norovirus(tsphuc).pdf - viện y tế công cộng
TRANSCRIPT
Trung Tâm Kiểm nghiệm VSATTP khu vực phía Nam
Labo Vi sinh thực phẩm
NOROVIRUS VÀ PHÁT HIỆN
NOROVIRUS BẰNG KỸ THUẬT
REALTIME-PCR
TS.NGUYỄN ĐỖ PHÚC
Phó giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm ATVSTP KV phía nam-
Viện Vệ sinh-Y tế công cộng Tp.HCM
TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN
Trưởng đơn vị Gene -TT Phòng chống chấn thương
và các bệnh không lây-Viện VS-YTCC Tp.HCM
Giảng viên trường đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh
Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011
Bệnh tiêu chảy do
nhiễm Norovirus
Phân loại, hình thái
học và tổ chức bộ
gen
Sự lây truyền, đặc
điểm lâm sàng và
phát sinh bệnh
Chẩn đoán
Các kỹ thuật sinh
học phân tử
Phương pháp RT-
PCR
Phương pháp Real-
time PCR
Tạo dòng
QUI TRÌNH
REALTIME PCR
PHÁT HIỆN
NOROVIRUS
TRONG NHUYỄN
THỂ HAI MẢNH VỎ
TÀI LIỆU THAM
KHẢO
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... 2
TỔNG QUAN ........................................................................................................................ 1
1. Bệnh tiêu chảy do nhiễm Norovirus (NoV) ......................................................... 1
2. Ph}n loại, hình th{i học v| tổ chức bộ gen ........................................................... 1
3. Sự l}y truyền, đặc điểm l}m s|ng v| ph{t sinh bệnh ......................................... 3
4. Chẩn đo{n ................................................................................................................. 5
5. C{c kỹ thuật sinh học ph}n tử ............................................................................... 7
5.1 Phương pháp RT-PCR ........................................................................................ 7
5.2 Real – time PCR .................................................................................................. 7
5.3 Tạo dòng .............................................................................................................. 8
QUI TRÌNH PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ....... 8
1. PHẠM VI ÁP DỤNG ................................................................................................. 9
2. TÀI LIỆU ÁP DỤNG ................................................................................................. 9
3. NGUYÊN TẮC ........................................................................................................... 9
4. DỤNG CỤ- THIẾT BỊ ................................................................................................ 9
4.1 Dụng cụ .............................................................................................................. 9
4.2 Thiết bị ................................................................................................................ 9
5. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT .................................................................................. 10
5.1 Bộ hóa chất t{ch chiết RNA to|n phần NKRNAPREP ................................ 10
5.2 Bộ hóa chất dùng tổng hợp cDNA NK ........................................................ 10
5.3 Bộ hóa chất dùng điện di ............................................................................... 11
5.4 C{c th|nh phần bộ kít Real Time PCR ........................................................ 11
5.5 Bộ kít Real Time PCR ..................................................................................... 12
6. QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM ................................................................................ 12
6.1 Chuẩn bị cDNA từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ ............................................. 12
6.2 Chu trình nhiệt Real Time PCR ph{t hiện Norovirus GI v| GII .............. 14
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 16
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
EIA Enzym Immunoassay
EM Electron microscopy
HBGA Histo-blood group antigens
IAHA Immune adherence hemagglutination assay
IC Immunochromatography
IEM Immune electron microscopy
MCR Multiple Cloning Region.
NoV Norovirus
ORF Open reading frame
PCR Polymerase chain reaction
RdRp RNA-dependent RNA polymerase
RIA Radioimmunoassay
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
RT-LAMP Reverse Transcription-Loop-mediated
Isothermal Amplification
ssRNA single stranded RNA
VLPs Virus-like particles
VP Viral coat and capsid Proteins
1
TỔNG QUAN
1. Bệnh tiêu chảy do nhiễm Norovirus (NoV)
C{c bệnh về tiêu chảy l| nguyên nh}n chính của dịch bệnh v| tử vong ở trẻ
em tại c{c nước đã v| đang ph{t triển [44,27]. Điều đó được chứng minh ở Ch}u
Phi, Ch}u Á v| Mỹ Latinh đã có 744 triệu đến 1 tỷ trường hợp viêm dạ d|y
cấp v| 2,4 đến 3,3 triệu trường hợp tử vong h|ng năm ở trẻ em dưới 5 tuổi [27,36]. Mặc dù, c{c b{o c{o cho thấy có ít nhất 25 loại vi sinh vật v| động vật
nguyên sinh có thể g}y ra bệnh tiêu chảy ở trẻ em, trong đó hơn 75% của c{c
trường hợp nguyên nh}n l| do c{c virus, v| 7 nhóm virus thường g}y tiêu
chảy l| Rotavirus, Norovirus, Sapovirus, Adenovirus, Astrovirus,
Parechovirus, v| Aichivirus được coi l| c{c t{c nh}n chính v| phổ biến của
bệnh viêm dạ d|y ruột cấp ở người [44,28,29].
Noroviruses (NoVs) được ph{t hiện lần đầu
tiên bởi Kapikian v| cộng sự v|o năm 1972 [11] dưới kính hiển vi điện tử (EM). Trước
đ}y, c{c virus được kí hiệu l| “Norwalk-like
viruses”. Chủng nguyên thủy của NoV l|
virus Norwalk, chúng được ph{t hiện từ
một đợt bùng ph{t viêm dạ d|y ruột cấp
tính tại một trường tiểu học ở Norwalk,
Ohio năm 1968 [11]. NoVs l| th|nh viên của
chi Norovirus, cùng với chi Sapovirus trong họ
Caliciviridae [6]. C{c virus n|y thường nhỏ v| không có m|ng bao quanh, sRNA
(+), với đường kính khoảng 27-35 nm.
NoV được coi l| nguyên nh}n chính g}y viêm dạ d|y ruột cấp tính ở trẻ em v|
người lớn. Bệnh do NoV thường xảy ra v| tìm thấy ở c{c nơi kh{c nhau: nh|
h|ng, trường học, c{c trung t}m chăm sóc sức khỏe, bệnh viện, nh| điều
dưỡng, v| t|u du lịch. Hằng năm có hơn 267 triệu nhiễm do NoV trên to|n thế
giới [20, 21,34]. Con đường truyền chính của virus n|y thường lan truyền qua
đường thực phẩm, đường nước, không khí, v| lan truyền từ người sang người [7,17,22].
