′,5′-tri-O-benzoyl)-β-D-ribofuran-

osyl]-7H -pyrrol[2,3-d]pyrimidin

14

C32H23ClIN3O7 [723,90 g·mol−1]

1,46 g (5,25 mmol) 5-Chlor-4-iod-7H -pyrrol[2,3-d]pyrimidin wurde in 30,0 mL abs.

Acetonitril suspendiert. 1,35mL (5,50mmol) N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid wurde

zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Min geruhrt. 2,52 g (5,00

mmol) 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-bezoyl-β-D-ribose und 1,00 mL (5,50 mmol) Trime-

thylsilyltriflat wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Min bei Raum-

temperatur und dann bei 80 ◦C (Olbad wurde auf 80 ◦C vorgeheizt) 1 Stunde geruhrt.

Anschließend wurde die Losung auf Raumtemperatur abgekuhlt und 50 mL Ethyla-

cetat zugegeben. Die organische Phase wurde mit NaHCO3-Losung gewaschen und

mit Na2SO4 getrocknet und das Losungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Das

Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: Cyclo-

hexan:EtOAc 3:1).

Ausbeute: 1,82 g (2,51 mmol), weißer Schaum, 50 %

DC (Cyclohexan:EtOAc, 3:1): Rf : 0,45

MS (ESI, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 724,03

m/z gemessen: 723,95

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.60 (1H, s, H -2), 8.29 (1H, s, H -6), 7,99 (2H,

dd, 3J 1 = 8,2 Hz, 3J 2 = 1,2 Hz, Ar-H ), 7,94 (2H, dd, 3J 1 = 8,2 Hz, 3J 2 = 1,2 Hz,

95

Ar-H ), 7.85 (2H, dd, 3J 1 = 8,2 Hz, 3J 2 = 1,1 Hz, Ar-H ), 7.70 -7.61 (3H, m, Ar-H ),

7.54-7.41 (6H, m, Ar-H ), 6.71 (1H, d, 3J = 5,0 Hz, H -1′), 6.29 (1H, dd, 3J 1 = 6,2

Hz, 3J 2 = 5,0 Hz, H -2′), 6.14 (1H, t, 3J = 5,8 Hz, H -3′), 4.87 (1H, q, 3J = 4,9 Hz,

H -4′), 4.80 (1H, dd, 2J = 12,1 Hz, 3J = 3,7 Hz, H -5a′), 4.68 (1H, dd, 2J = 12,1 Hz,

3J = 4,9 Hz, H -5b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 165.4, 164.6, 164.4, 151.5, 150.9, 150.7, 134.3,

133.9, 133.8, 133.5, 129.4, 129.3, 129.2, 129.1, 128.8, 128.7, 128.5, 128.2, 117.0, 86.5,

79.2, 73.5, 70.6, 63.4, 54.4

5.3.7 7-Iod-7-deazaadenosin

15

C11H13IN4O4 [392,15 g·mol−1]

1,81 g (2,50 mmol) 4-Chlor-5-iod-7-[(2′,3′,5′-tri-O-benzoyl)-β-D-ribofuranosyl]-7H -

pyrrol[2,3-d]pyrimidin wurden in 100 mL gesattigter Ammoniak/abs. Methanol-Los-

u-ng aufgelost. Die Reaktionsmischung wurde in 125 ◦C 14 Stunden bei Autoklav

erhitzt. Nach Abkuhlung wurde das Losungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Roh-

produkt wurde saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: DCM: MeOH

6:1).

Ausbeute: 0,745 g (1,90 mmol), weißer Feststoff, 76 %

DC (DCM:MeOH, 6:1): Rf : 0,40

MS (ESI, negativ Modus): [M-H]−

m/z berechnet: 390,99

96

m/z gemessen: 391,07

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.10 (1H, s, H -2), 7.67 (1H, s, H -8), 6.67 (2H,

br, NH 2), 6.02 (1H, d, 3J = 6,3 Hz, H -1′), 5.30 (1H, d, 3J = 6,4 Hz, 2′-OH ), 5.15

(1H, t, 3J = 5,5 Hz, 3′-OH ), 5.10 (1H, d, 3J = 4,7 Hz, 5′-OH ), 4.35 (1H, q, 3J =

6,2 Hz, H -2′), 4.07 (1H, q, 3J = 4,8 Hz, H -3′), 3.88 (1H, q, 3J = 3,6 Hz, H -4′), 3.62

(1H, dt, 2J = 11,8 Hz, 3J = 4,5 Hz, H -5a′), 3.53 (1H, ddd, 2J = 11,9 Hz, 3J 1 = 5,9

Hz, 3J 2 = 3,8 Hz, H -5b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 157.2, 151.9, 150.2, 127.2, 103.3, 86.8, 85.2,

73.9, 70.5, 61.6, 51.8

Allgemeines Verfahren fur die Sonogashira-Reaktion

Die Nukleoside und das Kupfer(I)-jodid wurden in 5,00 mL abs. Dimethylforma-

mid aufgelost. Unter dem Schutzgas wurden das Trimethylsilylacetylen, das Dichlor-

bis(triphenylphosphin)palladium(II) und das Triethylamin in der Reihenfolge zugege-

ben. Die Reaktionsmischung wurde unter Schutzgas und Schutz von Licht bei Raum-

temperatur Ubernacht geruhrt. Nach 16 Stunden zeigte DC, dass das Edukt schon

komplex umgesetzt wurde. 20 mL Ethylacetat wurden zugegeben. Die organische

Phase wurde mit 1 M Salzsaure (2 × 20 mL) und gesattigter NaHCO3-Losung (2

× 30 mL) noch gewaschen und mit MgSO4 getrocknet. Das Losungsmittel wurde

unter Vakuum entfernt und das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kie-

selgel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 10:1) und dann mittels RP-MPLC weiter gerei-

nigt (Eluent: Acetonitril/ddH2O). Anschließend wurden die TMS-geschutzen Ethinyl-

Nukleoside in 10,0 mL gesattigter Ammoniak/abs. Methanol-Losung gegeben. Die

Losung wurde bei Raumtemperatur geruhrt. Nach 1,5 Stunden wurde das Losungs-

mittel unter Vakuum entfernt. Das erhaltene Rohprodukt wurde mittels RP-MPLC

gereinigt (Eluent: Acetonitril/ddH2O).

97

5.3.8 2-Ethinyladenosin

17

C12H13N5O4 [291,26 g·mol−1]

Die Umsetzung erfolgte mit 0,393 g (1,00 mmol) 2-Iodadenosin und 38,1 mg (0,200

mmol) Kupfer(I)-jodid, 0,210 mL (1,50 mmol) Trimethylsilylacetylen, 70,2 mg (0,100

mmol) Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium(II) und 0,420 mL (3,00 mmol) Trie-

thylamin.

Ausbeute: 0,131 g (0,445 mmol), weißer Feststoff, 45 % uber 2 Schritte.

DC (DCM:MeOH, 6:1): Rf : 0,33

MS (HRMS, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 292,1040

m/z gemessen: 292,1026 (4,8 ppm)

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.42 (1H, s, H -8), 7.49 (2H, s, NH 2), 5.86 (1H,

d, 3J = 6,0 Hz, H -1′), 5.43 (1H, d, 3J = 6,2 Hz, 2′-OH ), 5.16-5.14 (2H, m, 3′-OH,

5′-OH ), 4.55 (1H, q, 3J = 5,8 Hz, H-2′), 4.14 (1H, q, 3J = 4,7 Hz, H -3′), 4.00 (1H,

s, CCH ), 3.95 (1H, q, 3J = 3,4 Hz, H -4′), 3.67 (1H, dt, 2J = 11,9 Hz, 3J = 4,3 Hz,

H -5a′), 3.55 (1H, ddd, 2J = 12,0 Hz, 3J 1 = 6,6 Hz, 3J 2 = 3,8 Hz, H -5b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 155.8, 149.1, 144.6, 140.7, 119.0, 87.5, 85.6,

83.2, 75.0, 73.5, 70.5, 61.5

98

5.3.9 7-Ethinyl-7-deazaadenosin

18

C13H14IN4O4 [290,27 g·mol−1]

Die Umsetzung erfolgte mit 0,392 g (1,00 mmol) 7-Iod-7-deazaadenosin und 38,1 mg

(0,200 mmol) Kupfer(I)-jodid, 0,210 mL (1,50 mmol) Trimethylsilylacetylen, 70,2

mg (0,100 mmol) Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium(II) und 0,420 mL (3,00

mmol) Triethylamin.

Ausbeute: 0,155 g (0,534 mmol), hellbrauner Feststoff, 53 % uber 2 Schritte.

DC (DCM:MeOH, 6:1): Rf : 0,40

MS (HRMS, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 291,1088

m/z gemessen: 292,1081 (2,4 ppm)

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.12 (1H, s, H -2), 7.82 (1H, s, H -8), 6.69 (2H,

br, NH 2), 6.02 (1H, d, 3J = 6,1 Hz, H -1′), 5.34 (1H, d, 3J = 6,1 Hz, 2′-OH ), 5.19

(1H, t, 3J = 5,5 Hz, 3′-OH ), 5.12 (1H, d, 3J = 4,6 Hz, 5′-OH ), 4.37 (1H, q, 3J =

5,7 Hz, H -2′), 4.27 (1H, s, CCH ), 4.08 (1H, q, 3J = 4,4 Hz, H -3′), 3.90 (1H, q, 3J =

3,5 Hz, H -4′), 3.63 (1H, dt, 2J = 11,9 Hz, 3J = 4,4 Hz, H -5a′), 3.54 (1H, ddd, 2J =

11,9 Hz, 3J 1 = 6,0 Hz, 3J 2 = 3,8 Hz, H -5b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 157.6, 152.8, 149.5, 127.5, 102.4, 93.9, 87.3,

85.3, 83.0, 77.3, 74.0, 70.5, 61.5

99

Allgemeines Verfahren fur die Monophosphorylierung

Die Ethinyl-Nukleoside und das 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin wurden in 2,00

mL Trimethylphosphat aufgelost und anschließend auf 0 ◦C abgekuhlt. Unter die-

ser Temperatur wurde das frisch destillierte Phosphorylchlorid zugegeben. Die Re-

aktionsmischung wurde bei dieser Temperatur geruhrt. Der Reaktionsverlauf wurde

mittels DC (iPrOH:H2O:NH3:3:1:1) uberpruft, bis das doppelt phosphorylierte Pro-

dukt langsam zu sehen war. Die Reaktion wurde durch Zugabe 1,50 mL 0,1 M TEAB

beendet. Die Mischung wurde 10 Min geruhrt und anschließend mit Ethylacetat zwei-

mal extrahiert. Die wasserige Phase wurde unter Vakuum bei 30 ◦C eingeengt. Das

Rohprodukt wurde uber Ionenaustauschchromatographie (TEAB: 0,1 M - 1,0 M)

gereinigt. Das aufgereinigte Produkt wurde lyophilisiert.

5.3.10 2-Ethinyladenosin-5′-monophosphat

19

C24H44N7O7P [573,62 g·mol−1]

Die Umsetzung erfolgte mit 58,0 mg (0,200 mmol) 2-Ethinyladenosin, 64,0 mg (0,300

mmol) 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin und 27,5 µL (0,300 mmol) Phosphorylchlo-

rid.

Ausbeute: 45,9 mg (0,080 mmol), brauner Feststoff, 40 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, negativ Modus): [M-2HNEt3+H]−

m/z berechnet: 370,0558

100

m/z gemessen: 370,0548 (2,7 ppm)

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 8.40 (1H, s, H -8), 5.91 (1H, d, 3J = 4,6 Hz, H -1′),

4.64 (1H, t, 3J = 5,1 Hz, H -2′), 4.44 (1H, t, 3J = 4,3 Hz, H -3′), 4.29 (1H, d, 3J =

4,8 Hz, H -4′), 4.09-4.01 (2H, m, H -5′), 3.45 (1H, s, CCH ), 3.07 (7H, q, 3J = 7,3 Hz,

(NCH 2CH3)3), 1.17 (15H, t, 3J = 7,3 Hz, (NCH2CH 3)3)

13C-NMR (101 MHz, D2O): δ = 154.6, 148.3, 144.5, 140.4, 117.8, 87.2, 83.9, 80.5,

76.3, 74.6, 70.2, 63.9, 46.5, 8.1

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = 1.24 (s)

5.3.11 7-Ethinyl-7-deazaadenosin-5′-monophsphat

20

C25H45N6O7P [572,63 g·mol−1]

Die Umsetzung erfolgte mit 58,0 mg (0,200 mmol) 7-Ethinyl-7-deazaadenosin, 64,0

mg (0,300 mmol) 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin und 27,5 µL (0,300 mmol) Phos-

phorylchlorid.

Ausbeute: 45,9 mg (0,078 mmol), brauner Feststoff, 39 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, negativ Modus): [M-2HNEt3+H]−

m/z berechnet: 369,0606

m/z gemessen: 369,0596 (2,7 ppm)

101

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 7.88 (1H, s, H -2), 7.54 (1H, s, H -8), 6.04 (1H, d,

3J = 5,4 Hz, H -1′), 4.49 (1H, t, 3J = 5,1 Hz, H -2′), 4.38 (1H, t, 3J = 4,5 Hz, H -3′),

4.24 (1H, d, 3J = 3,8 Hz, H -4′), 4.03 2H, q, 3J 1 = 5,2 Hz, 3J 2 = 4,4 Hz, H -5′), 3.58

(1H, s, CCH ), 3.08 (6H, q, 3J = 7,3 Hz, (NCH 2CH3)3), 1.18 (12H, t, 3J = 7,3 Hz,

(NCH2CH 3)3)

13C-NMR (101 MHz, D2O): δ = 155.9, 151.1, 148.1, 126.9, 102.4, 95.7, 86.5, 83.4,

82.0, 75.7, 74.2, 70.4, 64.2, 46.5, 8.1

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = 1.36 (s)

5.3.12 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-β-D-ribose

21

C13H18O9 [318,10 g·mol−1]

15,0 g (0,100 mol) D-Ribose wurden in 100 mL abs. Methanol zugegeben. 0,320

mL (6,00 mmol) konz. Schwefelsaure wurden langsam zu der Suspension eingetropft.

Die Reaktionsmischung wurde bei -2 ◦C Ubernacht geruhrt. Anschließend wurde das

Losungsmittel unter Vakuum bei 30 ◦C entfernt. Der entstandene Ruckstand wur-

de nun mit 25,0 mL (0,300 mol) abs. Pyridin evaporiert, um die Schwefelsaure zu

neutralisieren. Der Ruckstand wurde in 100 mL abs. Pyridin gelost und im Eisbad

auf 0 ◦C abgekuhlt. 28,4 mL (0,300 mol) Essigsaureanhydrid wurden innerhalb von

ca. 45 Min zugetropft, wobei die Temperatur immer zwischen -1 und +1 ◦C blieb.

Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 0 ◦C geruhrt. Anschließend wurde die

Losung bei Raumtemperatur geruhrt, bis alle OH-Gruppen geschutzt wurden (DC

Kontrolle). Das Pyridin und Uberschuss von Essigsaureanhydrid wurden unter Vaku-

um bei 30 ◦C entfernt. Der Ruckstand wurde ins Eiswasser gegossen und mehrmals

102

mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit 1 M HCl, gesattigter

NaHCO3- und NaCl-Losung jeweils dreimal gewaschen und uber MgSO4 getrocknet.

Das Losungsmittel wurde unter Vakuum bei 30 ◦C entfernt. Der Ruckstand wurde mit

140 mL Eisessigsaure und 28,4 mL (0,300 mol) Essigsaureanhydrid versetzt, anschlie-

ßend im Eisbad abgekuhlt. Dann wurde diese Losung mit 8,00 mL (0,150 mol) konz.

Schwefelsaure versetzt und auf Raumtemperatur erwarmt. Diese Losung wurde bei

Raumtemperatur Ubernacht geruhrt. Nach der Reaktion wurden die Essigsaure und

Essigsaureanhydrid unter Vakuum bei 30 ◦C moglichst gut entfernt. Der Ruckstand

wurde ins Eiswasser gegossen. Das Produkt wurde funfmal mit Ethylacetat extra-

hiert. Die organische Phase wurde funfmal jeweils mit 50 mL gesattigter NaHCO3-

und NaCl-Losung gewaschen und durch MgSO4 getrocknet. Das Losungsmittel wur-

de unter Vakuum bei Raumtemperatur entfernt. Der entstandene Ruckstand wurde

getrocknet. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt

(Eluent: n-Hexan:EtOAc 1:1) und anschließend mit Hilfe von einigen Impfkristallen

in Wasser umkristallisiert.

Ausbeute: 7,80 g (0,025 mol), weißer Stoff, 50 %

DC (n-Hexan:EtOAc 1:1): Rf : 0,48

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 341,08

m/z gemessen: 341,11

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 6.15 (1H, s, H -1), 5.35-5.32 (2H, m, H -2, H -3),

4.38-4.34 (1H, m, H -4), 4.32 (1H, dd, 2J = 11,9 Hz, 3J = 3,6 Hz, H -5a), 4.14 (1H,

dd, 2J = 11,8 Hz, 3J = 5,2 Hz, H -5b), 2.11 (1H, s, COCH 3), 2.09 (1H, s, COCH 3),

2.08 (1H, s, COCH 3), 2.06(1H, s, COCH 3)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 170.5, 169.8, 169.5, 169.1, 98.3, 79.5, 74.3, 70.7,

63.8, 21.1, 20.8, 20.6, 20.5

103

5.3.13 3-(Carbamoyl)-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-Dribofuranosy-

l)pyridiniumtriflat

22

C18H21F3N2O11S [530,43 g·mol−1]

0,640 g (2,00 mmol) 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-β-D-ribose und 0,270 g (2,20 mmol) Ni-

cotinamid wurden in 15,0 mL abs. Acetonitril aufgelost. 0,400 mL (2,20 mmol)

Trimethylsilyltriflat wurden langsam zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei

Raumtemperatur geruhrt. Nach 6 Stunden wurde das Losungsmittel unter Vakuum

entfernt. Das Rohprodukt wurde mittels RP-MPLC gereinigt (Eluent: Acetonitril/dd-

H2O).

Ausbeute: 0,779 g (1,47 mmol), weißer Schaum, 74 %

DC (n-BuOH:H2O:AcOH 5:3:2): Rf : 0,38

MS (ESI, positiv Modus): [M-OTf]+

m/z berechnet: 381,13

m/z gemessen: 381,10

1H-NMR (400 MHz, MeOD4): δ = 9.60 (1H, s, H -2), 9.28 (1H, d, 3J = 6,3 Hz,

H -6), 9.09 (1H, d, 3J = 8,1 Hz, H -4), 8.34 (1H, dd, 3J 1 = 7,9 Hz, 3J 2 = 6,3 Hz,

H -5), 6.58 (1H, d, 3J = 3,9 Hz, H -1′), 5.58 (1H, dd, 3J 1 = 5,6 Hz, 3J 2 = 3,9 Hz,

H -2′), 5.44 (1H, t, 3J = 5,6 Hz,H -3′), 4.82-4.80 (1H, m, H -4′), 4.60 (1H, dd, 2J =

12,9 Hz, 3J = 3,3 Hz, H -5a′), 4.49 (1H, dd, 2J = 12,9 Hz, 3J = 2,6 Hz, H -5b′), 2.18

(3H, s, COCH 3), 2.16 (3H, s, COCH 3), 2.14 (3H, s, COCH 3)

104

13C-NMR (101 MHz, MeOD4): δ = 172.1, 171.6, 171.2, 164.9, 146.9, 144.3, 142.3,

136.2, 129.5, 123.4, 120.2, 99.4, 84.4, 77.6, 70.6, 63.4, 20.7, 20.3

5.3.14 3-(Ethoxycarbonyl)-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-D-ribofur-

anosyl)pyridiniumtriflat

23

C20H24F3NO12S [559,46 g·mol−1]

0,960 g (3,00 mmol) 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-β-D-ribose wurden in 25,0 mL abs. Di-

chlormethan aufgelost. 0,610 mL (4,50 mmol) Ethylnicotinat und 0,570 mL (3,15

mmol) Trimethylsilyltriflat wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter

Ruckfluss erhitzt. Nach 6 Stunden wurde das Losungsmittel unter Vakuum entfernt.

Das Rohprodukt wurde mittels RP-MPLC gereinigt (Eluent: Acetonitril/ddH2O).

Ausbeute: 1,04 g (1,86 mmol), farbloses Ol, 62 %

DC (n-BuOH:H2O:AcOH 5:3:2): Rf : 0,50

MS (ESI, positiv Modus): [M-OTf]+

m/z berechnet: 410,14

m/z gemessen: 410,12

1H-NMR (400 MHz, MeOD4): δ = 9.63 (1H, s, H -2), 9.35 (1H, d, 3J = 6,3 Hz, H -6),

9.18 (1H, d, 3J = 8,1 Hz, H -4), 8.38 (1H, dd, 3J 1 = 7,9 Hz, 3J 2 = 6,4 Hz, H -5), 6.63

(1H, d, 3J = 4,0 Hz, H -1′), 5.57 (1H, dd, 3J 1 = 5,5 Hz, 3J 2 = 4,1 Hz, H -2′), 5.45

105

(1H, t, 3J = 5,5 Hz, H -3′), 4.82 (1H, dt, 3J 1 = 5,6 Hz, 3J 2 = 2,9 Hz, H -4′), 4.62-4.48

(4H, m, H -5′, OCH 2CH3), 2.19 (3H, s, COCH 3), 2.16 (3H, s, COCH 3), 2.15 (3H, s,

COCH 3), 1.46 (3H, t, 3J = 7,1 Hz, OCH2CH 3)

13C-NMR (101 MHz, MeOD4): δ = 172.0, 171.5, 171.2, 162.6, 148.9, 145.3, 143.1,

132.8, 129.9, 99.2, 84.5, 77.6, 70.6, 64.4, 63.4, 20.7, 20.5, 20.3, 14.3, 9.2

Allgemeines Verfahren fur die Synthese von NAD+-Analoga

Das β-Nicotinamidribosemonophosphat wurde in 0,100 mL abs. Dimethylformamid

aufgelost. Das 1,1′-Carbonyldiimidazol und das Triethylamin wurden zugegeben. Die

Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden geruhrt. Danach wurde

die Reaktion mit 0,100 mL abs. Methanol gequencht. Das Losungsmittel wurde un-

ter Vakuum bei 30 ◦C entfernt und der Ruckstand wurde dreimal mit jeweils 1,00

mL abs. Dimethylformamid koevaporiert. Die modifizierten Monophosphate wurden

in 0,100 mL abs. Dimethylformamid aufgelost und zu dem aktivierten Nicotinamid-

β-monophosphat gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur geruhrt. Nach

4 Tagen war das Edukt nicht mehr zu sehen. Die Reaktionsmischung wurde in 2,00

mL 0,1 M TEAB aufgenommen. Die wassrige Phase wurde dreimal mit Chloroform

extrahiert und danach unter Vakuum bei 30 ◦C eingeengt. Das Rohprodukt wur-

de uber Ionenaustauschchromatographie (Q Sepharose, 1,0 M TEAB/ddH2O) und

RP-HPLC (50 mM TEAB/ddH2O) aufgereinigt. Das aufgereinigte Produkt wurde

lyophilisiert.

106

5.3.15 2A-Ethinyl-NAD+

1

C29H42N8O14P2 [788,64 g·mol−1]

Die Umsetzung erfolgte mit 10,0 mg (0,030 mmol) β-Nicotinamidribosemonophosph-

at, 16,2 mg (0,100 mmol) 1,1′-Carbonyldiimidazol und 4,45 µL (0,032 mmol) Trie-

thylamin und 11,5 mg (0,020 mmol) 2-Ethinyladenosin-5′-monophosphat.

Ausbeute: 3,09 mg (3,92 µmol), brauner Feststoff, 20 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, positiv Modus): [M-HNEt3+2H]+

m/z berechnet: 668,1164

m/z gemessen: 668,1172 (1,2 ppm)

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 9.34 (1H, s, HN -2), 9.10 (1H, d, 3J = 6,2 Hz, HN -6),

8.91 (1H, d, 3J = 8,1 Hz, HN -4), 8.50 (1H, s, HA-8), 8.25 (1H, dd, 3J 1 = 7,8 Hz,

3J 2 = 6,4 Hz, HN -5), 6.03 (1H, d, 3J = 5,4 Hz, H -1′′), 5.98 (1H, d, 3J = 5,8 Hz,

H -1′), 4.82 (1H, s, H -2′′), 4.55 (1H, dd, 3J 1 = 5,3 Hz, 3J 2 = 3,7 Hz, H -3′′), 4.51

(1H, t, 3J = 2,4 Hz, H -4′), 4.47 (1H, t, 3J = 5,2 Hz, H -2′), 4.45-4.41 (2H, m, H -3′,

H -4′′), 4.31-4.21 (4H, m, H -5′, H -5′′), 3.55 (1H, s, CCH ), 3.23 (8H, q, 3J = 7,3 Hz,

(NCH 2CH3)3), 1.31 (14H, t, 3J = 7,3 Hz, (NCH2CH 3)3)

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = -11.32 (1P, d, 3J = 21,0 Hz), -11.67 (1P, d, 3J =

21,0 Hz)

107

5.3.16 7DA-Ethinyl-7-deazaNAD+

2

C30H43N7O14P2 [787,65 g·mol−1]

Die Umsetzung erfolgte mit 10,0 mg (0,030 mmol) β-Nicotinamidribosemonophosph-

at, 16,2 mg (0,100 mmol) 1,1′-Carbonyldiimidazol und 4,45 µL (0,032 mmol) Trie-

thylamin und 11,5 mg (0,020 mmol) 7-Ethinyl-7-deazaadenosin-5′-monophosphat.

Ausbeute: 2,64 mg (3,35 µmol), brauner Feststoff, 17 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, positiv Modus): [M-HNEt3+2H]+

m/z berechnet: 687,1211

m/z gemessen: 687,1213 (0,29 ppm)

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 9.34 (1H, s, HN -2), 9.14 (1H, d, 3J = 6,0 Hz, HN -6),

8.76 (1H, d, 3J = 8,0 Hz, HN -4), 8.17 (1H, t, 3J = 7,1 Hz, HN -5), 8.07 (1H, s, HA-2),

7.69 (1H, s, HA-8), 6.13 (2H, t, 3J = 5,0 Hz, H -1′, H -1′′), 4.64-4.61 (2H, m, H -4′,

H -2′′), 4.49-4.43 (4H, m, H -2′, H -3′, H -3′′, H -4′′), 4.36 (1H, s, H -5a′), 4.29-4.23 (3H,

m, H -5b′, H -5′′), 3.78 (1H, s, CCH ), 3.23 (4H, q, 3J = 7,3 Hz, (NCH 2CH3)3), 1.31

(7H, t, 3J = 7,3 Hz, (NCH2CH 3)3)

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = -11.22 (1P, d, 3J = 19,8 Hz), -11.59 (1P, d, 3J =

19,8 Hz)

108

5.3.17 3-Azidopropyl-1-amino-sulfocyanin 5 (Sulfo-Cy5-Azid)

27

C42H61N7O7S2 [840,11 g·mol−1]

25,0 mg Sulfo-Cy5-NHS-Ester (33,2 µmol) wurden mit 10,0 mg 3-Azido-1-propanam-

in (100 µmol) und 13,9 µL Triethylamin (100 µmol) in 2,50 mL abs. Dimethylfor-

mamid gemischt und bei Raumtemperatur fur 12 Stunden geruhrt. Das Ethylacetat

wurde zugegeben, um das Produkt auszufallen. Anschließnd wurde die ausgefallene

Substanz abfiltriert. Der Filterkuchen wurde noch zweimal mit Ethylacetat gewaschen

und danach unter Vakuum bei 30 ◦C getrocknet. Das Rohprodukt wurde mittels RP-

HPLC weiter gereinigt (Eluent: 50 mM TEAB/ddH2O). Das aufgereinigte Produkt

wurde lyophilisiert.

Ausbeute: 12,5 mg (14,9 µmol), blauer Feststoff, 45 %

MS (HRMS, negativ Modus): [M-HNEt3]−

m/z berechnet: 737,2797

m/z gemessen: 737.2794 (0,41 ppm)

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 7.98 (2H, td, 3J 1 = 13,1 Hz, 3J 2 = 7,3 Hz, CH β,

CH β′), 7.84-7.78 (4H, m, Ar-H ), 7.30 (1H, d, 3J = 8,4 Hz, Ar-H ), 7.27 (1H, d,

3J = 8,3 Hz, Ar-H ), 6.48 (1H, t, 3J = 12,4 Hz, CH γ), 6.20 (1H, d, 3J = 13,7 Hz,

CH α), 6.13 (1H, d, 3J = 13,6 Hz, CH α′), 4.06 (2H, t, 3J = 7,3 Hz, N+-CH 2), 4.00

109

(1H, t, 3J = 7,0 Hz, N-CH 2) 3.22 (8H, p, 3J 1 = 7,3 Hz, 3J 2 = 6,9 Hz, CONH-CH 2,

HN(CH 2CH3)3, 3.12 (2H, t, 3J = 6,8 Hz, N3-CH 2), 2.18 (2H, t, 3J = 7,0 Hz, CH 2-

CONH), 1.75 (2H, p, 3J = 7,3 Hz, N+-CH2-CH 2), 1.64-1.54 (16H, m, 2 × C(CH 3)2,

N3-CH2-CH 2, CH 2-CH2-CONH), 1.30 (14H, t, 3J = 7.3 Hz, N-CH2CH 3, N+-CH2-

CH2-CH 2, HN(CH2CH 3)3)

13C-NMR (101 MHz, D2O): δ = 175.7, 173.4, 162.7, 143.8, 141,4, 139.9, 126.7, 119.7,

110.8, 49.0, 48.9, 48.7, 46.7, 45.7, 36.5, 35.4, 27.8, 26.9, 26.7, 25.4, 11.7, 8.3

5.3.18 N2, 9-Diacetylguanin

29

C9H9N5O3 [235,20 g·mol−1]

7,55 g (0,050 mol) Guanin, 90,0 mL Essigsaureanhydrid, 180 mL Essigsaure und

0,611 g (0,050 mol) 4-(Dimethylamino)pyridin wurden in einem Kolben gegeben. Die

Reaktionsmischung wurde bei 125 ◦C erhitzt. Nach 18 Stunden entstand eine klare

Losung. Das Losungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Ruckstand wurde noch

mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen und abfiltriert. Der Feststoff wurde

unter Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 9,39 g (0,040 mol), weißer Feststoff, 80 %

DC (DCM:MeOH, 10:1): Rf : 0,27

MS (HRMS, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 258,0598

m/z gemessen: 258,0598

110

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.45 (1H, s, H -8), 2.82 (3H, s, OCH 3), 2.21

(3H, s, COCH 3)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 173.8, 168.0, 154.7, 148.4, 147.9, 137.5, 121.5,

24.7, 23.9

5.3.19 2-Amino-6-chlorpurin

30

C5H4ClN5 [169,57 g·mol−1]

9,39 g (0,040 mol) N2,9-Diacetylguanin, 18,2 g (0,120 mol) Methyltriethylammonium-

chlorid und 5,56 mL (0,040 mol) Triethtylamin wurden in 100 mL abs. Acetonitril

zugegeben und auf 50 ◦C erhitzt. 7,33 mL (0,080 mol) Phosphorylchlorid wurden

dann bei dieser Temperatur langsam gegeben. Danach wurde die Reaktionsmischung

bei 50 ◦C noch weitere 4 Stunden geruhrt. Nach Abkuhlung wurde NaOH- Losung

(24,0 g in 150 mL) zugegeben und bei 80 ◦C 2 Stunden erhitzt. Dann wurden 100

mL destilliertes Wasser dazugegossen und auf Raumtemperatur abgekuhlt. Mit 10 %

HCl-Losung wurde der pH-Wert auf 7 gestellt. Die Mischung wurde 15 Min bei Raum-

temperatur geruhrt und dann bei 4 ◦C Ubernacht stehen gelassen. Der entstandene

Niederschlag wurde abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und unter Vakuum

getrocknet.

Ausbeute: 9,39 g (0,040 mol), weißer Feststoff, 80 %

DC (DCM:MeOH, 10:1): Rf : 0,38

MS(HRMS, negativ Modus): [M-H]−

m/z berechnet: 168,0082

111

m/z gemessen: 168,0080 (1,2 ppm)

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 12.83 (1H, s, NH ), 8.08 (1H, s, H -8), 6.75 (2H,

s, NH 2)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 159.9, 155.0, 149.0, 141.3, 123.2

5.3.20 9-Acetyl-2-amino-6-chlorpurin

31

C7H6ClN5O [211,61 g·mol−1]

5,08 g (0,030 mol) 2-Amino-6-chlorpurin, 8,50 mL (0,090 mol) Essigsaureanhydrid

und 12,5 mL (0,090 mol) Triethylamin wurden zusammen gemischt. Das Gemisch

wurde bei 80 ◦C 1,5 Stunden geruhrt. Danach wurde 50 mL Toluol zugegeben und

der Feststoff wurde abfiltriert und noch dreimal mit 15 mL Isopropanol gewaschen.

Der Feststoff wurde dann unter Vakuum abgetrocknet.

Ausbeute: 3,80 g (0,018 mol), brauner Feststoff, 60 %

DC (DCM:MeOH, 10:1): Rf : 0,40

MS (HRMS, positiv Modus): [M-H]−

m/z berechnet: 210,0188

m/z gemessen: 210,0188

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.54 (1H, s, H -8), 7,26 (2H, s, NH 2), 2,82 (3H,

s, COCH 3)

112

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 167.9, 160.3, 153.1, 150.3, 139.9, 124.2, 24.7

5.3.21 6-Chlor-2-iodpurin

32

C5H2ClIN4 [280,45 g·mol−1]

3,60 g (0,017 mol) 9-Acetyl-2-amino-6-chlorpurin, 3,30 g (0,026 mol) Iod und 8,30

mL (0,062 mol) Isopentylnitrit wurden in 50,0 mL abs. Tetrahydrofuran zusammen

gemischt. Das Gemisch wurde bei 55 ◦C 2 Stunden geruhrt. Danach wurde 100 mL

15 % Na2S2O3 zugegeben und mit Methylisobutylketon extrahiert. Die orgainsche

Phase wurde dann noch mehrmals mit 10 % NaOH-Losung extrahiert. Der pH-Wert

der wassrigen Phase wurde auf pH 4-5 gestellt und bei 4 ◦C Ubernacht stehen gelassen.

Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und unter

Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 1,82 g (6,50 mmol), gelber Feststoff, 50 %

DC (DCM:MeOH, 10:1): Rf : 0,57

MS (HRMS, positiv Modus): [M-H]−

m/z berechnet: 278,8940

m/z gemessen: 278,8940

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 14.02 (1H, s, NH ), 8.63 (1H, s, H -8)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 154.7, 147.8, 146.9, 130.3, 117.4

113

5.3.22 1,2-O-Isopropyliden-5-O-(4-methybenzoyl)-α-D-xylo-

furanose

34

C16H20O6 [308,33 g·mol−1]

15,0 g (0,100 mol) D-Xylose wurden in 300 mL abs. Aceton suspendiert und mit

10,7 mL konz. (0,200 mol) Schwefelsaure versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei

Raumtemperatur geruhrt. Nach 1 Stunde ist das Gemisch klar geworden. Die Losung

wurde auf 0 ◦C abgekuhlt und mit NaOH neutralisiert (pH 7). Das Salz wurde ab-

filtriert und noch mit Aceton gewaschen. Das Losungsmittel wurde unter Vakuum

entfernt. Der Ruckstand wurde mit 50 mL destilliertem Wasser versetzt und mehr-

fach mit n-Hexan extrahiert. Die wassrige Phase wurde unter Vakuum eingeengt. Das

Produkt wurde dreimal mit Ethanol/Toluol (1:1) koevaporiert und bis Gewichtskon-

stanz eingetrocknet. 14,7 g (0,077 mol) Produkt wurden mit 10,0 mL abs. Pyridin

koevaporiert und dann in 50,0 mL abs. Pyridin aufgelost. Die Losung wurde in einem

Eisbad auf 0 ◦C abgekuhlt. 10,3 mL (0,077 mol) p-Toluoylchlorid wurden innerhalb

von ca. 30 Min zugetropft, wobei die Temperatur immer zwischen -1 und +1 ◦C

blieb. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 0 ◦C geruhrt. Anschließend wurde

die Losung auf Eis gegossen und mit Ethylacetat mehrmals extrahiert. Die organische

Phase wurde noch mit 1 M Salzsaure dreimal gewaschen und mit MgSO4 getrocknet.

Das Losungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und das Produkt unter Vakuum bis

Gewichtskonstanz eingetrocknet.

Ausbeute: 20,6 g (0,067 mol), weißer Feststoff, 87 %

DC (n-Hexan:EtOAc 2:1): Rf : 0,38

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

114

m/z berechnet: 331,12

m/z gemessen: 331,17

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.93 (2H, d, 3J = 8,2 Hz, Ar-H ), 7.24 (2H, d, 3J

= 8,0 Hz, Ar-H ), 5.95 (1H, d, 3J = 3,6 Hz, H -1), 4.76 (1H, q, 3J = 9,1 Hz, H -2),

4.58 (1H, d, 3J = 3,6 Hz, H -3), 4.93-4.35 (2H, m, H -5), 4.18 (1H, d, 3J = 2,2 Hz,

H -4), 2.41 (3H, s, Ar-CH 3), 1.50 (3H, s, CCH 3), 1.32 (3H, s, CCH 3)

1H-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 167.6, 144.5, 130.1, 129.3, 126.6, 112.0, 104.9,

85.2, 78.7, 74.5, 61.4, 26.9, 26.3, 21.8

5.3.23 3-Deoxy-1,2-O-isopropyliden-5-O-(4-methylbenzoyl)-α-

D-ribofuranose

35

C16H20O5 [292,33 g·mol−1]

15,4 g (0,050 mol) 1,2-O-Isopropyliden-5-O-(methybenzoyl)-α-D-xylofuranose wur-

den in 150mL abs. Acetonitril aufgelost und dann mit 30,5 g (0,250mol) 4-(Dimethyl-

amino)pyridin umgesetzt. 8,30 mL (0,060 mol) Phenylchlorthionocarbonat wurden

zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur geruhrt. Nach 2 Stun-

den wurde das Losungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Ruckstand wurde mit

100 mL Ethylacetat aufgenommen und zweimal mit 1 M HCl, gesattigter NaHCO3-

Losung gewaschen. Das Ethylacetat wurde unter Vakuum entfernt. 17,8 g (0,040 mol)

1,2-O-Isopropyliden-5-O-(4-methybenzoyl)-3-O-(phenoxythiocarbony-l)-α-D-xylofur-

anose wurden in 250 mL abs. Toluol aufgelost. 1,32 g (8,00 mmol) AIBN und 15,9 mL

115

(0,060 mol) Tributylzinnhydid wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei

75 ◦C bis zum Verschwinden des Edukts erhitzt. Nach 5 Stunden wurde das Losungs-

mittel unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an

Kieselgel gereinigt (Eluent: n-Hexan:Diethyleter 9:1 - 4:1).

Ausbeute: 8,89 g (0,031 mol), farbloses Ol, 76 %

DC (n-Hexan:Diethyleter 4:1): Rf : 0,28

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 315,12

m/z gemessen: 315,15

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.93 (2H, d, 3J = 8,2 Hz, Ar-H ), 7.21 (2H, d,

3J= 8,0 Hz, Ar-H ), 5.85 (1H, d, 3J = 3,7 Hz, H -1), 4.75 (1H, t, 3J = 4,2 Hz, H -2),

4.54 (2H, ddd, 3J 1 = 10,3 Hz, 3J 2 = 5,5 Hz, 3J 3 = 3,5 Hz, H -4), 4.49 (1H, dd, 2J =

11,7 Hz, 3J = 3,5 Hz, H -5a), 4.33 (1H, dd, 2J = 11,7 Hz, 3J = 5,4 Hz, H -5b), 2.38

(3H, s, Ar-OCH 3), 2.16 (1H, dd, 2J = 13,2 Hz, 3J = 4,2 Hz, H -3a), 1.74 (1H, ddd,

2J = 13,0 Hz, 3J 1 = 10,4 Hz, 3J 2 = 4,6 Hz, H -3b), 1.52 (3H, s, CCH 3), 1.31 (3H, s,

CCH 3)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 166.4, 143.8, 129.8, 129.1, 127.2, 111.4, 105.8,

80.4, 75.9, 65.2, 35.5, 26.8, 26.2, 21.7

5.3.24 3-Deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-α,β-D-ribofuranose

36

C13H16O5 [252,26 g·mol−1]

116

5,82 g (0,020 mol) 3-Deoxy-1,2-O-isopropyliden-5-O-(4-methylbenzoyl)-α-D-ribofur-

anose wurden in 150 mL Acetonitril aufgelost, dann mit 10,0 mL destilliertem Wasser

und 4,56 g (0,024 mol) p-Toluolsulfonsaure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde

bei Raumtemperatur 48 Stunden geruhrt. Nach DC war das Edukt nicht mehr zu se-

hen. 200 mL gesattigte NaHCO3-Losung wurden zugegeben und dreimal mit jeweils

100 mL Chloroform extrahiert. Die organische Phase wurde danach mit NaCl-Losung

gewaschen, uber MgSO4 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde saulen-

chromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: EtOAc:n-Hexan 3:1). Es entstand

ein farbloses Ol, das nach einigem Stehen bei 4◦C kristallisiert.