2. Phân loại, hình thái học và tổ chức bộ gen
Trước đ}y, việc ph{t hiện l}y nhiễm NoV ở người bị hạn chế bởi vì NoV g}y
bệnh ở người nhưng không sinh sản v| ph{t triển được trong c{c nuôi cấy tế
b|o, v| cũng không có động vật thí nghiệm n|o thích hợp cho sự g}y nhiễm
NoV. Tạo dòng của bộ gen virus Norwalk được thực hiện năm 1990 đã dẫn
Hình 1.1: Norovirus dưới kính hiển vi điện tử
2
đến sự tiến bộ đ{ng kể trong sự hiểu biết về virus học ph}n tử v| dịch tễ học
của NoVs [41]. Gần đ}y, c{c phương ph{p chẩn đo{n ph}n tử nhạy cảm dựa
trên phản ứng RT-PCR v| c{c kỹ thuật giải trình tự bộ gen để ph{t hiện v| mô
tả đặc điểm NoV đã n}ng cao thêm sự hiểu biết của chúng ta về dịch tễ học
của sự l}y nhiễm NoV [42]. Những kỹ thuật n|y đã chứng minh rằng c{c virus
NoV có tính di truyền v| đa dạng về kh{ng nguyên [43]. Dựa v|o trình tự giống
nhau v| ph}n tích ph{t sinh chủng lo|i, NoVs có thể được ph}n loại theo
nhóm gen (genogroup), kiểu gen (genotype) v| cụm gen (genocluster). Hiện
nay, NoVs được ph}n loại th|nh năm nhóm gen kh{c nhau: GI đến GV [6,30].
NoVs ở người thuộc GI, GII v| GIV, nhưng hầu hết c{c chủng g}y bệnh ở
người thuộc đều thuộc nhóm gen GI và GII. NoVs GIII v| GV cho đến nay đã
được tìm thấy ở lo|i bò v| c{c lo|i chuột. Trong c{c nhóm gen (genogroups),
NoVs được chia tiếp th|nh c{c kiểu gen (genotypes), trong số đó có ít nhất 29
kiểu gen đã được b{o c{o. Hiện nay nhóm gen GI được chia th|nh t{m kiểu
gen (GI/1 đến GI/8), GII bao gồm ít nhất 17 kiểu gen (GII/1 đến GII/17), GIII có
hai kiểu gen (GIII/1-GIII/2) v| mỗi GIV v| GV bao gồm một kiểu gen [43].
C{c ph}n tích về trình tự to|n bộ chiều d|i bộ gen của NoV đã chỉ ra rằng c{c
chủng virus trong một nhóm gen thường có nhiều hơn 69% tương đồng về
nucleotide, trong khi c{c chủng trong c{c nhóm gen kh{c chỉ chiếm 51-56% sự
tương đồng. Ngo|i ra, sự ph}n loại dựa trên trình tự nucleotide của gen cho
protein vỏ capsid cho thấy rằng c{c trình tự chệch nhau bởi 60% giữa c{c
genogroups v| 20- 30% giữa c{c genotypes. Trong cùng genocluster, trình tự
vỏ capsid của virus thường rất giống nhau [5].
Thông qua việc gi{m s{t dịch tễ của NoV trên thế giới đã cho thấy vai trò chủ
yếu của những chủng có nhóm gen GII, đặc biệt l| những chủng có kiểu gen
GII/4 chiếm ưu thế l| nguyên nh}n của c{c vụ dịch (hiện tại ước tính khoảng ~
80% của tất cả c{c trường hợp l}y nhiễm), v| có c{c biến thể GII/4 mới xuất
hiện mỗi 1-2 năm. Dường như sự tăng lên thường xuyên của biến thể GII/4
mới đã tiếp diễn trong năm qua, v| trở th|nh một hiện tượng to|n cầu [31,32].
Mặc dù dịch bệnh NoV
được b{o c{o quanh năm,
nhưng đỉnh điểm của việc
bùng ph{t dịch l| trong
mùa đông [1].
NoVs l| th|nh viên của
chi Norovirus, trong họ
Caliciviridae. Hạt Virion
NoV được tạo th|nh bởi
3
cấu trúc đơn của vỏ capsid, với khối 20 mặt đối xứng. Bề mặt điển hình của
hạt virus mang hình d{ng lõm của c{i t{ch. Vỏ capsid gồm có 90 dimer của
một protein vỏ đơn, có trọng lượng ph}n tử l| 58 kD.
Bộ gen của NoV bao gồm mạch dương (positive-sense), 7.400-7.700 nucleotide
của sRNA. Bộ gen được chia th|nh 3 khung đọc mở (ORF1, ORF2, v| ORF3).
ORF1 mã hóa cho một polyprotein được t{ch ra từ enzym thủy ph}n protein,
tạo th|nh NTPase, protease, v| RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp).
ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1, v| ORF3 mã hóa một protein VP2
cơ bản nhỏ chưa biết chức năng [6].
3. Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và phát sinh bệnh
C{c NoV thường l| nguyên nh}n phổ biến của c{c bệnh viêm dạ d|y ruột cấp
ở hầu hết c{c nhóm tuổi. Nhìn chung, c{c NoV GII l| chủng phổ biến nhất
được b{o c{o trong c{c vụ dịch trên to|n thế giới [17]. Sự lan truyền phổ biến l|
thông qua thức ăn, nước v| môi trường bị ô nhiễm, sự tiếp xúc giữa người với
người, trong không khí, v| có thể do một số phương thức kh{c chưa biết. C{c
NoV được tìm thấy trong mẫu ph}n v| mẫu nôn của một người bị nhiễm
bệnh.
Hình 1.3: Cấu trúc bộ gen NoV
Hình 1.2: Cấu trúc của NoV
4
Có ít nhất 2 nh}n tố góp phần v|o khả năng bùng ph{t dịch bệnh của virus.