Ausbeute: 4,20 g (0,017 mol), weißer Feststoff, 85 %

DC (EtOAc:n-Hexan 3:1): Rf : 0,36

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 275,09

m/z gemessen: 275,07

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.93 (4H, d, 3J = 8,5 Hz, Ar-H ), 7.23 (4H, d, 3J=

7,2 Hz, Ar-H ), 5.42 (1H, d, 3J = 4,0 Hz, H -1α), 5.33 (1H, s, H -1β), 4.73-4.62 (2H,

m, H -4αβ), 4.42-4.31 (5H, m, H -2αβ, H -5aa′b), 4.25 (1H, dd, 2J = 11,8 Hz, 3J = 5,4

Hz, H -5b′), 2.40 (3H, s, Ar-CH 3), 2.39 (3H, s, Ar-CH 3), 2.17-2.03 (4H, m, H -3)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 166.9, 166.7, 144.1, 129.9, 129.3, 127.3, 127.2,

103.2, 97.2, 76.5, 75.9, 71.8, 67.7, 66.5, 34.8, 34.1, 21.8

117

5.3.25 1,2-Di-O-acetyl-3-deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-α,β-D-

ribofuranose

37

C17H20O7 [336,34 g·mol−1]

4,20 g (0,017 mol) 3-Deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-α,β-D-ribofuranose wurden in

50,0 mL abs. Pyridin aufgelost. 6,50 mL Essigsaureanhydrid (0,069 mol) wurden zu-

gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur geruhrt. Nach 3 Stun-

den war das Edukt nicht mehr zu sehen. Unter starkem Ruhren wurden Eis und

NaHCO3-Losung in die Losung gegossen. Die wasserige Phase wurde mehrmals mit

Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde jeweils zweimal mit 1 M HCl,

NaCl-Losung gewaschen und uber MgSO4 getrocknet. Das Losungsmittel wurde un-

ter Vakuum bei 30 ◦C entfernt. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an

Kieselgel gereinigt (Eluent: n-Hexan:EtOAc 2:1).

Ausbeute: 5,20 g (0,015 mol), farbloses Ol, 88 %

DC (n-Hexan:EtOAc 2:1): Rf : 0,52

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 359,11

m/z gemessen: 359,16

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.94 (2H, d, 3J = 7,9 Hz, Ar-H ), 7.23 (2H, d, 3J =

8,0 Hz, Ar-H ), 6.43 (0,25H, d, 3J = 4,3 Hz, H -1α), 6.19 (0,75H, s, H -1β), 5.31 (0,3H,

td, 3J 1 = 8,4 Hz, 3J 2 = 4,4 Hz, H -4), 5.23 (0,7H, d, 3J = 4,5 Hz, H -4), 4.74-4.67

(1H, m, H -2), 4.50 (0,8H, dd, 2J = 11,9 Hz, 3J = 3,8 Hz, H -5a), 4.42 (0,2H, dd, 2J

= 12,0 Hz, 3J = 3,4 Hz, H -5a), 4.32 (1H, dd, 2J = 11,9 Hz, 3J = 5,5 Hz, H -5b), 2.41

118

(3H, s, Ar-CH 3), 2.17-2.03

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 170.2, 170.1, 169.9, 169.4, 166.5, 166.4, 144.1,

129.9, 129.8, 129.4, 129.2, 127.2, 127.0, 99.6, 94.9, 78.9, 75.9, 71.9, 66.0, 65.9, 31.7,

30.0, 21.8, 21.2, 21.0, 20.7

5.3.26 6-Chlor-2-iod-9-[(2′-O-acetyl-3′-deoxy-5′-O-(4-methy-

lbenzoyl)-β-D-ribofuranosyl]purin

38

C20H18ClIN4O5 [556,74 g·mol−1]

1,40 g (5,00 mmol) 6-Chlor-2-iodpurin wurde in 100 mL abs. Acetonitril suspen-

diert. 1,40 mL (5,50 mmol) N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid wurde zugegeben. Die

Mischung wurde bei Raumtemperatur geruhrt, bis eine klare Losung entstand. 1,90 g

(5,50mmol) 1,2-Di-O-acetyl-3-deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-α,β-D-ribofuranose und

1,00 mL (5,50 mmol) Trimethylsilyltriflat wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch

wurde 15 Min bei Raumtemperatur und dann bei 80 ◦C (Olbad wurde auf 80 ◦C

vorgeheizt) 1 Stunde geruhrt. Anschließend wurde die Losung auf Raumtempera-

tur abgekuhlt und 30 mL Ethylacetat zugegeben. Die organische Phase wurde mit

NaHCO3-Losung gewaschen und mit Na2SO4 getrocknet. Das Losungsmittel wurde

unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kiesel-

gel gereinigt (Eluent: n-Hexan:EtOAc 1:1).

Ausbeute: 1,83 g (3,30 mmol), weißer Schaum, 66 %

DC (n-Hexan:EtOAc 2:3): Rf : 0,41

119

MS (HRMS, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 578,9903

m/z gemessen: 578,9878 (4,3 ppm)

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.14 (0,53H, s, H -8), 8.12 (0,49H, s, H -8), 7.80-

7.77 (2H, m, Ar-H ), 7.20 (2H, d, 3J = 8,4 Hz, Ar-H ), 6.07 (0,35H, d, 3J = 1,2 Hz,

H -1′), 6.04 (0,65H, d, 3J = 1,5 Hz, H -1′), 5.94 (0,35H, d, 3J = 5,2 Hz, H -2′), 5.77

(0,65H, d, 3J = 6,2 Hz, H -2′), 4.81-4.75 (1H, m, H -4′), 4.72 (1H, dt, 2J = 12,3 Hz,

3J = 3,5 Hz, H -5a′), 4.51 (1H, dt, 2J = 12,3 Hz, 3J = 4,6 Hz, H -5b′), 2.78 (1H, ddd,

2J = 14,1 Hz, 3J 1 = 10,1 Hz, 3J 2 = 6,2 Hz, H -3a′), 2.40 (3H, s, Ar-CH 3), 2.36 (1H,

ddd, 2J = 14,0 Hz, 3J 1 = 5,8 Hz, 3J 2 = 1,6 Hz, H -3b′), 2.17 (3H, s, COCH 3)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 170.4, 166.3, 166.2, 159.9, 151.5, 151.4, 151.0,

150,9, 144.5, 144.4, 144.2, 144.1, 132.4, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 126.6, 126.5, 116.8,

116.7, 90.8, 90.6, 79.7, 79.6, 77.9, 75.9, 64.5, 64.2, 33.1, 32.9, 21.8, 21.0

5.3.27 2-Iod-3′-deoxyadenosin

39

C10H12IN5O3 [377,14 g·mol−1]

1,67 g (3,00 mol) 6-Chlor-2-iod-9-[(2′-O-acetyl-3′-deoxy-5′-O-(4-methylbenzoyl))-β-

D-ribofuranosyl]purin wurde noch mit 100 mL gesattigter Ammoniak/abs. Methanol-

Losung aufgelost. Die Losung wurde in 125 ◦C 18 Stunden bei Autoklav erhitzt. Nach

Abkuhlung wurde das Losungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde

120

saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 9:1).

Ausbeute: 0,905 g (2,40 mmol), weißer Feststoff, 80 %

DC (DCM:MeOH 9:1): Rf : 0,35

MS (HRMS, positiv Modus): [M-H]−

m/z berechnet: 375,9912

m/z gemessen: 375,9894 (4,8 ppm)

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.29 (1H, s, H -8), 7.67 (2H, s, NH 2), 5.79 (1H,

d, 3J = 2,2 Hz, H-1′), 5.65 (1H, d, 3J = 4,2 Hz, 2′-OH ), 4.98 (1H, t, 3J = 5,9 Hz,

5′-OH ), 4.53-5.52 (1H, m, H -2′), 4.37-4.31 (1H, m, H -4′), 3.67(1H, ddd, 2J = 12,0

Hz, 3J 1 = 5,1 Hz, 3J 2 = 3,5 Hz, H -5a′), 3.51 (1H, ddd, 2J = 12,0 Hz, 3J 1 = 5,0 Hz,

3J 2 = 4,4 Hz, H -5b′), 2.22 (1H, ddd, 2J = 13,3 Hz, 3J 1 = 8,9 Hz, 3J 2 = 5,8 Hz,

H -3a′), 1.91 (1H, ddd, 2J = 13,0 Hz, 3J 1 = 6,2 Hz, 3J 2 = 3,0 Hz, H -3b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 155.9, 149.4, 138.8, 120.8, 118.9, 90.4, 80.9,

74.7, 62.4, 34.0

5.3.28 6-Chlor-2-iod-9-[2′-deoxy-3′,5′-di-O-(4-methylbenzoyl)-

β-D-ribofuranosyl]purin

40

C26H22ClIN4O5 [632,83 g·mol−1]

1,40 g (5,00 mmol) 6-Chlor-2-iodpurin wurde in 100 mL abs. Acetonitril suspendiert.

Die Suspension wurde 5 Min bei Raumtemperatur geruhrt. 0,710 g (12,5 mmol) Kali-

121

umhydroxid Pulver und 0,110 mL (0,330 mmol) Tris(2-(2-methoxyethoxy)ethyl)amin

(TDA-1) wurden in der Suspension eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 15 Min

bei Raumtemperatur geruhrt. Anschließend wurden 2,33 g (6,00 mmol) 2-Deoxy-

3,5-di-O-(4-methylbenzoyl)-l-α-D-ribofuranosylchlorid zugegeben. Nach 30 Min zeig-

te die DC, dass das Edukt nicht mehr zu sehen war. Der Niederschlag wurde abfiltriert

und der Filterkuchen mit 100 mL heißem Aceton gewaschen. Die Filtrate wurden un-

ter Vakuum eingeengt. Der Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kieselgel

gereinigt (Eluent: n-Hexan:EtOAc 2:1).

Ausbeute: 2,12 g (3,35 mmol), weißer Feststoff, 63 %

DC (n-Hexan:EtOAc 3:2): Rf : 0,45

MS (HRMS, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 655,0216

m/z gemessen: 655,0183 (5,0 ppm)

1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6): δ = 8.64 (1H, s, H -8), 8,00 (2H, d, 3J = 8,2 Hz,

Ar-H ), 7.85 (2H, d, 3J = 8,2 Hz, Ar-H ), 7.36 (2H, d, 3J = 8,1 Hz, Ar-H ), 7.26 (2H,

d, 3J = 8,1 Hz, Ar-H ), 6.70 (1H, t, 3J = 6,8 Hz, H -1′), 5.93 (1H, dt, 3J 1 = 6,6 Hz,

3J 2 = 2,8 Hz, H -3′), 4.80-4.66 (3H, m, H -4′, H -5′), 3.36 (1H, dt, 2J = 14,6 Hz, 3J

= 6,9 Hz, H -2a′), 3.02 (1H, ddd, 2J = 14,5 Hz, 3J 1 = 6,4 Hz, 3J 2 = 3,0 Hz, H -2b′),

2.43 (3H, s, Ar-CH 3), 2.39 (3H, s, Ar-CH 3)

13C-NMR (101 MHz, Aceton-d6): δ = 166.6, 166.5, 153.4, 150.4, 146.0, 145.3, 145.0,

133.4, 130.7, 130.5, 130.3, 130.2, 128.1, 117.0, 86.5, 84.1, 76.1, 64.9, 38.0, 21.8

122

5.3.29 2-Iod-2′-deoxyadenosin

41

C10H12IN5O3 [377,14 g·mol−1]

1,67 g (3,00 mol) 6-Chlor-2-iod-9-[2′-deoxy-3′,5′-di-O-(4-methylbenzoyl)-β-D-ribofu-

ranosyl]purin wurde noch mit 100 mL gesattigter Ammoniak/abs. Methanol-Losung

aufgelost. Die Losung wurde in 125 ◦C 18 Stunden bei Autoklav erhitzt. Nach Abkuhl-

ung wurde das Losungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde saulen-

chromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 9:1).

Ausbeute: 0,849 g (2,25 mmol), weißer Feststoff, 75 %

DC (DCM:MeOH 9:1): Rf : 0,35

MS (HRMS, positiv Modus): [M-H]−

m/z berechnet: 375,9912

m/z gemessen: 375,9897 (4,0 ppm)

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.23 (1H, s, H -8), 7.69 (2H, s, NH 2), 6,25 (1H,

t, 3J = 6,6 Hz, H -1′), 5.30 (1H, d, 3J = 4,2 Hz, 3′-OH ), 4.93 (1H, t, 3J = 5,7 Hz,

5′-OH ), 4.39-4.37 (1H, m, H -3′), 3.85 (1H, q, 3J = 4,3 Hz, H -4′), 3.59 (1H, dt, 2J

= 11,8 Hz, 3J = 4,9 Hz, H -5a′), 3.53-3.48 (1H, m, H -5b′), 2.66-2.60 (1H, m, H -2a′),

2.27 (1H, ddd, 2J = 13,2 Hz, 3J 1 = 6,0 Hz, 3J 2 = 3,2 Hz, H -2b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 155.9, 149.5, 139.1, 120.8, 119.0, 87.9, 83.4,

70.8, 61.7, 48.6

123

5.3.30 2′-Deoxy-3′,5′-di-O-acetylguanosin

43

C14H17N5O6 [351,31 g·mol−1]

5,70 g (0,020 mol) 2′-Deoxyguanosin Monohydrat, 0,240 g (2,00 mmol) 4-(Dimethyl-

amino)pyridin und 8,34 mL (0,060 mol) Triethylamin wurden mit 100 mL abs. Aceto-

nitril umgesetzt. 8,30 mL (0,060 mol) Essigsaureanhydrid wurde langsam zugetropft

Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur geruhrt. Anschließend

wurde die Reaktion durch Zugabe von Methanol beendet. Die Losungsmittel wurden

unter Vakuum entfernt. Der Ruckstand wurde mit abs. Acetonitril koevaporiert und

dann abfiltriert. Der Feststoff wurde noch mit Ethanol/Diethylether (1:3) gewaschen

und unter Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 7,05 g (0,020 mol), weißer Feststoff, 100 %

DC (DCM:MeOH, 10:1): Rf : 0,39

MS (ESI, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 352,13

m/z gemessen: 352,10

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 10.66 (1H, s, NH ), 7.91 (1H, s, H -8), 6.49 (2H,

s, NH 2), 6,13 (1H, dd, 3J 1 = 8,7 Hz, 3J 2 = 5,9 Hz, H -1′), 5.29 (1H, dt, 3J 1 = 6,2

Hz, 3J 2 = 1,9 Hz, H -3′), 4.29-4.24 (1H, m, H -5a′), 4.21-4.16 (2H, m, H -4′, H -5b′),

2.91 (1H, ddd, 2J = 14,2 Hz, 3J 1 = 8,7 Hz, 3J 2 = 6,4 Hz, H -2a′), 2.45 (1H, ddd, 2J

= 14,2 Hz, 3J 1 = 5,9 Hz, 3J 2 = 2,1 Hz, H -2b′), 2.08 (3H, s, COCH 3), 2.03 (3H, s,

COCH 3)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 170.2, 170.0, 156.7, 153.7, 151.1, 135.1, 116.8,

124

82.6, 81.5, 74.5, 63.6, 35.5, 20.8, 20.5

5.3.31 2-Amino-6-chlor-9-[(3′,5′-di-O-acetyl-2′-deoxy)-β-D-r-

ibofuranosyl]purin

44

C14H16ClN5O5 [369,76 g·mol−1]

7,05 g (0,020 mol) 2′-Deoxy-3′,5′-di-O-acetylguanosin, 5,00 g (0,030 mol) Tetrae-

thylammoniumchlorid und 15,2 mL (0,120 mol) N,N -Dimethylanilin wurden in 100

mL abs. Acetonitril unter Schutzgas umgesetzt und auf 0 ◦C abgekuhlt. 11,0 mL

(0,120 mol) Phosphorylchlorid wurden unter dieser Temperatur langsam zugetropft.

Danach wurde die Reaktionsmischung noch 10 Min bei Raumtemperatur geruhrt und

anschließend unter Ruckfluss 15 Min erhitzt (Olbad wurde auf 100 ◦C vorgeheizt).

Nach kurz Abkuhlung wurden die fluchtigen Substanzen unter Vakuum entfernt. Der

Ruckstand wurde mit Eis 15 Min geruhrt, dann mehrmals mit Chloroform extra-

hiert. Die organische Phase wurde anschließend mit 5 % NaHCO3-Losung gewaschen

und uber Na2SO4 getrocknet. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an

Kieselgel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 98:2).

Ausbeute: 4,81 g (0,013 mol), weißer Schaum, 45 %

DC (DCM:MeOH, 95:5): Rf : 0,45

MS (ESI, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 370,09

m/z gemessen: 370,08

125

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.91 (1H, s, H -8), 6.28 (1H, dd, 3J 1 = 7,7 Hz, 3J 2

= 6,2 Hz, H -1′), 5.41 (1H, dt, 3J 1 = 6,2 Hz, 3J 2 = 2,3 Hz, H -3′), 5.29 (2H, br, NH 2),

4.44 (1H, dd, 2J = 13,3 Hz, 3J = 5,9 Hz, H -5a′), 4.37-4.33 (2H, m, H -4′, H -5b′),

2.95 (1H, ddd, 2J = 14,2 Hz, 3J 1 = 7,7 Hz, 3J 2 = 6,4 Hz, H -2a′), 2.55 (1H, ddd, 2J

= 14,2 Hz, 3J 1 = 6,1 Hz, 3J 2 = 2,6 Hz, H -2b′), 2.12 (3H, s, COCH 3), 2.07 (3H, s,

COCH 3)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 170.7, 170.4, 159.1, 153.2, 151.7, 140.6, 125.9,

84.8, 82.6, 74.5, 63.8, 36.9, 21.1, 20.9

5.3.32 2-Amino-6-chlor-9-(2′-deoxy-β-D-ribofuranosyl)purin

45

C14H16ClN5O5 [369,76 g·mol−1]

150 mL 25 % wassriges Ammoniak wurden mit 4,81 g (0,013 mol) 2-Amino-6-chlor-

9-[( 3′,5′-di-O-acetyl-2′-deoxy)-β-D-ribofuranosyl]purin umgesetzt. Die Reaktionsmi-

schung wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden geruhrt. Danach wurde Losungsmittel

unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kiesel-

gel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 10:1).

Ausbeute: 2,57 g (9,00 mmol), weißer Feststoff, 69 %

DC (DCM:MeOH, 10:1): Rf : 0,33

MS (ESI, negativ Modus): [M+HCOO]−

m/z berechnet: 330,06

m/z gemessen: 330,08

126

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.34 (1H, s, H -8), 6.94 (1H, s, NH 2), 6.22 (1H,

dd, 3J 1 = 7,1 Hz, 3J 2 = 6,4 Hz, H -1′), 5.28 (1H, d, 3J = 4,1 Hz, 3′-OH ), 4.93 (1H, t,

3J = 5,5 Hz, 5′-OH ), 4.37 (1H, dd, 3J 1 = 6,7 Hz, 3J 2 = 3,4 Hz, H -3′), 3.85-3.82 (1H,

m, H -4′), 3.61-3.48 (2H, m, H -5′,), 2.61 (1H, ddd, 2J = 13,2 Hz, 3J 1 = 7,4 Hz, 3J 2

= 5,9 Hz, H -2a′), 2.26 (1H, ddd, 2J = 13,2 Hz, 3J 1 = 6,2 Hz, 3J 2 = 3,4 Hz, H -2b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 159.7, 153.7, 149.4, 141.0, 123.5, 87.7, 83.0,

70.5, 61.5

5.3.33 2-Amino-6-chlor-9-[2′-deoxy-5′-O-(tert-butyldimethy-

lsilyl)-β-D-ribofuranosyl]purin

46

C16H26ClN5O3Si [399,95 g·mol−1]

2,57 g (9,00mmol) 2-Amino-6-chlor-9-(2′-deoxy-β-D-ribofuranosyl)purin, 1,42 g (9,45

mmol) tert-Butyldimethylsilylchlorid, 0,16 g (1,35 mmol) 4-(Dimethylamino)pyridin

und 1,25mL (9,00mmol) Triethylamin wurden in 75mLDimethylformamid/Dichlor-

methan (2/1) aufgelost und unter Schutzgas bei Raumtemperatur 20 Stunden geruhrt.

Die Reaktion wurde mit Methanol beendet und das Losungsmittel wurde unter Vaku-

um entfernt. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt

(Eluent: DCM:MeOH 97:3).

Ausbeute: 2,98 g (7,45 mmol), weißer Schaum, 83 %

DC (DCM:MeOH, 95:5): Rf : 0,39

MS (HRMS, positiv Modus): [M+H]+

127

m/z berechnet: 400,1556

m/z gemessen: 400,1550 (4,0 ppm)

1H-NMR (400 MHz, MeOD-d4): δ = 8.25 (1H, s, H -8), 6.33 (1H, t, 3J = 6,4 Hz,

H -1′), 4.55 (1H, dt, 3J 1 = 5,9 Hz, 3J 2 = 3,9 Hz, H -3′), 4.00 (1H, q, 3J = 3,5 Hz,

H -4′), 3.89 (1H, dd, 3J 1 = 11,4 Hz, 3J 2 = 3,4 Hz, H -5a′), 3.82 (1H, dd, 3J 1 = 11,4

Hz, 3J 2 = 3,7 Hz, H -5b′), 2.69 (1H, dt, 2J = 13,5 Hz, 3J = 6,2 Hz, H -2a′), 2.45 (1H,

ddd, 2J = 13,5 Hz, 3J 1 = 6,4 Hz, 3J 2 = 4,2 Hz, H -2b′), 0.87 (9H, s, SiC(CH 3)3),

0.06 (3H, s, SiCH 3), 0.05(3H, s, SiCH 3)

13C-NMR (101 MHz, MeOD-d4): δ = 161.6, 154.6, 151.5, 142.4, 125.2, 89.1, 85.6,

72.2, 64.4, 41.4, 26.4, 19.3

5.3.34 2-Amino-6-chlor-9-[2′,3′-dideoxy-5′-O-(tert-butyldime-

thylsilyl)-β-D-ribofuranosyl]purin

47

C16H26ClN5O2Si [383,95 g·mol−1]

2,80 g (7,00 mmol) 2-Amino-6-chlor-9-[2′-deoxy-5′-O-(tert-butyldimethylsilyl)-β-D-

ribofuranosyl]purin und 4,27 g (0,035 mol) 4-(Dimethylamino)pyridin wurden in 150

mL abs. Acetonitril aufgelost. Unter Schutzgas wurden 1,38 mL (0,010 mol) Phenyl-

chlorothionocarbonat langsam zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raum-

temperatur 10 Stunden geruhrt. Das Losungsmittel wurde unter Vakuum entfernt.

Der Ruckstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und mit 1 M HCl (2 × 20 mL)

gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend mit gesattigter NaCl-Losung (3

128

× 20 mL) gewaschen und uber Na2SO4 getrocknet. Das Produkt wurde dreimal mit

20 mL abs. Toluol koevaporiert und dann in 80,0 mL abs. Toluol aufgelost. 0,25 g

(1,50 mmol) AIBN und 2,00 mL (7,50 mmol) Tributylzinnhydrid wurden in die Re-

aktion umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde unter Ruckfluss erhitzt.

Das Losungsmittel wurde danach unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde

saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 97:3).

Ausbeute: 1,65 g (4,30 mmol), weißer Schaum, 61 %

DC (DCM:MeOH, 95:5): Rf : 0,43

MS (HRMS, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 384,1617

m/z gemessen: 384,1629 (3,1 ppm)

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.22 (1H, s, H -8), 6.17 (1H, dd, 3J 1 = 6,5 Hz,

3J 2 = 3,2 Hz, H -1′), 5.47 (2H, br, NH 2), 4.22 (1H, ddt, 3J 1 = 9,6 Hz, 3J 2 = 6,4 Hz,

3J 3 = 3,3 Hz, H -4′), 3.93 (1H, dd, 2J = 11,3 Hz, 3J = 3,3 Hz, H -5a′), 3.73 (1H, dd,

2J = 11,3 Hz, 3J = 3,3 Hz, H -5b′), 2.51-2.34 (2H, m, H -2′), 2.17-2.00 (2H, m, H -3′),

0.89 (9H, s, SiC(CH 3)3), 0.07 (6H, s, Si(CH 3)2)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 159.0, 153.1, 151.1, 140.9, 125.8, 85.3, 82.2, 64.4,

33.2, 26.1, 25.4, 18.6, -5.2, -5.3

129

5.3.35 6-Chlor-2-iod-9-[2′,3′-dideoxy-5′-O-(tert-butyldimeth-

ylsilyl)-β-D-ribofuranosyl]purin

48

C16H24ClIN4O2Si [494,83 g·mol−1]

1,61 g (4,20 mmol) 2-Amino-6-chlor-9-[2′,3′-dideoxy-5′-O-(tert-butyldimethylsilyl)-

β-D-ribofuranosyl]purin wurden in 50,0 mL abs. Tetrahydrofuran aufgelost. 1,07 g

(4,20 mmol) Iod, 3,40 mL (42,0 mmol) Diiodmethan, 0,92 g (4,83 mmol) Kupfer(I)-

jodid und 1,70 mL (12,6 mmol) Isopentylnitrit wurden mit der Losung versetzt. Die

Reaktionsmischung wurde unter Ruckfluss 1 Stunde erhitzt. Nach Abkuhlung wurde

der Feststoff abfiltriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum eingeengt und der Ruck-

stand wurde saulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (Eluent: DCM: MeOH

99:1).

Ausbeute: 1,73 g (3,50 mmol), gelbes Ol, 83 %

DC (DCM:MeOH, 98:2): Rf : 0,49

MS (HRMS, negativ Modus): [M+HCOO]−

m/z berechnet: 539,0384

m/z gemessen: 539,0373 (2,0 ppm)

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.59 (1H, s, H -8), 6.34 (1H, dd, 3J 1 = 6,5 Hz,

3J 2 = 2,6 Hz, H -1′), 4,27 (1H, ddt, 3J 1 = 8,9 Hz, 3J 2 = 5,9 Hz, 3J 3 = 2,8 Hz,H -4′),

4.05 (1H, dd, 2J = 11,5 Hz, 3J = 2,8 Hz, H -5a′), 3.76 (1H, dd, 3J 1 = 11,5 Hz, 3J 2

= 2,9 Hz, H -5b′), 2.61-2.52 (1H, m, H -2a′), 2.41 (1H, ddt, 2J = 13,6 Hz, 3J 1 = 6,8

Hz, 3J 2 = 3,2 Hz, H -2b′), 2.21-2.11 (1H, m, H -3a′), 2.08-2.00 (1H, m, H -3b′), 0.91

130

(9H, s, SiC(CH 3)3), 0.11 (3H, s, SiCH 3), 0.10 (3H, s, SiCH 3)

13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ = 151.7, 150.2, 144.3, 132.3, 116.3, 86.3, 82.8, 64.0,

34.0, 26.1, 24.8, 18.7, -5.2, -5.3

5.3.36 2-Iod-2′,3′-dideoxyadenosin

49

C10H12IN5O2 [361,14 g·mol−1]

80,0 mL gesattigte Ammoniak/abs. Ethanol-Losung wurden mit 1,63 g (3,30 mmol)

6-Chlor-2-iod-9-[2′,3′-dideoxy-5′-O-(tert-butyldimethylsilyl)-β-D-ribofuranosyl]purin

versetzt und bei Raumtemperatur 24 Stunden geruhrt. Danach wurde das Losungs-

mittel unter Vakuum entfernt. 1,33 g (2,80 mmol) Produkt wurde in 25,0 mL abs.

Tetrahydrofuran aufgelost. 2,80 mL (1,00 mol/L) Tetrabutylammoniumfluorid/Tetr-

ahydrofuran-Losung wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtem-

peratur geruhrt. Nach 3 Stunden war das Edukt nicht mehr zu sehen. Das Losungs-

mittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Ruckstand wurde saulenchromatographisch

an Kieselgel gereinigt (Eluent: DCM:MeOH 95:5).

Ausbeute: 0,832 g (2,30 mmol), weißer Stoff, 82 %

DC (DCM:MeOH, 95:5): Rf : 0,31

MS (HRMS, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 362,0108

m/z gemessen: 362,0106 (0,55 ppm)

131

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.29 (1H, s, H -8), 7.68 (2H, s, NH 2), 6.13 (1H,

dd, 3J 1 = 6,7 Hz, 3J 2 = 3,5 Hz, H -1′), 4.93 (1H, t, 3J = 5,6 Hz, 5-OH ), 4.09 (1H, tt,

3J 1 = 7,9 Hz, 3J 2 = 4,2 Hz, H -4′), 3.61 (1H, ddd, 2J = 11,7 Hz, 3J 1 = 5,4 Hz, 3J 2

= 4,1 Hz, H -5a′), 3.49 (1H, dt, 2J = 11,8 Hz, 3J = 5,0 Hz, H -5b′), 2.45-2.30 (2H, m,

H -2′), 2.07-1.98 (2H, m, H -3′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 155.9, 149.3, 138.8, 120.8, 118.9, 84.2, 81.9,

62.7, 31.8, 25.6

5.3.37 2-Ethinyl-3′-deoxyadenosin

50

C12H13N5O3 [275,26 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Sonogashira-Reak-

tion. Die Umsetzung erfolgte mit 0,377 g (1,00 mmol) 2-Iod-3′-deoxyadenosin und

38,1 mg (0,200 mmol) Kupfer(I)-jodid, 0,210 mL (1,50 mmol) Trimethylsilylacety-

len, 70,2 mg (0,100 mmol) Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium(II) und 0,420 mL

(3,00 mmol) Triethylamin.

Ausbeute: 0,221 g (0,803 mmol), weißer Feststoff, 80 % uber 2 Schritte.

DC (DCM:MeOH 10:1): Rf : 0,33

MS (HRMS, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 276,1091

m/z gemessen: 276,1091

132

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.44 (1H, s, H -8), 7.46 (2H, s, NH 2), 5.85 (1H,

d, 3J = 1,9 Hz, H -1′), 5.67 (1H, d, 3J = 4,2 Hz, 2′-OH ), 5,05 (1H, t, 3J = 5,5 Hz,

5′-OH ), 4.54-4.52 (1H, m, H -2′), 4.39-4.33 (1H, m, H -4′), 3.99 (1H, s, CCH ), 3.70

(1H, ddd, 2J = 12,0 Hz, 3J 1 = 5,0 Hz, 3J 2 = 3,5 Hz, H -5a′), 3.53 (1H, ddd, 2J =

11,9 Hz, 3J 1 = 5,4 Hz, 3J 2 = 4,2 Hz, H -5b′), 2.26 (1H, ddd, 2J = 13,0 Hz, 3J 1 = 8,9

Hz, 3J 2 = 5,7 Hz, H -3a′), 1.93 (1H, ddd, 2J = 13,0 Hz, 3J 1 = 6,1 Hz, 3J 2 = 2,8 Hz,

H -3b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 155.8, 148.8, 144.6, 139.9, 118.9, 90.6, 83.4,

80.8, 74.9, 74.7, 62.4, 33.8

5.3.38 2-Ethinyl-2′-deoxyadenosin

51

C12H13N5O3 [275,26 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Sonogashira-Reak-

tion. Die Umsetzung erfolgte mit 0,377 g (1,00 mmol) 2-Iod-2′-deoxyadenosin und

38,1 mg (0,200 mmol) Kupfer(I)-jodid, 0,210 mL (1,50 mmol) Trimethylsilylacety-

len, 70,2 mg (0,100 mmol) Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium(II) und 0,420 mL

(3,00 mmol) Triethylamin.

Ausbeute: 0,224 g (0,814 mmol), weißer Feststoff, 81 % uber 2 Schritte.

DC (DCM:MeOH 10:1): Rf : 0,33

MS (HRMS, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 276,1091

133

m/z gemessen: 276,1097 (2,2 ppm)

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.41 (1H, s, H -8), 7.48 (2H, s, NH 2), 6,31 (1H,

t, 3J = 6,5 Hz, H -1′), 5.30 (1H, d, 3J = 4,1 Hz, 3′-OH ), 5.04 (1H, t, 3J = 5,6 Hz,

5′-OH ), 4.41-4.38 (1H, m, H -3′), 4.00 (1H, s, CCH ), 3.87 (1H, q, 3J = 4,0 Hz, H -4′),

3.61 (1H, dt, 2J = 11,7 Hz, 3J = 4,8 Hz, H -5a′), 3.54-3.49 (1H, m, H -5b′), 2.70-2.63

(1H, m, H -2a′), 2.27 (1H, ddd, 2J = 13,1 Hz, 3J 1 = 6,0 Hz, 3J 2 = 3,1 Hz, H -2b′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 155.8, 148.9, 144.6, 140.4, 119.0, 87.9, 83.6,

83.3, 75.0, 74.8, 70.8, 61.7

5.3.39 2-Ethinyl-2′, 3′-dideoxyadenosin

52

C12H13N5O2 [259,26 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Sonogashira-Rea-

ktion. Die Umsetzung erfolgte mit 0,361 g (1,00 mmol) 2-Iod-2′,3′-deoxyadenosin und

38,1 mg (0,200 mmol) Kupfer(I)-jodid, 0,210 mL (1,50 mmol) Trimethylsilylacetylen,

70,2 mg (0,100 mmol) Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium (II) und 0,420 mL

(3,00 mmol) Triethylamin.

Ausbeute: 0,212 g (0,818 mmol), weißer Stoff, 82 % uber 2 Schritte.

DC (DCM:MeOH, 95:5): Rf : 0,33

MS (HRMS, positiv Modus): [M+H]+

m/z berechnet: 260,1142

134

m/z gemessen: 260,1145 (1,2 ppm)

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.43 (1H, s, H -8), 7.46 (2H, s, NH 2), 6.19 (1H,

dd, 3J 1 = 6,7 Hz, 3J 2 = 3,7 Hz, H -1′), 4.99 (1H, t, 3J = 4,9 Hz, 5-OH ), 4.14-4.08

(1H, m, H -4′), 3.99 (1H, s, CCH ), 3.63 (1H, dt, 2J = 11,7 Hz, 3J = 3,9 Hz, H -5a′),

3.50 (1H, dt, 2J = 11,7 Hz, 3J = 4,4 Hz, H -5b′), 2.46-2.32 (2H, m, H -2′), 2.08-1.98

(2H, m, H -3′)

13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ = 155.8, 148.7, 144.6, 139.9, 118.9, 84.3, 83.4,

81.9, 74.8, 62.7, 31.9, 25.5

5.3.40 2-Ethinyl-3′-deoxyadenosin-5′-monophosphat

53

C24H44N7O6P [557,62 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Monophosphory-

lierung. Die Umsetzung erfolgte mit 55,0 mg (0,200 mmol) 2-Ethinyl-3′-deoxyadeno-

sin und 64,0 mg (0,300 mmol) 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin und 24,0 µL (0,260

mmol) Phosphorylchlorid.

Ausbeute: 52,4 mg (0,094 mmol), brauner Feststoff, 47 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, negativ Modus): [M-2HNEt3+H]−

m/z berechnet: 354,0609

m/z gemessen: 354,0596 (3,7 ppm)

135

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 8.42 (1H, s, H -8), 5.96 (1H, s, H -1′), 4.74-4.71 (2H,

m, H -2′, H -4′), 4.23 (1H, ddd, 2J = 12,2 Hz, 3J 1 = 4,3 Hz, 3J 2 = 2,4 Hz, H -5a′),

4.03 (1H, dt, 2J = 11,4 Hz, 3J = 4,6 Hz, H -5b′), 3.51 (1H, s, CCH ), 3.18 (4H, q, 3J

= 7,3 Hz, (NCH 2CH3)3), 2.36 (1H, ddd, 2J = 14,3 Hz, 3J 1 = 9,6 Hz, 3J 2 = 5,4 Hz,

H -3a′), 2.20 (1H, ddd, 2J = 13,9 Hz, 3J 1 = 5,8 Hz, 3J 2 = 2,4 Hz, H -3b′), 1.26 (9H,

t, 3J = 7,3 Hz, (NCH2CH 3)3)

13C-NMR (101 MHz, D2O): δ = 154.6, 147.7, 144.3, 140.4, 90.7, 80.9, 80.8, 80.1,

75.7, 64.9, 46.5, 32.8, 8.2

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = 1.13 (s)

5.3.41 2-Ethinyl-2′-deoxyadenosin-5′-monophosphat

54

C24H44N7O6P [557,62 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Monophosphory-

lierung. Die Umsetzung erfolgte mit 55,0 mg (0,200 mmol) 2-Ethinyl-2′-deoxyadeno-

sin und 64,0 mg (0,300 mmol) 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin und 24,0 µL (0,260

mmol) Phosphorylchlorid.

Ausbeute: 48,6 mg (0,094 mmol), brauner Feststoff, 44 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, negativ Modus): [M-2HNEt3+H]−

m/z berechnet: 354,0609

m/z gemessen: 354,0597 (3,4 ppm)

136

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 8.42 (1H, s, H -8), 6.31 (1H, t, 3J = 6,6 Hz, H -1′),

4.70 (1H, dt, 3J 1 = 6,2 Hz, 3J 2 = 3,4 Hz, H -3′), 4.27-4.24 (1H, m, H -4′), 4.06-3.98

(2H, m, H -5′), 3.51 (1H, s, CCH ), 3.18 (6H, q, 3J = 7,3 Hz, (NCH 2CH3)3), 2.75 (1H,

dt, 2J = 13,8 Hz, 3J = 6,7 Hz, H -2a′), 2.63 (1H, ddd, 2J = 13,8 Hz, 3J 1 = 6,0 Hz,

3J 2 = 3,8 Hz, H -2b′), 1.24 (11H, t, 3J = 7,3 Hz, (NCH2CH 3)3)

13C-NMR (101 MHz, D2O): δ = 154.7, 148.1, 144.5, 140.5, 118.0, 86.0, 83.6, 80.6,

76.2, 71.3, 64.4, 46.6, 39.5, 8.2

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = 1.31 (s)

5.3.42 2-Ethinyl-2′,3′-dideoxyadenosin-5′-monophosphat

55

C24H44N7O5P [541,62 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Monophosphory-

lierung. Die Umsetzung erfolgte mit 52,0 mg (0,200 mmol) 2-Ethinyl-2′,3′-dideoxyad-

enosin und 64,0 mg (0,300 mmol) 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin und 36,7 µL

(0,400 mmol) Phosphorylchlorid.

Ausbeute: 66,1 mg (0,122 mmol), brauner Feststoff, 61 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, negativ Modus): [M-2HNEt3+H]−

m/z berechnet: 338,0660

m/z gemessen: 338,0660

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 8.39 (1H, s, H -8), 6.14 (1H, dd, 3J 1 = 6,5 Hz, 3J 2

137

= 2,6 Hz, H -1′), 4.46-4.40 (1H, m, H -4′), 4.08 (1H, ddd, 2J = 11,4 Hz, 3J 1 = 5,2 Hz,

3J 2 = 3,1 Hz, H -5a′), 3.93 (1H, dt, 2J = 11,5 Hz, 3J = 5,3 Hz, H -5b′), 3.49 (1H, s,

CCH ), 3.13 (9H, q, 3J = 7,3 Hz, (NCH 2CH3)3), 2.65-2.55 (1H, m, H -2a′), 2.43-2.38

(1H, m, H -2b′), 2.26-2.19 (1H, m, H -3a′), 2.13-2.05 (1H, m, H -3b′) 1.22 (15H, t, 3J

= 7,2 Hz, (NCH2CH 3)3)

13C-NMR (101 MHz, D2O): δ = 154.6, 147.6, 144.3, 140.5, 118.1, 84.9, 81.3, 80.6,

76.1, 65.8, 46.5, 32.1, 25.2, 8.2

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = 1.51 (s)

5.3.43 2A-Ethinyl-3′′-deoxy-NAD+

3

C29H42N8O13P2 [772,64 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Synthese von

NAD+ Analoga. Die Umsetzung erfolgte mit 10,0 mg (0,030 mmol) β-Nicotinamidri-

bosemonophosphat, 16,2 mg (0,100 mmol) 1,1′-Carbonyldiimidazol und 4,45 µL

(0,032 mmol) Triethylamin und 11,2 mg (0,020 mmol) 2-Ethinyl-3′-deoxyadenosin-

5′-monophosphat.