Thứ nhất, virus l}y nhiễm rất cao v| chỉ một lượng nhỏ, khoảng 10-100 hạt
virion, l| đủ để g}y bệnh. Thứ hai, virus tương đối bền trong môi trường, ví
dụ khả năng chống chịu đóng băng, nhiệt độ đến 600C, khử khuẩn với chlore,
điều kiện acid, giấm, rượu, c{c dung dịch khử trùng tay, v| nồng độ đường
cao [4,38]. Giai đoạn ủ bệnh trung bình của vius ngắn (12-48h), nhưng sự ph{t
t{n của virus được ph{t hiện ba tuần sau khi xuất hiện c{c triệu chứng, tạo cơ
hội để mở rộng phạm vi ph{t t{n của virus sang c{c vật chủ kh{c [35]. Hiện nay
việc phòng ngừa v| khống chế c{c vụ dịch của NoV l| dựa v|o việc x{c định
c{c phương thức truyền nhiễm; sự lan truyền bệnh được cắt đứt bằng việc
kiểm so{t sự ô nhiễm của thực phẩm v| nguồn nước, duy trì vệ sinh c{ nh}n,
v| l|m giảm sự truyền bệnh từ người sang người.
Triệu chứng nhiễm NoV có thể có nôn mửa hoặc tiêu chảy, phổ biến l| đau
quặn, v| đôi khi có sốt. Ph}n tiêu chảy thường không có m{u, thiếu chất nhờn,
thể lỏng v| có nước. C{c triệu chứng thường kéo d|i khoảng 24-60h [13]. C{c
cuộc nghiên cứu trên người tình nguyện cho thấy rằng có đến 30% c{c trường
hợp nhiễm trùng m| không có triệu chứng n|o. Không có c{c điều trị kh{ng
virus đặc hiệu, cũng như không có vaccine để ngăn ngừa bệnh [6]. Điều trị chỉ
tập trung v|o chăm sóc hỗ trợ, đặc biệt l| ngăn ngừa v| điều trị mất nước.
Những người không thể duy trì sự chống mất nước, đặc biệt l| trẻ em v|
người cao tuổi, có nguy cơ mất nước rất cao, dẫn đến rối loạn sự điện giải v|
có thể phải nhập viện. C{c biến chứng từ nhiễm NoV có thể thường thấy ở trẻ
sơ sinh v| người cao tuổi. Tuy nhiên, dữ liệu mới cho thấy rằng c{c dấu hiệu
v| c{c biến chứng l}m s|ng bất thường từ sự l}y nhiễm NoV có thể xảy ra ở
những người suy giảm miễn dịch v| căng thẳng tinh thần [14].
Do không có khả năng nuôi NoV ở người, nên hầu hết c{c dữ liệu về bệnh học
v| miễn dịch học đều thu được từ c{c cuộc nghiên cứu trên những người tình
nguyện. C{c nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh bị nhiễm
virus cho thấy sự nhiễm trùng chính thường xảy ra ở phần dưới của ruột non
với sự dãn nỡ của lông nhung v| sự co ngắn của vi lông nhung [44]. Những vết
viêm loét của niêm mạc ph{t triển sau đó, kết quả cuối cùng l| dẫn đến tiêu
chảy. Nhiễm trùng do NoV kích thích cơ thể sinh ra kh{ng thể IgG, IgA đặc
hiệu v| kh{ng thể IgM trong huyết thanh, ngay cả khi đã có sự phơi nhiễm
trước đó. Hầu hết c{c bệnh nh}n đều có sự đề kh{ng với sự t{i l}y nhiễm
trong khoảng 4 - 6 th{ng. Tuy nhiên, không có sự miễn dịch l}u d|i [44].
Nghiên cứu ban đầu trong c{c nhóm tình nguyện đã chứng minh rằng khoảng
30% trường hợp nhiễm bệnh m| không có triệu chứng đi kèm v| có khoảng
50% dẫn đến bệnh [33,45]. Gần đ}y, nghiên cứu cho thấy rằng những người
5
nhiễm bệnh NoV phụ thuộc v|o sự hiện diện của c{c thụ thể kh{ng nguyên
nhóm m{u histo đặc hiệu ở người (HBGA) trong ống tiêu hóa [18]. HBGAs ở
người l| phức hợp c{c carbohydrate bao gồm một oligosaccharide liên kết với
protein hoặc lipid trên niêm mạc biểu mô của hệ hô hấp, sinh dục, v| ống tiêu
hóa, hoặc như c{c oligosaccharide tự do trong c{c dịch sinh học như nước bọt [23]. Cả 3 họ HBGA chính (họ ABO, Lewis, v| họ secretor) đã cho thấy có sự
liên quan đến việc nhận diện NoV. Sự phối hợp của liên kết đặc hiệu chủng v|
biểu hiện biến đổi trên thụ thể HBGA có thể giải thích sự mẫn cảm của người
nhiễm kh{c nhau được theo dõi trong c{c vụ dịch NoV v| trong c{c nghiên
cứu ở người tình nguyện [9,39].
4. Chẩn đoán
Có nhiều phương ph{p thích hợp để chẩn đo{n bệnh nhiễm NoV. Những
phương ph{p n|y bao gồm hiển vi điện tử trực tiếp (EM), hiển vi điện tử miễn
dịch (IEM), thử nghiệm ngưng kết hồng cầu miễn dịch (IAHA), thử nghiệm
miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm miễn dịch enzym (EIA), thử nghiệm
sắc ký miễn dịch (IC), RT-PCR, real-time PCR, v| giải trình tự nucleic acid.
Trong số những phương ph{p n|y thì RT-PCR, real-time PCR v| giải trình tự
nucleic acid được sử dụng rộng rãi để ph{t hiện v| x{c định kiểu gen của NoV [15,28,25,42]. C{c kỹ thuật n|y đã thay thế c{c thử nghiệm miễn dịch truyền thống
v| trở th|nh tiêu chuẩn v|ng cho chẩn đo{n nhiễm trùng NoV trong thập kỷ
qua.
Các kỹ thuật thông thường. Vì NoV ở người không thể ph{t triển trên môi
trường nuôi cấy tế b|o, chẩn đo{n ban đầu viêm dạ d|y ruột liên quan đến sự
nhiễm NoV được dựa v|o quan s{t trực tiếp bằng c{ch sử dụng EM [11]. Vì kỹ
thuật n|y ph{t hiện một lượng virus > 106/ml trong dịch huyền phù ph}n, nó
chỉ có thể th|nh công khi {p dụng trong giai đoạn sớm của bệnh [38]. Trong khi
c{c hạt virus n|y có thể được quan s{t trong mẫu lọc của ph}n tiêu chảy ở giai
đoạn rất sớm, quan s{t được tăng cường bằng kỹ thuật IEM với huyết thanh
miễn dịch thêm v|o. Trong kỹ thuật n|y, huyết thanh miễn dịch được sử dụng
để n}ng cao sự ph{t hiện virus bởi sự ngưng kết của c{c hạt virus trong dịch
huyền phù ph}n. Sự kết cụm virus xảy ra trong sự hiện diện của kh{ng thể
đặc hiệu có thể ph{t hiện v| cải thiện khả năng chẩn đo{n đặc hiệu. Tuy
nhiên, kỹ thuật n|y chỉ được sử dụng cho c{c mẫu ph}n thu nhận trong giai
đoạn đầu của bệnh [19].
Thử nghiệm ngưng kết hồng cầu miễn dịch (IAHA) v| RIA đang được ph{t
triển. IAHA l| thử nghiệm để đ{nh gi{ nồng độ kh{ng thể NoV trong một
lượng lớn huyết thanh vì thế c{c nghiên cứu dịch tễ học về huyết thanh có thể
6
được thực hiện bằng thử nghiệm n|y [12]. Những hạt virus được l|m sạch từ
mẫu ph}n có thể được dùng như một kh{ng nguyên, v| tương t{c của phức
hợp giữa kh{ng nguyên/kh{ng thể được ph{t hiện bởi sự ngưng kết hồng cầu
nhóm m{u O ở người. Mặc dù thử nghiệm có lợi thế l| đòi hỏi kh{ng nguyên
ít hơn, nó nhanh chóng được thay thế bằng RIA. RIA đã được ph{t triển như
l| một phương ph{p thay thế cho IEM để ph{t hiện kh{ng nguyên NoV trong
c{c mẫu ph}n [8].
Các kỹ thuật phân tử: Sau th|nh công về tạo dòng v| giải trình tự bộ gen
virus Norwalk (NoV), thử nghiệm RT-PCR được ph{t triển để ph{t hiện NoV
trong cả mẫu bệnh phẩm v| mẫu môi trường trong hai thập kỷ qua. Ứng dụng
RT-PCR v| c{c kỹ thuật giải trình tự cDNA để ph{t hiện v| mô tả đặc điểm di
truyền NoV đã tăng cường đ{ng kể sự hiểu biết của chúng ta về dịch tễ học
của bệnh nhiễm NoV [30,39,42].
Gần đ}y, RT-PCR được sử dụng rộng rãi như một công cụ để chẩn đo{n bệnh
nhiễm NoV. Một bước ngoặt đ{ng tin cậy nhất cho chẩn đo{n nhiễm NoV l|
sự hiện diện RNA của NoV trong c{c mẫu ph}n. Do đó, c{c mẫu được lựa
chọn l| mẫu ph}n từ bệnh nh}n bị tiêu chảy. Để tạo điều kiện cho việc ph}n
tích ph}n tử RNA của NoV, khuếch đại bộ gen RNA của chúng v| trình tự của
sản phẩm khuếch đại phải được thực hiện. Thêm v|o đó, c{c kỹ thuật ph}n tử
kh{c như l| PCR-miễn dịch, RT-LAMP v| real-time-PCR, những kỹ thuật đó
nhanh v| nhạy hơn phương ph{p RT-PCR chuẩn, gần đ}y c{c phương ph{p
real-time RT-PCR đã được ph{t triển để ph{t hiện nhanh NoV trong một số
lượng lớn c{c mẫu ph}n v| mẫu hải sản trong suốt mùa dịch bệnh v| c{c vụ
dịch của NoV [10,40] .
Trong những năm gần đ}y, baculovirus đã biểu hiện protein vỏ NoV v| nó
được khai th{c để tạo hạt giống virus (VLPs). Những VLPs n|y sau đó biểu
hiện hình th{i v| kh{ng nguyên giống với c{c hạt virus nguyên thể. C{c VLPs
rất hữu ích cho việc tạo miễn dịch của nhiều lo|i động vật kh{c nhau (chuột,
chuột lang, v| thỏ) để sản xuất sản phẩm huyết thanh miễn dịch đa v| đơn
dòng v| sau đó có thể được sử dụng để thiết lập c{c thử nghiệm chẩn đo{n cơ
bản EIA như thử nghiệm ELISA v| thử nghiệm IC [37]. Một số bộ kít ELISA
dùng để ph{t hiện NoV trong c{c mẫu ph}n đã được ph{t triển v| thương mại
hóa. Mặc dù c{c mẫu ph}n có thể được thử nghiệm trực tiếp bằng những bộ
kít ELISA m| không cần bước tinh chế v| cô đặc qu{ phức tạp, độ nhạy của
phương ph{p ELISA thì thấp hơn nhiều so với phương ph{p RT-PCR [3,2,16]. Độ
nhạy thấp l| hạn chế của phương ph{p ELISA, điều đó l|m cho nó không phù
hợp cho việc ph{t hiện trực tiếp NoV trong c{c mẫu ph}n, mẫu hải sản m|
không có sự cải thiện độ nhạy. Gần đ}y, thử nghiệm ph{t hiện nhanh bằng bộ
7
kít IC cũng đã trở th|nh thương mại hóa, có sẵn để ph{t hiện NoV. Bộ kít IC
n|y đã chứng minh có độ nhạy cao hơn so với c{c thử nghiệm bằng ELISA.
Tuy nhiên, hạn chế của c{c thử nghiệm chẩn đo{n EIA cơ bản để ph{t hiện
NoV l| chỉ có kiểu gen NoV m| c{c kh{ng thể đơn dòng đặc hiệu có thể được
ph{t hiện.