Ausbeute: 3,52 mg (4,53 µmol), brauner Feststoff, 23 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, positiv Modus): [M-HNEt3+2H]+

m/z berechnet: 672,1215

m/z gemessen: 672,1215

138

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 9.36 (1H, s, HN -2), 9.16 (1H, d, 3J = 6,0 Hz, HN -6),

8.91 (1H, d, 3J = 7,9 Hz, HN -4), 8.40 (1H, s, HA-8), 8.26 (1H, t, 3J = 6,8 Hz, HN -5),

6.06 (1H, d, 3J = 5,4 Hz, H -1′′), 5.94 (1H, br, H -1′), 4.52-4.44 (3H, m, H -4′, H -2′′,

H -4′′), 4.36-4.10 (6H, m, H -2′, H -3′, H -5′, H -5′′), 3.55 (1H, s, CCH ), 3.22 (15H, q,

3J = 7,3 Hz, (NCH 2CH3)3), 2.46 (1H, ddd, 2J = 14,4 Hz, 3J 1 = 9,2 Hz, 3J 2 = 6,0

Hz, H -3a′′), 2.28-2.23 (1H, m, H -3b′′), 1.30 (24H, t, 3J = 7,3 Hz, (NCH2CH 3)3)

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = -11.21 (1P, d, 3J = 20,4 Hz), -11.67 (1P, d, 3J =

20,4 Hz)

5.3.44 2A-Ethinyl-2′′-deoxy-NAD+

4

C29H42N8O13P2 [772,64 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Synthese von

NAD+-Analoga. Die Umsetzung erfolgte mit 10,0 mg (0,030 mmol) β-Nicotinamidri-

bosemonophosphat, 16,2 mg (0,100 mmol) 1,1′-Carbonyldiimidazol und 4,45 µL

(0,032 mmol) Triethylamin und 11,2 mg (0,020 mmol) 2-Ethinyl-2′-deoxyadenosin-

5′-monophosphat.

Ausbeute: 3,88 mg (5,02 µmol), brauner Feststoff, 25 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, positiv Modus): [M-HNEt3+2H]+

m/z berechnet: 672,1215

m/z gemessen: 672,1217 (0,30 ppm)

139

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 9.32 (1H, s, HN -2), 9.06 (1H, d, 3J = 6,0 Hz, HN -6),

8.89 (1H, d, 3J = 7,9 Hz, HN -4), 8.43 (1H, s, HA-8), 8.22 (1H, t, 3J = 7,1 Hz, HN -5),

6.28 (1H, t, 3J = 6,7 Hz, H -1′′), 6.02 (1H, d, 3J = 5,2 Hz, H -1′), 4.50-4.49 (1H, m,

H -4′), 4.47-4.41 (2H, m, H -2′, H -3′′), 4.31-4.30 (1H, m H -3′), 4.27-4.12 (5H, m, H -4′′,

H -5′, H -5′′), 3.53 (1H, s, CCH ), 3.21 (6H, q, 3J = 7,2 Hz, (NCH 2CH3)3), 2.85 (1H,

dt, 2J = 13,8 Hz, 3J = 6,8 Hz, H -2a′′), 2.64 (1H, ddd, 2J = 13,8 Hz, 3J 1 = 6,1 Hz,

3J 2 = 3,3 Hz, H -2b′′), 1.29 (9H, t, 3J = 7,2 Hz, (NCH2CH 3)3)

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = -11.34 (1P, d, 3J = 21,2 Hz), -11.68 (1P, d, 3J =

21,2 Hz)

5.3.45 2A-Ethinyl-2′′,3′′-dideoxy-NAD+

5

C29H42N8O12P2 [756,64 g·mol−1]

Die Reaktionsdurchfuhrung siehe im allgemeinen Verfahren fur die Synthese von

NAD+-Analoga. Die Umsetzung erfolgte mit 10,0 mg (0,030 mmol) β-Nicotinamidri-

bosemonophosphat, 16,2 mg (0,100 mmol) 1,1′-Carbonyldiimidazol und 4,45 µL

(0,032 mmol) Triethylamin und 10,8 mg (0,020 mmol) 2-Ethinyl-2′,3′-deoxyadenosin-

5′-monophosphat.

Ausbeute: 3,82 mg (5,05 µmol), brauner Feststoff, 25 % (UV Bestimmung)

MS (HRMS, positiv Modus): [M-HNEt3+2H]+

m/z berechnet: 656,1266

m/z gemessen: 656,1263 (0,46 ppm)

140

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 9.34 (1H, s, HN -2), 9.12 (1H, d, 3J = 6,0 Hz, HN -6),

8.90 (1H, d, 3J = 8,0 Hz, HN -4), 8.41 (1H, s, HA-8), 8.24 (1H, dd, 3J 1 = 8,2 Hz, 3J 2

= 6,2 Hz, HN -5), 6.14 (1H, dd, 3J 1 = 6,7 Hz, 3J 2 = 3,0 Hz, H -1′′), 6.06 (1H, d, 3J

= 5,4 Hz, H -1′), 4.50-4.44 (4H, m, H -2′, H -3′, H -4′, H -4′′), 4.27-4.24 (3H, m, H -5′,

H -5a′′), 4.07 (1H, dt, 2J = 11,2 Hz, 3J = 5,1 Hz,H -5b′′), 3.53 (1H, s, CCH ), 3.21

(6H, q, 3J = 7,3 Hz, (NCH 2CH3)3), 2.71-2.61 (1H, m, H -2a′′), 2.53-2.48 (1H, ddd, 2J

= 14,0 Hz, 3J 1 = 7,8 Hz, 3J 2 = 3,8 Hz, H -2b′′),2.35-2.26 (1H, m, H -3a′′), 2.25-2.15

(1H, m, H -3b′′), 1.30 (9H, t, 3J = 7,3 Hz, (NCH2CH 3)3)

31P-NMR (162 MHz, D2O): δ = -11.25 (1P, s), -11.64 (1P, s)

5.3.46 1,2-Bis(2-azidoethoxy)ethan

57

C6H12N6O2S [200,20 g·mol−1]

6,70 mL (0,050 mol) Triethylenglycol wurden in 150 mL abs. Dichlormethan auf-

gelost. Unter N2 wurde die Losung auf 0 ◦C abgekuhlt. Unter dieser Temperatur

wurden 28,6 g (0,150 mol) Tosylchlorid, 20,9 mL (0,150 mol) Triethylamin und

0,300 g (2,50 mmol) 4-(Dimethylamino)pyridin langsam zugegeben. Danach wur-

de die Losung langsam auf Raumtemperatur aufgewarmt und anschließend weitere

18 Stunden geruhrt. Die Reaktionsmischung wurde dreimal mit destilliertem Was-

ser gewaschen und die organische Phase uber MgSO4 getrocknet. Das Losungsmittel

wurde unter Vakuum entfernt. Der Ruckstand wurde dann in 100 mL abs. Dime-

thylformamid aufgelost. 6,50 g (0,100 mol) Natriumazid und 0,920 g (2,50 mmol)

Tetrabutylammoniumiodid wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wur-

de bei 80 ◦C 18 Stunden geruhrt. Nach Abkuhlung wurde die Reaktionsmischung

dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde noch dreimal mit

NaHCO3-Losung gewaschen und uber MgSO4 getrocknet. Das Losungsmittel wurde

141

unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde saulenchromatographisch an Kiesel-

gel gereinigt (Euent: n-Hexsan:EtOAc 3:1).

Ausbeute: 7,87 g (0,039 mol), farbloses Ol, 79 %

DC (n-Hexan:EtOAc 2:1): Rf : 0,49

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 223,09

m/z gemessen: 222,98

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.70-3.67 (m, 8H, CH 2OCH 2CH 2OCH 2), 3.39 (t,

4H, 3J = 5,2 Hz, N3CH 2)

13C-NMR(101 MHz, CDCl3): δ = 70.9, 70.3, 50.8

5.3.47 N-(2-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)ethyl)biotinylamid

58

C16H28N6O4S [400,50 g·mol−1]

1,00 g (5,00 mmol) 1,2-Bis(2-azidoethoxy)ethan wurde in 5,00 mL Toluol aufgelost

und auf 0 ◦C abgekuhlt. 5,00 mL 5 % HCl-Losung wurden zugetropft und dann 1,25

g (4,75 mmol) Triphenylphosphin wurden gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde an-

schließend langsam auf Raumtemperatur erwarmt und weitere 16 Stunden geruhrt.

Die wassrige Phase wurde danach getrennt und das Wasser wurde unter Vakuum

entfernt. Der Ruckstand wurde dreimal mit Toluol koevaporiert. 0,421 g (2,00 mmol)

2-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)ethanaminhydochlorid wurde in 5,00 mL abs. Dimethyl-

formamid aufgelost. 0,493 g (2,02 mmol) D-(+)-Biotin, 0,893 g (2,02 mmol) Ben-

142

zotriazolyloxytris(dimethylamino)phosphonium Hexafluorophosphat (BOP) und 1,00

mL (6,06 mmol) N-Ethyldiisopropylamin wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung

wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden geruhrt. Anschließend wurde das Volumen

der Mischung auf die Halfte unter Vakuum reduziert. Das Rohprodukt wurde mit

Uberschuss von Ethylacetat ausgewaschen und mit Methanol/ Ethylacetat umkris-

tallisiert.

Ausbeute: 0,389 g (0,971 mmol), weißer Feststoff, 49 %

DC (DCM:MeOH 9:1): Rf : 0,36

MS (ESI, positiv Modus): [M+Na]+

m/z berechnet: 423,18

m/z gemessen: 423,23

1H-NMR (600 MHz, MeOD4): δ = 4.48 (1H, dd, 3J 1 = 7,6 Hz, 3J 2 = 5,0 Hz,

NHCHCH2), 4.29 (1H, dd, 3J 1 = 7,7 Hz, 3J 2 = 4,4 Hz, NHCHCH), 3.68-3.64

(6H, m, CH 2OCH 2CH 2), 3.54 (2H, t, 3J = 5,5 Hz, CH 2N3), 3.38-3.34 (4H, m,

NHCH 2CH 2O), 3.21-3.18 (1H, m, SCH ), 2.92 (1H, dd, 3J 1 = 12,7 Hz, 3J 2 = 5,0 Hz,

SCH 2α), 2.70 (1H, d, 3J = 12,7 Hz, SCH 2β), 2.21 (2H, t, 3J = 7,2 Hz, CCH 2CO),

1.73-1.57 (4H, m, CCH 2CCH 2), 1.46-1.41 (2H, m CCH 2)

13C-NMR (151 MHz, MeOD4): δ = 176.2, 166.1, 71.5, 71.3, 71.2, 70.7, 63.4, 61.6,

57.0, 51.7, 41.0, 40.3, 36.7, 29.8, 29.5, 26.9

143

5.4 Methoden

5.4.1 Enzymatische Reaktionen

5.4.1.1 Ubersicht der verwendeten Protein- und DNA-Sequenz

Fur die enzymatischen Reaktionen wurden folgende Sequenzen verwendet:

Histon H1,2 His-tag:

SETAPAAPA AAPPAEKAPV KKKAAKKAGG TPRKASGPPV

SELITKAVAA SKERSGVSLA ALKKALAAAG YDVEKNNSRI

KLGLKSLVSK GTLVQTKGTG ASGSFKLNKK AASGEAKPKV

KKAGGTKPKK PVGAAKKPKK AAGGATPKKS AKKTPKKAKK

PAAATVTKKV AKSPKKAKVA KPKKAAKSAA KAVKPKAAKP

KVVKPKKAAP KKKHHHHHH

EcoRI (das hybridisierte Oligonukleotid):

5′-GGAATTCC-3′

5.4.1.2 ADP-Ribosylierung von Histon H1.2

Fur die ADP-Ribosylierungsexperimente wurden 150 nM human ARTD1, 4,5 µM

Histon H1,2, 13,5 µM EcoRI und 1 mM naturliches bzw. modifiziertes NAD+ im

Reaktionspuffer zusammen gemischt. Die Reaktionen wurden im Thermocycler 20

Min bei 37 ◦C inkubiert. Durch Abkuhlung auf 4 ◦C wurden die Reaktionen beendet.

Danach wurden die erhaltenen Produkte direkt in die Click-Reaktion eingesetzt und

anschließend nach Denaturierung durch SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

144

5.4.1.3 Automodifikation von ARTD1

Zur Automodifikation von ARTD1 wurden 150 nM human ARTD1, 13,5 µM Eco-

RI und 1 mM naturliches bzw. modifiziertes NAD+ im Reaktionspuffer zusammen

gegeben und die Reaktionsmischungen wurden bei 37 ◦C im Thermocycler 20 Min

behandelt. Durch Abkuhlung auf 4 ◦C wurden die Reaktionen beendet. Danach wur-

den die erhaltenen Produkte direkt in die Click-Reaktion eingesetzt und anschließend

nach Denaturierung durch SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

5.4.2 Proteinbiochemische Methoden

5.4.2.1 Click-Reaktion von modifizierten Proteinen

Es handelt sich nun um eine Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, sog.

Click-Reation. Unter Argon wurden 4 mM CuSO4, 2 mM Sulfo-Cy5-Azid bzw.

Biotin-Azid, 20 mM BTTAA und 32 mM Natrium-L-Ascorbat in den Proben, die

in enzymatischen Reaktionen erhielten, zugegeben. Die Kupfer(I)-Spezies wurden in

situ durch Reduktion von Kupfer(II)-Salzen generiert und dadurch diese Azid-Alkin-

Cycloaddtion bei Raumtemperatur katalysiert. Nach 60 Min war die Reaktion erfolg-

reich beendet. Das nicht umgesetzte Sulfo-Cy5-Azid wurde durch eine SephadexTM

G-25 Minisaule fur 3 Min bei 12000 × g entfernt. Nach Denaturierung wurden die

Proben in SDS-PAGE Gelelektrophorese nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt.

Die erhaltenen Gele wurden schließlich durch Fluoreszenz bzw. Western-Blot nach-

gewiesen.

5.4.2.2 SDS-PAGE Gelelektrophorese

Die Trennung von Proteinen erfolgte in denaturierenden SDS-PAGE Gelen nach der

Methode von Laemmli[183]. Diese setzen sich aus einem Sammel- und einem Trenngel

zusammen. Das Sammelgel dient zur Fokussierung der Proteine, wahrend diese im

145

Trenngel nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden. Zur Fertigung eines Gels

(7,5 × 6 cm) wurde zuerst das Trenngel aus den entsprechenden Vorratslosungen her-

gestellt, mit APS und TEMED versetzt und die Losung zwischen zwei abgedichtete

Glasplatten (Abstand 0,75 mm) pipettiert. Um eine waagerechte, glatte Gelober-

kante zu erreichen und um Luftblasen zu vermeiden, wurde mit dem Isopropanol

uberschichtet. Nach der Polymerisation (ca. 30 Min) wurde der Alkohol abgegossen,

das Sammelgel (4 %) auf das Trenngel (7,5 % bzw. 12 %) gegossen und der Kamm ein-

gesetzt. Das fertige Gel wurde in eine Elektrophorese-Apparatur eingesetzt und mit

SDS-Laufpuffer befullt. Die Proben wurden mit 6 × SDS-PAGE Ladepuffer versetzt,

5 Min bei 95 ◦C denaturiert und anschließend abhangig von der Große der Geltaschen

je 12 µL Probe aufgetragen. Als Molekulargewichtsmarker dienten die PageRulerTM

Prestained Protein Ladder oder SpectraTM Multicolor High Range Protein Ladder

(Thermo Scientific) fur unterschiedlichen Gellaufe. Die Auftrennung erfolgte bei 25

mA fur ca. 60 Min im SDS-PAGE Laufpuffer.

5.4.2.3 Coomassie-Farbung von SDS-PAGE Gelen

Zum Einfarben wurden die Gele mindestens 3 Stunden, besser Ubernacht, in kolloi-

daler Coomassie-Farbelosung geschwenkt und anschließend fur 15 Min in Entfarber-

Losung wieder soweit entfarbt, bis ein ausreichender Kontrast zwischen Banden und

Hintergrund erreicht war. Die Gele wurden schließlich in einem SDS-PAGE Scanner

aufgenommen. Die Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Losungen kann

5.2.2 entnommen werden.

5.4.2.4 Western-Blot von Proteinen auf PVDF-Membranen

Im Anschluss an eine SDS-PAGE wurden die Proteine durch das Semi-Dry-Verfahren

auf PVDF-Membranen (sog.: Transfermembran) ubertragen, um von Proteinen mit

spezifischen Antikorpern nachzuweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Nass-

146

Transfer mit einem Semi-Dry-Elektroblotter auf eine Transfermembran durchgefuhrt.

Dazu wurde die sog.”Sandwich-Methode“ angewendet, bei dem die einzelnen Kom-

ponenten ubereinander geschichtet wurden. Vor dem Blotten wurde die Transfermem-

bran 10 Min im Methanol aktiviert und anschließend zusammen mit dem SDS-Gel

10 Min in Transferpuffer aquilibriert. Das Gel und die Membran wurden zwischen

die zuvor ebenfalls in Transferpuffer inkubierten Whatman-Filterpapiere geschichtet,

so dass die negativ geladenen Proteine durch die Stromrichtung auf die Membran

transferiert wurden. Das Sandwich wurde zusammen mit einem Kuhlelement in der

Blot-Kammer eingesteckt und mit Transferpuffer uberschichtet. Der Proteintransfer

erfolgte bei einer Spannung von 200 V fur 1 Stunde. Nach dem Transfer wurde die

Membran kurz in TBST gewaschen.

5.4.2.5 Detektion mittels Streptavidin-alkalischer Phosphatase

Die Membran wurde nach dem letzten Waschschritt fur mindestens 1 Stunde bei

Raumtemperatur oder Ubernacht bei 4 ◦C in Western Blot Blockpuffer blockiert. Die

Blockierungslosung wurde abgegossen und die Membran dann 1 × 10 Min in TBST

gewaschen und noch fur 2 × 10 Min in AP-Puffer geschwenkt. Dann ließ der Blot mit

der Streptavidin-alkalischen Phosphatase, die in AP-Puffer verdunnt, fur 1 Stunde

wechselwirken. Nach dem Waschschritt fur 10 Min mit AP-Puffer erfolgte die Detek-

tion. Zur Detektion wurden 10 mL AP-Puffer mit Entwickler-Losung versetzt und

fur 1 - 5 Min im Dunkeln auf die Membran gegeben. Die Nachweisfarbung erfolgte

direkt auf der Membran. Anschließend wurde die Membran mit tridestilliertem Was-

ser gewaschen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in einem Scanner aufgenommen.

147

5.4.3 Pulldown-Experiment unter Anwendung des Ketten-

terminators

5.4.3.1 Bruch der Biotin-Streptavidin-Interaction

Nach der Automodifikation von ARTD1 unter Verwendung des NAD+ Analogons

5 und der Click-Reaktion mit Biotin-Azid wurden die Streptavidin-haltigen Ma-

gnetkugelchen ins Reaktionsgemisch gegeben und fur eine weitere Stunde bei 25 ◦C

inkubiert. Anschließend wurde die oben stehende Losung durch 2 Min Zentrifuga-

tion bei 12000 × g von den Magnetkugelchen abgetrennt. Die proteingebundenen

Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen wurden dreimal mit PBS gewaschen.