5. Các kỹ thuật sinh học phân tử
5.1 Phương pháp RT-PCR
L| phương ph{p PCR m| nucleic acid đích cần phải ph{t hiện l| RNA. Để có
thể thực hiện được PCR n|y thì trước hết RNA đích phải được phiên mã
ngược (RT-reverse transcription) th|nh cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để
khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự n|y.
Vì phải thực hiện hai giai đoạn RT rồi mới đến PCR, nên kỹ thuật n|y được
gọi l| kỹ thuật RT-PCR. Kỹ thuật RT-PCR gồm hai giai đoạn:
− Giai đoạn phiên mã ngược: (RT) l| một giai đoạn hết sức quan trọng quyết
định sự th|nh công của RT-PCR. Enzym được sử dụng trong giai đoạn n|y l|
Reverse transcriptase. Mồi sử dụng trong giai đoạn n|y l| mồi “ngược” của
PCR giai đoạn sau, có thể l| oligonucleotic oligodT (để bắt cặp với đuôi poly A
của c{c mRNA), hoặc cũng có thể l| một mồi ngẫu nhiên (random primer) có
bản chất l| một hexan nucleotide bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn
trên mRNA.
− Giai đoạn khuếch đại: l| phản ứng PCR với c{c cặp mồi đặc hiệu khuếch
đại theo cấp số nh}n c{c cDNA nhờ Taq polymerase.
5.2 Real – time PCR
Real-time PCR l| một phương ph{p kiểm so{t lượng huỳnh quang giải phóng
ra trong phản ứng, từ đó có thể biết được lượng sản phẩm PCR trong từng chu
kỳ của qu{ trình khuếch đại, tr{i ngược với PCR truyền thống chỉ biết được
lượng sản phẩm khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại.
Real-time PCR l| một phản ứng động, cho phép ph{t hiện "huỳnh quang ph{t
ra nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR”. Tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR.
Ph}n tích kết quả m| không cần qua bước điện di trên gel như phản ứng PCR
truyền thống. Kết quả được ph}n tích thông qua tín hiệu huỳnh quang ph{t ra
theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR. Kỹ thuật Real-time PCR cũng
qua hai bước giống RT-PCR: tạo cDNA, v| sau đó sử dụng cDNA n|y để thực
hiện phản ứng real-time PCR.
8
5.3 Tạo dòng
Mục đích của việc tạo dòng l| nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một
trình tự DNA x{c định. Chính x{c hơn, tạo dòng chính l| chọn lọc trong một
thư viện gen dòng vi sinh vật t{i tổ hợp cần tìm – tức tập hợp vi sinh vật cùng
bắt nguồn từ một tế b|o vi sinh vật ban đầu có mang vector t{i tổ hợp cần tìm.
Vector thường được sử dụng l| một plasmid thuộc thế hệ thứ 3 pGEM-T easy.
Đặc điểm của vector pGEM - T easy
- Đầu thừa Thymidine 3’ để tách dòng sản phẩm PCR: pGEM-T Easy vector
được thiết kế với một 3’- thymidine ở cả hai đầu. T- nhô ra ở vị trí gắn
tăng hiệu quả của qu{ trình gắn sản phẩm PCR bằng c{ch ngăn chặn
việc tự gắn vòng vector v| cung cấp một đầu T tương thích với đầu A
của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi c{c enzym tổng hợp.
- Lựa chọn các thể biến nạp Xanh/ Trắng: pGEM-T Easy l| vector có số lượng
bản copy cao, chứa c{c promoter T7 v| SP6 RNA polymerase nằm cạnh
vùng MCR (Multiple Cloning Region), bên trong đoạn mã cho α-peptite v|
đoạn mã cho enzym β-galactosidase. Sự bất hoạt do hoạt động chèn v|o của
đoạn α-peptite cho phép x{c định c{c thể chuyển nạp hay không chuyển
nạp bằng c{ch s|ng lọc m|u sắc xanh/trắng trên đĩa thạch.
- Vị trí enzym giới hạn cho việc cắt đoạn sản phẩm gắn: Vector chứa một số
lớn vị trí cắt của enzym giới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR. Vị trí
MCR của vector pGEM-T Easy nằm dọc theo c{c vị trí nhận biết của
enzym EcoRI, BstZI v| NotI, cho phép 3 enzym riêng rẽ cắt đoạn chèn.
- Gắn nhanh chóng: Phản ứng gắn có thể được ủ trong vòng 1 giờ ở nhiệt
độ phòng. Khoảng thời gian ủ có thể tăng thêm để tăng số lượng khuẩn
lạc được biến nạp.
Hình 1.4. Promoter và trình tự đa nối của vector pGEM-T Easy. Sợi trên chịu
trách nhiệm tổng hợp RNA nhờ enzym T7 RNA polymerase. Sợi dưới chịu trách
nhiệm tổng hợp RNA nhờ SP6 RNA polymerase.
9
QUI TRÌNH PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN
THỂ HAI MẢNH VỎ
1. PHẠM VI ÁP DỤNG
X{c định Norovirus trong thực phẩm
2. TÀI LIỆU ÁP DỤNG
Tham khảo t|i liệu Narayanan Jothikumar, James A. Lowther, Kathleen
Henshilwood, David N. Lees, Vincent R.Hill and Fan Vinje, 2004, Rapid and
Sensitive detection of Norovirus by using Taqman-Based one-step RT-PCR
assay and Aplication to naturally contaminated Shellfish samples. Applied
and Environmental. Microbiology, p. 1870-1875, 2004
3. NGUYÊN TẮC
Real-time PCR l| một phản ứng động, cho phép ph{t hiện "huỳnh quang FAM
cho ph{t hiện NoV GI v| huỳnh quang HEX cho ph{t hiện NoV GII nhờ sự
khuếch đại của sản phẩm PCR”. Tại mỗi chu kỳ của phản ứng Real Time PCR,
kết quả được ph}n tích thông qua tín hiệu huỳnh quang ph{t ra theo thời gian
tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR. Kỹ thuật Real-time PCR qua hai bước: tạo
cDNA, v| sau đó sử dụng cDNA n|y để thực hiện phản ứng real-time PCR
4. DỤNG CỤ- THIẾT BỊ
4.1 Dụng cụ
- Chai Dural 250ml, 500ml
- Eppendorf 1,5ml, 0,2ml
- Ống nghiệm 18x150mm
- Túi nylon vô trùng
- Pipetteman c{c loại 0,5-1000µl
- Eppendorf c{c loại 0,2-0,5ml
- Kéo, ch|y nhựa sử dụng một lần
- Bình cồn
- Muỗng, panh. dao, kéo inox
4.2 Thiết bị
- C}n ph}n tích
10
- M{y vortex
- M{y ủ nhiệt khô
- M{y dập mẫu.
- Tủ cấy vô trùng
- M{y trộn mẫu
- Tủ cấy vô trùng (Lab hood)
- M{y Vortex
- M{y ly t}m eppendorf
- M{y PCR
- M{y Real Time PCR
- Bộ dụng cụ điện di
- M{y chụp UV
- M{y l|m khô
5. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT
5.1 Bộ hóa chất tách chiết RNA toàn phần NKRNAPREP
Phương ph{p t{ch chiết thô RNA to|n phần {p dụng cho hầu hết c{c mẫu thử,
c{c mục đích sử dụng vì đ}y l| phương ph{p rất hiệu quả cho tất cả c{c loại
RNA từ virus, vi khuẩn, nấm men,… mẫu thử có thể l| c{c canh cấy tế b|o có
nh}n hay mô nghiền, vi khuẩn hay virus trong c{c dịch sinh học như m{u,
huyết thanh, huyết tương v| c{c dịch kh{c.
Bộ thuốc thử NKRNAPREP do công ty Nam Khoa cung cấp. Bộ thuốc thử bao
gồm c{c th|nh phần đủ để t{ch chiết RNA.
Tên thuốc thử Th|nh phần Điều kiện bảo quản
R1RNAPREP Guanidine, ure, phenol, chất tẩy 4oC/tối
R2RNAPREP Chloroform 4oC/tối
R3RNAPREP Isopropanol 4oC/tối
R4RNAPREP Ethanol 75% 4oC/tối
R5RNAPREP Nước tinh sạch xử lý DEPC 4oC/tối
Tube Tube eppendorf 1.5ml ToPTN
5.2 Bộ hóa chất dùng tổng hợp cDNA NK
11
Bộ hóa chất n|y được sử dụng để tổng hợp cDNA từ c{c mẫu t{ch chiết RNA
to|n phần, sử dụng mồi ngẫu nhiên.
Bộ hóa chất tổng hợp NKcDNA (công ty Nam Khoa) gồm c{c th|nh phần đủ để
phiên mã ngược RNA th|nh cDNA.
Tên thuốc thử Th|nh phần Điều kiện bảo quản NKRT mix Enzym reverse transcriptase -18 đến -30oC
RNAse H, dNTP, oligo (dT)
Random hexamer
5.3 Bộ hóa chất dùng điện di
Bộ hóa chất bao gồm c{c th|nh phần đủ để có thể điện di sản phẩm PCR
trên gel agarose.
Tên thuốc thử th|nh phần ĐK bảo quản NKTBE10X tris HCl, boric acid, EDTA ToPTN NKAgarose agarose (MB grade) ToPTN NKLoading buffer bromo phenol blue, glycerol ToPTN
tris-EDTA NKEthidium bromide ethidium bromide ToPTN NKDNA ladder thang DNA từ 100 đến 1000bps 2-8oC
5.4 Các thành phần bộ kít Real Time PCR
Mồi phát hiện NoV nhóm GI và GII như sau:
GI GIJJ_V1F GCC ATG TTC CGI TGG ATG
JJ_V1R TCC TTA GAC GCC ATC ATC AT
GII GIIJJ_V2F
CAA GAG TCA ATG TTT AGG TGG
ATG AG
CO_G2Ra TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
12
Probe: Probe để ph{t hiện NoV GI có đầu gắn huỳnh quang FAM v|
probe để ph{t hiện NoV GII có đầu gằn huỳnh quang HEX, có trình tự
sau:
5.5 Bộ kít Real Time PCR
Thành phần Real Time PCR-mix phát hiện Norovirus GI và GII
Tên thuốc thử
Nồng độ cho 1
Real Time PCR
mix
Thể tích phải lấy cho
20 Real Time PCR mix
20µl/mix
PCR master mix 2X 1x 500µl
Mồi GI JJ-V1 F (100µM) 12pm 2,4µl
Mồi JJ-V1 R (100µM) 12pm 2,4µl
JJ V1- Probe (100µM) 5pm 1µl
Mồi GII JJ-V2 F (100µM) 12pm 2,4µl
Mồi CO-G2 R (100µM) 12pm 2,4µl
RIN-G2- Probe (100µM) 5pm 1µl
MgCl2 (50mM) 3,5µM 70µl
dNTP (100mM) 0,2mM 2µl
miliQ water 219,3µl
Tổng cộng 800 µl
Chu trình nhiệt chạy Real Time PCR:: 1 chu kỳ 960C trong 3 phút, tiếp theo l|
40 chu kỳ ở 950C trong 15 gi}y , 600C trong 1 phút v| chụp Real Time.
6. QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM
6.1 Chuẩn bị cDNA từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Genogroup Oligonucleotide Trình tự (5' - 3') Vị trí
GI JJV1P
TGT GGA CAG GAG ATC GCA
ATC TC 5319 – 5341
GII RING2-P
TGG GAG GGC GAT CGC AAT
CT 5048 – 5067
13
6.1.1 Chuẩn bị mẫu thực phẩm ph{t hiện Norovirus
C{c mẫu được t{ch chiết riêng biệt, số lượng tối thiểu 10 con/mẫu, được cắt
nhỏ, cho v|o m{y nghiền, dập đều mẫu để giải phóng hạt virus ra khỏi tế b|o.
Hút dịch lỏng của mẫu 200µl, cho v|o ống eppendorf loại 1,5ml v| tiến h|nh
t{ch chiết mẫu thu RNA bằng bộ kít chiết t{ch mẫu NKRNAPREP của Công ty
Nam Khoa.