Methode 1:

Die Magnetkugelchen wurden nach dem letzten Waschschritt in PBS suspendiert

und dann mit dem SDS-PAGE Ladepuffer 5 Min bei 95 ◦C erhitzt. Die oben stehen-

de Losung und Magnetkugelchen wurden zusammen in die Geltaschen aufgetragen

und danach durch die SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

Methode 2:

Die Magnetkugelchen wurden nach dem letzten Waschschritt in tridestilliertem Was-

ser suspendiert. Die Mischung wurde mit einem Gradient von 0,5 ◦C per Sekunde von

25 ◦C bis 70 ◦C und noch fur weitere 2 Min bei 70 ◦C erhitzt. Nach der Abtrennung

der Magnetkugelchen durch 2 Min Zentrifugation bei 12000 × g wurden die Proben

unter vermindertem Druck konzentriert, durch den SDS-PAGE Ladepuffer denatu-

riert und dann mittels der SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

Methode 3:

Die Magnetkugelchen wurden nach dem letzten Waschschritt im 0,1 M Glycin-HCl

Puffer (pH 2,5) suspendiert und 5 Min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend

148

wurde die Losung durch 1,0 M Tris-HCl (pH 9,0) auf pH 7,0 neutraliert. Nach der

Abtrennung der Magnetkugelchen durch 2 Min Zentrifugation bei 12000 × g wurden

die Proben unter vermindertem Druck konzentriert, durch den SDS-PAGE Ladepuf-

fer denaturiert und dann mittels der SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

5.4.3.2 Spaltung der Phosphodiesterbindung

Nach der Automodifikation von ARTD1 unter Verwendung des NAD+ Analogons

5 und der Click-Reaktion mit Biotin-Azid wurden die Streptavidin-haltigen Ma-

gnetkugelchen ins Reaktionsgemisch gegeben und fur eine weitere Stunde bei 25 ◦C

inkubiert. Anschließend wurde die oben stehende Losung durch 2 Min Zentrifuga-

tion bei 12000 × g von den Magnetkugelchen abgetrennt. Die proteingebundenen

Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen wurden dreimal mit PBS gewaschen und da-

nach mit der PDE I (5 mU) im PDE-Reaktionspuffer gemischt. Die Reaktionsmi-

schung wurde anschließend fur 3 Stunden bei 37 ◦C inkubiert. Nach der Abtrennung

der Magnetkugelchen durch 2 Min Zentrifugation bei 12000 × g wurden die Proben

unter vermindetem Druck konzentriert, durch den SDS-PAGE Ladepuffer denaturiert

und dann mittels der SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

5.4.3.3 Aminolyse der Esterbindung

Nach der Automodifikation von ARTD1 unter Verwendung des NAD+ Analogons

5 und der Click-Reaktion mit Biotin-Azid wurden die Streptavidin-haltigen Ma-

gnetkugelchen ins Reaktionsgemisch gegeben und fur eine weitere Stunde bei 25 ◦C

inkubiert. Anschließend wurde die oben stehende Losung durch 2 Min Zentrifuga-

tion bei 12000 × g von den Magnetkugelchen abgetrennt. Die proteingebundenen

Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen wurden dreimal mit PBS gewaschen.

149

Methode 1:

Nach dem letzten Waschschritt wurden die Magnetkugelchen in tridestilliertem Was-

ser suspendiert. Ein Amin (Methylamin, Ethanolamin und Hydrazin) wurde in die

Suspension zugegeben, so dass sie eine Konzentration des Amins von 10 % (v/v) ent-

hielt. Die Mischung wurde danach 30 Min bei 25 ◦C inkubiert. Nach der Abtrennung

der Magnetkugelchen durch 2 Min Zentrifugation 12000 × g wurden die Proben unter

vermindertem Druck konzentriert, durch den SDS-PAGE Ladepuffer denaturiert und

dann mittels der SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

Methode 2:

Nach dem letzten Waschschritt wurden die Magnetkugelchen im 100 mM HEPES-

Puffer suspendiert. Das Hydroxylamin wurde dann in die Mischung zugegeben, so

dass sie eine Endkonzentration des Amins von 100 mM enthielt. Die Mischung wur-

de 1 Stunde bei 50 ◦C erwarmt. Nach der Abtrennung der Magnetkugelchen durch

2 Min Zentrifugation bei 12000 × g wurden die Proben unter vermindertem Druck

konzentriert, durch den SDS-PAGE Ladepuffer denaturiert und dann mittels der SDS-

PAGE Gelelektrophorese analysiert.

Methode 3:

Nach der Automodifikation von ARTD1 unter Verwendung des NAD+ Analogons 5

wurden die Proben mit Sulfo-Cy5-Azid geclickt. Der Uberschuss von Sulfo-Cy5-Azid

wurde durch eine SephadexTM G-25 Minisaule fur 3 Min bei 12000 × g entfernt. An-

schließend wurden die Proben mit dem Hydroxylamin (100 mM Endkonzentration)

gemischt und 1 Stunde bei 50 ◦C erwarmt, danach durch den SDS-PAGE Ladepuffer

denaturiert und dann mittels der SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

150

5.4.3.4 Pulldown-Experiment von Histon H1.2

Fur die Trans(ADP-Ribos)ylierung von Histon H1.2 wurden 150 nM human ARTD1,

113 µM Histon H1,2, 13,5 µM EcoRI und 2 mM naturliches bzw. NAD+ Ana-

loga 1 und 5 im Reaktionspuffer zusammen gemischt. Die Reaktionen wurden im

Thermocycler 20 Min bei 37 ◦C inkubiert. Durch Abkuhlung auf 4 ◦C wurden die

Reaktionen beendet. Danach wurden die erhaltenen Produkte direkt in die Click-

Reaktion (8 mM CuSO4, 4 mM Biotin-Azid, 40 mM BTTAA und 64 mM Natrium-

L-Ascorbat) und anschließend mit den Streptavidin-haltige Magnetkugelchen in den

Affinitatsaufreinigungsschritt[182] eingesetzt. Nach dem letzten Waschschritt wurden

die proteingebundenen Streptavidin-haltigen Magnetkugelchen in 20 mM Tris-HCl

(pH 7,4) suspendiert. Die Proben wurden mit 6 × SDS-PAGE Ladepuffer versetzt

und 15 Min bei 95 ◦C erhitzt. Anschließend wurde die oben stehende Losung durch

2 Min Zentrifugation bei 12000 × g von den Magnetkugelchen abgetrennt und die

Proben wurden dann mittels der SDS-PAGE Gelelektrophorese analysiert.

151

Kapitel 6

Abkurzungsverzeichnis

3-AB 3-Aminobenzamid

Ac Acetyl

ACN Acetonitril

ADPR ADP-Ribose

ADPRC ADP-Ribosyl-Cyclasen

abs. absolut

ART ADP-Ribosyltransferase

ARTD ADP-Ribosyltransferase Diphtherietoxin-ahnlich

ARTs ADP-Ribosyltransferasen

AMP Adenosinmonophosphat

AP Apurine/Apyrimidine

APE Apurinische/apyrimidinische Endonuklease

APS Ammoniumperoxodisulfat

Asp Asparaginsaure (D)

ATM Ataxia telangiectasia mutated

BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat

BER Basenexzisionsreparatur

BOP Benzotriazolyloxytris(dimethylamino)phosphonium

Hexafluorophosphat

152

br Breiter

BRCA1 Breast cancer 1, early onset

BRCA2 Breast cancer 2, early onset

BRCT Breast Cancer Carboxaterminal

BSA N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid

BTTAA 2-(4-((Bis((1-tert-butyl-1H -1,2,3-triazol-4-yl)methyl)-

amino)methyl)-1H -1,2,3-triazol-1-yl)essigsaure

bzw. beziehungsweise

ca. Circa

cADPR Cyclische ADP-Ribose

CD Cluster of differentiation

CDCl3 Deuteriertes Chloroform

CDI 1,1′-Carbonyldiimidazol

CtIP CtBP(C-terminal-binding protein)-interacting protein

CuAAC Kupferkatalysierte 1,3-dipolare Azid-Alkin-Cycloaddition

Cys Cystein

D2O Deuteriumoxid (Schweres Wasser)

d Duplett

DBD DNA-bindenden Domane

DC Dunnschichtchromatographie

DCC Dicyclohexylcarbodiimid

DCM Dichlormethan

dd Duplett vom Duplett

ddd Duplett vom Duplett vom Duplett

ddH2O Tridestilliertes Wasser

ddt Duplett vom Duplett vom Triplett

DEVD Einbuchstabencode der Aminosauren: Asp-Glu-Val-Asp

d.h. Das heißt

DIFO Difluoriertes Cyclooctin

153

DMAP 4-(Dimethylamino)pyridin

DMF Dimethylformamid

DNA Desoxyribonukleinsaure

DNA-PKCS DNA-abhangige Proteinkinase katalytische Untereinheit

dq Duplett vom Quartett

dRP Deoxyribose-5′-phosphat

DSB Doppelstrangbruche

dt Duplett vom Triplett

DTT Dithiothreitol

E Einbuchstabencode der Glutaminsaure

ECL Enhanced Chemilumineszenz

EDTA Ethylendiamintetraessigsaure

EMS Ethylmethansulfonat

ESI Elektrosprayionisation

Et Ethyl

FMN Flavinmononukleotid

GFP Grunfluoreszierendes Protein

Glu Glutaminsaure

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethansulfonsaure

His Histidin

HIV Humanes Immundefizienz-Virus

HR Homologe Rekombination

HRMS Hochauflosende Massenspektren

HRP Meerrettichperoxidase

HTH Helix-Turn-Helix-Domane

IC50 Mittlere inhibitorische Konzentration

IEX Ionenaustauschchromatographie

K Kelvin

Ku70 XRCC6

154

Ku80 XRCC5

LC/MS Flussigchromatographie mit Massenspektrometrie

Lys Lysin

M Molar

m Multiplett

Me Methyl

Min Minuten

MMR Mismatch-Reparatur

MMS Methylmethansulfonat

MNNG Methylnitronitrosoguanidin

MPLC Mitteldruckflussigkeitschromatographie

MS Massenspektren

NA Nicotinamid

NAD+ Nicotinamidadenindinukleotid

NADH Reduzierte Form des Nicotinamidadenindinukleotids

NADP+ Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

NADPH Reduzierte Form des Nicotinamidadenindinukleotid-

phosphats

Nbs1 Nibrin

NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid

NCL Native chemische Ligation

NER Nukleotidexzisionsreparatur

NHEJ Nicht-homologes End-Joining

NHS N-Hydroxysuccinimid

NLS Nuclear Localisation Signal

nm Nanometer

NMN Nicotinamidmononukleotid

NMR Kernspinresonanzspektroskopie

Mre11 Meiotic recombination 11

155

MRN Ein Proteinkomplex aus Mre11, Rad50 und Nbs1

OAADPR O-Acetyl-ADP-Ribose

p Pseudo

p para

p.a. pro analysi

PAR Poly(ADP-Ribose)

PARG Poly(ADP-Ribose)-Glykohydrolase

PARP Poly(ADP-Ribose)-Polymerase

PARPs Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen

PBS Phosphatgepufferte Salzlosung

PDE Phosphodiesterase

PK Proteinkinase

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PNK Polynukleotid Kinase

Polβ DNA-Polymerase β

PPi Diphosphat

PRAMP Phosphoribosyladenosinmonophosphat

PR2AMP Diphosphoribosyladenosinmonophosphat

PRPP Phosphoribosylpyrophosphat

PTM Post-translationale Modifikation

Rad50 DNA Reparaturprotein RAD50

Rad51 DNA-bindendes Protein RAD51

Rad52 DNA Reparaturprotein RAD52 homolog

RAP74 TFIIF-Untereinheit

Rf Retentionsfaktor

RNA Ribonukleinsaure

RPA Replikation Protein A

RP-HPLC Rephase-Hochleistungsflussigkeitschromatographie

rt Raumtemperatur

156

Q Einbuchstabencode des Glutamins

q Quartett

s Singulett

SDS Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

sog. So genannt

SPM Streptavidin-haltiges Magnetkugelchen

SSB Einzelstrangbruche

SSBR Einzelstrangbruche Reparatur

Strep Streptavidin

Strep-AP Streptavidin-alkalische Phosphatase

t Triplett

TBAF Tetrabutylammoniumfluorid

TBDMS tert-Butyldimethylsilyl

TBS Trisgepufferte Salzlosung

td Triplett vom Duplett

TDA-1 Tris(2-(2-methoxyethoxy)ethyl)amin

TEAB Triethylammoniumhydrogencarbonat

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin

TFIIF Transkriptionsfaktor IIF

TMS Trimethylsilyl

THF Tetrahydrofuran

TRF1 Telomeric repeat-binding factor 1

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

Tyr Tyrosin

U Unit

UV Ultraviolett

Val Valin

Vis sichtbar

157

XLF XRCC4-ahnlicher Faktor

XRCC1 X-ray repair cross-complementing protein 1

XRCC4 X-ray repair cross-complementing protein 4

158

Kapitel 7

Literaturverzeichnis

159

Literaturverzeichnis

[1] A. Harden, W. J. Young: The alcoholic ferment of yeast-juice. Part II.–The

Conferment of Yeast-Juice, Proc. R. Soc. B, 1906, 78, 369-375.

[2] H. von Euler, R. Vestin: Zur Kenntnis der Wirkungen der Co-Zymase, Z. phy-

siol. Chem., 1935, 237, 1-5; H. von Euler, H. Albers, F. Schlenk: Chemische

Untersuchungen an hochgereinigter Co-Zymase, Z. Physiol. Chem., 1936, 240,

113-126.

[3] O. Warburg, W. Christian, A. Griese: Wasserstoffubertragendes Co-Ferment,

seine Zusammensetzung und Wirkungsweise, Biochem. Z., 1935, 282, 157-205;

O. Warburg, W. Christian: Pyridin, der wasserstoffubertragene Bestandteil von

Garungsfermenten, Biochem. Z., 1936, 287, 291-328.

[4] T. Honjo, Y. Nishizuka, O. Hayaishi, I. Kato: Diphtheria toxin-dependent ade-

nosine diphosphate ribosylation of aminoacyl transferase II and inhibition of

protein synthesis, J. Biol. Chem., 1968, 243, 3553-3555.

[5] M. O. Hottiger, P. O. Hassa, B. Luscher, H. Schuler, F. Koch-Nolte: Toward a

unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases, Trends Biochem

Sci., 2010, 35, 208-219.

[6] A. A. Sauve, C. Wolberger, V. L. Schramm, J. D. Boeke: The biochemistry of

sirtuins, Annu. Rev. Biochem., 2006, 75, 435-465.

[7] R. Ramakrishna, J. S. Edwards, A. McCulloch, B. O. Palsson: Flux-balance

analysis of mitochondrial energy metabolism: consequences of systemic stoi-

160

chiometric constraints, Am. J Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 2001,

280, R695-R704.

[8] H. R. Horton, L. A. Moran, K. G. Scrimgeour, M. D. Perry, J. D. Rawn, Bioche-

mie, Addison-Wesley Verlag; Auflage: 4., aktualisierte Auflage (29. Juli 2008),

ISBN: 978-3-8273-7321-0.

[9] F. Berger, M. H. Ramırez-Hernandez, M. Ziegler: The new life of a centenarian:

signalling functions of NAD(P), Trends in Biochem. Sci., 2004, 29, 111-118.

[10] C. Canto, A. A. Sauve, P. Bai: Crosstalk between poly(ADP-ribose) polymerase

and sirtuin enzymes, Mol. Asp. Med., 2013, 34, 1168-1201.

[11] K. G. Tanne, J. Landry, R. Sternglanz, J. M. Denu: Silent information regulator

2 family of NAD-dependent histone/protein deacetylases generates a unique

product, 1-O-acetyl-ADP-ribose, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 14178-

14182; J. C. Tanny, D. Moazed: Coupling of histone deacetylation to NAD

breakdown by the yeast silencing protein Sir2: Evidence for acetyl transfer from

substrate to an NAD breakdown product, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001,

98, 415-420.

[12] S. Imai, C. M. Armstrong, M. Kaeberlein, L. Guarente: Transcriptional silencing

and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase, Nature,

2000, 403, 795-800.

[13] L. Tong, J. M. Denu: Function and metabolism of sirtuin metabolite O-acetyl-

ADP-ribose, BBA-Proteins and Proteom., 2010, 1804, 1617-1625.

[14] D. L. Clapper, T. F. Walseth, P. J. Dargie, H. C. Lee: Pyridine nucleotide

metabolites stimulate calcium release from sea urchin microsomes desensitized

to inositol trisphosphate, J. Biol. Chem., 1987, 262, 9561-9568.

[15] H. C. Lee, R. Aarhus, D. Levitt: The crystal structure of cyclic ADP-ribose,

Nat. Struct. Mol. Biol., 1994, 1, 143-144.

161

[16] D. J. States, T. F. Walseth, H. C. Lee: Similarities in amino acid sequences of

aplysia ADP-ribosyl cyclase and human lymphocyte antigen CD38, Trends in

Biochem. Sci., 1992, 17, 495-497.

[17] M. R. Hellmich, F. Strumwasser: Purification and characterization of a mol-

luscan egg-specific NADase, a second-messenger enzyme, Cell. Regul., 1991,

2, 193-202; D. L. Glick, M. R. Hellmich, S. Beushausen, P. Tempst, H. Bay-

ley, F. Strumwasser: Primary structure of a molluscan egg-specific NADase,

asecond-messenger enzyme, Cell. Regul., 1991, 2, 211-217.

[18] S. Yamamoto-Katayama, A. Sato, M. Ariyoshi, M. Suyama, K. Ishihara, T.

Hirano, H. Nakamura, K. Morikawa, H. Jingami: Site-directed removal of N-

glycosylation sites in BST-1/CD157: effects on molecular and functional hete-

rogeneity, Biochem. J., 2001, 357, 385-392.

[19] A. H. Guse: Biochemistry, biology, and pharmacology of cyclic adenosine di-

phosphoribose (cADPR), Curr. Med. Chem., 2004, 11, 847-855.

[20] A. H. Guse: Regulation of calcium signaling by the second messenger cyclic

adenosine diphosphoribose (cADPR), Curr. Med. Chem., 2004, 4, 239-246.

[21] P. Belenky, K. L. Bogan, C. Brenner: NAD+ metabolism in health and disease,

Trends in Biochem. Sci., 2007, 32, 12-19.

[22] A. Mattevi: A close look at NAD biosynthesis, Nat. Struct. Mol. Biol., 2006,

13, 563-564.

[23] V. Sharma, C. Grubmeyer, J. C. Sacchettini: Crystal structure of quinolinic

acid phosphoribosyltransferase from mycobacterium tuberculosis : A potential

TB drug target, Structure, 1998, 6, 1587-1599; D. H. Shin, N. Oganesyan, J.

Jancarik, H. Yokota, R. Kim, S.-H. Kim: Crystal structure of a nicotinate phos-

phoribosyltransferase from thermoplasma acidophilum, J. Biol. Chem., 2005,

280, 18326-18335; J. S. Chappie, J. M. Canaves, G. W. Han, C. L. Rife, Q. P.

162

Xu, R. C. Stevens: The structure of a eukaryotic nicotinic acid phosphoribosyl-

transferase reveals structural heterogeneity among type II PRTases, Structure,

2005, 13, 1385-1396.

[24] V. Saridakis, D. Christendat, M. S. Kimber, A. Dharamsi, A. M. Edwards, E.

F. Pai: Insights into ligand binding and catalysis of a central step in NAD+

synthesis: structures of methanobacterium thermoautotrophicum NMN adeny-

lyltransferase complexes, J. Biol. Chem., 2001, 276, 7225-7232; S. Garavag-

lia, I. D’Angelo, M. Emanuelli, F. Carnevali, F. Pierella, G. Magni, M. Rizzi:

Structure of human NMN adenylyltransferase: A key nuclear enzyme for NAD

homeostasis, J. Biol. Chem., 2002, 277, 8524-8530; T. J. Zhou, O. Kurnasov,

D. R. Tomchick, D. D. Binns, N. V Grishin, V. E. Marquez, A. L. Osterman,

H. Zhang: Structure of human nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide ade-

nylyltransferase: Basis for the dual substrate specificity and activation of the

oncolytic agent tiazofurin, J. Biol. Chem., 2002, 277, 13148-13154; H. Zhang,

T. J. Zhou, O. Kurnasov, S. Cheek, N. V Grishin, A. Osterman: Crystal struc-

tures of E. coli nicotinate mononucleotide adenylyltransferase and its complex

with deamido-NAD, Structure, 2002, 10, 69-79.

[25] E. M. Sletten, C. R. Bertozzi: Bioorthogonale Chemie - oder: in einem Meer aus

Funktionalitat nach Selektivitat fischen, Angew. Chem., 2009, 121, 7108-7133.

[26] E. M. Sletten, C. R. Bertozzi: From mechanism to mouse: A tale of two bioor-

thogonal reactions, Acc. Chem. Res., 2011, 44, 666-676.

[27] G. U. Nienhaus: Das grun fluoreszierende Protein: Schlussel zur Untersuchung

chemischer Prozesse in lebenden Zellen, Angew. Chem., 2008, 120, 9130-9132.

[28] J. M. Baskin C. R. Bertozzi: Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling

in living systems, QSAR Comb. Sci., 2007, 26, 1211-1219; C. P. R. Hackenber-

ger, D. Schwarzer: Chemoselektive Ligations- und Modifikationsstrategien fur

Peptide und Proteine, Angew. Chem., 2008, 120, 10182-10228.

163

[29] S. Brase, C. Gil, K. Knepper, V. Zimmerman: Organische Azide - explodierende

Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse, Angew. Chem., 2005, 117, 5320-

5374; M. F. Debets, C. W. J. van der Doelen, F. P. J. T. Rutjes, F. L. van Delft:

Azide: A unique dipole for metal-free bioorthogonal ligations, ChemBioChem,

2010, 11, 1168-1184.

[30] R. J. Griffin: The medicinal chemistry of the azido group, Prog. Med. Chem.,

1994, 31, 121-232.

[31] A. Michael: Ueber die Einwirkung von Diazobenzolimid auf Acetylendicarb-

onsauremethylester, J. Prakt. Chem., 1893, 48, 94-95.

[32] R. Huisgen: 1.3-Dipolare Cycloadditionen Ruckschau und Ausblick, Angew.

Chem., 1963, 75, 604-637.

[33] H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless: Click-Chemie: Diverse chemische

Funktionalitat mit einer Handvoll guter Reaktionen, Angew. Chem., 2001, 113,

2056-2075.

[34] F. Himo, T. Lovell, R. Hilgraf, V. V. Rostovtsev, L. Noodleman, K. B. Sharp-

less, V. V. Fokin: Copper(I)-catalyzed synthesis of azoles. DFT study predicts

unprecedented reactivity and intermediates, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127,

210-216.

[35] V. D. Bock, H. Hiemstra, J. H. van Maarseveen: Cu(I)-catalyzed alkyne-azide

“click” cycloadditions from a mechanistic and synthetic perspective, Eur. J.

Org. Chem., 2006, 1, 51-68.

[36] K. B. Sharpless, E. van der Eycken: Click chemistry (siehe gesamtes Heft),

QSAR Comb. Sci., 2007, 26, 1110-1323.

[37] F. Wolbers, P. ter Braak, S. Le Gac, R. Luttge, H. Andersson, I. Vermes, A.

van den Berg: Viability study of HL60 cells in contact with commonly used

microchip materials, Electrophoresis, 2006, 27, 5073-5080.

164

[38] G. Wittig, A. Krebs: Zur Existenz niedergliedriger Cycloalkine, Chem. Ber.,

1961, 94, 3260-3275.

[39] E. M. Sletten, C. R. Bertozzi: A hydrophilic azacyclooctyne for Cu-free click

chemistry, Org. Lett., 2008, 10, 3097-3099.

[40] X. H. Ning, J. Guo, M. A. Wolfert, G. J. Boons: Visualizing metabolically

labeled glycoconjugates of living cells by copper-free and fast Huisgen cycload-

ditions, Angew. Chem., 2008, 120, 2285-2287.

[41] J. M. Baskin, J. A. Prescher, S. T. Laughlin, N. J. Agard, P. V. Chang, I. A.

Miller, A. Lo, J. A. Codelli, C. R. Bertozzi: Copper-free click chemistry for

dynamic in vivo imaging, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104, 16793-16797;

S. T. Laughlin, J. M. Baskin, S. L. Amacher, C. R. Bertozzi: In vivo imaging

of membrane-associated glycans in developing zebrafish, Science, 2008, 320,

664-667.

[42] E. Saxon, C. R. Bertozzi: Cell surface engineering by a modified Staudinger

reaction, Science, 2000, 287, 2007-2010.

[43] H. Staudinger, J. Meyer: Uber neue organische Phosphorverbindungen III.

Phosphinmethylenderivate und Phosphinimine, Helv. Chim. Acta, 1919, 2, 635-

646.

[44] D. H. Dube C. R. Bertozzi: Glycans in cancer and inflammation - potential for

therapeutics and diagnostics, Nat. Rev. Drug. Discov., 2005, 4, 477-488.

[45] S. S. van Berkel, M. B. van Eldijk, J. C. M. van Hest: Staudinger-Ligation als

Methode zur Biokonjugation, Angew. Chem., 2011, 123, 8968-8989.

[46] B. L. Nilsson, L. L. Kiessling, R. T. Raines: Staudinger ligation a peptide from

a thioester and azide, Org. Lett., 2000, 2, 1939-1941

[47] E. Saxon, J. I. Armstrong, C. R. Bertozzi: A “traceless” Staudinger ligation for

the chemoselective synthesis of amide bonds, Org. Lett., 2000, 2, 2141-2143.

165

[48] P. E. Dawson, T. W. Muir, I. Clark-Lewis, S. B. Kent: Synthesis of proteins by

native chemical ligation, Science, 1994, 266, 776-779.

[49] M. L. Blackman, M. Royzen, J. M. Fox: Tetrazine ligation: Fast bioconjugation

based on inverse-electron-demand diels-alder reactivity, J. Am. Chem. Soc.,

2008, 130, 13518-13519.

[50] A. H. Guse, X. F. Gu, L. R. Zhang, K. Weber, E. Kramer, Z. J. Yang, H. W.

Jin, Q. Li, L. Carrier, L. H. Zhang: A minimal structural analogue of cyclic

ADP-ribose: synthesis and calcium release activity in mammalian cells, J. Biol.

Chem., 2005, 280, 15952-15959.

[51] S. Bruzzone, A. D. Flora, C. Usai, R. Graeff, H. C. Lee: Cyclic ADP-ribose is a

second messenger in the lipopolysaccharide-stimulated proliferation of human

peripheral blood mononuclear cells, Biochem. J., 2003, 375, 395-403.

[52] M. A. Blasco: Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond, Nat.

Rev. Genet., 2005, 6, 611-622.

[53] M. C. Gendron, N. Schrantz, D. Metivier, G. Kroemer, Z. Maciorowska, F.

Sureau, S. Koester, P. X. Petit: Oxidation of pyridine nucleotides during fas-

and ceramide-induced apoptosis in Jurkat cells: Correlation with changes in

mitochondria, glutathione depletion, intracellular acidification and caspase 3

activation, Biochem. J., 2001, 353, 357-367.

[54] S. Mandir, C. M. Simbulan-Rosenthal, M. F. Poitras, J. P. Lumpkin, V. L.

Dawson, M. E. Smulson, T. M. Dawson: A novel in vivo post-translational mo-

dification of p53 by PARP-1 in MPTP-induced parkinsonism, J. Neurochem.,

2002, 83, 186-192.

[55] M. D. Girolamo, N. Dani, A. Stilla, D. Corda: Physiological relevance of the

endogenous mono(ADP-ribosyl)ation of cellular proteins, FEBS J., 2005, 272,

166

4565-4575; S. Michan, D. Sinclair: Sirtuins in mammals: insights into their

biological function, Biochem. J., 2007, 404, 1-13.

[56] M. Seman, S. Adriouch, F. Scheuplein, C. Krebs, D. Freese, G. Glowacki, P.

Deterre, F. Haag, F. Koch-Nolte: NAD-induced T cell death, Immunity, 2003,

19, 571-582; E. K. Song, Y. R. Lee, H. N. Yu, U. H. Kim, S. Y. Rah, K. H.

Park, I. K. Shim, S. J. Lee, Y. M. Park, W. G. Chung, J. S. Kim, M. K: Han:

Extracellular NAD is a regulator for FcγR-mediated phagocytosis in murine

macrophages, Biochem. Biophys. Res. Com., 2008, 367, 156-161.

[57] J. A. Birrell, J. Hirst: Investigation of NADH binding, hydride transfer, and

NAD+ dissociation during NADH oxidation by mitochondrial complex I using

modified nicotinamide nucleotides, Biochemistry, 2013, 52, 4048-4055.

[58] Y. Hatefi, A. G. Haavik, D. E. Griffiths: Studies on the electron transfer system.

Preparation and properties of mitochondrial DPNH-coenzyme Q reductase. J.

Biol. Chem., 1962, 237, 1676-1680.

[59] U. Brandt, S. Kerscher, S. Drose, K. Zwicker, V. Zickermann: Proton pumping

by NADH: ubiquinone oxidoreductase. A redox driven conformational change

mechanism? FEBS Lett., 2003, 545, 9-17.

[60] W. Q. Liu, A. A. Gahr, R. Bao, Y. Z. Li: Recent progress in the synthesis and

evaluation of azido and diazo derivatives of NAD+ for photoaffinity labeling

experiments, Trends in Org. Chem., 1997, 6, 219-230.

[61] H. Bayley: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, 1983,

Vol. 12, Elsevier Verlag, ISBN: 978-0-444-80530-0.

[62] H. Jiang, J. Congleton, Q. Liu, P. Merchant, F. Malavasi, H. C. Lee, Q. Hao,

A. Yen, H. Lin: Mechanism-based small molecule probes for labeling CD38 on

live cells, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 1658-1659.

167

[63] J. T. Du, H. Jiang. H. Lin: Investigating the ADP-ribosyltransferase activity of

sirtuins with NAD analogues and 32P-NAD, Biochemistry, 2009, 48, 2878-2890.

[64] H. Jiang, J. H. Kim, K. M. Frizzell, W. L. Kraus, H. Lin: Clickable NAD

analogues for labeling substrate proteins of poly(ADP-ribose) polymerases, J.

Am. Chem. Soc., 2010, 132, 9363-9372.

[65] L. M. Coetzee, S. S. Tay, D. Lawrie, G. Janossy, D. K. Glencross: From research

tool to routine test: CD38 monitoring in HIV patients, Cyto. Part B: Clin.

Cytom., 2009, 76B, 375-384.

[66] K. A. Wall, M. Klis, J. Kornet, D. Coyle, J.-C. Ame, M. K. Jacobson, J. T.

Slama: Inhibition of the intrinsic NAD+ glycohydrolase activity of CD38 by

carbocyclic NAD analogues, Biochem. J., 1998, 335, 631-636.

[67] P. Franchetti, L. Cappellacci, P. Perlini, H. N. Jayaram, A. Butler, B. P. Schnei-

der, F. R. Collart, E. Huberman, M. Grifantini: Isosteric analogues of nicotina-

mide adenine dinucleotide derived from furanfurin, thiophenfurin, and seleno-

phenfurin as mammalian inosine monophosphate dehydrogenase (type I and II)

inhibitors, J. Med. Chem., 1998, 41, 1702-1707; P. Franchetti, L. Cappellacci,

S. Marchetti, C. Martini, B. Costa, K. Varani, P. A. Borea, M. Grifantini: C-

nucleoside analogues of furanfurin as ligands to a1 adenosine receptors, Bioorg.

Med. Chem., 2000, 8, 2367-2373.

[68] K. W. Pankiewicz, K. A. Watanabe, K. Lesiak-Watanabe, B. M. Goldstein,

H. N. Jayaram: The chemistry of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)

analogues containing C-nucleosides related to nicotinamide riboside, Curr. Med.

Chem., 2002, 9, 733-741.

[69] N. E. Batoux, F. Paradisi, P. C. Engel, M. E. Migaud: Novel nicotinamide adeni-

ne dinucleotide analogues as selective inhibitors of NAD+-dependent enzymes,

Tetrahedron, 2004, 60, 6609-6617.

168

[70] P. Chambon, J. D. Weill, P. Mandel: Nicotinamide mononucleotide activati-

on of a new DNA-dependent polyadenylic acid synthesizing nuclear enzyme,

Biochem. Biophys. Res. Com., 1963, 11, 39-43.

[71] D. D’Amours, S. Desnoyers, I. D’Silva, G. G. Poirier: Poly(ADP-ribosyl)ation

reactions in the regulation of nuclear functions, Biochem. J., 1999, 342, 249-

268.

[72] V. Schreiber, F. Dantzer, J. C. Ame, G. de Murcia: Poly(ADP-ribose): Novel

functions for an old molecule, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006, 7, 517-528.

[73] B. A. Gibson, W. L. Kraus: New insights into the molecular and cellular func-

tions of poly(ADP-ribose) and PARPs, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2012, 13,

411-424.

[74] J. Yelamos, V. Schreiber, F. Dantzer: Toward specific functions of poly(ADP-

ribose) polymerase-2, Trends in Mol. Med., 2008, 14, 169-178 (modifizierte

Abbildung).

[75] T. Sugimura, S. Fujimura, S. Hasegawa, Y. Kawamura: Polymerization of the

adenosine 5’-diphosphate ribose moiety of NAD by rat liver nuclear enzyme,

Biochim. Biophys. Acta., 1967, 138, 438-441.

[76] M. Ikejima, S. Noguchi, R. Yamashita, T. Ogura, T. Sugimura, D. M. Gill, M.

Miwa: The zinc fingers of human poly(ADP-ribose) polymerase are differenti-

ally required for the recognition of DNA breaks and nicks and the consequent

enzyme activation. Other structures recognize intact DNA, J. Biol. Chem.,

1990, 265, 21907-21913.

[77] G. de Murcia, V. Schreiber, M. Molinete, B. Saulier, O. Poch, M. Masson,

C. Niedergang, J. Menissier de Murcia: Structure and function of poly(ADP-

ribose) polymerase, Mol. Cell. Biochem., 1994, 138, 15-24; S. Okano, L. Lan,

169

K. W. Caldecott, T. Mori, A. Yasui: Spatial and temporal cellular responses to

single-strand breaks in human cells, Mol. Cell. Biol., 2003, 23, 3974-3981.

[78] M. Audebert, B. Salles, P. Calsou: Involvement of poly(ADP-ribose)

polymerase-1 and XRCC1/DNA ligase III in an alternative route for DNA

double-strand breaks rejoining, J. Biol. Chem., 2004, 279, 55117-55126; E.

Kun, E. Kirsten, J. Mendeleyev, C. P. Ordahl: Regulation of the enzymatic

catalysis of poly(ADP-ribose) polymerase by dsDNA, polyamines, Mg2+, Ca2+,

histones H1 and H3, and ATP, Biochemistry, 2004, 43, 210-216; I. Lonskaya, V.

N. Potaman, L. S. Shlyakhtenko, E. A. Oussatcheva, Y. L. Lyubchenko, V. A.

Soldatenkov: Regulation of poly(ADP-ribose) polymerase-1 by DNA structure-

specific binding, J. Biol. Chem., 2005, 280, 17076-17083.

[79] G. Gradwohl, J. M. Menissier de Murcia, M. Molinete, F. Simonin, M. Koken,

J. H. Hoeijmakers, G. de Murcia: The second zinc-finger domain of poly(ADP-

ribose) polymerase determines specificity for single-stranded breaks in DNA,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 2990-2994.

[80] S. F. El-Khamisy, M. Masutani, H. Suzuki, K. W. Caldecott: A requirement for

PARP-1 for the assembly or stability of XRCC1 nuclear foci at sites of oxidative

DNA damage, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 5526-5533.

[81] T. Kinoshita, I. Nakanishi, M. Warizaya, A. Iwashita, Y. Kido, K. Hattori, T.

Fujii: Inhibitor-induced structural change of the active site of human poly(ADP-

ribose) polymerase, FEBS Lett., 2004, 556, 43-46.

[82] R. Martello, A. Mangerich, S. Sass, P. C. Dedon, A. Burkle: Quantification of

cellular poly(ADP-ribosyl)ation by stable isotope dilution mass spectrometry

reveals tissue- and drug-dependent stress response dynamics, ACS Chem. Biol.,

2013, 8, 1567-1575.

[83] M. Miwa, H. Saito, H. Sakura, N. Saikawa, F. Watanabe, T. Matsushima, T.

Sugimura: A 13C NMR study of poly(adenosine diphosphate ribose) and its mo-

170

nomers: evidence of alpha-(1′′ leads to 2′)ribofuranosyl ribofuranoside residue,

Nucleic. Acids Res., 1977, 4, 3997-4005.

[84] M. Miwa, N. Saikawa, Z. Yamaizumi, S. Nishimura, T. Sugimura: Structure

of poly(adenosine diphosphate ribose): identification of 2′-[1′′-ribosyl-2′′-(or 3′′-

)(1′′′-ribosyl)]adenosine-5′,5′′,5′′′-tris(phosphate) as a branch linkage, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 1979, 76, 595-599.

[85] C. Canto, A. A. Sauve, P. Bai: Crosstalk between poly(ADP-ribose) polymerase

and sirtuin enzymes, Mol. Asp. Med., 2013, 34, 1168-1201.

[86] D. Slade, M. S. Dunstan, E. Barkauskaite, R. Weston, P. Lafite, N. Dixon, M.

Ahel, D. Leys, I. Ahel: The structure and catalytic mechanism of a poly(ADP-

ribose) glycohydrolase, Nature, 2011, 477, 616-620.

[87] J. Diefenbach, A. Burkle: Introduction to poly(ADP-ribose) metabolism, Cell.

Mol. Life Sci., 2005, 62, 721-730.

[88] H. Lin: Nicotinamide adenine dinucleotide: beyond a redox coenzyme, Org.

Biomol. Chem., 2007, 5, 2541-2554.

[89] D. Cervantes-Laurean, D. E. Minte, E. L. Jacobson, M. K. Jacobson: Protein

glycation by ADP-Ribose: Studies of model conjugatest, Biochemistry, 1993,

32, 1528-1534.

[90] Z. Tao, P. Gao, H. W. Liu: Identification of the ADP-ribosylation sites in the

PARP-1 automodification domain: Analysis and implications, J. Am. Chem.

Soc., 2009, 131, 14258-14260.

[91] S. Messner, M. O. Hottiger: Histone ADP-ribosylation in DNA repair, replica-

tion and transcription, Trends in Cell Biol., 2011, 21, 534-542.

[92] H. Mendoza-Alvarez, R. Alvarez-Gonzalez: Regulation of p53 sequence-specific

DNA-binding by covalent poly(ADP-ribosyl)ation, J. Biol. Chem., 2001, 276,

36425-36430.

171

[93] Y. Ohashi, K. Ueda, M. Kawaichi, O. Hayaishi: Activation of DNA ligase by

poly(ADP-ribose) in chromatin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3604-

3607.

[94] H. Teraoka, K. Tsukada, A. Matsukage, T. Kamiya: Inhibition of DNA polyme-

rase alpha, DNA polymerase beta, terminal deoxynucleotidyl transferase, and

DNA ligase II by poly(ADP-ribosyl)ation reaction in vitro, Biochem. Biophys.

Res. Com., 1985, 128, 61-67.

[95] A. I. Scovassl, C. Mariani, M. Negroni, C. Negri, U. Bertazzoni: ADP-

Ribosylation of nonhistone proteins in HeLa cells: Modification of DNA to-

poisomerase II, Exp. Cell Res., 1993, 206, 177-181.

[96] T. Ruscetti, B. E. Lehnert, J. Halbrook, H. L. Trong, M. F. Hoekstra, D. J.

Chen, S. R. Peterson: Stimulation of the DNA-dependent protein kinase by

poly(ADP-ribose) polymerase, J. Biol. Chem., 1998, 273, 14461-14467.

[97] R. Alvarez-Gonzalez, G. Pacheco-Rodriguez, H. Mendoza-Alvarez: Enzymology

of ADP-ribose polymer synthesis, Mol. Cell Biochem., 1994, 138, 33-37.

[98] A. Ruf, J. M. de Murcia J, G. de Murcia, G. E. Schulz: Structure of the catalytic

fragment of poly(ADribose) polymerase from chicken, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 1996, 93, 7481-7485.

[99] D. Bellocchi, G. Costantino, R. Pellicciari, N. Re, A. Marrone, C. Coletti:

Poly(ADP-Ribose)-polymerase-catalyzed hydrolysis of NAD+: QM/MM simu-

lation of the enzyme reaction, ChemMedChem, 2006, 1, 533-539.

[100] A. Ruf, V. Rolli, G.de Murcia, G. E. Schulz: The mechanism of the elongation

and branching reaction of poly(ADP-ribose) polymerase as derived from crystal

structures and mutagenesis, J. Mol. Biol., 1998, 278, 57-65.

172

[101] J. D Chapman, J.-P. Gagne, G. G. Poirier, D. R. Goodlett: Mapping PARP-1

auto-ADP-ribosylation sites by liquid chromatography-tandem mass spectro-

metry, J. Proteome Res., 2013, 12, 1868-1880.

[102] Y. j. Zhang, J. q. Wang, M. Ding, Y. h. Yu: Site-specific characterization of the

Asp- and Glu-ADP-ribosylated proteome, Nat. Methods, 2013, 10, 981-984.

[103] D. Cervantes-Laurean, D. E. Minte, E. L. Jacobson, M. K. Jacobson: Protein

glycation by ADP-ribose: Studies of model conjugates, Biochemistry, 1993, 32,

1528-1534.

[104] C. J. Lord, A. Ashworth: The DNA damage response and cancer therapy, Na-

ture, 2012, 481, 287-294 (modifizierte Abbildung).

[105] K. W. Caldecott: Mammalian DNA single-strand break repair: an X-ra(y)ted

affair, Bioessays, 2001, 23, 447-455; J. Fan J, D.M. Wilson III: Protein-protein

interactions and posttranslational modifications in mammalian base excision

repair, Free Radic. Biol. Med., 2005, 38, 1121-1266.

[106] C. J. Park, B. S. Choi: The protein shuffle. Sequential interactions among com-

ponents of the human nucleotide excision repair pathway, FEBS J., 2006, 273,

1600-1608.