6.1.2 T{ch chiết RNA to|n phần bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP
Nguyên tắc
Dựa trên phương ph{p do Chomczynski v| Sacchi s{ng chế. Nguyên tắc l|
dùng guanidine 14M v| ure, phối hợp với phenol v| chất tẩy kh{c để l|m c{c
chất g}y biến tính c{c protein, kết quả l| c{c protein trong mẫu thử sẽ bị vón
lại, DNA sẽ tan trong pha phenol, còn RNA thì nằm trong phase nước v| sẽ
được t{ch khỏi pha phenol nhờ thêm v|o chloroform v| quay ly t}m lắng t{ch.
RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol
Các bước tiến hành
- Cho mẫu v|o một tube eppendorf chèn thật chặt mẫu để có thể tích 0,2ml
- Thêm 200µl nước cất v|o nghiền bằng cối, vừa nghiền vừa thêm dần dịch
v|o cho đến khi tổng thể tích cả mẫu l| 1ml
- Ly t}m 13.000 RMP/8 phút
- Lấy 100µl dịch nổi cho v|o một tube eppendorf mới
- Thêm v|o một tube eppendorf dịch mẫu thử đã chuẩn bị trên 300µl R1
rồi l|m thuần nhất mẫu dịch trong R1 bằng c{ch dùng pipette hút lên hút
xuống nhiều lần
- Ủ dịch thuần nhất ở 30oC trong 10 phút
- Thêm 80µl R2, lắc nhanh v| úp ngửa dung dịch trong 15 gi}y
- Giữ dung dịch ở 30oC trong 10 phút
- Ly t}m 13000 prm trong 15 phút
- Hút cẩn thận 200µl dịch nổi v|o một tube eppendorf mới tr{nh không
hút pha giữa
- Thêm 200µl R3, úp ngửa 15 gi}y rồi tiếp tục giữ 30oC trong 10 phút
- Hút bỏ phần nước nổi, tr{nh không l|m mất tủa RNA (nhiều khi không
thấy) đóng trên một bên đ{y tube
- Rửa tủa với 700µl R4 dùng ly t}m 8,000RPM trong 5 phút
14
- Dùng micropipette hay hút ch}n không hút bỏ tất cả phần nước nổi
- L|m khô tủa ở 55oC trong 10-15 phút trong m{y ủ nhiệt khô
- Cho v|o tủa khô 30l R5
- Giữ ở 55-60oC trong 10 phút
6.1.3 Tổng hợp cDNA bằng bộ thuốc thử NKcDNA synthesis
Nguyên tắc
Phương ph{p n|y sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexamer
primers) m| không cần dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp to|n bộ RNA từ mẫu
thử th|nh cDNA từ RNA nhờ men Reverse Transcriptase. Ngo|i ra trong hệ
thống phản ứng còn có men RNAse H để cắt bỏ RNA bị bắt cặp v|o cDNA sau
khi phiên mã ngược th|nh cDNA.
Nguyên tắc phiên mã ngược tổng hợp cDNA
Các bước tiến hành
Cho 40µl mẫu t{ch chiết RNA v|o tube PCR có chứa sẵn 3µl NKRTmix
đang ng}m trong đ{
Thực hiện tổng hợp cDNA trong m{y lu}n nhiệt theo chương trình như
sau: 5 phút: 25oC, 30 phút: 42oC, 5 phút: 85oC, Giữ 4oC
6.2 Chu trình nhiệt Real Time PCR phát hiện Norovirus GI và GII
Sử dụng 5µl mẫu cDNA cho v|o 20 µl Real Time PCR mix v| tiếp tục chạy
Real Time PCR trên m{y Bio Rad, với chu trình nhiệt như sau:
- 3 phút 94oC
15
Chạy 40 chu kỳ
- 15 gi}y 96oC
- 60 gi}y 60oC
Chụp Real Time
- Giữ 4oC
2.7. BIỂU THỊ KẾT QUẢ
Kết quả ph}n tích dựa trên kết quả Ct chứng dương v| chứng }m, từ đó suy ra
kết quả của mẫu:
Ct
Kết quả dương tính với NoV khi Ct trên chu kỳ ngưỡng
16
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Buesa, J., et al., Sequential evolution of genotype GII.4 norovirus variants
causing gastroenteritis outbreaks from 2001 to 2006 in Eastern Spain, J. Med.
Virol., 80, 1288, 2008.
2. Burin, E., et al., Diagnosis of norovirus outbreaks by commercial ELISA or
RT-PCR, J. Virol. Methods, 137, 259, 2006.
3. Burton-MacLeod, J. A., et al., Evaluation and comparison of two commercial
enzym-linked immunosorbent assay kíts for detection of antigenically diverse
human noroviruses in stool samples, J. Clin. Microbiol., 42, 2587, 2004.
4. Caul, E. O., Small round structured viruses: Airborne transmission and
hospital control, Lancet, 343, 1240, 1994.
5. Donaldson, E. F., et al., Norovirus pathogensis : Mechanisms of persistence
and immune evasion in human populations, Immunol. Rev., 225, 190, 2008.
6. Green, Y. K., Caliciviridae: The noroviruses, Chapter 28 in Fields Virology, eds.
B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (Wolters Kluwer
Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2007).
7. Galllimore, C. I., et al., Multiple norovirus genotypes characterised from an
oyster-associated outbreak of gastroenteritis, Int, J.Food. Microbiol., 103, 323,
2005.
8. Greenberg, H. B., and Kapikian, A. Z., Detection of Norwalk agent antibody
and antigen by solid-phage radioimmunoassay and immune adherence
hemagglutination assay, J. Am. Vet. Med. Assoc., 173, 620, 1978.
9. Huang, P., et al., Norovirus and histo-blood group antigens: Demonstration
of a wide spectrum of strain specificities and classification of two major
binding groups among multiple binding patterns, J. Virol., 79, 6714, 2005.
10. Kageyama, T., et al., Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-
like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR, J. Clin.
Microbiol., 41, 1548, 2003.
11. Kapikian, A. Z., et al., Visualization by immune electron microscopy of a 27-
nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis, J.
Virol., 10, 1075, 1972.
12. Kapikian,., et al., Prevalence of antibody to the Norwalk agent by a newly
developed immune adherence hemagglutination assay, J. Med. Virol., 2, 281,
1978.
13. Kaplan, J. E., et al., The frequency of a Norwalk-like pattern of illness in
outbreaks of acute gastroenteritis, Am. J. Public. Health, 72, 1329, 2982.