[107] M. R. Lieber: The mechanism of human nonhomologous DNA end joining, J.

Biol. Chem., 2008, 283, 1-5.

[108] J. San Filippo, P. Sung, H. Klein: Mechanism of eukaryotic homologous recom-

bination, Annu. Rev. Biochem., 2008, 77, 229-257.

[109] P. Hsieh, K. Yamane: DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer,

and ageing, Mech. Ageing Dev., 2008, 129, 391-407.

[110] H. L. Ko, E. C. Ren: Functional Aspects of PARP1 in DNA Repair and Tran-

scription, Biomolecules, 2012, 2, 524-548.

173

[111] K. W. Caldecott: XRCC1 and DNA strand break repair, DNA Repair, 2003,

2, 955-969.

[112] H. E. Bryant; E. Petermann; N. Schultz, A. S. Jemth, O. Loseva, N. Issaeva,

F. Johansson, S. Fernandez, P. McGlynn, T. Helleday: PARP is activated at

stalled forks to mediate Mre11-dependent replication restart and recombination,

EMBO J., 2009, 28, 2601-2615 (modifizierte Abbildung).

[113] S. N. Khodyreva, R. Prasad, E. S. Ilina, M. V. Sukhanova, M. M Kutuzov,

Y. Liu, E. W. Hou, S. H. Wilson, O I. Lavrik: Apurinic/apyrimidinic (AP) site

recognition by the 5′-dRP/AP lyase in poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-

1), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107, 22090-22095.

[114] M. L. Hegde,T. K. Hazra, S. Mitra: Early steps in the DNA base excision/single-

strand interruption repair pathway in mammalian cells, Cell Res., 2008, 18,

27-47.

[115] E. Petermann, M. Ziegler, S. L. Oei: ATP-dependent selection between single

nucleotide and long patch base excision repair, DNA Repair, 2003, 2, 1101-

1104.

[116] S. B. De Lorenzo, A. G. Patel, R. M. Hurley, S. H. Kaufmann: The elephant and

the blind men: making sense of PARP inhibitors in homologous recombination

deficient tumor cells, Front. Oncol., 2013, 3, 1-12 (modifizierte Abbildung).

[117] J. R. Walker, R. A. Corpina, J. Goldberg: Structure of the Ku heterodimer

bound to DNA and its implications for double-strand break repair, Nature,

2001, 412, 607-614.

[118] J. M. Pleschke, H. E. Kleczkowska, M. Strohm, F. R. Althaus: Poly(ADP-

ribose) binds to specific domains in DNA damage checkpoint proteins, J. Biol.

Chem., 2000, 275, 40974-40980.

174

[119] C. M. Graeme, G. C. Smith, S. P. Jackson: The DNA-dependent protein kinase,

Genes & Dev., 1999, 13, 916-934.

[120] L. Spagnolo, A. Rivera-Calzada, L. H. Pearl, O. Llorca: Three-dimensional

structure of the human DNA-PKcs/Ku70/Ku80 complex assembled on DNA

and its implications for DNA DSB repair, Mol. Cell, 2006, 22, 511-519.

[121] S. P. Lees-Miller, K. Meek: Repair of DNA double strand breaks by nonhomo-

logous end joining, Biochimie, 2003, 85, 1161-1173.

[122] D. Buck, L. Malivert, R. de Chasseval, A. Barraud, M-C. Fondanech, O. Sanal,

A. Plebani, J. L. Stephan, M. Hufnagel, F. le Deist, A. Fischer, A. Durandy, J.

P. de Villartay, P. Revy: Cernunnos, a novel nonhomologous end-joining factor,

is mutated in human immunodeficiency with microcephaly, Cell, 2006, 124,

287-299.

[123] P. Ahnesorg, P. Smith, S. P. Jackson: XLF interacts with the XRCC4-DNA

ligase IV complex to promote DNA nonhomologous end-joining, Cell, 2006,

124, 301-313.

[124] S. N. Andres, A. Vergnes, D. Ristic, C. Wyman, M. Modesti, M. Junop: A

human XRCC4-XLF complex bridges DNA, Nucleic Acids Res., 2012, 40, 1868-

1878.

[125] J. Gu, H. Lu, A. G. Tsai, K. Schwarz, M. R. Lieber: Single-stranded DNA

ligation and XLF-stimulated incompatible DNA end ligation by the XRCC4-

DNA ligase IV complex: influence of terminal DNA sequence, Nucleic Acids

Res., 2007, 35, 5755-5762.

[126] K. Rothkamm, I. Kruger, L. H. Thompson, M. Lobrich: Pathways of DNA

double-strand break repair during the mammalian cell cycle, Mol. Cell. Biol.,

2003, 23, 5706-5715.

175

[127] R. Kanaar, C. Wyman: DNA repair by the MRN complex: break it to make it,

Cell, 2008, 135, 14-16.

[128] J. F. Haince, S. Kozlov, V. L. Dawson, T. M. Dawson, M. J. Hendzel, M. F.

Lavin, G. G. Poirier: Ataxia telangiectasia mutated (ATM) signaling network

is modulated by a novel poly(ADP-ribose)-dependent pathway in the early

response to DNA-damaging agents, J. Biol. Chem., 2007, 282, 16441-16453.

[129] P. Sung, L. Krejci, S. Van Komen, M. G. Sehorn: Rad51 recombinase and re-

combination mediators, J. Biol. Chem., 2003, 278, 42729-42732; M. K. Shivji,

A. R. Venkitaraman: DNA recombination, chromosomal stability and carcino-

genesis: insights into the role of BRCA2, DNA Repair, 2004, 3, 835-843.

[130] S. C. West: Molecular views of recombination proteins and their control, Nat.

Rev. Mol. Cell Biol., 2003, 4, 435-445.

[131] R. Holliday: A mechanism for gene conversion in fungi, Genet. Res., 1964, 5,

282-304.

[132] H. E. Bryant, E. Petermann, N. Schultz, A. S. Jemth, O. Loseva, N. Issaeva,

F. Johansson, S. Fernandez, P. McGlynn, T. Helleday: PARP is activated at

stalled forks to mediate Mre11-dependent replication restart and recombination,

EMBO J., 2009, 28, 2601-2615.

[133] L. Virag, C. Szabo: The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase

inhibitors, Pharmacol. Rev., 2002, 54, 375-429.

[134] V. Cepeda, M. A. Fuertes, J. Castilla, C. Alonso, C. Quevedo, M. Soto, J. M.

Perez: Poly(ADP-Ribose) polymerase-1 (PARP-1) inhibitors in cancer chemo-

therapy, Rec. Pat. Anti-Cancer Drug Disc., 2006, 1, 39-53.

[135] J. B. Clark, G. M. Ferris, S. Pinder: Inhibition of nuclear NAD nucleosidase

and poly ADP-ribose polymerase activity from rat liver by nicotinamide and

5′-methyl nicotinamide, Biochim. Biophys. Acta., 1971, 238, 82-85.

176

[136] B. W. Durkacz, O. Omidiji, D. A. Gray, S. Shall: (ADP-ribose)n participates

in DNA excision repair, Nature, 1980, 283, 593-596.

[137] J. C. Marecki, J. M. McCord: The inhibition of poly(ADP-Ribose) polymerase

enhances growth rates of ataxia telangiectasia cells, Arch. Biochem. Biophys.,

2002, 402, 227-234.

[138] N. J. Curtin: PARP inhibitors for cancer therapy, Expert Rev. Mol. Med., 2005,

7, 1-16.

[139] J. X. He, C. H. Yang, Z. H. Miao: Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors as

promising cancer therapeutics, Acta Pharmacol Sin., 2010, 31, 1172-1180.

[140] D. V. Ferraris: Evolution of poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) inhibi-

tors. From concept to clinic, J. Med. Chem., 2010, 53, 4561-4584.

[141] L. Tentori, G. Graziani: Chemopotentiation by PARP inhibitors in cancer the-

rapy, Pharmacol. Res., 2005, 52, 25-33.

[142] H. E. Bryant, N. Schultz, H. D. Thomas, K. M Parker, D. Flower, E. Lopez, S.

Kyle, M. Meuth, N. J. Curtin, T. Helleday: Specific killing of BRCA2-deficient

tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase, Nature, 2005, 434,

913-917; H. Farmer, N. McCabe, C. J. Lord, A. N. Tutt, D. A. Johnson, T. B.

Richardson, M. Santarosa, K. J. Dillon, I. Hickson, C. Knights, N. M. Martin,

S. P. Jackson, G. C. Smith, A. Ashworth: Targeting the DNA repair defect in

BRCA mutant cells as a therapeutic strategy, Nature, 2005, 434, 917-921.

[143] R. Buisson, A.-M. Dion-Cote, Y. Coulombe, H. Launay, H. Cai, A. Z Stasiak,

A. Stasiak, B. Xia, J.-Y. Masson: Cooperation of breast cancer proteins PALB2

and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination, Nat. Struct. Mol.

Biol., 2010, 17, 1247-1254.

[144] C. J. Lord, A. Ashworth: Targeted therapy for cancer using PARP inhibitors,

Curr. Opin. Pharmacol., 2008, 8, 363-369.

177

[145] P. McGlynn, R. G. Lloyd: Recombinational repair and restart of damaged rep-

lication forks, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2002, 3, 859-870.

[146] P. C. Fong, D. S. Boss, T. A. Yap, A. Tutt, P. Wu, M. Mergui-Roelvink, P.

Mortimer, H. Swaisland, A. Lau, M. J. O’Connor, A. Ashworth, J. Carmichael,

S. B. Kaye, J. H. M. Schellens, J. S. de Bono: Inhibition of poly(ADP-Ribose)

polymerase in tumors from BRCA mutation carriers, N. Engl. J. Med., 2009,

361, 123-134; J. D. Iglehart, D. P. Silver: Synthetic lethality - A new direction

in cancer-drug development, N. Engl. J. Med., 2009, 361, 189-191.

[147] N. Saijo: Present status and problems on molecular targeted therapy of cancer,

Cancer Res. Treat., 2012, 44, 1-10.

[148] R. Alvarez-Gonzalez, J. Moss, C. Niedergang, F. R. Althaus: Selective pro-

bing of ADP-ribosylation reactions with oxidized 2′-deoxynicotinamide adeni-

ne dinucleotide, Biochemistry, 1988, 27, 5378-5383; R. Alvarez-Gonzalez: 3′-

Deoxy-NAD+ as a substrate for poly(ADP-ribose)polymerase and the reaction

mechanism of poly(ADP-ribose) elongation, J. Biol. Chem., 1988, 263, 17690-

17696; H. Mendoza-Alvarez, R. Alvarez-Gonzalez: Biochemical characterization

of mono(ADP-ribosyl)ated poly(ADP-ribose) polymerase, Biochemistry, 1999,

38, 3948-3953; H. Mendoza-Alvarez, R. Alvarez-Gonzalez: The 40 kDa carboxy-

terminal domain of poly(ADPribose) polymerase-1 forms catalytically compe-

tent homo- and heterodimers in the absence of DNA, J. Mol. Biol., 2004, 336,

105-114.

[149] Y. Wang, D. Rosner, M. Grzywa, A. Marx: Kettenterminierende und durch

Click-Chemie modifizierbare NAD+-Analoga zur Markierung von Zielproteinen

der ADP-Ribosyltransferasen, Angew. Chem., 2014, 126, 8298-8301.

[150] T. Kovacs, L. Otvos: Simple synthesis of 5-vinyl- and 5-ethynyl-2′-deoxyuridine-

5′-triphosphates, Tetrahedron Lett., 1988, 29, 4525-4528.

178

[151] A. Matsuda, M. Shinozaki, T. Yamaguchi, H. Homma, R. Nornoto, T. Miya-

saka, Y. Watanabe, T. Abiru: 2-Alkynyladenosines: A novel class of selective

adenosine A2 receptor agonists with potent antihypertensive effects, J. Med.

Chem., 1992, 35, 241-252.

[152] K. Sonogashira, Y. Tohda, N. Hagihara: A convenient synthesis of acetylenes:

catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkenes, iodoarenes

and bromopyridines, Tetrahedron Lett., 1975, 16, 4467-4470; Y. Wang, B. A.

Tkachenko, P. R. Schreiner, A. Marx: Diamondoid-modified DNA, Org. Biomol.

Chem., 2011, 9, 7482-7490.

[153] N. Piton, Y. g. Mu, G. Stock, T. F. Prisner, O. Schiemann, J. W. Engels: Base-

specific spin-labeling of RNA for structure determination, Nucleic Acids Res.,

2007, 35, 3128-3143.

[154] F. Seelao, X. Ming: 7-Functionalized 7-deazapurine β-D and β-L-ribonucleo-

sides related to tubercidin and 7-deazainosine: glycosylation of pyrrolo[2,3-

d]pyrimidines with 1-O-acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D or β-L-ribofuranose, Te-

trahedron, 2007, 63, 9850-9861.

[155] T. Sandmeyer: Ueber die Ersetzung der Amidgruppe durch Chlor in den aro-

matischen Substanzen, Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1884, 17, 1633-1635.

[156] M. E. Jung, Y. Xu: Efficient syntheses of L-ribose and 2-deoxy L-ribose from

D-ribose and L-arabinose, Tetrahedron Lett., 1997, 38, 4199-4202.

[157] J. Kim, L. g. Wang, Y. f. Li, K. D. Becnel, S. J. Garforth, K. M. Frey, V.

R. Prasad, R. F. Schinazi, D. C. Liotta, K. S. Andersona: Pre-steady state

kinetic analysis of cyclobutyl derivatives of 2′-deoxyadenosine 5′-triphosphate

as inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 2012,

22, 4064-4067.

179

[158] P. Franchetti, M. Pasqualini, R. Petrelli, M. Ricciutelli, P. Vita, L. Cappellac-

ci: Stereoselective synthesis of nicotinamide β-riboside and nucleoside analogs,

Bioorg. & Med. Chem. Lett., 2004, 14, 4655-4658.

[159] T. Yang, N. Yan-Ki Chan, A. A. Sauve: Syntheses of nicotinamide riboside and

derivatives: effective agents for increasing nicotinamide adenine dinucleotide

concentrations in mammalian cells, J. Med. Chem., 2007, 50, 6458-6461.

[160] B. G. Lawhorn, R. A. Mehl, T. P. Begley: Biosynthesis of the thiamin pyrimi-

dine: the reconstitution of a remarkable rearrangement reaction, Org. Biomol.

Chem., 2004, 2, 2538-2546.

[161] K. A. Kalesh, K. Liu,S. Q. Yao: Rapid synthesis of abelson tyrosine kinase

inhibitors using click chemistry, Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 5129-5136.

[162] C. Moreau, G. K. Wagner, K. Weber, A. H. Guse, B. V. L. Potter: Structural de-

terminants for N1/N7 cyclization of nicotinamide hypoxanthine 5′-dinucleotide

(NHD+) derivatives by ADP-ribosyl cyclase from Aplysia californica: Ca2+-

mobilizing activity of 8-substituted cyclic inosine 5′-diphosphoribose analogues

in T-lymphocytes, J. Med. Chem., 2006, 49, 5162-5176.

[163] C. Moreau, G. A. Ashamu, V. C. Bailey, A. Galione, A. H. Guse, B. V. L.

Potter: Synthesis of cyclic adenosine 5′-diphosphate ribose analogues: a C2′

endo/syn “southern” ribose conformation underlies activity at the sea urchin

cADPR receptor, Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 278-290.

[164] B. Zhang, G. K. Wagner, K. Weber, C. Garnham, A. J. Morgan, A. Galione,

A. H. Guse, B. V. L. Potter: 2′-Deoxy cyclic adenosine 5′-diphosphate ribose

derivatives: importance of the 2′-hydroxyl motif for the antagonistic activity of

8-substituted cADPR derivatives, J. Med. Chem., 2008, 51, 1623-1636.

[165] N. Hardt, S. M. Hacker, A. Marx: Synthesis and fluorescence characteristics of

ATP-based FRET probes, Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 8298-8305.

180

[166] F. Landi, C. M. Johansson, D. J. Campopiano, A. N. Hulme: Synthesis and

application of a new cleavable linker for “click”-based affinity chromatography,

Org. Biomol. Chem., 2010, 8, 56-59.

[167] J. M. Siegel, G. A. Montgomery, R. M. Bock: Ultraviolet absorption spectra of

DPN and analogs of DPN, Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82, 288-299.

[168] J. Fahrer, R. Kranaster, M. Altmeyer, A. Marx, A. Burkle: Quantitative ana-

lysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as

a function of chain length, Nucleic Acids Res., 2007, 35, e143, 1-9; O. Popp, S.

Veith, J. Fahrer, V. A. Bohr, A. Burkle, A. Mangerich: Site-specific noncova-

lent interaction of the biopolymer poly(ADP-ribose) with the werner syndrome

protein regulates protein functions, ACS Chem. Biol., 2013, 8, 179-188.

[169] Patent US6936713B2; Patent EP1515970B1.

[170] S.-Y. Rhie, W. Pfleiderer: Synthesis and chemical modifications of 3′-deoxy-

pyrimidine nucleosides, Nucleosides & Nucleotides, 1994, 13, 1425-1452.

[171] H. Gao, A. K. Mitra: Regioselective synthesis of acyclovir and its various pro-

drugs, Synth. Comm., 2001, 31, 1399-1419; Patent WO9315075A1.

[172] D. H. R. Barton, S. W. McCombie: A new method for the deoxygenation of

secondary alcohols, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1975, 1, 1574-1585.

[173] H. Vorbruggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua: Nucleoside synthesis with trime-

thylsilyl triflate and perchlorate as catalysts, Chem. Ber., 1981, 114, 1234-1255;

V. Rolland, M. Kotera, J. Lhomme: Convenient preparation of 2-deoxy-3,5-

di-O-p-toluoyl-α-D-erythro-pentofuranosyl chloride, Synth. Comm., 1997, 27,

3505-3511.

[174] L. H. Kool, H. M. Buck: Molecular conformation of 2′-deoxy-3′,5′-di-O-acetyl

guanosine. Crystal structure and high resolution proton nuclear magnetic reso-

nance investigations, Can. J. Chem., 1988, 66, 2634-2639.

181

[175] E. Nandanan, E. Camaioni, S.-Y. Jang, Y.-C. Kim, G. Cristalli, P. Herdewijn,

J. A. Secrist III, K. N. Tiwari, A. Mohanram, T. K. Harden, J. L. Boyer, K. A.

Jacobson: Structure-activity relationships of bisphosphate nucleotide derivati-

ves as P2Y1 receptor antagonists and partial agonists, J. Med. Chem., 1999,

42, 1625-1638.

[176] D. Ubiali, C. D. Serra, I. Serra, C. F. Morelli, M. Terreni, A. M. Albertini, P.

Manitto, G. Speranza: Production, characterization and synthetic application

of a purine nucleoside phosphorylase from Aeromonas hydrophila, Adv. Synth.

Catal., 2012, 354, 96-104.

[177] M. Verdoes, B. I. Florea, U. Hillaert, L. I. Willems, W. A. van der Linden, M.

Sae-Heng, D. V. Filippov, A. F. Kisselev, G. A. van der Marel, H. S. Overkleeft:

Azido-BODIPY acid reveals quantitative Staudinger-bertozzi ligation in two-

step activity-based proteasome profiling, ChemBioChem, 2008, 9, 1735-1738.

[178] H. Staudinger, J. Meyer: Uber neue organische Phosphorverbindungen III.

Phosphinmethylenderivate und Phosphinimine, Helv. Chim. Acta, 1919, 2, 635-

646.

[179] R. J. Suhadolnik, R. Baur, D. M. Lichtenwalner, T. Uematsu, J. H. Roberts,

S. Sudhakar, M. Smulson: ADP-ribosylation of isolated nuclei from HeLa cells,

rat liver, fetal rat liver, and novikoff hepatoma. Effect of nicotinamide adenine

dinucleotide analogs on template activity for DNA synthesis, incorporation into

nuclear proteins, and a new 1′′-3′ osidic linkage, J. Biol. Chem., 1977, 252,

4134-4144.

[180] A. Holmberg, A. Blomstergren, O. Nord, M. Lukacs, J. Lundeberg, M. Uhlen:

The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water at

elevated temperatures, Electrophoresis, 2005, 26, 501-510.

[181] Produktbeschreibung (BcMagTM Streptavidin Magnetic Beads) von der Firma

Bioclone.

182

[182] H. Jiang, H. Lin: Labeling substrate proteins of poly(ADP-ribose) polymerases

with clickable NAD analog, Curr. Protoc. Chem. Biol., 2012, 4, 19-34.

[183] U. K. Laemmli: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227, 680-685.

183