14. Kaufman, S. S., et al., Calicivirus enteritis in an intestinal transplant recipient,
Am. J. Transplant., 3, 764, 2003.
17
15. Khamrin, P. et al., Gentic diversity of noroviruses and sapoviruses in children
hospitalized with acute gastroenteritis in Chiang Mai, Thailand, J. Med. Virol.,
79, 1921, 2007.
16. Khamrin, P., et al., Evaluation of immunochromatography and commercial
enzym-linked immunosorbent assay for rapid detection of norovirus antigen
in stool samples, J. Virol. Methods, 147, 360, 2008.
17. Lopman, B., et al., Increase in viral gastroenteritis outbreaks in Europe and
epidemic spread of new norovirus variants, Lancet, 363, 682, 2004.
18. Lindesmith, L., et al., Human susceptibility and resistance to Norwalk virus
infection, Nat. Med., 9, 548, 2003.
19. Lewis, D. C., Three serotypes of Norwalk-like virus demonstrated by solid-
phase immune electron microscopy, J. Med. Virol., 30, 77, 1990.
20. McEvoy, M., et al., An outbreak of viral gastroenteritis on a cruise ship,
Commun. Dis. Rep. CDR. Rev., 6, 188, 1996.
21. McIntyre, L., et al., Gastrointestinal outbreaks asscociated with Norwalk virus
in restaurants in Vancouver, British Columbia, Can. Commun. Dis. Rep., 28,
197, 2002.
22. Marks, P. J., et al., Evidence for airbone transmission of Norwalk-like (NLV)
in a hotel restaurant, Epidemiol. Infect., 120, 481, 2000.
23. Marionneau, S., et al., ABH and Lewis histo-blood group antigens, a model
for the meaning of oligosaccharide diversity in the face of a changing world,
Biochimie, 83, 565, 2001.
24. Marina Hoehne and Eckart Schreier, 2006, Detection of Norovirus genogroup
I and II by multiplex real time RT-PCR using a 3’-minor groove binder-DNA
probe. BMC infection deseases, 69, 2006.
25. Nguyen, T. A., et al., Diversity of viruses associated with acute gastroenteritis
in children hospitalized with diarrhea in Ho Chi Minh City, Vietnam, J. Med.
Virol., 79, 582, 2007.
26. Narayanan Jothikumar, James A. Lowther, Kathleen Henshilwood, David N.
Lees, Vincent R.Hill and Fan Vinje, 2004, Rapid and Sensitive detection of
Norovirus by using Taqman-Based one-step RT-PCR assay and Aplication to
naturally contaminated Shellfish samples. Applied and Environmental.
Microbiology, p. 1870-1875, 2004.
27. Okítsu-negishi, S., el al., Molecular epidemiology of viral gastroenteritis in
Asia, Pediarr. Int., 46, 245, 2004.
28. Phan, T. G., et al., Viral diarrhea in Japanese children : Results from a one-
year epidemiologic study, Clin. Lab., 52, 183, 2005.
29. Pham, N. T., et al., Isolation and molecular characterization of Aichi viruses
from fecal specimens collected in Japan, Bangladesh, Thailand, and Vietnam,
18
J. Clin. Microbiol., 45, 2287, 2007.
30. Phan, T. G., et al., Gentic heterogenity, evolution and recombination in
noroviruses, J. Med. Virol., 79, 1388, 2007.
31. Patel, M. M., et al., Systematic literature review of role of noroviruses in
sporadic gastroenteritis, Emerg. Infect. Dis., 14, 1224, 2008.
32. Patel, M. M., et al., Noroviruses : A comprehensive review, J. Clin. Virol., 44, 1,
2009.
33. Parrino, T. A., et al., Clinical immunity in acute gastroenteritis caused by
Norwalk agent, N. Engl. J. Med., 297, 86, 1977.
34. Russo, P. L., et al., Hospital outbreak of Norwalk-like virus, Infect. Control
Hosp.Eepidemiol. 18, 5671997.
35. Rockx, B., et al., Natural history of human calicivirus infection: A prospective
cohort study, Clin. Infect. Dis., 35, 246, 2002.
36. Santos, N., and Hoshino, Y., Global distribution of rotavirus
serotypes/genotypes and tis implication for the development and
implementation of an effective rotavirus vaccine, Rev. Med. Virol., 15, 29, 2005.
37. Shiota, T., et al., Characterization of a broadly reactive monoclonal antibody
against norovirus genogroups I and II: Recognition of a novel conformational
epitope, J. Virol., 81, 12298, 2007.
38. Thornton, A. C., Jennings-Conklin, K. S., and McCormick, M. I., Noroviruses:
Agents in outbreaks of acute gastroenteritis, Disaster Manag. Response, 2, 4,
2004.
39. Tan, M., et al., Conversation of carbohydrate binding interfaces: Evidence of
human HBGA selection in norovirus evolution, PLoS One, 4, 1, 2009.
40. Tian, P., and Mandrell, R., Detection of norovirus capsid proteins in faecal
and food samples by a real time immune-PCR method, J. Appl. Microbiol.,
100, 564, 2006.
41. Xi, J. N. et al., Norwalk virus genome cloning and character-ization, Science,
250, 1580, 1990.
42. Yan, H., et al., Detection of norovirus (GI, GII), Sapovirus and astrovirus in
fecal samples using reverse transcription single-round multiplex PCR, J. Virol.
Methods, 114, 37, 2003.
43. Zeng, D. P., et al., Norovirus classification and proposed strain nomenclature,
Virology, 346, 312, 2006.
44. Wilhelmi, L., Roman, E., and Sanschez-Fauquier, A., Viruses causing
gastroenteritis, Clin. Microbiol. Infect., 9, 247, 2003.
45. Wyatt, R. G., et al., Comparison of three agents of acute infectious
nonbacterial gastroenteritis by cross-challenge in volunteers, J. Infect. Dis.,
129, 709, 1974.
19
Quantitative Polymerase Chain Reaction:TaqMan®Probe Detection
(1) Nucleotide
(Probe) coupled with
fluorescence
dye and quencher
(2) Polymerase
with exonuclease
activity
(3) Reporter dye
is cleaved